JPH06502992A - 新しいヒト組み換えガンマ−インターフェロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新しいヒト組み換えガンマーインターフェロン技術分野 本発明は、ガンマ−インターフェロンの新しい変異体、この変異体ガンマ−イン ターフェロンをコードするＤＮＡ配列およびプラスミドＤＮＡならびに医学的目 的のためのこの変背景技術 インターフェロンは３種類に分類されている。すなわち、アルファーインターフ ェロン、ベーターインターフェロンそしてガンマ−インターフェロンである。

特に、ガンマ−インターフェロンは最近、治療薬としての使用によって重要性を 増している。これは、遺伝子工学による組み換えガンマ−インターフェロンの産 生に成功したことによるものが殆どである。（組み換えガンマ−インターフェロ ン） しかしながら、医学におけるその全身的な適用ゆえに、高濃度のインターフェロ ンが使用される。これらの高い濃度はインターフェロンの処方において高い必要 性がある。加えて、抗原性に寄与することが出来る。もし、より高い活性を示す 変異体が入手できれば、より低い濃度が治療に使用される。

従って、治療薬としてのガンマ−インターフェロンの使用はより好ましいものに なる。さらに、この変異体インターフェロンは高い割合で発現されうることが望 まれる。

本発明の目的は１４４個のアミノ酸を持つ以前報告されたガンマ−インターフェ ロンに比して高い活性を持つカンマ−インターフェロンの新しい変異体を提供す ることである。本発明のさらに別の目的はその変異体ガンマ−インターフェロン をコードするＤＮＡ配列とプラスミドＤＮＡを提供することである。さらに本発 明の別の目的は最も高い生産高が可能な変異体ガンマ−インターフェロンの生産 方法を提供することである。

ｌ匪立説亘 前記の目的は、実際により高い活性を示す組み換えガンマ−インターフェロンを 生じるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列およびプラスミドＤＮＡを提供する ことによって解決される。この新しいポリペプチド（以下のテキストではガンマ −インターフェロンＣ−１０Ｌとして示す）は、１３４個のアミノ酸を含むＯア ミノ酸の１から１３２までは天然のガンマ−インターフェロンのアミノ酸に対応 する。更に０位の最初のアミノ酸が存在し、アミノ酸配列決定法によって決定さ れる０　１３３位のアミノ酸はグルタミンではなくてロイシンである。完全なり ＮＡとタンパク質の配列は、図１に与えられている。同時に、変異体ガンマ−イ ンターフェロンの高い生産高を示す方法について記述する。さらに、いわゆる「 パッチ　プロトコール」を使った精製法についても示す。

驚くべきことに、ガンマ−インターフェロンＣｌ０Ｌは完全な１４３個のアミノ 酸をもつガンマ−インターフェロンよりも４倍高い活性を持つことが発見された 。加えて、ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌは、ヒトＷＩＳＨ細胞に対して 通常のガンマ−インターフェロンに比べて抗増殖活性として２４倍高い活性を持 つ。以前から知られたガンマ−インターフェロンと対比してそのより高い活性と 発現割合ゆ尤に、このはじめて入手可能となった短くなった形のものは、ガンマ −インターフェロンをより低濃度でより標的指同性が高い服用量が治療目的に使 用されるようになることを可能にする。

高い発現割合のために、このガンマ−インターフェロンを例えばインターフェロ ンレベル測定のための標準品として、インビトロ実験のために、精密化成品とし て使用することが更に可能となる。

新しい変異体とその製法の詳細な記述は、以下に示す。

ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌの製造は、遺伝子の部分的な開裂とそれを プラスミドＤＮＡ中の調節部位の後に置き、続いてこのＤＮＡを使ってバクテリ ア細胞の形質転換を行うことによって達成される。次の段階で、ガンマ−インタ ーフェロン−ＣＩＯＬは陽イオン交換法をつかって濃縮される。そして、２番目 の段階として高い精製が行われる。実施例として、ガンマ−インターフェロンＣ −１ＯＬをコードするプラスミドＤＮＡ　（寄託番号　ＤＳＭ６２３８号）の説 明を以下に示す。

出発物質は、ヒトの細胞わら標準的な方法によって製造されたｃＤＮＡを用いた 。このｃＤＮＡは配列が決定され、ポリＡなしに１１９４塩基対（ｂｐ）の長さ を持つ。これは全コード領域および５′　と３′の非翻訳領域を含む。１８２番 目から５７４番目のヌクレオチドは発現プラスミドの構築に用いられた。

タンパク質のリーダー配列および５′非翻訳領域（１−１０９）は制限エンドヌ クレアーゼＡｖａＩＩ（配列ＧＧＡ／ＴＣＣ，１８１−１８５を認識する）によ って取り除かれた。

開始コドンＡＴＧ　（メチオニンをコードする）および最初のアミノ酸について のコドンは、合成りＮＡ断片（？ｆｆ［のリンｈ　−）　ヲ便ってｃＤＮＡの５ ′末端につけられた。この方法では天然のコドンＣＡＧ　（グルタミンをコード する）は、ＣＡＡ（これもグルタミンをコードする）に置き換わった。以上述べ た技術は、「従来技術」である。

３′の非翻訳領域および一部のコード領域は、ＨｉｎｆＩ（認識配列　ＧＡＮＴ Ｃ，５７１−５７５）による開裂によって取り除かれた。Ｘｂａｌ　（ＣＴＣＴ ＡＧＡＧ）認識部位のリンカ−の連結は、アミノ酸１３３（ロイシン）に対する コドンおよび終止コドン（ＴＡＧ）を提供する。短くされたｃＤＮＡは、アダプ ター配列を使って発現ベクターに挿入される。

Ｅ、ｃｏｌｔにおけるガンマ−インターフェロンの発現のためにＥ、　Ａｍｍａ ｎおよびＪ、Ｂｒｏｓｉｕｓ（ＧＥＮＥ　４Ｇ、　（１９１１５）１８９３）に よって構築されたプラスミドｐＫＫ２３３−２が使用された。このプラスミドは 誘導できるｔｒｃ−プロモーター、開始コドン（ＡＴＧ）およびＲＮＡポリメラ ーゼに対するターミネータ−を含むマルチクローニング部位を有する。

このプラスミドＤＮＡ　（寄託番号ＤＳＭ６２３８）は、ガンマ−インターフェ ロンＣ−１ＯＬの生産のための開始物質を構成する。

ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌは、７Ｍ１０５バクテリア細胞で全タンパ ク質の３０％の割合で発現する。ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌの９０％ より多くは不溶性の封入体の形で存在する。

ガンマ−インターフェロンの精製のためにバクテリア細胞は破壊され、封入体は 繰り返し洗浄することによって可溶性のバクテリアタンパク質がない状態となっ た。細胞破壊は好ましくは、機械的に行った。特に、超音波が用いられた。封入 体とそれについてのガンマ−インターフェロンはグアニジン塩化物を使った変性 工程によって可溶化した。ガンマ−インターフェロンは、リン酸緩衝液中で希釈 することによる復元工程で生物学的に活性な形に戻された。このようにして、「 パッチ　プロトコール」の陽イオン交換法によって９０％より多い純粋のガンマ −インターフェロンが濃縮された。更に、ゲル濾過工程によって精製が進み９５ ％より多い純度となる。

本発明の用語「パッチ　プロトコール」は次の過程を示すために用いられる。ガ ンマ−インターフェロンが全てのイオン交換物質に結合されるように陽イオン交 換物質はガンマ−インターフェロン溶液の中で攪拌された。モしてガンマ−イン ターフェロンのタンパク質濃度は詰められたイオン交換物質の温度約２　ｍ　ｇ 　／　ｍ　ｌよりは高くなかった。この方法は「パッチ　プロトコール」と呼ば れる。次にイオン交換物質にのせたガンマーインターフェクンは、パッチ中でリ ン酸緩衝液で洗われ、そして次にガンマ−インターフェロンは、パッチ中でリン 酸緩衝液中の塩化ナトリウム溶液で抽出された。

セルロースあるいはＡｆｆｌ−ｇｅｌ　Ｂｌｕｅのどちらも陽イオン交換物質と して使われ得る。

この「パッチ　プロトコール」は決定的な利点を持ち、そして一般的なカラム法 での１０％と比較して精製の間に４０％という生成物の増加がみられる。

このイオン交換法は普通カラムクロマトグラフィーによって実行される；例えば 、０．２Ｍグアニジン塩化物とリン酸緩衝液の存在下での復元工程の後、ガンマ −インターフェロンは陽イオン交換物質のカラムの上にくみあげられ、ガンマ− インターフェロンに対する陽イオン交換物質の高い結合能に従って、カラムの上 部部分に対応的に高濃度で結合する。

結合したガンマ−インターフェロンは高濃度であるので、対応した抽出生成物は 非常に少ない。すなわち、結合したインターフェロンのごく一部だけが対応する 塩溶液によって抽出され得る。従って、この発明による方法は従来技術に対して 決定的な利点をもつ。

図１はガンマ−インターフェロンＣ−１ＯＬ変異体のＤＮＡとタンパク質の配列 を示す。

このことから、ガンマ−インターフェロン変異体Ｃ−１ＯＬは１３４個のアミノ 酸を含むことが解る。最初のアミノ酸（０位のメチオニン）は追加物でありタン パク質配列決定法によって確認された。ｌから１３２番目のアミノ酸は天然のイ ンターフェロンのそれと対応する。１３３番目のアミノ酸はグルタミンの代わり にロイシンである。コード配列およびフランキングのヌクレオチドの正確な構造 はＤＮＡ配列決定法によって立証された。

ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌは自然の状態でＳ値が２．５という条件で は、約３０，０００ダルトンの分子量を有する。すなわち、それは二量体の形で 構成されている。ＳＤＳ中の変性条件下ではそれは約１５，０００ダルトンの分 子量を持つ単量体である。その等電点は１０．０である。

ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌは８　Ｘ　１０７Ｕ／ｍ　ｇタンパク質の 比抗ウィルス活性をもつ（ＥＭＣウィルスをもつヒトの肺の線維芽細胞癌細胞Ａ ３４９で測定された）。これは完全な１４３個のアミノ酸のガンマ−インターフ ェロンの４倍の活性を持つ。

ガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌは、カンマ−インターフェロンと比較して 、ヒ）ＷＩＳＨ細胞で２４倍高い抗増殖活性を持つ。

ガンマ−インターフェロンＣ−１ＯＬは、主要組織適合性抗原系（ＭＨＣ）のク ラスＩＩの抗原ＨＬＡ−ＤＲの発現をヒト結腸癌細胞においてガンマ−インター フェロンよ９６８倍多く生じさせる。驚（べきことに、ガンマ−インターフェロ ンＣ−１０Ｌのそれらの細胞への受容体結合はガンマ−インターフェロンの対応 する受容体結合よりも２倍悪い。受容体結合は３２ｐでラベルされたガンマ−イ ンターフェロンを用いた競合実験で測定された。この実験では３２ｐでラベルさ れたガンマ−インターフェロンがラベルされていないガンマ−インターフェロン あるいはインターフェロンＣ−１０Ｌと競合する。そして逆に３２Ｐでラベルさ れたガンマ−インターフェロ／Ｃ−１ＯＬがラベルされていないガンマ−インタ ーフェロンＣ−１ＯＬあるいはガンマ−インターフェロンと競合する。

この重要な特性、すなわち受容体結合では、ガンマ−インターフェロンＣ−１０ Ｌは、ｃａｒｏｔｔａらによって以前記載されたガンマ−インターフェロンのう ちの１つとは異なる。そのガンマ−インターフェロンは、ＣｏｏＨ末端が１０個 のアミノ酸分短くなっているが、この変異体は末端アミノ酸としてガンマ−イン ターフェロンＣ−１ＯＬのロイシンの代わりにグルタミンを持っており、ガンマ −インターフェロンと比較して４倍高い受容体結合能を持つ。

ここで示したガンマ−インターフェロンＣ−１０Ｌ組み換え体は、より多（の量 で、より高い活性を持つ変異体ガンマ−インターフェロンを初めて入手可能にし たものである。

日ｇｕｒ　＋ ヒトエＰＫ−ヴンマ変！！偉Ｃ−１ｏＬのタフ１〜η貧♂Ｊび“ＤＮＡ１Ｉｎ配 列Ｆｉｇｕｒ　２ 工ＦｔＪ−力゛ン？　Ｃ−１ｏＬつ褌εＥｊＬ＋ｒ；ｎｑｌｉヌ、７゛う、ス２ ミド−ａｙｒＹ３ｕｑ　ｒｓｔＩ　ｔ−１ぐ７ｏ−ンｔｅｔ４＜Ｆ、ｅトＩＦＪ ｔｊ　Ｃ−１０Ｌ　ｃＤＮＡ悶際調前軸告 国際調査報告 ＰＣＴ／ＤＥ　９１１００９１２ ：：　”　、：”；、：’　；’　？、−＝、コ°：、ｍｍ：Ｉ’ｌｌ：二’＋ １：０１１１９’ＫＯＷフ；ｍ°ｅ１ｍｌｓｔｈｅＩｍ°＃高撃撃≠高Pｍｙδ ン１１５フロ丁−１ 〒ＭＩｗｒａｐ＋＋＊ｅＰａＩ＠−ｍｌｌｅｅｉｌＩＲＭ６７１１ａｌｌｅ−ｆ ＩＮ書＋＋＋＋＃ｓＭｋｗｌ・を雷−中ｉｅｈ参ず−ｍｍｙ翌■高h＠ｌＩｈ＊ ｐｗｎｍ４−基Ｒｍ’ｍａ◆１・−フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　３／１８ １３１００　ＺＮＡ　８５１７−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ ／／（Ｃｌ３Ｆ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （、Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　オツトー、ベルント ドイツ連邦共和国　デー−３０００ハノーファ−５１，ハルバーシュタット　９ Ｉ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のアミノ酸配列を持つポリペプチドＩＦＮ−ガンマＣ−１０Ｌ： 【配列があります】
2. ２．以下のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ配列： 【配列があります】
3. ３．以下のアミノ酸配列をコードする寄託番号ＤＳＭ６２３８のプラスミドＤＮ Ａ： 【配列があります】
4. ４．請求項３に記載のプラスミドＤＮＡを調製する方法であって、 前記５′非翻訳領域ならびに１１９４ｂｐおよび１４３個のアミノ酸をもったｃ ＤＮＡのコード領域の一部が制限エンドヌクレアーゼによる開裂によって取り除 かれ、そして、前記３′非翻訳領域およびｃＤＮＡのコード領域の一部もまた制 限エンドヌクレアーゼによる開裂によって取り除かれ、そして、プラスミドにお けるこの遺伝子がバクテリア細胞に導入される、方法。
5. ５．前記バクテリア細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記プラスミドがｐＫＫ２３３−２である、請求項４および５に記載の方法 。
7. ７．前記５′領域およびリーダー配列の開裂のために使用された制限エンドヌク レアーゼが、ＡｖａＩＩである、請求項４から６に記載の方法。
8. ８．前記３′非翻訳領域およびコード領域の一部の開裂に使用された制限エンド ヌクレアーゼが、ＨｉｎｆＩである、請求項４から７に記載の方法。
9. ９．以下のの特性が結び付いた、請求項１に記載のポリペプチドの調製の方法で あって； ａ）ＩＦＮ−ガンマＣ−１０Ｌが請求項３に記載のプラスミドＤＮＡによって発 現され、そして ｂ）うまく発現したバクテリア細胞が壊され、得られた封入体が洗浄により可溶 性のバクテリアタンパク質がない状態にされ、そして ｃ）封入体は変性によって溶液中にもたらされ次に復元工程が行われ、そして ｄ）インターフェロン−ガンマＣ−１０しが精製される、方法。
10. １０．前記ガンマーインターフェロンがバッチ法（陽イオン交換法による）を使 って濃縮され、次にゲル濾過によって高度に精製される、請求項９に記載の方法 。
11. １１．前記バクテリア細胞が機械的方法、例えば超音波によって破壊される、請 求項９および１０に記載の方法。
12. １２．樹脂中に等しく分布するために、陽イオン交換物質をＩＦＮ−ガンマＣ− １０Ｌと一様に接触させ、次に、洗浄されバッチ法で抽出される、請求項９から １１までに記載の方法。
13. １３．一般的に使用される陽イオン交換物質（例えば、ＣＭ−セルロースあるい は【配列があります】が使われる、方法。
14. １４．請求項１に記載のポリペプチドの薬剤における使用。
15. １５．請求項１４に記載の薬剤としての使用。
16. １６．請求項１４および１５に記載のリウマチおよび腎臓癌の処置のための薬剤 としての使用。
17. １７．請求項１に記載のポリペプチドのインビトロ実験、例えばインターフュロ ンレベルの測定、のための精密化成品としての使用。