JPH06503707A - Ｎａｎｂｖ診断法：ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＡＮＢＹ診断法：Ｃ型肝炎ウイルスのスクリーニングに有用なポリヌクレオチ ド技術分野 本発明は非Ａ型、非Ｂ型肝炎ウィルス（ＮＡＮＢＶ）感染の広がりを抑制する物 質および方法論に関する。とりわけ、本発明は非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ ）　、Ｃ型肝炎（ＨＣｖ）ウィルスの病原体、並びに生物学的試料中のＨＣＶ検 出のためのア・ｌセイに有用である、ポリヌクレオチド、およびその類似体に関 する。

本土Ｗ憇 Ｂａｒｒ　ら　（１９８６）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：４２ｇ。

８ｅａｕｃａｇｅ　５し　（１９８１）、　Ｔｅｃｒａヒ１ｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ　、２２二１８５９゜Ｂｏｔｓｔｅｉｎ　（１９７９）、　Ｇｅｎｅ　 ｆｉ：１７゜Ｂｒ１ｎｔｏｎ、　Ｍｌ　（１９８６）　ＴＨＥ　ＶＴＲＵＳＥＳ ：　ＴＨＥ　ＴＯＧＡＶＩＲＩＤＡＥ　ＡＮＤＦＬＡＶＴＶＩＲＩＤＡＥ　（” ｐ）−＊”％’４．−　Ｆｒａｃｎｋ”−ＣＯｎｒａ【ゐｓｔｊＷａｇｎｅｒ。

！１１　Ｌ　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒあ搏°Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｐｌｅ ｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）。

ｐ、３２７−３７４゜ Ｂｒｏａｃｈ　（１９８１）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ＹｅａｓｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｖｏｌ、　１．　ｐ、４４５ ．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｂｒｏａｃｈ　ら　（１９８３）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、１０１：３０７゜Ｂｒｏ ｗｎ　’）　（１９７９）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　 ｆ）ｆｌ：　１０９゜Ｂｙｒｎｅ　５　（１９８８）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ｓＲｅｓ、ｌ：４１６５゜Ｃａ５ｔｌｅ　’７　（１９８６）、　Ｖｉｒｏｌｏ ｇｙ上１ｉ：１０゜Ｃｈａｎｇ　ら　（１９７７）、Ｎａｔｕｒｅ　、ｌｉ：１ ０５６゜Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ら　（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　［ ：５２９４゜Ｃｈｏｏ　ｌ７（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　ｌ＠：３５９゜ Ｃｌｅｗｅｌｌ　ｌ７（１９６９）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、Ｑ：１１５９゜Ｃｌｅｗｅｌｌ　（１９７２）、　Ｊ、　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　■：６６７゜Ｃｏｈｅｎ　（１９７２）、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　ｆＪ！ｌ：２１１０゜Ｃｏｕｓ ｅｎｓ　ら　（１９８７）、Ｇｅｎｅ　、Ｑ：２６５゜Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ら　（ １９８３）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　２２２： １２８゜Ｄｒｅｅｓｍａｎら　（１９８５）、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ ｅａｓｅ　皿ニア６１゜Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅ　Ｓ　（１９８１）、　Ｊ、　Ｉｎ ｆ、　Ｄ包、　止：　５８８゜Ｆｅ１ｎｓｔｏｎｅ　Ｓ　（１９８３）、　Ｉｎ ｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　［：８１６゜Ｆｅ１ｎＳｔＯ ｎｅ、　５．Ｍ、　靜びＨｏｏｆｎａｇｌｅ、　Ｊ、Ｈ，（１９８４）、　Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ。

Ｍｅｄ、　３１１：１８５゜ Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｋｎｉｐｅ　（１９８６）、　ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　Ｖ ＩＲＯＬＯＧＹ　（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、）。

Ｆｊｅ＋、ｓ　ら　（１９７８）、Ｎａｔｕｒｅ　２２１：１１３゜Ｇｅｒｅｔ ｙ、ＲＪ、　ら　、　ＶＩＲＡＬ　ＨＥＰＡＴＩＴＩＳ　ＡＮＤ　ＬｒＶＥＲＤ ＩＳＥＡＳＥ（Ｖｙａｓ、　Ｂ、Ｎ、、　Ｄｉｅｎｓｔａｇ、　Ｊ、Ｌ、　Ｒ・ 褌Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ、　Ｊ、Ｈ，、＆　。

Ｇｒｕｎｅ　ｉ、％　５ｔｒａｔｔｏｎ、　Ｉｎｃ、、　１９８４）　ｐｐ　２ ３−４７゜Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら　（１９８０）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　ｆｉ：４０５７゜Ｇｒａｈａｍ　Ｉｉ　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ　（ １９７８）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　、Ｎ２：５４６゜Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　ａｍ ’　Ｈｏｇｎｅｓｓ　（１９７５）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡコニ３９６１゜ Ｇｒｙｃｈ　’）　（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　北ニア４゜Ｇｕｂｌｅｒ　 Ｘ□Ｔｈ　Ｈｏｆｆｍａｎ　（１９８３）、　Ｇｅｎｅ　ｆｉ：２６３゜Ｈａｈ ｎ　ら　（１９８ｇ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｊｉ：１６７゜Ｈａｎ　（１９８７ ）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、２ｆｌ：１６１７゜Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ 　Ｎ）（１９８１）、　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ 　Ｔ−ＣＥＬＬＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ。

Ｈｅ５ｓ　ｌ７（１９６８）、　Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ　１： １４９゜Ｈｉｎｎｅｎ　ら　（１９７８）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、　７Ｓ：１９２９゜Ｈｉｔｚｅｍａｎら　（１９８０）、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２！！：２０７３゜Ｈｏ１ｌａｎｄ　ら　（１９７８）、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙユｌ：４９００゜Ｈｏ１ｌａｎｄ　（１９８１）、　Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、　ｌｆｉ：　１３８５゜Ｈｏｕｇｈｔｏｎ　Ｓ　（ １９８１）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、９＋２４７Ｈｕｙｎ ｈ、Ｔ、Ｖ、　’）　（１９８５）　ＤＮＡＣＬＯＮＩＮＧＴＥＣＨＮＩＱＵＥ Ｓ；ＡＰＲＡＣｎＣＡＬ　ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｄ、　Ｇｌｏｖｅｒ、ｆ、、　Ｉ ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ。

Ｕ、に、）　ｐｐ、　４９−７８゜ Ｉｍｍｕｎ、　Ｒｅｖ、　（１９８２）、Ｑ：１８５゜Ｉｗａｒｓｏｎ　（１９ ８７）、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊ、　ｚホ：９４６゜Ｋｅｎｎｅ ｔｔ　ら　（１９８０）ＭＯＮＯＣＬＯＮ、八１．メｎ０ＤＩＥｓ。

Ｋｕｏ　ら　（１９８９）、　５ｃｆｅｎｃｅ　２４４：３６２゜Ｋｙｔｅ　Ｊ 、ＩＤｏｏｌｉｔｔｌｅ　（１９８２）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、Ｌ Ｌ２：１０５−１３２゜Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　５　（１９８８）、　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２４１２：２２９゜Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｓ　（１９８２）　Ｍ ＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ；　ＡＭａｔｔｈｅｗｓ　ｉ、１ｉ　Ｋｒ１ｃ ｋａ　（１９８８）、　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、 Ｍ１２：１゜ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ）。

Ｍｉｔｔｌｉｎ　（１９８９）、　０ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ、　盟：１８１９ 、Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９７０）、　Ｎａｔｕｒｅ　２２２．６８０゜Ｌｅｅ　 ら　（１９８８）、５ｃｉｅｎｃｅ　２１２：１２８８゜Ｌｏｈ　う　（１９８ ９）、５ｃｉｅｎｃｅ　；ンＬゴ：２１７゜Ｍａｃｋｏｗら　（１９８７）、　 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５！ｌ：２１７゜Ｍａｙｅｒｘｙ　Ｗａｌｋｅｒ、　！Ｉ ４　（１９８７）、ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮＣＥ ＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ）。

Ｍａｙｕｍｉ　’）　（１９９０）、　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍ ｅｄ、　、ｉ：１６７゜Ｍａｘａｍ　’ｙ　（１９８０）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　盟：４９９゜ＭａｃＮａｍａｒａ　ラ　（１９８ ４）、５ｃｉｅｎｃｅ　２２ｆＬ：１３２５゜Ｍｅｓｓｉｎｇ　”７　（１９８ １）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌ：３０９゜Ｍｅｓｓｉｎｇ 　（１９８３）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ皿：２Ｑ−３ ７゜ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ）。

Ｍｉｃｈｅｌｌｅ　ｌ７１ｎｔ、　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　ＶｉｒａＪ　Ｈ ｅｐａｔｉｔｉｓ。

Ｍｕｒａｋａｗａ　’）　（１９８８）、ＤＮＡ２：２８７゜Ｎａｇａｌｒｕｍ ａ　’）　（１９８４）、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｌ旦ニア４゜Ｎａ ｒａｎｇ　ら　（１９７９）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 　ｇ：９０゜Ｎｅｕｒａｔｈ　ら　（１９８４）、５ｃｉｅｎｃｅ　２２ｉ：３ ９２゜Ｎ１５ｏｎｏｆｆう　（１９８１）、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ。

コ、：３９７−４０６゜ Ｇｖｃｒｂｙ、　ＬＲ，（１９８５）、０ｍ、　ＨｅｐａｔｏＬ　５：４９゜０ ｖｅｒｂｙ、　ＬＲ，（１９８６）、　Ｃｕｒｒ、　Ｈｅｐａｔｏｌ、　６：６ ５゜０ｖｅｒｂｙ、　ＬＲ，（１９８７）、αｔｒｒ、　Ｈｅｐａｔｏｌ、　７ ：３５゜Ｐｅｌｅｇ　（１９６９）、　Ｎａｔｕｒｅ　＝：１９３゜Ｐｆｅｆｆ ｅｒｋｏｒｎＲｍ’　５ｈａｐｉｒｏ　（１９７４）、ＣＯＭＰＲＥＨＥＮＳＩ ＶＥ　ＶＴＲ０ＬＯＧＹ。

Ｖｏｌ、　２　（Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ　＆　Ｗａｇｎｅｒ、　４４ 　、　Ｐｌｅｎｕｍ、　Ｎ、Ｙ、）ｐｐ、　１７１−２３０゜ Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ、Ｍ、　（１９８３）、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　３７：２１７゜＾−―、！！＋ａ（川Ｃ＞ｌｌｌｇｃｒＩＩ（１ ？ＪｕｌｌＩＣ＋１１１ｇＣ１，ｒｌｃｌｌｕｌｌｌｒｌＣ）５７゜ＦＬＡＶＩ ＶＴＲＩＤメ（１三（シリ−７、−４４ｊ　Ｆｒａｅｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔ２ ・Ｈ−Ｗａｇｎｅｒ。

１１（４１Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｃｒ／１７ｕ　Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、　Ｐｌ ｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）１、、　’ｙ　、　’ｔＡｐ、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅ ｓｓ）　ｐｐ、　２２５−２３６゜Ｗａｒｎｅｒ　（１９８４）、　ＤＮＡ　３ ：４０１゜Ｗｕ　（１９８７）、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ　ｖｏｌ　１５５．　ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ　ＤＮへ丑」１１許 米国特許第４．３４１．７６１号 米回持許第４．３９９．１２１号 米回持許東４．４２７．７８３号 米回持許第４．４４４．８８７号 米回持許第４．４６６、９１７号 米回持許第４．４７２．５００号 米回持許第４，４９１，６３２号 米国特許第４，４９３，８９０号 米国特許第４．６８３．２０２号 米回持許第４．４５８．０６６号 米回持許第４．８６８．１０５号 ！ｌ艮歪 非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、伝染性の病気またはウィルスによって誘 発されると考えられる一群の病気であり、公知の肝炎ウィルス、例えばＡ型肝炎 ウィルス（ＨＡＹ）、Ｂ型肝炎ウィルス（）ＩＢＶ）、およびデルタ肝炎ウィル ス（ＨＤＶ）によって引き起こされるもの、並びにサイトメガロウィルス（ＣＭ Ｖ）またはエプスタイン−バーウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）　（ＥＢ Ｙ）に誘発される肝炎等のウィルス関連の肝臓病の他の形態とは識別可能である 。ＮＡＮＢＨは、輸血された個体中で初めて同定された。ヒトからチンパンジー への伝染、およびチンパンジー内での連続継代は、ＮＡＮＢ）ｌが伝染し得る１ つまたは複数の感染因子によるものであるとする証拠となった。

疫学的証拠はＮＡＮＢＨこは３つの型があり得ることを示唆している：水を介し た伝染型；血液または注射針に関連した型；および散発的に生じる（地域的に発 生する）型。しかし、ＮＡＮＢＨの原因となり得る病原体の数は未知数である。

多くのＮＡＮＢＶの候補がある。例えば、Ｐｒ１ｎｃｅ　（１９８３）、Ｆｅ１ ｎｓ　ｔｏｎｅとＨｏｏｆｎａｇｌｅ　（１９８４）、および０ｖｅｒｂｙ　（ １９１１５，１９８６，１９８７）の総説、並びにＩｖａｒｓｏｎ　（１９ｇ？ ）の文献を参照。しかし、これらの候補のいくつかがＮＡＮＢＨの病原体である とする証拠はない。

ＮＡＮＢＶのキャリヤーおよびＮＡＮＢＶに汚染された血液または血液産物をス クリーニングおよび同定する感度のよい特異的方法に対する要求は絶大である。

輸血後肝炎（ＰＴＨ）は輸血された患者の約１０％に生じ、そのうち最高９０％ がＮＡＮＢＨによるものである。この病気の最大の問題点は高頻度で慢性肝臓傷 害に進行する点である（２５−５５％）。

患者の介護、並びに血液および血液産物、またはヒトとの密接な接触によるＮＡ ＮＢＨの伝染の予防には、ＮＡＮＢＩ／関連の核酸、抗原および抗体を検出する ための、信頼し得るスクリーニング、診断および予後の道具が必要とされる。

特異的ポリヌクレオチドをハイブリッドアッセイにより検出する方法は当業者に 公知である。例えば、Ｍａｔ　ｔｈｅｗｓとＫｒ１ｃｋａ　（１９８８）、Ａｎ ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６９：１；　Ｌａｎｄｅｇｒ ｅｎら（１９８８）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２＋２２９；およびＭｉｔｔｌｉｎ 　（１９８９）、ＣＣ１１ｎｉｃａｌｃｈｅ、　３５；１８１９．１９８９年９ 月９日発行の米国特許第４．８６８．１０５号、およびＥＰＯ公報Ｎｏ、　２２ ５８０７　（１９８７年６月１６日発行）参照。

木ｌ匪皇皿丞 ハイブリッド形成による特異的ポリヌクレオチドを単離および／または検出する 方法は、出願人がＨＣＶを発見するまでは、ＨＣＶをスクリーニングするために 用いることが出来なかった。

出願人の発明は、ＰＣＴ公報Ｎｏ、　１０９０／１４４３６および以下に記載さ れているウィルス性ゲノム配列を得るための物質および方法を提供する。

本発明の１つの局面は、■Ｃｖポリヌクレオチドを含有していると思われる分析 物ストランド中のＨＣＶ配列を検出するプロセスであり、そのＨＣＶポリヌクレ オチドは選択された標的領域を包含しており、そのプロセスは以下の工程を包含 する：（ａ）分析物ポリヌクレオチドストランド中のＨＣｖ配列とハイブリダイ ズし得るオリゴマー（１つまたは複数）を提供する工程であり、そのオリゴマー は、１（ＣＶゲノムの以下の領域（図１参照）に相補的であるオリゴヌクレオチ ドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を包含している：　１６−４ ５．４９−７８．８２−１１１．１１５−１４４．１４８−１７７．２１１−２ ４０．２４２−２７１．２７５−３０４．３３２−３６１．３６５−３９４．３ ９８−４２７、および４５７−４８６　；（ｂ）分析物ストランドを（ａ）のオ リゴマー（１つまたは複数）とインキュベートして、特異的ハイブリノド二本鎖 が標的する配列と標的配列との間に形成されることを可能とする工程；および （ｄ）存在するのであれば、標的領域と、オリゴマー（１つまたは複数）との間 に形成されたハイブリッドを検出する工程。

本発明の別の局面は、ＨＣＶポリヌクレオチドを含有していると思われる分析物 ストランド中のＨＣＶ配列を検出するプロセスであり、そのＩＩＩＣＶポリヌク レオチドは選択された標的領域を包含しており、そのプロセスは以下の工程を包 含する：（ａ）　分析物ポリヌクレオチドストランド中のＨＣＶ配列とハイブリ ダイズし得るオリゴマー（１つまたは複数）を提供する工程であり、そのオリゴ マーは、ＨＣｖゲノムの以下の領域（図１参照）に相補的であるオリゴヌクレオ チドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を包含している：　１６− ４５．４９−７８．８２−１１１．１１５−１４４．１４８−１７７．２１１− ２４０．２４２−２７１．２７５−３０４．３３２−３６１．３６５−３９４． ３９８−４２７、および４５７−４８６　；（ｂ）分析物ストランドを（ａ）の オリゴマー（１つまたは複数）とインキュベートして、特異的ハイブリッド二本 鎖が標的する配列と標的配列との間に形成されることを可能とする工程；および （ｄ）存在するのであれば、標的領域と、オリゴマー（１つまたは複数）との間 に形成されたハイブリッドを別のオリゴマー（１つまたは複数）を用いて検出す る工程であり、その別のオリゴマー（１つまたは複数）は、ＨＣＶゲノムの以下 の領域（図１参照）に相補的であるオリゴヌクレオチドからなる群から選択され るポリヌクレオチド配列を包含している：　１６−４５．４９−７８．８２−１ １１．１１５−１４４．１４ｇ−１７７，２１１−２４０，２４２−２７１，２ ７５−３０４，３３２−３６１，３６５−３９４，３９８−４２７、および４５ ７−４８６゜本発明のさらなる別の局面は、ＨＣＶを有さない血液を調製する方 法であり、以下の工程を包含する：（ａ）　ＨＣＶ標的配列を含有すると思われ る血液の試料から分析物核酸を得る工程； （ｂ）存在するのであれば、分析物ポリヌクレオチドストランド中の［ＩＣＶ配 列とハイブリダイズし得るオリゴマー（１つまたは複数）を提供する工程であり 、そのオリゴマーは、ＨＣｖゲノムの以下の領域（図１参照）に相補的であるオ リゴヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を包含してい る：　１６−４５．４９−１８．１１２−１１１．１１５−１４４．１４８−１ ７７．２１１−２４０、２４２−２７１．２７５−３０４．３３２−３６１．３ ６５−３９４．３９８−４２７、および４５７−４８６　； （Ｃ）存在するのであれば、ポリヌクレオチド二本鎖が標的する配列と標的配列 との間に形成されることを可能とする条件下で（ａ）を（ｂ）と反応させる工程 ；（ｄ）存在するのであれば、（ｃ）中で形成された二本鎖を検出する工程；お よび （ｅ）　（ｄ）中で複合体が検出されなかった血液を保存する工程。

本発明のさらなる局面は、ＨＣｖを有さない血液を調製する方法であり、以下の 工程を包含する： （ａ）　ＨＣ’／標的配列を含有すると思われる血液の試料から分析物核酸を得 る工程； （ｂ）存在するのであれば、分析物ポリヌクレオチドストランド中の［ＩＣＶ配 列とハイブリダイズし得るオリゴマー（１つまたは複数）を提供する工程であり 、そのオリゴマーはポリヌクレオチド配列を包含している： （Ｃ）存在するのであれば、ポリヌクレオチド二本鎖が標的する配列と標的配列 との間に形成されることを可能とする条件下で（ａ）を（ｂ）と反応させる工程 ；（ｄ）存在するのであれば、（ｃ）中で形成された二本鎖を、別のオリゴマー （１つまたは複数）を用いて検出する工程であり、その別のオリゴマー（１つま たは複数）はポリヌクレオチド配列を包含している；および （ｅ）　（ｄ）中で複合体が検出されなかった血液を保存する工程。

図面の簡単な説明 図１は、本明細書中に記載のクローンおよびＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４４３６ 号に提示されている集積されたＨＣＶｃＤＮＡ配列由来の、集積されたＨＣＶｃ ＤＮＡ配列を示す。この配列が由来するクローンは、５°−クローン３２、ｂｌ １４ａ、１８ｇ、ａｇ３０ａ、ＣＡ２０５ａ、ＣＡ２９０ａ、ＣＡ２１６ａ、ｐ ｉ１４ａ、ＣＡ１６７ｂ１ＣＡ１５６ｅ、ＣＡ３４ａ、ＣＡ３９ａ、Ｋ９−１　 （ｋｇ−１とも称される）、２６ｊ、１３ｉ、１２ｆ、１４ｉ、ｌｌｂ。

７ｆ、７ｅ、８ｈ、３３ｃ、４０ｂ、３７ｂ、３５．３６．８１．３２．３３ｂ 、２Ｓｃｓ　１４ｃ、８ｆ、３３ｆ、３３ｇ、３９ｅ、３５ｆ、１９ｇ、２６ｇ 、１５ｅ、ｂ５ａ、１６ｊｈ。

６に、およびｐＬ３１ｊｈである。図中、配列の上方の３つの水平ダッシュは、 推定開始メチオニンコドンを示す。さらに図中には、ＨＣＶｃＤＮＡ中にコード された推定ポリタンパク質のアミノ酸配列が示されている。ＨＣＶＩのクローン 化ＤＮＡ中の不均質性は、大きなＯＲＦの推定コード配列の上方に示すアミノ酸 によって示されている。括弧は、その不均質性が、クローン中のＨＣＶｃ　ＤＮ Ａの５°−もしくは３°−末端で、またはその近傍で検出されたことを示す。

図２は、異なる地理的位置（日本および米国）からの５つの異なるＨＣＶ単難物 のＤＮＡ共通配列である。図中、ＨＣｖｌの大きなＯＲＦによってコードされた アミノ酸を、ＤＮＡ配列の上方に示す。

図３は、実施例ＩＩ！で使用される生物試料中のＨＣＶ　ＲＮＡの検出のための 標識プローブの配列を示す。

図４は、図１の番号付けに従い、ＨＣＶＩと図３のプローブとを対応させて並べ たものである。

日る 用語「Ｃ型肝炎つィルスＪ　（ＨＣＶ）は、当業者によって、現在まで不明のＮ ＡＮＢＨの病因物質のために保留されていた。ＨＣＶのプロトタイプ単離物は、 米国特許出願第１２２．７１４号（ＥＰＯ公開第３１８．２１６号も参照のこと ）において同定されている。用語Ｈ（ｙはまた、同じウィルス種の新たな単離物 を包含する。この用語の拡大解釈として、従来血液由来ＮＡＮＢ肝炎（ＢＢ−Ｎ ＡＮＢＨ）と呼ばれていたＨＣＶによって生じる疾患を、Ｃ型肝炎と称する。用 語ＮＡＮＢＨおよびＣ型肝炎は、本明細書中では相互に交換可能である。

ＨＣＶは、その病原性株がＢＢ−ＮＡＮＢＨを引き起こすウィルス種である。Ｈ ＣＶ由来の、弱毒化された株もしくは不完全な干渉性粒子（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ 　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ｐａｒｔｉｃｌｅ）もまた存在し得る。以下に示す ように、ＨＣＶゲノムはＲＮＡにより構成されている。ウィルスを含有するＲＮ Ａが、比較的高い割合の自然突然変異を有すること、即ち、報告によれば、一つ の組み入れられたヌクレオチドに対して１０−３〜１０−４である（Ｆｉｅｌｄ ｓおよびＫｎｉｐｅ（１９８６））ことが知られている。したがって、遺伝子型 の不均質性および流動性がＲＮＡウィルスに固有のものであるために、ＨＣＶＣ 中種中数の株／単離物が存在する。これらの株／単離物は、毒性であり得るか、 あるいは無毒性であり得る。本明細書中に記載の組成物および方法によって、こ れらの種々のＨＣＶ株もしくは単離物の増殖、同定、検出および単離が可能とな る。

ＨＣＶの数個の異なる株／単離物が同定されている（ＰＣＴ公開第Ｗ０９０／１ ４４３６号参照）。一つのこのような株もしくは単離物は・　プロトタイプであ り、ＣＤＣ／ＨＣＶＩ　（ＨＣＶＩとも称される）と命名される。例えば部分ゲ ノム配列などの−つの株もしくは単離物からの情報は、当業者が標準技術を用い て新たな株／単離物を単離し、そのような株／単離物がＨＣｖであるかどうかを 確認できるようにするには十分なものである。例えば、数個の異なる株／単難物 を以下に説明する。

これらの株は、多くのヒト血清から（および異なる地理的領域から）得られ、Ｈ ＣＶＩのゲノム配列からの情報を利用して単離されたものである。

ＰＣＴ公開第Ｗ０９０／１４４３６号に記載の技術を用いて、ＨＣＶＩゲノムＲ ＮＡのゲノム構造およびヌクレオチド配列を推定した。

ゲノムは、１０，０００個までのヌクレオチドを含有する一本鎖ＲＮＡであると 思われる。ゲノムは、プラスストランドを有しており、かつ連続した翻訳オープ ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。このＯＲＦは、約３．０００個の アミノ酸のポリタンパク質をコードする。ＯＲＦ中では、１個または複数の構造 タンパク質が、非構造タンパク質に関連する大部分のポリタンパク質と共に、Ｎ −末端領域の最初の約４分の１中にコードされると思われる。全ての既知のウィ ルス配列と比較すると、低いものではあるが有意の共直線的相同性が、ワラビウ イルスファミリーの非構造タンパク質およびベスチウイルス（現在はワラビウイ ルスファミリーの一部と考えられている）に見られる。

フラビウイルスポリタンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端までに、ヌク レオキャプシドタンパク質（Ｃ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、エンベロー プタンパク’ｌ　（Ｅ）、ならびに非構造タンパク質（ＮＳ）１．２　（ａ＋ｂ ）、３．４　（ａ＋ｂ）および５を含有する。ＨＣＶＩのヌクレオチド配列中に コードされた推定アミノ酸から判断すると、ＨＣＶポリタンパク質のＮ−末端の 最端部の小さいドメインは、サイズおよび高い塩基性残基含有量の双方において 、ワラビウィルスポリタンパク質のＮ−末端に見られるヌクレオキャプシドタン パク質（Ｃ）に類似していると思われる。ＨＣＶおよび黄熱病ウィルス（ＹＦＶ ）の非構造タンパク質２．３．４および５（ＮＳ２〜５）は、各アミノ酸配列の 相違はあるものの、類似のサイズおよびバイトロバシティ−を持つ、相互に対応 する部分を有していると思われる。しかし、Ｍ、ＥおよびＮＳＩタンパク質を含 有するＹＦＶポリタンパク質の各領域に対応するＨＣＶの領域は、配列の違いを 呈するだけではなく、サイズおよびバイトロバシティ−の双方においても非常に 異なっていると思われる。したがって、ＨＣＶゲノムの特定のドメインは、本明 細書中で例えばＮＳＩもしくはＮＳ２と称され得るが、これらの命名は推論的な ものであり、ＨＣｖファミリーとフラビウイルスとの間にまだ認められていない かなりの相違点があり得ることに留意すべきである。

ＨＣＶの異なる株、単離物もしくは亜種（５ｕｂｔｙｐｅ）は、ＨＣｖｌと比較 して、アミノ酸および核酸に相違があると予想される。多くの単離物は、ＨＣＶ Ｉと比較して、全アミノ酸配列中に高い（即ち約４０％を越える）相同性を有す ると予想される。しかし、より低い相同性を有する他のＨＣｖ単離物が存在する こともまた判明し得る。これらのＨＣＶ単離物は、種々の基準に従ってＨＣＶと 定義される。これらの基準とは、例えば、ＨＣＶＩと類似のサイズのポリタンパ ク質をコードする、約９，０００個〜約１２，０００個のヌクレオチドのＯＲＦ 、ＨＣｖｌに類似の疎水性および／もしくは抗原性を有するコードされたポリタ ンパク質、ならびにＨＣＶＩに保存されている共直線ペプチド配列の存在である 。さらに、ゲノムはプラスストランドＲＮＡであると考えらルる。

全てのＨＣＶ単離物は、本明細書中に記載のＨＣＶｃＤＮＡ中にコードされるエ ピトープを用いて免疫学的に同定可能である（即ちこれに対して免疫学的に交差 反応性を有する）少なくとも一つのエピトープをコードする。好ましくは、この エピトープは、本明細書中に記載のアミノ酸配列中に含有され、かつ従来知られ ている病原体と比較した場合にＨＣＶに固有のものである。エピトープの固有性 は、抗ＨＣＶ抗体との免疫学的反応性を持つこと、および既知の病原体に対する 抗体との免疫学的反応性を持たないことによって決定され得る。

ＨＣＶ株および単離物は、進化論的に関連している。したがって、ヌクレオチド レベルでのゲノムの全相同性は、約４０％以上である可能性があり、おそら（は 約５０％以上、おそらくは約６０％以上、そしてさらにおそらくは約８０％以上 であること；および、これに加えて、少なくとも約１３個のヌクレオチドの対応 する連続配列があることが予想される。ＨＣＶゲノム内に可変領域および高頻度 可変領域があり、そのために、これらの領域における相同性は全ゲノム中の相同 性よりもかなり低いと予想されることに留意すべきである。推定ＨＣＶ株ゲノム 配列と、例えばＣＤＣ／ＨＣＶＩ　ｃＤＮＡ配列との対応は、当該分野で既知の 技術によって決定され得る。例えば、これらの対応は、推定ＨＣＶからのポリヌ クレオチドの配列情報と本明細書中に記載の一つもしくは複数のＨＣＶｃＤＮＡ 配列とを直接比較することによって決定され得る。これらの対応はまた、相同領 域間で安定した二本鎖（例えばＳ＋？ｇＩ化の前に使用されるもの）を形成する ような条件下でポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行い、次いで一つ もしくは複数の一本鎖ＲＮＡヌクレアーゼを用いて消化を行い、そして消化され たフラグメントのサイズ決定を行うことによっても決定され得る。

ＨＣＶの株もしくは単離物に進化論的関係が存在するために、推定ＨＣＶ株もし くは単離物は、ポリペプチドレベルでのこれらの相同性によって同定可能である 。一般に、ＨＣＶ株もしくは単離物は、少なくとも４０％の相同性、約５０％を 超える相同性、おそらくは約７０％を超える相同性、そしてさらにおそら（は約 ８０％を超える相同性を有すると予想され、ポリペプチドレベルで約９０％の相 同性を有するものさえあり得る。

アミノ酸配列相同性を決定する技術は当該分野で既知のものである。例えば、ア ミノ酸配列を、直接決定し、本明細書中に提供される各配列と比較し得る。ある いは、推定ＨＣＶのゲノム物質のヌクレオチド配列を（通常ｃＤＮＡ中間体を介 して）決定し得る。そしてこの配列中にコードされる推定アミノ酸配列を決定し 、対応する各領域を比較することができる。

本明細書中に使用する、指定された配列「由来の」ポリヌクレオチドとは、指定 されたヌクレオチド配列のある領域に対応する、少なくとも約６個、好ましくは 少なくとも約８個、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個、そしてさらに好 ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチドの配列により構成されたポリ ヌクレオチド配列を言う。「対応する」は、指定された配列に相同であるかもし くは相補的であることを意味する。好ましくは、ポリヌクレオチドが由来する領 域の配列は、あるＨＣＶゲノムに固有の配列に対して相同であるかもしくは相補 的である。より好ましくは、由来した配列は、全ての、もしくは大部分のＨＣＶ 単離物に固有の配列に対して相同であるか、もしくは相補的である。ある配列が ＨＣＶゲノムに固有であるかどうかは、当業者に既知の技術によって決定され得 る。例えば、配列を、データバンク、例えばＧｅｎｅｂａｎｋ中の各配列と比較 することにより、感染していない宿主もしくは他の生物中にこの配列が存在する かどうかを決定し得る。配列を、他のウィルス性物質の既知の配列、およびフラ ピウィル科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーと比較することもできる。

これらの他のウィルス性物質には、例えばＨＡＶ。

ＨＢＶおよびＨＤＶなどの、肝炎を誘導することが知られているものが含まれる 。由来した配列の、他の配列に対する対応あるいは非対応もまた、適切な緊縮条 件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）下でハイブリダイゼーションを行うことによって決 定され得る。

核酸配列の相補性を決定するためのハイブリダイゼーション技術は当該分野で既 知のものであり、以下に説明する。例えばＭａｎｉａｔｉｓら（１９ｇ２）　も また参照のこと。さらに、ハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖ポリ ヌクレオチドのミスマツチを、既知の技術により決定することができる。この既 知の技術には、例えば、二本鎖ポリヌクレオチド中の一本鎖領域を特異的に消化 する８１などのヌクレアーゼを用いた消化が含まれる。典型的なりＮＡ配列が「 由来」し得る領域には、限定はされないが、例えば、特異的なエピトープをコー ドする領域、ならびに転写されない領域および／または翻訳されない領域が含ま れる。

誘導されたポリヌクレオチドは物理的には示したヌクレオチド配列由来である必 要はなく、例えば、化学合成もしくはＤＮＡ複製、または逆転写もしくは順転写 を含むどのような方法でも生成され得る。加えて、指定した配列の領域に対応す る領域の組み合わせは、意図する使用法と一致するように当業者に公知の方法で 改変され得る。

本明細書で用いる用語「組換えポリヌクレオチド」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合 成、または合成にもとずくポリヌクレオチドを意味するものであり、それは元々 、または操作によって＝（１）自然界では関連のあるポリヌクレオチドの全てま たは一部分と関連しない、（２）自然界では連結するポリヌクレオチド以外のポ リスクレオチドと連結する、（３）自然界では生じない、ものである。

本明細書で用いる用語「ポリヌクレオチド」は、どのような長さであれ、リボヌ クレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合形 態を指す。この用語は分子の第一次構造のみを指す。よって、この用語は二重鎖 および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡを含む。それはまた以下のものを含む：改変 体の公知の型、例えば当業者に公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つまた はそれ以上の自然に生じるヌクレオチドの類似体による置換１、例えば非荷電結 合（Ｕｎｃｈａｒｇｅｄ　ｌｉｎｋａｇｅ）例えば、メチルホスホネート、ホス ホトリプ：ステル、ホスホアミデート、カルバミン酸塩等）および荷電結合（ｃ ｈａｒｇｅｄ　ｌｉｎｋａｇｅ）　（例えば、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐ ｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉ 　ｔｈｉｏａｔｅｓ）等）などのインターヌクレオチド修飾を有するもの、例え ばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポ リーＬ−リジン等を含む）のような付属部位を含有するもの、挿入物を有するも の（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤を含有するものく例えば、 金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）、アルキル剤を含有するもの、改変さ れた結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸等）、並びにポリヌクレ オチドの非改変形態。

本明細書で用いる核酸の「センスストランド」は、ｖＡＲＮＡの配列に対して配 列相同を有する配列を含有する。「センスストランド」は、「センスストランド 」の配列に相補的である配列を含有する。

本明細書で用いるウィルスの「ポジティブストランドゲノム」は、ＲＮＡまたは ＤＮＡであれ、ゲノムポリヌクレオチドであり、少なくとも１つのウィルス性ポ リペプチドをコードする。

ポジティブストランドＲＮＡウィルスの例としては、トガウィルス科（Ｔｏｇａ ｖａｒｉｄａｅ）、コロナウィルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）　。

レトロウィルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）　、ピコルナウィルス科（Ｐｉ ｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、およびカリシウィルス科（Ｃａｌｉｅｉｖｉｒｉ ｄａｅ）が挙げられる。さらに以前はトガウィルス科として分類されていたワラ ビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）が含まれる。これらのウィルスは典 型的には一本鎖である。Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｋｎｉｐｅ（１９８６）参照。

本明細書で用いる用語「プライマー」は適切な条件下におくとポリヌクレオチド ストランドの合成の開始点として作用し得るオリゴマーを指す。プライマーはコ ピーされるポリヌクレオチドストランドの領域に完全にまたは実質的に相補的で ある。よって、ハイブリッド形成を促進する条件下では、プライマーは分析物ス トランドの相補的領域にアニールされる。適切な反応物（例えば、ポリメラーゼ 、ヌクレオチド−３−リン酸塩等）を添加することにより、プライマーは分析物 ストランドのコピーを形成する重合剤により拡張される。プライマーは一本鎖、 あるいは部分的にまたは完全に二重鎖であり得る。

用語「分析物ポリヌクレオチド」および「分析物ストランド」は、標的配列を含 有していると思われる、また生物学的試料中に存在し得る、一本鎖または二重鎖 の核酸分子を指す。

本明細書で用いる用語「オリゴマー」はプライマーおよびプローブを指す。用語 オリゴマーは、分子のサイズを示唆しない。しかし、典型的オリゴマーは全長１ ０００ヌクレオチド未満であり、より典型的には５００ヌクレオチド未満であり 、さらにより典型的には２５０ヌクレオチド未満であり；それらは１００ヌクレ オチド未満であり得、また７５ヌクレオチド未満であり得、さらには５０ヌクレ オチド未満でもあり得る。

本明細書で用いる用語「プローブ」は、標的配列とハイブリッド構造を形成する ポリヌクレオチドを包含する構造を指す。プローブ中の少なくとも１つの配列が 標的領域の配列と相補的である。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、 および／またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチド類似体から構成され得 る。プローブの中には、「捕獲プローブ」および「標識プローブ」が含まれる。

好ましくは、プローブはポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を開示す るために用いられる配列（１つまたは複数）に相補的である配列を含有しない。

本明細書で用いる用語「標的領域」は増幅および／または検出される核酸の領域 を指す。用語「標的配列」はプローブまたはプライマーが所望の条件下で安定し たハイブリッドを形成するための配列を指す。

本明細書で用いる用語「捕獲プローブ」は、結合パートナ−に共役した一本鎖ポ リヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを指す。一本鎖ポリヌクレオチドは、 分析物ポリヌクレオチド中で検出される標的領域中の標的配列に相補的である、 標的するポリヌクレオチド配列を包含する。この相補的領域は、分析物ポリヌク レオチドを固体表面に（結合パートナ−を介して）固定するに十分な安定性を二 本鎖に付与するに十分な長さであり、かつ標的配列に十分に相補的である。結合 パートナ−は第２結合パートナーに特異的であり；第２結合ハードナーは固体支 持体の表面に結合し得るか、または結合パートナ−の他の構造を介して間接的に 固体支持体に連結し得る。

本明細書で用いる用語「標的するポリヌクレオチド配列」とは、標的ヌクレオチ ド配列に相補的であるヌクレオチドを包含するポリヌクレオチド配列を指し；そ の配列は意図する目的のために十分な安定性を有する二本鎖を形成するに十分な 長さであり、かつ標的配列に十分に相補的である。

本明細書で用いる用語「結合パートナ−」とは、高い特異性を有するリガンド分 子を結合し得る分子を指し、例えば、抗原およびそれに特異的である抗体を指す 。一般的には、特異的結合パートナ−は、単離条件下で分析物コピー／相補的ス トランド二本鎖（捕獲プローブの場合）を固定するに十分な親和力で結合せねば ならない。特異的結合パートナ−は、当業者に公知であり、また例えば、ピオチ ンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロティンＡなどの 、多くの既知の受容体−リガントの対、および相補的ポリヌクレオチドストラン ドを含む。相補的ポリヌクレオチド結合パートナ−の場合には、パートナ−は通 学生なくとも約１５塩基の長さであり、少なくとも４０塩基の長さでもあり得； 加えて、少なくとも約４０％、および約６０％のＧおよびＣを含有している。

ポリヌクレオチドはＤＮＡ、　ＲＩＪＡ、　または合成ヌクレオチド類似体から 構成され得る。

本明細書で用いる用語「共役した」は、共有結合または強力な非共有相互作用（ 例えば、疎水性相互作用、水素結合等）による付着を指す。共有結合は、例えば 、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫 黄結合、炭素−リン結合等であり得る。

（以下余白） 用語「支持体」は、所望される結合パートナ−が固定され得る、すべての固体ま たは半固体の表面を示す。適切な支持体は、ガラス、プラスチック、金属、ポリ マーゲルなどを含み、ビーズ、ウェル、ディツプスティック、薄膜などの形状を とり得る。

本明細書で使用される用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量可能な）信 号を提供するために使用され得る、そしてポリヌクレオチドまたはポリペプチド に連結され得る、すべての原子または成分を示す。

本明細書で使用される用語「標識プローブ」は、分析物ポリヌクレオチド内で検 出される標的配列に対して相補的な標的する（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ポリヌクレ オチド配列を含む、オリゴマーを示す。この相補領域は、この標識によって検出 される「標識プローブ」および「標的配列」を含む二重鎖を生じるための十分な 長さであり、十分相補的である。このオリゴマーは、相互に高度な特異性を持つ 一組のリガンド分子を介して直接的または間接的に標識に結合される。高度な特 異性のリガンド分子の組は、上述されており、多量体を含む。

本明細書で使用される用語「多量体」は、同じ繰り返しの一本鎖のポリヌクレオ チドユニットまたは異なる一本鎖のポリヌクレオチドユニットの直鎖または分枝 ポリマーを示す。

少なくとも一つのユニットは、このユニットを対象の最初の一本鎖のヌクレオチ ド配列に特異的にハイブリダイズすることができる、配列、長さおよび構成を有 し、典型的には分析物または分析物に結合されたオリゴマー（例えば、標識プロ ーブ）である。このような特異性および安定性を達成するために、このユニット は、通常は少なくとも長さが約１５のヌクレオチド、典型的には長さが約５０未 満のヌクレオチドであり、好ましくは長さが約３０のヌクレオチドである；さら に、ＧｓおよびＣｓ含量は、通常少なくとも約４０％であり、多く見ても約６０ ％である。そのようなユニットに加えて、この多量体は、特異的におよび安定し て対象の典型的には標識されたポリヌクレオチドまたは別の多量体である、第２ の一本鎖のヌクレオチドにハイブリダイズし得る多（のユニットを有している。

これらのユニットは、一般的に上述の多量体とほぼ同じ大きさおよび構成である 。ある多量体が別の多量体にハイブリダイズされるように設計される場合、第１ および第２のオリゴスクレオチドユニットは異種（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）であり 、選択されたアッセイの条件下では互いにハイブリダイズしない。このように、 多量体は、標識プローブであり得、またはこのプローブに標識を結合するリガン ドであり得る。

本明細書で使用される用語「ウィルス性ＲＮＡＪは、ＨＣＶ　ＲＮＡを含み、ウ ィルス性ゲノム由来のＲＮＡ、そのフラグメント、その転写物、およびそれに由 来した突然変異配列を示す。

本明細書で使用される「生物学的サンプル」は、個体から単離された組織または 液体のサンプルを示す。例えば下記のものが含まれるが、これらに限定されない ：血漿、血清、骨髄液、リンパ液、皮膚の外部組織、呼吸器、腸、および尿生殖 器管、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、組織、およびインビトロ細胞培養成分 のサンプル（細胞培養培地において、細胞の増殖の結果得られた、ウィルス感染 されたと推定される細胞、組換え細胞、および細胞成分の調整培地を含むがこれ らに限定されない）。

ｌ囲旦記五 本発明の実施では、特別に指示されない限り、当業者に公知の、化学、分子生物 学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術が使用される。そのよう な技術は、文献に十分に記載されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｉｔ ｓｃｈおよびＳａｍｂｒ。

ｏｋによる、　−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（１９ｇ２）；　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、第１および 第１１巻（Ｄ、Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）　；０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ ｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（Ｍ、Ｊ、　Ｇａｌｔ編、　１９８４）：　Ｎｕｃ ｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　（Ｂ、Ｄ、　Ｈａ＋＊ｅｓお よびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）のシリーズ、特 に第１５４巻および第１５５巻（ＮｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編）。本明細書で （上記および下記）示したすべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書 に参考として援用される。

本発明の有用物質および方法は、ＢＢ−ＮＡＮＢＶの病原因子としてＩ（ＣＶを 同定することにより、およびＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡライブラリー から単離されたヌクレオチド配列のファミリーを準備することにより、可能にな る。これらのｃＤＮＡライブラリーは、ＨＣ’／感染したチンパンジーの血漿中 に存在する核酸配列に由来した。これらのライブラリー（”Ｃ”ライブラリー（ ＡＴＣＣ４０３９４号））の１つを構築物は、ＰＣＴ公開第Ｗ０９０／１４４３ ６号に記載されている。

本明細書に記載されているように上述の）ＩｃＶ　ｃＤＮＡ配列を使用して、生 物学的サンプル中のウィルス性ポリヌクレオチドを検出する試薬として有用なオ リゴマーが構築され得る。例えばこの配列から、例えば、ドナー血液、血液フラ クション、ウィルスを宿している疑いのある患者の血清、またはウィルスが復製 している細胞培養システム中の、ＨＣＶ　ＲＮＡの存在を検出するためのハイブ リダイゼーションプローブとして有用な約８−１０　（またはそれより大きい） ヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーを合成することができる。さらに、本明細書に 記載されている新規のオリゴマーは、Ｉ（ＣＶゲノムのさらなる特徴付けを可能 にする。これらの配列に由来するポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは 、ｃＤＮＡライブラリー中に存在する配列を増幅するために、および／または別 の重複するｃＤＮＡ配列のｅＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、 使用され得、これはまた、より多くの重複している配列を得るために使用され得 る。ＰＣＴ公開第Ｗ０９０／１４４３６号に示されているように、ＨＣＶのゲノ ムは、大きなタンパク質をコードする大きな読み取り枠（ＯＲＦ）を第１に含む ＲＮＡであるようだ。

上記に加えて、下記に記載する情報は、別のＨＣＶ株または単離体の同定を可能 にする。別のＨＣＶ株または単離体の単離および特徴付けは、例えば、ウィルス 粒子および／またはウィルスＲＮＡを有する生体成分から核酸を単離し、ＨＣＶ １配列に基づくオリゴマーを使用してｃＤＮＡライブラリーを形成し、そして下 記に記載するＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を有するクローンのライブラリーをスクリー ニングするために、新規の単離体からのＨＣｖｅＤＮＡとＰＣＴ公報第ＷＯ９０ ／１４４３６号および下記に記載されたｃＤＮＡとを比較することにより、達成 される。定義の項目（上述）で述べた、ＨＣＶのパラメーター内に収まる株およ び単離体は、容易に同定可能である。当業者にとっては、ここに提供される情報 に基づいて、ＨＣＶ株を同定する他の方法は自明である。

ＨＣＶ　ｃＤＮＡ　ｌの 本発明のオリゴマーは、ＨＣｖポリヌクレオチド中の標的配列とハイブリッド二 本鎖構造を形成する領域を有する。オリゴマーの■ｃＶポリヌクレオチドとハイ ブリダイズする領域は、本明細書で提供され、そしてＰＣＴ公報第ＷＯ９０／１ ４４３６号に記載されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列から確定され得る。ＨＣＶＩ　（ プロトタイプＨＣＶ）からのＨＣＶ　ｃＤＮＡの構成を、図１に表す。この構成 の配列は、ラムダｇｔ１ｔ（λｇｔｌｌ）（ＡＴＣＣ第４０３９４号）中に存在 する”Ｃ”ライブラリーを含むいくつかのＨＣＶ　ｃＤＮＡライブラリーおよび ヒト血清から単離した、いくつかのＨＣｖｃＤＮＡクローンに由来する配列情報 に基づいている。このＨＣＶ　ｃＤＮＡクローンは、ＰＣＴ公報第Ｗ０９０／１ ４４３６号に記載の方法によって単離した。藺潔に述べると、単離された多くの クローンは、慢性のＨＣｖ感染を有し、高力価のウィルスを有する、チンパンジ ー（即ち、少なくとも１０６チンハンシー感染量／　ｍ　ｌ　（ＣＩＤ／ｍ１） ）からのプールされた血清を使用して構築されたＨＣＶ　ｃＤＮＡ″Ｃ°ライブ ラリーからの配列を有していた。プールされた血清を、ウィルス粒子を単離する ために使用した；これらの粒子から単離された核酸を、ウィルスのゲノムのｃＤ ＮＡライブラリーの構築のテンプレートとして使用した。最初のクローン５−ｔ −ｉが、感染した個体からの血清を用いて”Ｃ”ライブラリーをスクリーニング することによって得られた。最初のクローンの単離の後、残りの配列を、合成ヌ クレオチドプローブでスクリーニングして得た。この配列は、公知のＨＣＶ　ｃ ＤＮＡ配列の５゛−領域および３°−領域に由来していた。

ｃＤＮＡ配列を回収するための方法の記述の多くは、古くからの関心事である。

得られた配列（およびその相補物）が本明細書で提供され、そしてその配列また はそのすべての部分は、合成法により、またはＰＣＴ公報第ＷＯ９０／１４４３ ６号に記載の方法と同様の方法を用いる配列の一部の回収をする合成方法の組み 合わせによって、調製され得る。

第１ゴマ−プローブおよびプライマー 基本としては■Ｃｖゲノム（図１に示されている）、および／または、好ましく はＦＩＣＶゲノムの保存領域を用いて、約８ヌクレオチド以上のオリゴマーが調 製され得、これはＨＣＶ　ＲＮＡのプラスストランドあるいはその相補体および ＨＣＶ　ｃＤＮＡに対する相補体にハイブリダイズする。これらのオリゴマーは 、ＨＣＶヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの検出用プローブ（単離およ び／または標識を含む）、および／または標的■ｃｖ配列の転写および／または 複製用プライマーとして機能し得る。

このオリゴマーは、標的するポリヌクレオチド配列を含んでいて、標的１’ｌＣ Ｖヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチドを含んでいる。この配列は、意図す る目的に対して十分な安定性を有する２本鎖を形成するために、十分な長さを有 し、ＨＣＶ配列に相補的である。例えば、目的が、標的ＨＣＶ配列を含む分析物 の固定化による単離である場合には、このオリゴマーは、単離条件において、分 析物のこのオリゴマーへの結合にょる固相への固定化に対して十分に安定な２本 鎖を形成するために十分な長さを有し、標的ＨＣＶ配列に相補的であるポリヌク レオチド領域を含む。さらに、例えば、分析物ポリヌクレオチドの標的ＨＣＶ配 列の転写および／または複製用のプライマーとして機能する場合には、このオリ ゴマーは、重合条件化において、標的配列との安定な２本鎖形態であるプライマ ーからの複製を継続させる重合剤となり得る、十分な長さのポリヌクレオチド領 域および標的ＨＣＶ配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を含む。さらに、 例えば、このオリゴマーが標識プローブとして使用されるか、あるいは多量体に 結合される場合には、標的するポリヌクレオチド領域は、この標識プローブおよ び／または多量体と安定なハイブリッド２本鎖構造を形成しそしてこの２本鎖を 検出するのに、十分な長さを有しそして相補的である。このオリゴマーは、標的 ＨＣＶ配列に相補的である少なくとも約４個の連続ヌクレオチドを含み得、通常 はこのオリゴマーは、標的ＨＣＶ配列に相補的である少なくとも約８個の連続ヌ クレオチドを含み、好ましくは、標的ＨＣＶ配列に相補的な少なくとも約１４個 の連続ヌクレオチドを含む。

ＨＣＶヌクレオチドを標的する適切な配列は、図１に示されているＨＣＶｃＤＮ Ａヌクレオチドから選択される相補的なヌクレオチドであるヌクレオチドからな り得る。

しかしながら、このオリゴマーは、標的ＨＣｖ配列に相補的な配列のみから構成 される必要はない。このオリゴマーが使用される目的に適しているヌクレオチド 配列あるいは他の部分も付加的に含み得る。例えば、このオリゴマーがＰＣＲに よる■Ｃｖ配列の増幅プライマーとして使用される場合には、２本鎖であれば、 増幅される配列のクローニングを容易にする制限酵素部位を形成する配列を含み 得る。さらに、例えば、このオリゴマーがハイブリダイゼーションアッセイ（下 記に記載されている）における「捕獲プローブ」として使用される場合には、標 的１（ＣＶ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴマーとカップリングす る結合パートナ−をさらに含む。このオリゴマーが含むかあるいはカップリング し得る有用な部分あるいは配列の他のものは、ヌクレオチドプローブの標識を含 む種々の目的に適することが当業者には公知であるものである。

オリゴマーの調製は、当業者には公知の手段、例えば切り出し、転写、あるいは 化学合成を含む方法による。オリゴマーの標的するポリヌクレオチド配列が相補 的であるように選択されるゲノムの標的配列および／または領域はその目的に依 存する。例えば、目的が生物学的試料（例えば、血液）中の１（ＣＶの存在をス クリーニングすることである場合には、好ましいオリゴマーは、プローブおよび ／またはプライマーとして使用され、■Ｃｖゲノムの保存領域にハイブリダイズ する。オリゴマーが結合し得るｔｌｃＶゲノムの保存領域のいくつかは、本明細 書に開示されている。例えば、図１に示されているヌクレオチド番号がほぼ５末 端から約２００、あるいは約４０００から５０００、あるいは約８０００から約 ９０４０、好ましくは、約−３１８から約１７４、約４０５６から約４４４８、 および約４３７８から約４９０２である。特に好ましいプライマーおよびプロー ブは、図１に示されているヌクレオチド約−３１３から−１７３、および約１か ら約５４０である。

保存されているゲノムの他の領域は、プロトタイプＨＣＶすなわちＨＣＶＩを含 む種々のＨＣＶ単離物のヌクレオチド配列との比較によって容易に確認できる。

保存領域と非保存領域とを決定する遺伝子型間の比較を行う方法は、当分野では 公知であって、ＰＣＴ公開第１ｆ０９０／１４４３６号に開示されている。

基本的な核酸のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、１本鎖の分析物核酸 （、ＤＮＡあるいはＲＮＡ）は、核酸プローブとハイブリダイズし、得られた２ 本鎖が検出される。ＨＣＶポリヌクレオチド（未変性あるいは誘導体の）に対す るプローブは、ハイブリダイゼーシヨンにより独特のウィルス配列の検出をなし 得る長さである。６−８ヌクレオチドが機能し得る長さであるが、１０−２０ヌ クレオチドの配列が好ましく、約２０ヌクレオチド以上が適している。望ましく は、これらの配列は異質性を欠く領域由来である。これらのプローブは自動オリ ゴヌクレトチド合成法を含む所定の方法によって調製され得る。

有用なプローブのうちには、例えば、本明細書に開示の新たに単離されたクロー ン由来のもの、および下記に示すｃＤＮＡライブラリーのプローブに有用なオリ ゴマーがある。ＨＣ’／ゲノムの任意の特徴的な部分に対しての相補体が適して いる。プローブとしの使用に対しては、フラグメントの長さが増すと不必要であ り得るが、完全な相補性が必要である。

ＦＩＣＶポリヌクレオチドの存在の検出（例えば、夾雑血液のスクリーニングに おいて）物質としてこのようなプローブを使用するためには、分析されるべき生 物学的試料、例えば血液るいは血清は、必要であればそれに含有される核酸を抽 出するために処理され得る。試料から得られた核酸はゲル電気泳動あるいは他の サイズ分離法に供する。あるいは核酸試料は、サイズ分離を行わずにドツトプロ ティングされ得る。プローブの標的する配列とのハイブリッド２本鎖を形成する ために、分析物核酸の標的領域は、１本鎖の形状にあるべきである。

配列がもともと１本鎖の形状である場合は、変性は必要とされない。しかしなが ら、配列が２本鎖の形状である場合には、変性される。変性は、当分野には公知 の種々の方法によって行われ得る。変性に続いて、分析物核酸およびプローブは 、プローブ中の標的配列と分析物中の推定標的配列との安定なハイブリッド形成 を促進する条件化で、インキュベートされ、そしてそのプローブを含む得られた ２本鎖が検出される。

得られた２本鎖の検出は、いずれにせよ通常は標識プローブの使用によって完成 される。あるいは、プローブは標識されていなくても、標識されたリガンドと、 直接あるいは間接的に特異的に結合することによって検出され得る。適切な標識 ならびにプローブおよびリガンドを標識する方法は、当分野では公知であって、 例えば、公知の方法（例えば、ニックトランスレージ３ンあるいはキナーゼ処理 ）により取り込まれる放射標識、ビオチン、蛍光基、ケミルミネッセンス基（例 えば、ジオキセタン類、特にトリガジオキセタン類）、酵素、抗体などが含まれ る。

分析物への結合に使用されるプローブの領域は、ＨＣＶゲノムに完全に相補的に され得る。従って、通常高度の緊縮条件が偽陽性を避けるために必要とされる。

しかし、高度の緊縮条件は、プローブが、異質性を欠（ウィルスゲノムの領域に 相補的である場合にのみ使用されるべきである。ハイブリダイゼーションの緊縮 さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度を含むハイブリ ダイゼーションおよび洗浄工程中の多くの因子により決定される。これらの因子 は、例えば、Ｔ、　Ｍａｎｉｎａｔｉｓ　（１９８２）に概略されている。

外来物質から検出されるべき２本鎖の分離を容易にする、および／あるいは標識 部分からのシグナルを増幅する方法を含む、当分野に公知の基本的な方法の変法 がまた使用され得る。これらの変法の多（が、例えば、Ｍａｔｔｈｅｖｓおよび Ｋｒ１ｃｋａ（１９８８）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６９：１；　Ｌａｎ ｄｅｇｒｅｎら（１９８８）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：２２９：　およびＭｉ ｔｔｌｉｎ　（１９８９）、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　３５：１８１９にレビ ューされている。これらのアッセイにおける■Ｃｖ検出に適切なプローブは、標 的ＨＣＶポリヌクレオチド配列とハイブリダイズして分析物ストランドと２本鎖 を形成する配列から構成される。この２本鎖は特定のアッセイシステムにおいて の検出に対して十分に安定である。

適切な変法は、例えば、１９８９年９月９日発行の米国特許第４゜８６８、１０ ５号およびＥ、　Ｐ、　Ｏ，公開第２２５８０７号（１９８７年６月１６日公開 ）に記載されている。これらの公表には、分析物核酸が標識プローブセットおよ び捕獲プローブセットにハイブリダイズされる、液相核酸ハイブリダイゼーショ ンアッセイが開示されティる。プローブ分析物複合体は、捕獲プローブセットに 相補的な、固相に支持された捕獲プローブとハイブリダイズすることによってカ ップリングされる。このことで、分析物核酸は固相複合体として溶液から除去さ れる。分析物が固相複合体の形態であればアッセイにおいて次の分離工程を促進 する。この標識プローブセットは、ハイブリダイゼーシヨンによって結合されて 固相／分析物複合体にされる標識プローブに相補的である。

一般に、ＨＣｖゲノム配列は、感染した個体の血清中に比較的低いレベル、すな わち、１ミリリットル当り１０２−１０３チンパンジー感染投与量（ＣＩＤ）で 存在する。このレベルは、ノ＼イブリダイゼーシコンアッセイにおいて、増幅技 術が使用されることを必要とされ得る。このような技術は、当業者には周知であ る。例えば、Ｅｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの ＋Ｂｉｏ−Ｂｒｉｄｇｅ”システムは、未修飾３−ポリーｄＴ−テールをＤＮＡ プローブに添加するために、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラー ゼを使用する。ポリｄＴ−テールプローブは、標的ヌクレオチド配列にハイブリ ダイズされ、その後、ビオチン修飾ポリ−Ａにハイブリダイズされる。ＰＣＴ公 開第ＷＯＩＩ４１０３５２０号および欧州特許出願公開第１２４２２１号は、Ｄ ＮＡハイブリダイゼーシコンアノセイについて記載し、そこにおいて、（１）分 析物は、酵素標識オリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖ＤＮＡプローブにアニー ルされ、且つ、（２）得られたテール付き二本鎖は、酵素標本オリゴヌクレオチ ドＣ；ハイブリダイズされる。欧州特許出願公開第２０４５１０号は、分析物Ｄ ＮＡが、ポリーｄＴテールのようなテールを有するプローブ、および、ポリーＡ 配列のような、プローブのテールにハイブリダイズされる配列を有する増幅スト ランドに接触し、且つ、複数の標識ストランドを結合させることのできるハイブ リダイゼーションアッセイについて記載している。欧州特許出願公開第３１７０ ７７号（１９８９年５月２４日公開）に記載され、約１０６／ｍｌのレベルで配 列を検出するとされている、ひとつのタイプのハイブリダイゼーションアッセイ は、一本鎖の分析物核酸に結合し、且つ、複数の一本鎖標識オリゴヌクレオチド にもまた結合する核酸多量体を利用している。特に所望の技術は、ハイブリダイ ゼーションシステムの一部として、血清中の標的ＨＣＶ配列の約１０．０００倍 （すなわち、約１０６配列／＊ｌまで）の増幅を含み得る。増幅は、例えば、５ ａｉｋｉら（１９８６）、Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４．６８３．１９５号、お よびＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４．６８３．２０２号に記載のポリメラーゼチ ェーンリアクション（ＰＣＲ）により達成し得る。増幅は、ＨＣＶ標的配列の精 製の前に、または、好適にはこれに続いて行い得る。例えば、増幅は、米国特許 第４，８６８．１０５号に記載のアッセイ法と組み合わせて、または、さらなる 増幅が望まれる場合は、欧州特許出願公開第３１７０７７号に記載のハイブリダ イゼーシコンシステムと組み合わせて使用され得る。

分析物ポリヌクレオチドストランド中のＨＣＶ配列を検出するための好適な方法 は、米国特許第４．８６８．１０５号および欧州特許出願公開第３１７０７７号 に記載のハイブリダイゼーション検出法に基づく。これらの方法は、分析物核酸 中の標的配列にハイブリダイズされる捕獲および標識プローブの両方を利用する 溶液相サンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイである。ＨＣＶの生体試 料をスクリーニングするために、これらのアッセイを使用する場合、用いられる プローブは、ＨＣＶゲノムの保存領域に結合すると考えられる。捕獲および標識 プローブは、標的配列に対する結合に際して点在し得る。また、好適なモードに おいては、捕獲および標識プローブは、セットになっており、ひとつのセットの プローブは、他のセットのプローブと互いに結合しない。後者のモードにおいて 、好適には、複数の捕獲プローブのセット（単数および複数）は、ゲノムの最も 保存されている領域にハイブリダイズされる。他方、複数の標識プローブのセッ ト（単数および複数）は、少量の多様性を示す領域にハイブリダイズされる。例 えば、図１に示すプロトタイプＨＣＶＩ　ＣＤＮＡ配列を用いると、約−３１８ から約１７４のヌクレオチドの領域、および／または約４３７８から約４９０２ の領域のヌクレオチド、および／または約４０５６から約４４４８の領域のヌク レオチド中の配列にハイブリダイズされるプローブが使用され得る。好適なプロ ーブは、ＨＣＶゲノムの５−領域中の配列にハイブリダイズされると考えられる 。なぜなら、以下に述べるように、この領域は高度に保存されているからである 。したがって、好適なプローブは、例えば、図１に示すように約−３１８から約 １７４のヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。例えば、ウィルス性ゲノム配 列を検出するためか、ＰＣＲ増幅により得られたＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列を検出す るためか、または、ポジティブなＨＣＶ　ＲＮＡ鎖に対する複製中間体を検出す るためなどの目的に応じて、保存領域のポジティブストランド、および／または 、その相補体のいずれかにハイブリダイズされるプローブが、使用され得る。

ＨＣｖｃＰＣＲを　いた　）ＩＣＶ　ＲＮＡおよびＨＣＶ　ＲＮＡ　ノボリヌク と１１ヱ亘簾旦 ＨＣＶ　ＲＮＡまたはＨＣＶ　ＲＮＡ由来のポリヌクレオチドを検出するために 特に青用な方法は、■ＣＶ／ｃＰｃＲ法であり、これは、本出願の主題であり、 且つ、５ａｉｋｉら（１９８６）、Ｍｕｆｔｉｓの米国特許第４、６８３．１９ ５号、およびＭｕｆｔｉｓらの米国特許第４．６８３．２０２号に記載のポリメ ラーゼチェーンリアクンヨン技術（ＰＣＲ）を利用する。

ＨＣＶ／ｃＰｃＲ法は、ＨＣＶゲノムの性質に関してここで提供された情報から 得られたプライマーおよびプローブを利用する。

一般に、ＰＣＲ技術において、所望の配列の互いに対向する末端に適合する短い オリゴヌクレオチドブライマーが生産される。プライマー間の配列は、周知であ る必要はない。ポリヌクレオチドの試料は、抽出され、好適には熱により変性さ れ、モル過剰のオリゴヌクレオチドブライマーによりハイブリダイズされる。重 合は、デオキシヌクレオチド−３−リン酸またはヌクレオチド類似体（ｄＮＴＰ ）の存在下において、鋳型およびプライマー依存型ポリメラーゼの触媒作用を受 ける。この結果、５°−末端におけるそれぞれのプライマーを含み、新規に合成 された、元の鎖の相補体に共有結合した、２つの「長い生産物」が得られる。複 製ＤＩＪＡは再び変性され、オリゴヌクレオチドブライマーによりハイブリダイ ズされ、重合状態に戻り、複製の第２のサイクルが開始される。第２のサイクル は、２つの元の鎖、サイクル１からの２つの長い生産物、および長い生産物から 複製された２つの「短い生産物」を供給する。短い生産物は、プライマー配列に より５−および３−末端がはさまれた標的配列由来の配列（センスまたはアンチ センス）を含む。各追加サイクルにおいて、短い生産物の数は、指数的に複製さ れる。したがって、この工程は、特異的標的配列の増幅を引き起こす。

上記方法において、）ＩＣＶ　ＲＮＡまたはその断片を含むと考えられる試料が 供給される。試料は通常、ＮＡＮＢＨを有すると考えられる個体から採取される が、例えば、調整培地、またはウィルスが複製されるインビトロシステムからの 細胞を含む他の試料源からも採取され得る。しかし、試料は、標的核酸配列（単 数および複数）を含まなければならない。

その後、試料に、ＨＣＶ　ＲＮＡからＨＣＶ　ｃＤＮＡへの逆転写ができる条件 を与える。ＲＮＡを逆転写するための条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｍ ａｎｉａｔｉｓら（１９８２）およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ ｇｙに記載されている。逆転写の好適な方法は、組換え分子を含み、例えば、レ トロウィルス、好適には、トリ骨髄芽球騰ウィルス（ＡＭＶ）から単離された、 様々な源からの逆転写酵素、および、転写に適した条件を利用する。逆転写のＨ ＣＶ　ｃＤＮＡ生産物は、１回目の逆転写から得られるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリ ッド中にある。続いて、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、２回以上の逆転写から 得られる。

その後、逆転写して得られたＨＣＶ　ｃＤＮＡに、ＰＣＲを用いて標的配列を増 幅する。このために、ＨＣＶ　ｃＤＮＡは変性され、分離したストランドが、標 的配列をはさむ（ｆｌｉｎｋ）プライマーによりハイブリダイズされる。

ストランドの分離は、物理的、化学的、または酵素を用いた手段を含む、当業者 に周知の任意の適切な変性法により達成され得る。好適な方法は、物理的なもの であり、核酸が完全に変性される（〉９９％）まで核酸を熱することを含む。典 型的な熱変性は、約８０°Ｃから約１０５°Ｃの範囲の温度で約１から１０分間 熱することを含む。

プライマーによるＨ（、Ｖ　ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの後、標的ＨＣ Ｖ配列は、複製鎖の合成を開始するために、ブライマーオリゴヌクレオチドを利 用する、重合手段により複製される。

プライマーは、ＨＣＶゲノムの配列に相補的であるように選択される。ＦＩＣＶ 　ｃＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の領域に相補的なオリゴマーブライマ ーは、図１に示す複合ｃＤＮＡ配列から得られるＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列から設計 され得る。

プライマーは、二本鎖配列に沿った相対的位置が、一方のプライマーから合成さ れた伸展生産物が、鋳型（相補的）から分離された時に、他方のプライマーの伸 展のための鋳型として作用し、それによって、所定の長さを有する複製鎖を生産 するような位置になるように、選択される。

プライマーは、好適には、増幅において最大限の効果が得られるように、一本鎖 であるが、また二本鎖でもあり得る。

二本鎖の場合は、プライマーは、まず、伸展生産物を調製するために用いられる 前に、その鎖を分離するために処理される。好適には、プライマーは、オリゴデ オキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下において伸展生 産物の合成を開始するために十分長くなければならない。プライマーの正確な長 さは、プライマーの温度および源、そして方法の使用法を含む多くの要素に依存 する。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドブライマーは 、典型的には、約１５−４５個のヌクレオチドを含むが、それより多くの、また はそれより少ないヌクレオチドを含み得る。短いプライマー分子は、一般的に、 十分に安定した、鋳型とのハイブリッド複合物を生成するために、より低い温度 を必要とする。

ここで用いるプライマーは、増幅すべき各特異的配列の異なる鎖に「実質的に」 相補的であるように選択される。したがって、プライマーは、鋳型の正確な配列 を反映する必要はないが、その対応する鎖により選択的にハイブリダイズされる ために十分相補的でなければならない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、 プライマーの５−末端に結合し得、その場合、プライマー配列の残りは、鎖に完 全に相補的である。

また、プライマーが、増幅し、それによりハイブリダイズし、それにより重合手 段により伸展され得る二本鎖構造を形成すべき鎖のうちのひとつの配列に対して 十分な相補性を有する場合、非相補的塩基、または、それより長い配列は、プラ イマーに点在し得る。プライマーの非相補的ヌクレオチド配列は、制限酵素部位 を含み得る。標的配列の末端（単数および複数）に制限酵素部位を追加すること は、特に、標的配列のクローニングにとって有用である。

本明細書で用いる用語「プライマー」は、特に、増幅すべき標的領域の末端配列 （単数および複数）に関する情報に曖昧な点がある場合、１より多いプライマー を意味するということが理解される。したがって、「プライマー」は、配列中の 可能な変化を示す配列を含むブライマーオリゴヌクレオチドを集めたものを含み 、または、典型的な塩基対を形成するヌクレオチドを含む。上記プライマーオリ ゴヌクレオチドを集めたものにおいて、ブライマーオリゴヌクレオチドのうちの ひとつは、標的配列の末端に相同である。特別な場合とは、オリゴマーのセット が、ＨＣＶゲノムの、可変領域である可能性を有するものの増幅を開始するため に、利用される場合である。

プロトタイプ鎖であるＨＣｖｌから派生する配列を有する、様々なＩ（０７株お よび単離物が存在するということが予想される。

したがって、変種株を検出するためには、ＨＣＶゲノムの保存領域にハイブリダ イズされるプライマーを構築することが好適である。保存領域は、いくつかのＨ Ｃｖ株／単離物の、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較することにより決定 され得る。

ＨＣｖゲノムには、上記のように、プライマーが由来し得る、少なくとも３つの 保存アミノ酸領域が存在すると考えられる。

これらの領域は、存在すると信じられている。以下に実施例中で述べるプライマ ーは、フラピウイルス属の配列に相同な配列に基づき、ＨｃＶの保存領域である と信じられている領域由来である。

オリゴヌクレオチドブライマーは、任意の適切な方法により調製され得る。特異 的配列のオリゴヌクレオチドを調製する方法は、当業者に周知であり、例えば、 適切な配列のクローニングおよび制限、そして、直接的化学合成を含み得る。

化学的合成法は、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）が記載したホスホトリエ ステルＬ　Ｂｒｏ豐ｎら（１９７９）が開示したホスホジエステル法、Ｂｅａｕ ｃａｇｅら（１９８１）が開示したジエチルホスホルアミデート法、および米国 特許第４．４５８．０６６号に記載の固体支持法を含み得る。

プライマーは、所望であれば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、ま たは化学的手段による検出可能な組み込み手段により標識され得る。

オリゴヌクレオチドブライマー（単数および複数）の鋳型依存性伸長は、適量の 、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴ ＰおよびｄＴＴＰ）または類似体の存在下、適当な塩、金属カチオン、およびｐ Ｈ緩衝系を含む反応培地において、重合剤により触媒作用を受け得る。適切な重 合剤は、プライマー依存性および鋳型依存性ＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼすとい うことが知られている酵素である。周知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、Ｅ 、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ■またはそのＫｌｅｎｏｖ　（フレノウ）フ ラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼが含 まれる。これらのＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼすための反 応条件は、当業者に周知である。

合成による産物は、標的配列を含む鋳型ストランドおよびプライマー伸長ストラ ンドからなる二本鎖分子である。これらの産物は、順に、もう１回複製をするた めの鋳型として作用する。２回目の複製において、１回目のサイクルのプライマ ー伸長ストランドは、その相補的プライマーによりアニールされる。合成によっ て、プライマー配列およびそれらの補体により、５°−末端および３°−末端の 両方で結合されている「短い」産物を得る。変性、プライマーアニーリング、お よび伸長のサイクルの反復の結果、プライマーにより定義される標的領域の指数 関数的蓄積が得られる。核酸の標的領域を含む所望量のポリヌクレオチドを得る ために、十分なサイクルが実行される。所望量は、産物であるポリヌクレオチド が有する機能により、変化し、且つ、決定される。

ＰＣＲ法は、数多くの一過性配列中で行われ得る。例えば、各ステップ後に新し い試薬が加えられる段階的様式、すべての試薬が同時に加えられる様式、または 、所定数のステップ後に新しい試薬が加えられる部分的な段階的様式で行われ得 る。

好適な方法においては、ＰＣＲ反応は、耐熱性酵素を利用する自動化工程として 実行される。この工程において、反応混合物は、変性領域、ブライマーアニーリ ング領域、および反応領域を循環する。酵素は各サイクル毎に加えられる必要は ないため、特に耐熱性酵素の使用に適し、且つ、液体処理システムを用いずに温 度サイクリングを利用する、機械が使用され得る。このタイプの機械は、Ｐｅｒ ｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃａｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、から市販されている。

ＰＣＩＩによる増殖後、標的ポリヌクレオチドは、緊縮性から適度な緊縮性まで のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的配列のポリヌクレオチドと 安定したハイブリッドを生成する、プローブポリヌクレオチドとのハイブリダイ ゼーションにより検出される。プローブが標的配列と完全に（すなわち、約９９ ％以上）相捕的であるということが予想される場合は、緊縮性条件が用いられる 。ある程度のミスマツチが予想される場合、例えば、プローブが完全には相捕的 でないという結果を、変異種法がもたらすということが予想される場合は、ハイ ブリダイゼーションの緊縮性は低下され得る。しかし、非特異的／偶発的結合を 排除する条件が選択される。

ハイブリダイゼーションに影響を与え、且つ、非特異的結合を選択しない条件は 、当該分野では周知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載さ れている。一般に、塩濃度を低くし、そして温度を高くすると、結合の緊縮性は 上昇する。例えば、通常、緊縮性条件とは、約６５°Ｃのインキュベーション／ 洗浄温度で約０．１　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを含む溶液中でのインキュベ ーションであり、適度な緊縮性条件とは、約５０℃−６５℃のインキュベーショ ン／洗浄温度で約１−２　ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳを含む溶液中でのインキ ュベーションであると考えられている。低い緊縮性条件とは、２　Ｘ　ＳＳＣお よび約３０℃−５０℃である。

ＨＣＶ標的配列用のプローブは、図１に示すＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列、または新し いＨＣＶ単離体由来であり得る。ＨＣＶプローブは、標的領域に広がるが、プラ イマーを排除し、且つ、標的領域に対して特異的ハイブリダイゼーションをさせ る、任意の適切な長さを有し得る。完全な相補性が存在すべきである場合、すな わち、株がプローブの配列と同一の配列を含む場合、二本鎖は緊縮な条件下にお いてさえも比較的安定であるため、プローブは、短い、すなわち、約１０−３０ 塩基対の範囲であり得る。

ある程度のミスマツチがプローブに予想される場合、すなわち、プローブが変異 種領域にハイブリダイズすると考えられる場合には、プローブは、より長いこと があり得る。なぜなら、長さは、ミスマツチ（単数および複数）の効果をある程 度相殺すると考えられるからである。

標的配列と相捕的な配列を有するプローブ核酸は、プライマー配列の合成のため に上記した技術と同様の技術を用いて、合成され得る。所望であれば、プローブ は標識され得る。適当な標識は、上に記載されている。

い（つかの場合において、プローブにより検出されたＰＣＲ産物の長さを決定す ることが望ましいということがあり得る。

このことは、特に、変異種ＨＣＶ株が標的領域内に欠失を含み得るということが 考えられる場合、または、ＰＣＲ産物の長さを確認したい場合に、当てはまる。

このような場合は、産物に、サイズ分析およびプローブとのハイブリダイゼーシ ョンを施すことが好適である。核酸のサイズを決定する方法は、当該分野では周 知であり、例えば、ゲル電気泳動法、勾配による沈降法、およびゲル排除クロマ トグラフィーを含む。

生物学的試料中の標的配列の存在は、ＦＩＣＶポリヌクレオチドプローブと、Ｐ ＣＲ増幅技術を施された核酸との間に、ハイブリッドが生成しているかどうかを 決定することにより、検出される。プローブと核酸配列との間に生成したハイブ リッドを検出する方法は、当該分野では周知である。例えば、便宜上、未標識試 料は、それが結合する固体マトリックスに転移され、結合した試料には、標識さ れたプローブによる特異的ハイブリダイゼーションをさせる条件を施し得る。次 いで、固体マトリックスはＩｎされたプローブの存在を調べられる。あるいは、 試料が標識されている場合は、未標識プローブは、マトリックスに結合され、適 当なハイブリダイゼーション条件にされされた後、そのマトリックスは標識の存 在を調べられる。他の適切なハイブリダイゼーションアッセイは上記に記載され ている。

ＰＣＲを　いた′Ｉ（ＣＶＩの。

変異種ＨＣＶ株を同定し、それによりこれらの変異種のプローブを設計するため に、上記の■ＣＶ／ｃＰｃＲ法を用いてＨＣＶゲノムの変異種領域を増幅し、そ のことによってこれらの変異種標的領域のヌクレオチド配列を決定し得る。一般 に、変異型のＨＣＶは、ＥＩＣＶ　１株が優勢な、例えば、日本、アフリカなど とは地理的に異なる場所、またはそのウィルスにもまた感染した異なるを椎動物 種において発生することが予想される。変異種ＨＣＶはまた、組織培養系の経過 中に発生するか、または自然または誘発変異の結果発生し得る。

変異種標的領域を増幅するために、プライマーを、疑わしい領域の側面に配置す るように設計し、好ましくは保存領域と相捕的である。保存されていると思われ る、ＨＣＶの２つの領域に対するプライマーは、ワラビウイルスモデルに基づい ている。これらのプライマーおよびプローブは、図１に示されるＨＣＶＩ株の配 列情報を用いて設計され得る。

標的領域（単数および複数）のヌクレオチド配列の分析は、ＰＣＲ増幅した産物 を直接分析することによって行われる。ＰＣＲ増幅した産物の直接的な配列分析 の方法については、５ａｉｋｉら（１９８８）により記載されている。

あるいは、増幅した標的配列（単数および複数）は、配列分析の前にクローニン グされ得る。酵素により増幅したゲノムセグメントの直接的なりローニングおよ び配列分析方法は、５ｃｈａｒｆ　（１９８６）によって記載されている。この 方法では、ＰＣＲ技術において使用されるプライマーは、その５°末端付近で改 変され、例えば、Ｍ１３配列決定ベクターに直接クローニングするのに都合のよ い制限部位を生成する。増幅後、ＰＣＲ産物は、適切な制限酵素で開裂される。

制限フラグメントは、Ｍ１３ベクターに連結され、例えば、プレートされたＪＭ １０３宿主に形質転換され、得られたプラークは、標識されたオリゴヌクレオチ ドプローブとのハイブリダイゼーシヨンによってスクリーニングされる。クロー ニングおよび配列分析の他の方法は、当該技術分野において公知である。

フラピウイルスおよびＨＣｖの−　・なプライマーＨＣＶ　ｃＤＮＡ由来のプロ ーブおよびＨＣＶ　ｃＤＮＡ内に含まれる配列情報を用いた、ＨＣＶゲノムの性 質の研究により、Ｉ’ｌＣＶがフラビ様ウィルスであることが示唆される。これ らの研究については、ＰＣＴ公開公報第Ｗ０９０／１４４３６号に記載されてい る。ＨＣＶ　ｃＤＮＡクローン由来のＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列と、多数のフラビウ イルスの公知の配列との比較により、ＨＣＶが、フラビウイルスにおける保存配 列と相同な配列を含んでいることが示される。これらの保存配列により、フラピ ウイルスおよび）ＩＣＶの標的領域の増幅に一般に応用され得るプライマーの形 成が可能になる。次いで、この種の同定は、この種に特異的なプローブを用いて 行われる。多数のフラビウイルスのゲノムが当該技術分野において公知であり、 例えば、日本脳炎ウィルス（Ｓｕｍｉｙｏｓｈｉら、（１９８７））、黄熱病ウ ィルス（Ｒｉｃｅら、（１９８５））、デング熱２盟ウィルス（Ｈａｈｎら、（ １９８８））、デング熱４型ウィルス（Ｍａｃｋ。

ｗ（１９８７））、および西ナイルウイルス（Ｃａｓｔｌｅら、（１９８６）） が含まれる。ＨＣＶ　ＲＮＡの同定は、ＨＣＶに特異的なプローブを用いて行わ れ、その配列は、本願で提供されるＨＣＶ　ｃＤＮＡ配列によって決定され得る 。

あるいは、コドンの縮重性を説明するために、ならびに、それゆえＨＣＶアミノ 酸配列配列ワラビウイルスの公知の配列との比較により決定されるフラビウイス ルおよびＨＣＶに対する共通配列を含むように設計されたプローブのセットを用 いると、これらのウィルスの一般的な検出システムが可能になる。

のＤＮＡ　の 合成オリゴヌクレオチドは、Ｗａｒｎｅｒ　（１９８４）によって記載されるよ うに、自動オリゴヌクレオチド合成器を用いて調製され得る。所望であれば、合 成ストランドは、標準的な反応条件を用いて％　３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ポ リヌクレオチドキナーゼで処理することにより３２ｐで標識され得る。

ｃＤＮＡライブラリーから単離した配列を含むＤＮＡ配列は、例えば、Ｚｏｌｌ ｅｒ　（１９８２）によって記載されるように、部位特異的変異誘発を含む公知 の技術により改変され得る。要するに、改変されるＤＮＡを、一本鎖配列として ファージにパッケージングし、改変されるＤＮＡの部分と相捕的な合成オリゴヌ クレオチドをプライマーとして使用し、それ自身の配列中に所望の改変を含む、 ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡに変換する。

得られた二本鎖ＤＮＡを、宿主バクテリアを支持するファージに形質転換する。

ファージの各ストランドの複製を含む形質転換されたバクテリアの培養物を寒天 中にプレートし、プラークを得る。理論的には、新しいプラークの５０％が変異 配列を有するファージを含み、残りの５０％がオリジナルの配列を有する。

プラークの複製物を、改変されていない配列とではなく、正しいストランドとハ イブリダイゼーシヨンさせるような温度および条件で、標識された合成プローブ にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーシヨンによって同定された配列を回収 し、クローニングする。

ＨＣＶ　のポリヌクレオチドをスフ菅−ニング　るためのキット ＨＣＶの試料を増幅および／またはスクリーニングするためのプローブおよび／ またはプライマーであるオリゴマーは、キットにパッケージングされ得る。ＨＣ ｖ配列をスクリーニングするためのキットは、オリゴマープローブＤＮＡを含む 。ＨＣＶ配列を増幅するためのキットは、増幅に使用されるオリゴマーブライマ ーを含み得る。キットは、通常、予め測定したまたは予め決定した量のプローブ またはプライマー、および特定のハイブリダゼーションおよび／または増幅プロ トコルに必要な、別の適切な容器に適切にパッケージングされた他の試薬および 物質を含む。例えば、キットは、標本物、緩衝液、支持体、酵素、基質、標識プ ローブ、結合パートナ−１および／またはテストを行うための指導書を含み得る 。

支嵐勇 以下に示す本発明の実施例は、単に例示を目的とし、本発明の範囲を限定するも のではない。

ＬＪ［ｊ　にお（るポジティブストランドおよびネガティブストランド５°−Ｉ ＴｃＶ　ＲＮＡの 血清から単離したＨＣＶ２７中のＲＮＡにおけるポジティブストランドおよびネ ガティブストランドの存在を、ＰＣＲ法を用いて分析した。ＰＣＲ法は、以下に 示すこと以外は、実質的に上記のように行った。

抽出した１ＩｃＶ２７　ＲＮＡを、プライマーとしてＡｌｅｘ９０またはＪＨ５ ２のいずれかを用いて、一本鎖ｃＤＮＡに逆転写した。Ａ１ｅｘ９０は、ＨＣＶ Ｉゲノムのヌクレオチド−３１２位から一２８３位の由来で、以下の配列を有し ている： ５°ＡＣＣＡＴＧ　ＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＣＣＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣＴＡ Ｃ３’ＪＨ５２は、ＨＣＶヌクレオチド−９３位から一１１７位由来で、ヌクレ オチド番号は、以下の配列の下に示すかっこで示される。ＪＨ５２においては、 下線のジヌクレオチドが変異され、Ｎｏｔ１部位を形成している。ｐｆ　ＪＨ５ ２の配列は、以下の通りである：（プう４７−）　ニー　団　上ｆｆｆ一旦＆」 生−（ＪＨ５２）　５’　、へＧＴＣＴＴ　ＧＣＧＧ匡ＧＣＡＣＧＣＣＣＡＡＡ ＴＣ３’Ａ１ｅｘ９０の配列は、ＨＣＶ　ＲＮＡのポジティブストランドのヌク レオチド−３１２位から一２８３位までの配列に一致し、ＪＨ５２は、ネガティ ブストランドのヌクレオチド−１１７位から一９３位の配列に一致する。得られ た一本鎖ＦＩＣ’／　ｃＤＮＡを、Ａｌｅｘ９０およびＪＨ５２を用いて、各々 別々にＰＣＨによって増幅した。増幅した産物の検出は、プローブとしてＡｌｅ ｘ８９を用いて、サザンブロツテイングにより行った。Ａ１ｅｘ８９は、ＨＣＶ 　ＲＮＡのヌクレオチド番号−２０３位から一１７５位までと一致する。Ａｌｅ ｘ８９の配列は、以下の通りである５°ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＣＴ　ＧＣ Ｇ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　３’この方法を用いた分析では 、両ＲＮＡストランドの増幅産物のシグナルが、同一の強度であることが示され た。これらの結果は、５°領域におけるＨＣＩ／　ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡとして 存在し得ることを示唆している。

＋１．）ＩＣＶ　ＲＮＡの５°　のプライマーおよびプローブを　いた　ＨＣｖ ｃＰＣＲニよる　のＨＣＶ　ＲＮＡノからノ）ＩｃＶ　ＲＮＡの 凍結した血漿を、Ｐ３フード（ｈｏｏｄ）で解凍した。０．２ｎ＋１の消化混合 物（１００ミリモル（ｍＭ）のＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　２１１ＭのＥＤＴＡ、　２ ００ｍＭのＮａＣ］、２０？イクログラム／ミリリツトル＜μｇ／ｌｌ１ｌ）の ＭＳ２　ＲＮＡ、。

０．５％のＳＤＳ、　および２ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼに、　ｐ）Ｉ　８） を２ｍｌのマイクロヒュージ管に加え、３７℃に予め暖めた。次いで、血漿（０ ，２＋＊ｌ）を加え、この混合物を６０℃で１時間インキュベートした。次いで 、フェノール（０，４ｍ１）を加え、この混合物を、３０秒間ずつ３回攪拌した 。これは、各攪拌の間隔を３０秒間ずつおいて行われた。次いで、混合物を５分 間遠心分離にかけ、水相を回収した。有機相を、Ｏ，１ｍｌのＴＢＳでもう一度 抽出し、プールしておいた水相を、１容量のフェノール／クロロホルム／ＩＡＡ で２回、次いで１容量のクロロホルムで抽出した。この抽出物に、１μｍ　（２ μｇ）のグリコーゲン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ、　 ）、２５μｍのＮａ０Ａｃ　（３ＭＳｐＨ５，４）、および１．２５ｗ＋１の冷 やしたＥｔＯＨを加え、産物をドライアイスで凍結させ、１０分間遠心分離にか けた。ベレットを１００μｌの蒸留水に溶解し、５μｌのＮａ０Ａｃ　（ｐＨ５ ，４）を、２５０μｍの冷やしたＥｔＯＨと共に加えた。

この溶液を凍結し、再び遠心分離にかけ、得られたベレットを１０μｌのｄＨ２ ０に溶解した。

吐■旦金或 抽出したＲＮＡからｃＤＮＡを合成するために、まず、５μｌの溶解したＲＮＡ を、４μｍの水および１．ｃｚｌ（１μｇまたは１６６ｐ＋＊ｏｌの１８量体） のＲＴプライマーとインキユベートした。インキュベーションは、７０℃で３分 間行い、水上で冷却した。ＲＴプライマーの配列は、以下の通りであった： ５°ＣＣＣＡＡＣＡＣＴ　ＡＣＴ　ＣＧＧ　ＣＴＡ　３’最初のインキュベーシ ョン後、１０μｌの５倍の第一ストランド緩衝液（２５０ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣ Ｉ、ｐＨ８，３，３７５＋ｓＭのＫＣＩ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２．５０ｍＭのジ チオスレイトール）；２．５μｌのデオキシヌクレオシドトリホスフェート（各 １０ｍＭ）　；　２．５μｍの逆転写酵素（ＢＲＬからのＭＭＬＶ、１μｍ当り ２００ユニツト）；および蒸留水を、インキュベーション混合物に加え、容量５ ０μＩにした。この混合物を３７°Ｃで１時間インキュベートし、９０°Ｃで３ 分間加熱し、氷上で冷却した。

四犯１幡 上記のように生成したＨＣＶ　ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、以下の表に示すコント ロールおよびテスト試薬を用いて行った。表中、［ＲＮＡＪは、ＲＮＡを、ｌｌ ＩＣ’／　１に感染していない個体から抽出したコントロール試料を示し、この 試料を、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅工程にかけた。ｒｃＤＮＡＪは、ｃＤＮ Ａ合成およびＰＣＲ増幅の工程にかけたコントロール試料を示すが、この場合、 ＲＮＡの部分は、ｃＤＮＡ合成中、水と置換された。「テンプレート」は、テン プレートが省略されたＰＣＲ反応のコントロールであった。　「試料」は、ｌ（ Ｃ’／　ＲＮＡの存在をテストした血清を示す。

（以下余白） ＲＮＡ　ｃＤＮＡ　テン７゛トド　試料（μ　ｌ）　（μｌ）　（μ　１）　（ μ　ｌ）水　１００．０Ｆ°４３　１００．Ｏ＋？−す６　１００．０ＩＳｉｋ 　１００．０＋＝ＪＡ１０倍緩衝液　１０．０　１０．０　１０．０　１０．０ ｄＮＴＰｓ　１６．０　１６．０　１６．０　１６．０プライマー１　０．５　 ０．５　０．５　０．５ブライ７−２　０．５　０．５　０．５　０．５テンプ レート　２．５　２．５　２．５Ｔａｑ　Ｐｏｌ　Ｏ，５０，５０，５０，５プ ライマー１およびプライマー２は、それぞれ０．５μｇ／μｍおよヒ０．４２μ ｇ／μｍであり、以下の配列を有していたニア゛ライｖ−１：　５’　ＡＣＣＡ ＴＧ　ＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＣＣＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣＴＡＣ３゜プライ マー２＝　５°　ＡＧＴ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＧＣＡ　ＣＧＣＣＣＡ　Ａ ＡＴ　Ｃ３゜これらのプライマーは、ＨＣＶゲノムの５゛末端の保存領域にハイ ブリダイズする。試料は、ＨＣＶ　ｃＤＮＡの１２．５μｌの血清等量を含んで いた。使用した増幅サイクルの条件は、以下の通りであった： ３５サイクル：　融解−９４℃で１．５分間アニーリング−６０℃で２分間 伸長−７２°Ｃで３分間 最終伸長＝７２°Ｃで３０分間 除去するまで４℃で潰した。

増幅産物を標識したＤＮＡを用いてプローブした。このプローブの配列は、以下 の通りであったニ ア′ローフ′　＝５°　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＴＣＡ　ＡＣＣＣＧＣＴＣＡ 　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　３゜２００個より多くのＨＣＶ血清陽性試料を、上 記の手法で調べた。

コントロールが陰性であった結果のみを考察した。この場合、すべての血清陽性 試料はまた、ＰＣＲアッセイにおいて陽性であった。

ＩＩｌ、　Ｉ’ＩＣＶ　ＲＮＡ（７）　：ｆｆア　のプローブ異なるＨＣｖ単離 体に対するｃＤＮＡのヌクレオチド配列の分析により、高度な配列保存が、図１ に示されるヌクレオチドのナンバーリングシステムを用いて、ヌクレオチド約１ 位からヌクレオチド約５７０位までの領域に存在することが示される。この領域 は、推定的に、ＨＣ’／の「コア」ポリペプチドをコードする。

異なる地理上の場所（日本および米国）からの５つの異なる単離物のコンセンサ ス配列を図２に示す。ここで、ＨＣＶＩは、プロトタイプＨＣＶであり、　ＨＣ ＶＩの大きなＯＲＦにおいてコードされるアミノ酸は、コンセンサスヌクレオチ ド配列の上方に示される。図２に示される配列において、ＨＣＶ−Ｊｌｌは、Ｄ ｒ、　ＴｅｔｓｕＭｉｙａｍｕｒａ　（日本国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ））のパーソナ ルコミュニケーションからのものであり、ＪＣ−ＪｌおよびＪＣ−Ｊ４は、Ｍａ ｙｕ＋ｗｉら（１９９０）からのものである。推定「コア」領域におけるコンセ ンサス配列間には、ＨＣＶＩの配列に対して少なくとも９０％の相同性が存在す ることが図２から理解され得る。ヌクレオチド＋１位と＋５７１位との間の領域 における高度な相同性を考慮すると、この領域のプローブは、ＨＣＶ陽性生物学 被検体をスクリーニングするのに有用であり得る。

推定的にＨＣＶ　ｒコア」ポリペプチドをコードする領域からのＨＣＶ　ＲＮＡ の検出に使用され得る標識プローブのセットを図３に示す。図３で、セントにお ける「プローブ数」は、図３に記載のＩＵＢグループコードによって示される異 質性を有する一連のポリヌクレオチドを含む。異質性とは、異なる単離体のコン センサス配列に見いだされるヌクレオチド配列に相違が存在することである。図 ３のプローブセットにおけるプローブが相補的である１（Ｃｖ配列の領域を図４ に示す。ここで、ヌクレオチド番号は、図１のナンバーリングに対応する。

このプローブを、ＨＣｖ配列を検出するためのアッセイに用いた。このアッセイ フォーマットは、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４４３６号における、実施例の”Ｐ ｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　Ｓａｎｄｗｉｃｈ　ｔｌｙｂｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ ＨＣＶ“の項目において記載された。

ｌ策上皇ｚ月 本願に記載の方法、ＢＣＶ　ｃＤＮＡ由来のプローブおよびプライマーであるオ リゴマー、ならびにそれらを含むキットは、生物学的試料、特に、輸血に用い得 る血液およびＨＣＶに感染していると思われる個体における［ＩＣ’／の存在を 、正確に、比較的簡単に、そして経済的に決定するのに有用である。さらに、こ れらの方法およびオリゴマーは、組換えＨＣＶポリペプチドの使用に基づいた免 疫学アッセイよりも速い段階でｕｃｖ＠染を検出するのに有用であり得る。増幅 したポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアノセイはまた、抗ＨＣｖ抗体陰 性である通常の試料におけるＦＩＣＶ　ＲＮＡを検出する。従って、本願に記載 のプローブおよびプライマーは、ＨＣＶポリペプチドに基づいた免疫アッセイと 組み合わせて、増幅ハイブリダイゼーシコンアッセイに使用され、ＨＣＶによる 感染、および血液を含むＨＣｖに感染した生物学被検体をより完全に同定し得る 。

本願に記載の情報は、ＨＣｖゲノムの保存領域由来のプライマーおよび／または プローブの設計を可能にする。これらのプライマーおよびプローブの提供により 、変異種ＢＣＶ株を検出し得、血液および血液産物のスクリーニングに使用され 得る一般的方法が得られる。

この方法に使用されるプライマーが、ＨＣｖゲノムの保存領域由来であると、こ の方法により、ＨＣＶの変異株の検出および／または同定が手助けされるはずで ある。そして、このことにより、ＨＣ’／の検出および診断のためのさらなる免 疫試薬の発達、ならびにＨＣＶの検出および／または治療のためのさらなるヌク レオチド試薬の発達がなされる。

さらに、ワラビウイルスおよびＨＣＶの保存アミノ酸配列から設計されるプライ マーおよびプローブのセットにより、これらの感染物質の一般的な検出方法が可 能となる。

以下の物質は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）　１２３ ０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、Ｒｏｃｋｖｉｌｌａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２ ０８５２に、ブダペスト条約に基づいて寄託され、以下の受託番号を受けている 。

−し二二二　と；ＪＢ　＊ｉ屯Ｂ ＨＣＶ　ｃＤＮＡ　−７４７”う’Ｉ−４０３９４ｒｑ９７’１ｊｌＬｆ４／Ｂ りｏ−：ｚ８１　４０３８８　ｌｑＫ’７ｆｆ　ｔｔｆｊ、ｔ７ｅグＯ−ン９１ 　４０３８９　（ｑ２７斗　１．目、７゜りＯ−，１−２４０３９０ｔｑｅ７７ Ｍ　ｔ／ｐｔ７ｅりｏ−７５−１−１４０３９１ｒ０７５１　ｕｐ　ｔｈｅ’） ｏ−、／１２ｆ　４０５１４　１９ｇＦＩＲ７／　１４　ｔｏｅ’）ｏ−ン３５ ｆ　４０５１１　ｔデ？２ｆｌ　／／Ｉ￥　ｔｅａり〇−ン１５ｅ　４０５１３ 　ｒデ２２ル　ノＩｐｒｏｇフｏ−ンに９−１　４０５１２　ｔ２２２５４　ｔ ｔ＃　ｔｅａＪＳＣ３０８２０８７９ｔ　’ｉｌ？ｇ５ｊ　’；ｆＪ　ｒｅｐＳ ３５６　６７６８３　７７２２％　ｔＨ４４１３さらに、以下の寄託物は、１９ ８９年５月１１日に寄託された。

Ｄ１２１０　（Ｃｆ１１５−１−１）　ＥＦ　６７９６７Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ ／８１）　ＥＦ　６７９６８Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／２７９ａ）　ＥＦ　６７９ ６９Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／３５ｆ）　ＡＢ　６７９７０Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ ／２７９ａ）　ＥＦ　６７９７１Ｄ１２１０　（Ｃｆ１１０６）　ＣＤ　６７９ ７２Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／１３ｉ）　Ａｌ３　６７９７３Ｄ１２１０　（Ｃｆ ｌ／Ｃ３３ｂ）　ＥＦ　６７９７４Ｄ１２１０　（Ｃｆｌ／ＣＡ２９０ａ）　Ａ ｌ１　６７９７５ＨＢＩＯＩ　（ＡＢ２４／Ｃ１００＃３Ｒ）　６７９７６Ｄ１ ２１０株の以下の誘導体は、１９８９年５月３日に寄託された。

」ＬｌＡ」−Ｋ＝」１ ｐｃＦ１ｃｓ／Ｃ８ｆ　６７９５６ ｐｃＦＩＡＪ３／Ｃｌ２ｆ　６７９５２ｐｃＦＩＥＦ／１４ｃ　６７９４９ ｐｃＦＩＥＦ／１５ｅ　６７９５４ ｐｃＦＩＡＢ／Ｃ２５ｃ　６７９５８ ｐｃＦＩＥＦ／Ｃ３３ｃ　６７９５３ ｐｃＦＩＥＦ１０３ｆ　６７０５０ ｐｃＦ１ｃＤ／３３ｇ　６７９５１ ｐｃＦ１ｃＤ／口９ｃ　６７９５５ ｐｃＦＩＥＦ／Ｃ４０ｂ　６７９５７ ｐｃＦＩＥＦ／ＣＡ１６７ｂ　’　６７９５９以下の株は、１９８９年５月１２ 日に寄託された。

揉　凹二ニロ ”ｒｔ、−ｑｇｔｌｌ（０５）　４０６０３′）ｌ−タ゛　ｇｔｌｏ（へ”−９ −５ａ）　４０６０２Ｄ１２１０　（Ｃ４０ｂ）　６７９８０Ｄ１２１０　（Ｍ １６）　６７９８１ 以下の生物学的物質は、１９９０年３月２３日に寄託された。

米国特許として本願が許可および発行されると、これらの寄託物の入手に関する 制限はそれ以降すべて取り除かれ、米国特許法施行規則第１．１４条および米国 特許法第１．２２条に基づいて特許商標庁長官により認められたものには、上記 出願の係属中、上記寄託物の入手が可能となる。さらに、上記の寄託物は、寄託 口から３０年間、または寄託の最終申請後５年間、または米国特許の実施期間の いずれか最も長い期間維持され得る。本願に記載の寄託物質は、単に便宜上のも のであり、本願の記載を考慮して本発明を実施するために必要なものではない。

これらの物質はまた、本願では参考のために援用されている。

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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ 、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、Ａ Ｕ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、 ５Ｕ （７２）発明者　クオ、ジョージ アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４１１２サンフランシスコ、シックスス　 アベニュー　１３７０ （７２）発明者　ウニイナー、エイミー　ジェイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５１０ベニシア、グリーンブライアー　 コート（７２）発明者　ハン、シャン アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５４９ラフアイエツト、デル　マール　 ３２３８（７２）発明者　アープイア、マイケル　ステイーブンアメリカ合衆国 　カリフォルニア　９４５０１アラモ　バンス　メドウ　ロード　１００（７２ ）発明者　アービン、ブルース　ダンカンアメリカ合衆国　カリフォルニア　９ ４５１９コンコード、エル　モンテ　ドライブ （７２）発明者　コルバーグ、ジャニス　エイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４８０４リッチモンド、シューナー　コー ト

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＣＶポリヌクレオチドを有すると思われる分析物ストランドにおいてＨＣ Ｖ配列を検出する方法であって、該ＨＣＶポリヌクレオチドが、選択された標的 領域を含み、（ａ）分析物ポリヌクレオチドストランドにおけるＨＣＶ配列にハ イブリダイズし得るオリゴマーを提供する工程であって、該オリゴマーが、図１ に示すＨＣＶゲノムの以下の領域：１６−４５、４９−７８、８２−１１１、１ １５−１４４、１４８−１７７、２１１−２４０、２４２−２７１、２７５−３ ０４、３３２−３６１、３６５−３９４、３９８−４２７、および４５７−４８ ６、に相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド 配列を含む、工程； （ｂ）該分析物ストランドを、標的する配列と標的配列との間に特異的なハイブ リッド二重鎖を形成し得る、該（ａ）のオリゴマーと共にインキュベートする工 程；および（ｄ）標的領域が存在する場合には、該標的領域と、該オリゴマーと の間に形成されるハイブリッドを検出する工程、を包含する方法。
2. ２．以下の工程： （ａ）オリゴマーのセットを提供する工程であって、該オリゴマーが、ポリメラ ーゼ鎖反応法のプライマーであり、前記標的領域に隣接して存在する、工程；お よび（ｂ）該標的領域をポリメラーゼ領反応法により増幅する工程、 をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
3. ３．適切な容器にパッケージされた請求項１に記載のオリゴマーを含む、分析物 ストランド中のＨＣＶ標的配列を検出するためのキット。
4. ４．ＨＣＶを含まない血液を調製する方法であって、（ａ）ＨＣＶ標的配列を含 むと思われる血液試料からの分析物核酸を提供する工程； （ｂ）分析物ポリヌクレオチドストランド中にＨＣＶ配列が存在する場合には、 該ＨＣＶ配列にハイブリダイズし得るオリゴマーを提供する工程であって、該オ リゴマーが、図１に示すＨＣＶゲノムの以下の領域：１６−４５、４９−７８、 ８２−１１１、１１５−１４４、１４８−１７７、２１１−２４０、２４２−２ ７１、２７５−３０４、３３２−３６１、３６５−３９４、３９８−４２７、お よび４５７−４８６に相補的なオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるポ リヌクレオチド配列を含む、工程；（ｃ）標的する配列と、標的配列が存在する 場合には該配列との間にポリヌクレオチド二本鎖を形成し得る条件下で、（ａ） と（ｂ）とを反応させる工程； （ｄ）（ｃ）で形成される二本鎖が存在する場合には、該二本鎖を検出する工程 ；および （ｅ）（ｄ）において複合体が検出されなかった血液を保存する工程、 を包含する方法。
5. ５．ＨＣＶの検出に有用な試薬であって、図１に示す塩基１６−４５、４９−７ ８、８２−１１１、１１５−１４４、１４８−１７７、２１１−２４０、２４２ −２７１、２７５−３０４、３３２−３６１、３６５−３９４、３９８−４２７ 、および４５７−４８６からなる群から選択されるＨＣＶゲノムの領域に相補的 な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む試薬。
6. ６．前記オリゴヌクレオチドがさらに検出可能な標識を含む、請求項５に記載の 試薬。