JPH06502543A - ラクトースからのダルシットの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ラクトースからのダルジットの製法 本発明はクルイフエロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のガラクトキ ナーゼ・マイナス突然変異体の酵素的変換によるダルジットの製法に関する。

クルイフエロマイセス属のガラクトキナーゼ・マイナス突然変異体が三糖類ラク トースをグルコースとガラクトースに分解し、グルコースを代謝し、かつガラク トースを攻撃しないということは公知である（　Ｍｉｃ−ｈａｅｌ　Ｉ、　Ｒｌ ｌｅｙ等著、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、第１５８巻、１９８４年、第７０ ５〜７１２頁及びＰｉｅｒｒｅ　Ｇａｌｚｙ等著、西独特許公開第２４３４８７ ４号公報）。更に、この変換で生じたガラクトースを約５０％までの収率でダル ジットに水素添加することのできる突然変異体があることも公知である（　Ｍ、 −ｆ１６１６ｎｅ　Ｍａｒｉｎ等著、Ｊ、　Ｂａ−５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、　、第２７巻、１９８７年、第５０５〜５１０頁）。

この公知法でラクトースからダルジットを製造しようとする場合、まずラクトー スをクルイフェロマイセス属のガラクトキナーゼ・マイナス突然変異体で変換し 、生じたガラクトース又はガラクトースとダルジットとからなる混合物を単離し 、次いで水素添加によりダルジットに変換することが必要である（　Ｂｅ１ｌｓ ｔｅｉｎ。

第４巻、第３補遺、第１巻、第２４０５〜２４０６頁）。しかしながら、この方 法はマダガスカル・マンナ（Ｍｅｌａｍｐｙｒｕｍ　ｎｅｍｏｒｏｓｕｓ）から ダルジットを獲得する６より著しく費用がかかる（Ｒｏｅｍｐｐｓ　Ｃｈｅａ＋ １ｅ−Ｌｅｘｉｋｏｎ、第８改訂版、Ｆｒａｎｃｋ’５ｃｈｅ　Ｖｅｒｌａｇｓ ｈａｎｄｌｕｎｇｌＳｔｕｔ−ｔｇａｒｔ、第１０２７頁）。

本発明による方法は、ラクトースをクルイフエロマイセスのガラクトキナーゼ・ マイナス突然変異体で酵素的に変換させることにより高い収率でダルジットに変 換することを可能にする。得られたダルジットはガラクトースを実質的に全（含 有していないか、又は非常に僅かな量で含有しているにすぎず（すべてにおいて ５％より少量）、従って簡単な再結晶、例えば水性エタノールからの再結晶によ り精製することができる。　本発明による方法は、ラクトースをクルイフエロマ イセス属のガラクトキナーゼ・マイナス突然変異体で酵素的に変換する際に ａ）　ラクトースの十分な加水分解の後、この醗酵培地に１１あたりグルコース ５ｇ〜２５ｇを添加するか、又は ｂ）　この醗酵を休止細胞（ｒｅｓｔｉｎｇ　−ｃｅｌｌ）法の条件下に行なう 、 ことを特徴とする。

本発明方法を実施するためにはすでに前記のＲ１１ｅｙ等、Ｇａ１ｚｙ等又は１ ｌａｒｉｎ等による刊行物中に記載されているクルイフエロマイセスの突然変異 体を使用することができる。

これらの刊行物中に記載されたすべての突然変異体を該分野において自由に入手 することができるわけで−はないので、Ｍａｒｉｎ等によって記載された条件下 に独自の突然変異実験を実施し、内部記号１４４ＥＨの突然変異体が得られ、こ れはすべての主要な特徴においてクルイフェロマイセス・マルキシアヌス・バー ル・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ　ｖａｒ、 　１ａｃｔｉｓ）ノ特性を分類学的に有する（　Ｊ、　Ｌｏｄｄｅｒ著、−Ｔｈ ｅ　Ｙｅ−ａｓｔｓ＋、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌ、Ｃａｍｐｌ、 ＾ｍｓｔｅｒｄａｍ。

１９７１年、第３４９〜３５２頁）。この突然変異体はドイツ微生物保存機関（ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓａｓｉｌｕｎｇ　ｖａｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ＋１ ｌｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　Ｇ＋ｓｂＨ，Ｄ−３３００Ｂｒａ ｕｎｓｃｈｖｅｉｇ）にＤＳＭ６１１９という番号で寄託され、これは該分野に おいて自由に入手可能であり、本発明による方法を実施するために特に好適であ る。

本発明による方法は酵母培地で基質を微生物学的に変換する際にも使用される条 件下で実施される。

酵母培養、特にクルイフエロマイセス培養のために通常適用する培養条件下に好 適な栄養培地中で通気及び撹拌下に予培養を行なう。

変法の実施のためには、この予培養の分割部分を醗酵培地中に導入するが、この 醗酵培地は通常の培養培地の池に培地１１あたりラクトース１０ｇ〜５０９（特 に２０９〜３０ｇ）を含有する。次いで、この醗酵を撹拌及び通気下に温度２５ 〜３０℃、ｐＨ値４〜６で少なくとも約９５％のラクトースが加水分解されるま で行ない、醗酵培地にラクトース１ｇあたりグルコース０゜２５〜１９（有利に ０．４〜０　、６９）を加え、更に変換が静止するまで醗酵させる二 最適なラクトース製産及びグルコース濃度、グルコース添加の最適な時点及び最 適な醗酵時間は使用したクルイフエロマイセス突然変異体の種類及び醗酵条件に 依存する。

微生物学的基質変換に必要とされているようなこの大きさの程度は、個々の場合 においては専門家がしばしば行なうようにめなければなりません。

醗酵の経過を知るためには、培地から一定の時間をあけて試料を取り出し、常法 で、例えば薄層クロマトグラフィーにより、ラクトース、ガラクトース、グルコ ース及びダルジットに関してその含量を知ることができる。

変法を実施するためには、変法ａ）の条件下に、しかしラクトースを添加するこ とな（クルイフエロマイセスー培地を培養する。約２４〜４８時間の増殖期の後 、細胞塊を濾過又は遠心分離により分離し、洗浄し、場合により等強化用添加物 及び緩衝物質を含有していてよい０．５〜１０（有利に１〜５）重量％のラクト ース水溶液中に再分散させ、この懸濁液中の細胞密度を醗酵培地におけるより２ 〜５倍太き（する。次いで撹拌及び通気下に変換が静止するまで醗酵する。

この場合にも最適な反応パラメーターを前実験で知ることが必要である。

反応が達せられた後、変法ａ）及びｂ）により得られた醗酵配合物がダルジット を簡単に単離することができる。この単離は、この配合物を濾過するか、又は遠 心分離し、得られた溶液から無機塩を除去し、濃縮し、好適な溶剤、例えばエタ ノールを添加するこ□とによりダルジットを結晶化する。

このように形成されたダルジットは、場合により再結晶の後、例えば砂糖不含甘 味料として使用される。

次に実施例につき本願方法をより詳細に説明する。

実施例： 例　１ （ＮＨ４）　２Ｓ　０４　５９／Ｊ ＫＨ２ＰＯ４１９／ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｖ／Ｉ Ｎ　ａ　ＣＩ　０．１９／Ａ’ ＣａＣｌ２　０．１ｇ／ｌ ニコチン酸　４００　μ９／１ ビオチン　２　μ９／１ 塩酸チアミン　４００　μｙ／１ アデニン　１０　冨ｙ／１ ラクトース　５９／１ −ｐＨ４により調節− を含有する滅菌培養液１１を有する２１−エルレンマイヤーフラスコをクルイフ ェロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｒｘｉａｎ ｕｓ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　５１１９の細胞を接種環を用いて接種し、３０℃、１９０ 　ｒ、ｐ、ｍで振盪する。

予培地と同じ組成の滅菌培養液４０１を有する５０１−醗酵装置を予培地１ｊで 接種する。この配合物を３０℃に温度調節し、２４時間１００　ｒ、ｐ、ｍで撹 拌し、１時間あたり１諺３の空気を通気する。

予醗酵培地と同じ組成であるが、ラクトース２０ｇ／ｌを含有し、ｐＨ５に調節 された滅菌培養液３２１を有する５０１−醗酵装置を予醗酵培地４１で接種し、 ３０℃、１００　ｒ、ｐ、ｍで撹拌し、１時間あたり空気１１３を通す。

ｐＨ値がｐＨ５より下まわらないように調節する。

４８時間後、水４１中のグルコース４００の滅菌溶液を添加する。

９６時間後、配合物に活性炭及びパーライトを各々１００ｇ添加し、濾過する。

細胞不含培地泥状液を電気透析装置上でコンダクタンス０．２ｍＳで脱塩する。

この溶液を真空中で約１１に濃縮し、等容量のエタノールを加える。結晶として ダルジット３７４ｇが得られる例　２ 酵母エキス　３ｙ／１ 麦芽エキス　３ｙ／ｌ ペプトン　５９／ｌ ラクトース　１０　ｑ／１ を含有する滅菌培養液１００ｍ１を含有する５　００　ｍｌ　−エルレンマイヤ ーフラスコにクルイフェロマイセス・マルキシアヌスＤＳＭ６１１９の細胞を接 種環を用いて接種し、２４時間３０℃で、かつ１８０ｒ、ｐ、−で振盪する。

この細胞を培地の遠心分離により分離し、０．９％食塩溶液で１回洗浄し、Ｍｇ Ｃ１２０，５ｙ／ｌ及びラクトース１０ｇ／Ｉｔを含有し、ｐＨ４，５に調節さ れた脱イオン水２０１１Ａ’中に再懸濁する。

この配合物を３０℃で１８　Ｏｒ、ｐ、ｍで振盪する。２４時間後、この細胞を 遠心分離する。ＤＣ−分析によれば、上澄中にダルジット５ｇ／ｌが含有されて いるのがわかった。

参考例 予培地及び予醗酵培地の培養を例１に記載されたと同様に行なう。

予醗酵と同じ組成であるが、ラクトース２０９７ＩＩを含有し、かつｐＨを５に 調節した滅菌培養液３６１を有する５０１−醗酵装置に予醗酵培地４１を接種し 、３０℃で、１００　ｒ、ｐ、ｍで撹拌し、１時間あたり空気１寵３で通気する 。ｐＨ値がｐ　Ｈ５を下まわらないように調節する。

７２時間後、配合物に活性炭及びパーライト各１００ｇを添加し、濾過する。細 胞不含の培地泥状液を電気透析装置上でコンダクタンス０．２ｍＳで脱塩する。

この溶液を真空中で約１１に濃縮し、等容量のエタノールを加える。結晶体とし てガラクトース１６０ｇ及びダルジット２１２ｇが得られる。

国際調査報告 国際調査報告 １ｍ１１．ア、１ｍ４．＋＋−＾−ＰＣＴ／ＤＥ９２１００００８

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．クルイフェロマイセス属のガラクトキナーゼ・マイナス突然変異体によりラ クトースを酵素的に変換することによりダルシットを製造するための方法におい て、 ａ）ラクトースの十分な加水分解の後、この醗酵培地に１ｌあたりグルコース５ ｇ〜２５ｇを添加するか、又は ｂ）この醗酵を休止細胞法の条件下に実施する、ことを特徴とするラクトースか らのダルシットの製法。
2. ２．醗酵のために１ｌあたりラクトース１０ｇ〜５０ｇを含有する培地を使用す る請求項１記載の製法。
3. ３．この醗酵を突然変異体クルイフェロマイセス・マルキシアヌスＤＳＭ６１１ ９を用いて実施する請求項１記載の製法。