JPH06504374A - 時間分解不均一化学ルミネッセンスアッセイを用いた複数の分析対象物の同時決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 時間分解不均一化学ルミネッセンスアッセイを用いた複数の分析対象物の同時決 定 この出願は、米国特許出願第０７／６３６，０３８号の一部継続出願であり、該 出願は共通の出願人のものであり、ここに引用される。

発明の背景 この出願は、一般に化学ルミネッセンス標識に関し、さらに詳しくは不均一化学 ルミネッセンスアッセイ法を用いた複数の分析対象物の同時決定に関する。

化学反応の結果としての光の発生は当該技術分野で知られており、ゴールド（Ｖ 、　Ｇｏｌｄ）およびベセル（Ｄ、Ｂｅｔｈｅｌ）編、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ 　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８　：１８７〜２ ３８、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９８２）中のシャスター（Ｓ　ｃ ｈｕｓｔｅｒ）およびシュミット（Ｓ　ｃｈｍｉｄｔ）の「ケミルミネッセンス ・オン・オーガニック・コンパウンズ（Ｃｈｅｍｉｌｕ＋＋＋１ｎｅｓｃｅｎｃ ｅ　ｏｆＯｒｇａｎｉｃ　ＣｏＩＩ＋ｐｏｕｎｄｓ）コに概説されている。化学 ルミネッセンス生成の応用およびイムノアッセイにおけるその使用もまた当該技 術分野でよく知られている。

たとえば、ルドルフ・ザイツ（Ｗ、　Ｒｕｄｏｌｆ　５ｅｉｔｚ）の「イムノア ッセイ・ラベルズ・ベイスト・オン・ケミルミネッセンス・アンド・バイオルミ ネッセンス（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｌａｂｅｌｓ　Ｂａ５ｅｄ　ｏｎ　Ｃｈ ｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎモ■j Ｊ、 Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７　：１２０〜１２６　（１９８４ ）を参照。

イムノアッセイ用標識としてのアクリンニウム化合物の使用およびこれら標識か らの短命な（ｓｈｏｒｔ−１ｉｖｅｄ）化学ルミネッセンスシグナルのその後の 発生は、ウィークス（１、Ｗｅｅｋｓ）らによって記載されている（「アクリジ ニウム・エステルズ・アズ・ハイ・スペシフィック・アクティビティ−・ラベル ズ・イン・イムノアッセイズ（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ　Ｅｓｔｅｒｓ　ａｓ　Ｈ ｉｇｈ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｌａｂｅｌｓｉｎ　ｌ　ｍｍｕ ｎｏａｓｓａｙｓ）　Ｊ　、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＣｈｅＩＩｌｉｓｔｒｙ　２９ 　：　１４７４〜１４７８（１９８４））。安定なアクリジニウムスルホンアミ ドエステルおよびフエネントリジン化合物の使用については、１９８６年１０月 ２２日に出願された継続中の米国特許出願第９２１，９７９号明細書（該出願は 本出願と同じ出願人であり、参照のため本明細書中に引用する）に記載されてい る。

長命な（ｌｏｎｇ−１ｉｖｅｄ）ルミネッセンスシグナルの発生は、アダマンタ ン構造を有するジオキセクン化合物に対し酵素または親核剤を作用させるとみら れることが文献に記載されている。たとえば、米国特許第４．９６２．１９２号 、ジャツブ（Ａ、　Ｐ、　５ｃｈａｐｐ）の公開されたＥＰＯ出願第ＥＰ　０− ２５４−０５１−Ａ２；ブロンスティン（１、Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ）の公開され たＰＣＴ出願第Ｗ○８８１　００６９４　（ＷＯ８９０６６５０）：ブロンーデ インダス・オン・ザ・フィツス・インターナショナル・コンファランス・オン・ バイオルミネッセンス・アンド・ケミルミネッセンス（Ｐｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　 ｏｆ　ｔｈｅ　Ｖｔｈ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ＣｈｅｍｉｌｕｌＱｉｎｅｓ ｃｅｎｃｅ）　、フローレンスーボローニャ、イタリー、１９８８年９月２５〜 ２８日およびザ・ジャーナル・オン・バイオルミネッセンス・アンド・ケミルミ ネッセンス（ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｕＩｌ＋１ｎｅｓｃｅｎｃ ｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）　４　：　９９　（１９８ ８）中のブロンスティンらの「１，２−ジオキセタンズ、ノーベル・ケミルミネ ッセント・サブストレイツ、アプリケーションズ・トウ・イムノアッセイズ（１ ，２−Ｄｉｏｘｅｔａｎｅｓ、　Ｎｏｖｅｌ　ＣｈｅＩＩｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅ ｎｔ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓ、　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）　Ｊ　、および米国特許第４．９５０．５９３号 参照。

多孔質マトリックス中の化学ルミネッセンス反応の誘起およびその後の固定化微 細粒子からのシグナルの検出が、継続中の米国特許出願第２０６．６４５号（該 出願は本出願と同じ出願人であり、参照のため本明細書中に引用する）に記載さ れている。多孔質マトリックス中での化学ルミネッセンス検出を用いたイオン捕 捉分離法の使用が、継続中の米国特許出願第４２５．６４３号（該出願は本出願 と同じ出願人であり、参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。

同じ試料中で複数の分析対象物の同時試験を行うことができれば、幾つかの利点 が得られるであろう。第一に、同じ試料処理時間に対して複数のアッセイ結果を 得ることができ、それゆえ、自動化装置の処理量が増大する。第二に、試験当た りの費用が低減するであろう。なぜなら、使い捨て試験装置の同じ位置を幾つか の試験結果に対して用いることができるからである。第三に、使用した使い捨て 試験装置の容量、従って、生物学的に危険な廃棄物質の量を減らすことができる であろう。第四に、ウィルス抗原やウィルス抗原に対する抗体などの分析対象物 の同時アッセイが可能であり、より良好なスクリーニング試験が得られる。最後 に、薬剤や薬剤とその代謝産物などの異なる分析対象物の同時アッセイが可能で あり、それゆえ、アッセイの予測的価値が増大し、そのことが今度は一層正確な 診断をもたらす。

化学ルミネッセンスを用いた複数の分析対象物の同時検出は、化学的に励起する ことのできる分子種の数が限られているため、これまで達成することができなか った。わずかに限られた発光波長が利用できたにすぎない。また、２つの独立し た種を励起することの可能な蛍光検出の場合のような励起波長の選択が化学ルミ ネッセンス測定の場合には適用できない。最後に、光を発生する化学反応の大部 分は反応条件という観点で互いに両立しないものである。

本発明は、同じ反応条件下で発生する光放出の時間分解（ｔｉｍｅ　ｒｅｓｏｌ ｕｔｉｏｎｓ）を用いることにより、化学ルミネッセンスアッセイにおいて分析 対象物の同時決定を可能にすることによって、従来の方法の問題点を解決する。

本発明は、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイにおいて分析対象物の同時 測定を達成した新規方法を提供する。このことが、今度は該アッセイの予測的価 値を高め、一層正確な診断を可能とする。

発明の要約 本発明は、試験試料中に存在するかもしれない複数の分析対象物の決定法であっ て、（ａ）試験試料を、固相に結合した特異的結合ペアの成員の混合物とともに 分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアを形成するのに充分な時間および条件 下でインキュベートし；　（ｂ）かくして生成した特異的結合ペアとともに、各 分析対象物に対する特異的結合ペアの標識成員の混合物をインキュベートし、そ の際、各分析対象物は、誘起溶液との接触によって短命なまたは長命な異なる化 学ルミネッセンスシグナルを生成し得る異なる化学ルミネッセンス化合物（標識 ）に結合する：　（Ｃ）誘起溶液を用いてシグナルを誘起し：　（ｄ）検出した 化学ルミネッセンスシグナルを測定し：ついで（ｅ）化学ルミネッセンス化合物 （標識）から生成したシグナルの時間−プロフィル（ｔｉｍｅ−ｐｒｏｆｉｌｅ ）の違いを計算することによって試験試料中の各分析対象物の存在および量を決 定することを特徴とする方法を提供する。固相には、粒子のグループの混合物で あって各グループは一つの分析対象物に対する特異的結合ベアの成員が結合して いるもの、分析対象物に対する特異的結合ペアの成員の混合物をコーティングし たチューブ、粒子のグループの混合物からなる磁化できる粒子の懸濁液であって 粒子の各グループは分析対象物に対する特異的結合ペアの成員が結合しているも の、分析対象物に対する特異的結合ペアの成員の混合物をコーティングしたプラ スチックビーズ、および分析対象物に対する特異的結合ペアの成員を化学結合に よって結合した誘導体化メンプラン（該成員は、全メンプランまたは該メンプラ ンの別個の領域をカバーする）が挙げられる。上記方法にはまた、分離工程が含 まれていてもよい。固相が微細粒子に結合した分析対象物／分析対象物特異的結 合ベアからなる場合には、多孔質要素上での微細粒子の分離および該固相の洗浄 を行うことができる。

固相が磁化可能な粒子からなる場合には、分離工程は磁気分離によって行うこと ができる。

本発明はまた、競合結合化学ルミネッセンスアッセイを用いて分析対象物を含有 するかもしれない試験試料中で複数の分析対象物の同時決定を行う方法であって 、（ａ）試験試料を、既知量の化学ルミネッセンス標識した分析対象物（それぞ れ短命なまたは長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成することができる）お よび該分析対象物に対する特異的結合ペアの成員の混合物が限られた量で結合し た固相と分析対象物／分析対象物特異的結合成員を形成するに充分な時間および 条件下でインキュベートし：　（ｂ）これら標識の一つに特異的な基質を加え、 長命な化学ルミネッセンス生成反応を起こさせ；　（Ｃ）得られた混合物をアル カリ過酸化物で誘起し；ついで（ｄ）生成した化学ルミネッセンスシグナルの短 命な成分および長命な成分を統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）および時間識別（ ｔｉｍｅ−ｄｉｓｃｒｉ履ｉｎａｔｉｎｇ）することを特徴とする方法をも提供 する。分析対象物には、ハブテン、巨大分子、代謝産物および抗体が含まれる。

競合結合化学ルミネッセンスアッセイを用いた分析対象物を含有するかもしれな い試験試料中の複数の分析対象物の同時決定のためのさらに別の態様においては 、アッセイは、（ａ）試験試料を、既知量の化学ルミネッセンス標識した特異的 結合ベア成員（各成員は短命なまたは長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成 し得る）および分析対象物誘導体の混合物が結合した固相と分析対象物／抗分析 対象物特異的結合ベアを形成するに充分な時間および条件下でインキュベートし ：　（ｂ）これら標識の一つに特異的な基質を加え、長命な化学ルミネッセンス 生成反応を起こさせ：　（Ｃ）得られた混合物を他の標識に特異的な誘起溶液で 誘起し：ついで（ｄ）生成した化学ルミネッセンスシグナルの短命な成分および 長命な成分を統合および時間識別することを特徴とする方法をも提供する。

本発明はさらに、試験試料中に存在するかもしれない複数の分析対象物のいずれ かに対して同時化学ルミネッセンスアッセイを行う方法であって、（ａ）試験試 料を、分析対象物に対する特異的結合成員ベアの成員の混合物をコーティングし た固相とともにインキュベートして分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアを 形成させ；　（ｂ）該固相を分離し：　（Ｃ）誘起溶液との接触によって短命な または長命な異なる化学ルミネッセンスシグナルを生成し得る異なる化学ルミネ ッセンス化合物（標識）を結合させた分析対象物に対する特異的結合ペアの成員 の混合物を加えてこれをインキュベートし：　（ｄ）これら標識の一つに対する 基質を加え、これをインキュベートして長命な化学ルミネッセンス生成反応を起 こさせ；　（ｅ）得られた混合物を誘起溶液で誘起し；ついで（ｆ＞生成した化 学ルミネッセンスシグナルを統合し、生成したシグナルの短命な成分および長命 な成分を時間識別することを特徴とする方法をも提供する。試験することのでき る分析対象物としては、感染性疾患の抗原、ホルモン、癌マーカーおよびＤＮＡ プローブ配列が挙げられる。

本発明はさらに、いずれかの分析対象物を含有するかもしれない試験試料中の複 数の分析対象物の決定法であって、（ａ）試験試料を、ポリマーイオン性分子に 結合した各分析対象物の特異的結合ペアの成員の混合物とともにインキュベート し；　（ｂ）各分析対象物に対する特異的結合ペアの化学ルミネッセンス標識し た成員の混合物を加え、その際、各分析対象物は、誘起溶液との接触によって短 命なまたは長命な異なる化学ルミネッセンスシグナルを生成し得る異なる化学ル ミネッセンス化合物（標識）と結合し、これを分析対象物／抗分析対象物特異的 結合ペアの反応混合物を形成させ；　（Ｃ）この反応混合物を、ポリマーカチオ ン性化合物で処理した多孔質メンンブランに移し：　（ｄ）誘起溶液で化学ルミ ネッセンスングナルを誘起し：　（ｅ）生成した化学ルミネッセンスシグナルを 検出し、ついで（ｆ）化学ルミネッセンス化合物（標識）から生成したシグナル の時間−プロフィルの違いから各分析対象物の存在および量を決定することを特 徴とする方法をも提供する。分析対象物としては、ハブテン、巨大分子、代謝産 物、抗体、感染性疾患の抗原、ホルモン、癌マーカーおよびＤＮＡプローブ配列 が挙げられる。

本発明はまた、２つの分析対象物の同時決定を行うためのキットであって、各分 析対象物に対する特異的結合ペアの成員を含有する容器からなり、各分析対象物 が、誘起溶液との接触により短命なまたは長命な異なる化学ルミネッセンスシグ ナルを生成し得る異なる化学ルミネッセンス化合物（標識）と結合するキットを も提供する。このキット中の短命な化学ルミネッセンス化合物（標識）はアクリ ジニウムスルホンアミド化合物（標識）であり、また長命な化学ルミネッセンス 化合物はアルカリホスファターゼ基質またはβ−ガラクトシダーゼ基質である。

発明の詳細な記載 アクリジニウム化合物（標識）の化学ルミネッセンスとしての性質およびイムノ アッセイへの使用は記載されている。アクリジニウムエステルまたはアクリジニ ウムスルホンアミド標識を用いた免疫化学トレーサーは、アルカリ過酸化物溶液 で誘起して化学ルミネッセンスシグナルを生じさせることができる（該シグナル は約２秒後に最大になる）。光の放出は１０秒後には完全に消滅する。高量子収 量の安定なトレーサーを調製するため、アクリジニウムスルホンアミド標識化学 をこの発明に従ワて用いることができる。そのような化学は、１９８９年６月２ ３日に出願した発明の名称が「化学ルミネッセンスアクリジニウム塩」の継続中 の米国特許出願第３７１，７６３号（該出願は本出願と同じ出願人であり、参照 のため本明細書中に引用する）に記載されている。

化学的に触媒した長命な化学ルミネッセンス１．２−ジオキセタンは、種々の方 法で生成させることができる。それゆえ、シロキシ置換ジオキセタン、４−（５ 、ｔｅｒ−ブチルジメチルシロキン−２−ナフチル）−４−メトキシスピロ［１ ゜２−ジオキモクン−３，２′アダマンタン］は、テトラブチルアンモニウムフ ルオリド溶液で誘起して２０分分間風化学ルミネッセンスシグナルを生成する。

また、アリールエステラーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダ ーゼなどの酵素は、アダマンクン骨格で安定化したアリールジオキセタン誘導体 と反応して同様の長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成する。さらに、３（ ２’−スピロアダマンタン）−４−メトキン−４−（３”−ホスホリルオキシ） −フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）および同様のβ−ガラクトシ ダーゼ基質のアルカリホスファターゼ触媒反応からの長命な発光は、これら化合 物（標ｉりのイムノアッセイにおける使用とともにＷＯ８８１００６９４に記載 されている。アルカリホスファターゼ標識法およびβ−ガラクトシダーゼ標識法 は公知であり、触媒したジオキセタン化学ルミネッセンスをこの発明に従って用 いて長命なシグナルを生成させることができる。

本発明によれば、短命な化学ルミネッセンス標識は、短命なシグナルを生成する ことができる限り、いかなるアクリジニウムおよび／またはフエナントリジニウ ム化合物（標識）であってもいかなる化学ルミネッセンス化合物（標識）であっ てもよい。ルミノール誘導体もまた、反応が誘起され崩壊が数秒で起こるような 仕方で、ｐＨおよび触媒の誘起条件にて行う化学ルミネッセンス生成反応に用い ることができる。

この発明による長命な化学ルミネッセンス化合物（標識）は、アルカリホスファ ターゼやβ−ガラクトンダーゼなどの酵素標識と反応して長い持続時間の化学ル ミネッセンスシグナルを生成することのできるジオキセタン化合物（標識）のク ラスの一つであってよい。また、ルミノールなどのように長命なシグナルを生成 するように形成することのできるあらゆる化合物、または長命なシグナルを生成 するあらゆる化合物を用いることができることも考えられる。アルカリホスファ ターゼは、ｐＨ８〜９でＡＭＰＰＤの分解を触媒して長い持続時間の化学ルミネ ッセンスシグナルを生成する。このｐＨを約１２に上げるとシグナルの生成が高 められる。β−ガラクトンダーゼはｐＨ８でＡＭＰＧＤの分解を触媒する。得ら れた中間体は、溶液のｐＨを約１２に上げることにより化学ルミネッセンスにな る。

これら条件下で長命な化学ルミネッセンスシグナルが生成する。

この発明による誘起溶液は、アルカリ過酸化物溶液である。この誘起溶液は、水 酸化ナトリウム溶液中に過酸化水素を添加するか、または水酸化ナトリウム中に 固体の尿素−過酸化水素付加物を溶解することにより調製することができる。

アルカリ過酸化物誘起溶液は、この発明によれば、アクリジニウム標識上に作用 して、高工不ルキー中間体の分解および励起アクリドン誘導体の生成により短命 な化学ルミネッセンスシグナルを生成する。アルカリ過酸化物はまた、この発明 によれば、酵素反応生成物の二ノール化を促進し、それゆえ化学ルミネッセンス シグナルの強化を促進する。このことは、シグナルのｐＨ−飛躍様（ｐＨ−ｊｕ ｍｐ−１ｉｋｅ）変化として現れる。アルカリ過酸化物はまた、この発明によれ ば、β−ガラクトンダーゼとＡＭＰＧＤとの非ルミネッセンス反応生成物とも反 応して長い持続時間の化学ルミネッセンスシグナルを生成する。

本発明による固相は、抗原または抗体が化学的または物理的に結合したポリマー 微細粒子の混合物である。使用できる微細粒子としては、半径が約１１から２０ μｍのポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレートま たは同様な粒子が挙げられる。これら粒子の好ましい分離法は、ガラス繊維マト リックス上で微細粒子を捕捉し、ついでこのマトリックス上で化学ルミネッセン ス反応を誘起することである。

他の好ましい分離法は、継続中の米国特許出願第１５０．２７８号および米国特 許ａ願第３７５，０２９号（ともに本願と同じ出願人であり、参照のため本明細 書中に引用する）に記載されているものである。これら出願にはイオン捕捉分離 の使用が記載されており、該方法では問題となっているアッセイのための抗体ま たは抗原をポリグルタミン酸やポリアクリル酸などのポリアニオン酸に化学的に 結合させる。繊維状パッドをカチオン性ポリマーで処理して該繊維を正に帯電さ せる。免疫化学反応生成物の分離は、正に帯電したパッドと負に帯電したポリア ニオン／免疫複合体との間の静電的な相互作用により行う。

使用可能な他の固相としては、抗原または抗体を化学的または物理的に結合した 磁化可能なポリマー微細粒子の混合物が挙げられる。使用できる磁化可能な微細 粒子は、酸化第二鉄または酸化クロムのコアおよびポリスチレン、カルボキシル 化ポリスチレン、ポリメチルアクリレートのコーティングを有しているのが好ま しい。これら粒子の好ましい分離法は、定磁石またはパルス磁石を使用し、該粒 子を洗浄し、ついで該分離した粒子を容器中で懸濁することであり、該容器中で 化学ルミネッセンス反応を生成し検出することができる。さらに他の固相は当業 者に知られており、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、ニ トロセルロースストリップ、メンプランその他が挙げられる。

抗原または抗体が化学的または物理的に結合したポリマー微細粒子は、本発明に 従い、結合反応において捕捉固相として用いて溶液中におけるこれら粒子の速い 拡散速度を利用し速やかな結果を得ることができる。この発明に従って用いるこ とのできる微細粒子としては、半径が約０．１〜２０μｍのポリスチレン、カル ボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレートまたは同様の粒子が挙げられ る。

本明細書に記載した本発明の方法により試験することのできる試験試料としては 、ヒトおよび動物の体液などの生物学的流体が挙げられる。それゆえ、全血、血 清、血漿、脳を髄液、尿、並びに細胞培養上澄み液などを用いることができる。

本明細書に使用する「分析対象物」とは、試験試料中に存在するかもしれない検 出すべき物質である。分析対象物は、特異的結合成員（抗体など）が天然に存在 するか、または特異的結合成員を調製することのできるあらゆる物質であってよ い。それゆえ、分析対象物は、アッセイにおいて１または２以上の特異的結合成 員と結合することのできる物質である。「分析対象物」はまた、感染性疾患の抗 原（ウィルス抗原、細菌抗原、リケッチア抗原など）を含み、さらにＣＥＡなど の癌マーカー、および巨大分子、ハブテンおよび／またはその代謝産物、その抗 体、その組合せも含む。特異的結合ペアの成員として、分析対象物は、ビタミン Ｂ１２の決定のための特異的結合ペアの成員としての内因子タンパク質の使用、 または炭水化物の決定のための特異的結合ペアの成員としてのレクチンの使用な どのような天然に存在する特異的結合パートナ−（ペア）により検出することが できる。分析対象物には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＤＮＡまたはＲＮ Ａプローブ配列、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与されるもの および不法目的で投与されるものを含む薬剤、細菌、ウィルス、およびこれら物 質のいずれかの代謝産物またはこれら物質のいずれかに対する抗体が含まれる。

そのような抗体の調製法の詳細および特異的結合成員としての使用の適切さにつ いては、当業者によく知られている。

本明細書において使用する「捕捉試薬」は、サンドイッチアッセイにおけるよう に分析対象物に対して特異的であるか、競合アッセイにおけるように指示試薬ま たは分析対象物に対して特異的であるか、または間接アッセイにおけるように補 助特異的結合成員（このもの自体が分析対象物に特異的である）に特異的な非標 識の特異的結合成員をいう。捕捉試薬は、アッセイを行う前またはアッセイを行 っている間に固相物質に直接または間接に結合することができ、それにより試験 試料から固定化複合体を分離することが可能となる。

「指示試薬」は、分析対象物に対する特異的結合成員に結合した、外部手段によ って検出てきる測定可能なシグナルを生成することのできるシグナル生成化合物 （標識）からなる。本明細書において使用する「特異的結合成員」とは、特異的 結合ベアの成員を意味する。すなわち、化学的または物理的手段により一方の分 子が第二の分子に特異的に結合するような２つの異なる分子である。分析対象物 のための特異的結合ベアの抗体成員であることに加えて、指示試薬はまた、ビオ チンまたは抗ビオチンなどのハプテン−抗−ノ＼ブテン系、アビジンまたはビオ チン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子ま たはレセプター分子、酵素コファクターと酵素、酵素インヒビターまたは酵素な どを含むあらゆる特異的結合ペアの成員であってよい。免疫反応性の特異的結合 成員は、抗体、抗原、またはサンドイッチアッセイにおけるように分析対象物に 結合し得る、競合アッセイにおけるように捕捉試薬に結合し得る、または間接ア ・ソセイにおけるように補助特異的結合成員に結合し得る抗体／抗原複合体であ ってよい。

本発明を実行するうえで考えられる種々のシグナル生成化合物（標識）としては 、アクリジニウムスルホンアミド、アクリジニウムエステルまたはツェナトリジ ン化合物（標識）などの短命な化学ルミネッセンスシグナル生成化合物（標識） 、および長命な化学ルミネッセンスシグナル生成化合物（標識）（そのシグナル は、アダマンタン構造を有するジオキセタン化合物に対する酵素または核試薬の 作用による）が挙げられる。

このアッセイに用いる試薬は、バイアルやびんなどの１または２以上の容器を有 するキットの形態で提供することができ、各容器にはア・ンセイにおＬＮて捕捉 相または指示試薬（シグナル生成化合物として化学ルミネ・ツセンス化合物（標 識）を含む）として用いられるモノクローナル抗体などの別々の試薬またはモノ クローナル抗体のカクテルを入れることが考えられる。

この発明によれば、目的とする分析対象物のいずれかまたはすべてを含有してい るかもしれない試験試料、本明細書に記載したようにして標識した分析対象物に 対するプローブの混合物、および分析対象物に対する捕捉相の混合物を、分析対 象物にとって最適の免疫化学的結合反応が起こるのに充分な時間および条件下で インキュベートする。ついで、捕捉相を分離し、洗浄する。ついで、アルカリホ スファターゼ標識に特異的な基質を加える。この基質はこの酵素標識の作用によ って化学ルミネッセンスとなる。酵素／基質反応が終点に達した後、分離した反 応混合物をアルカリ過酸化物溶液を用いて誘起させる。シグナルを約４〜１０秒 間にわたって回収し、統合してｐＨ飛躍増大したアルカリホスファターゼ触媒に よる化学ルミネッセンスとアルカリ過酸化物により誘起したアクリジニウムスル ホンアミドの化学ルミネッセンスとの合計を得る。残りのシグナルを回収し、等 しい時間間隔について統合して定常状態の酵素触媒された化学ルミネッセンスを 得る。２つの分析対象物を試験する場合には、２つの時間間隔で回収したシグナ ルの相対的な大きさから２つの分析対象物のいずれかの存在または不存在を決定 する。

この発明のアッセイ法を行う別態様において、目的とする分析対象物のいずれか またはすべてを含有しているかもしれない試験試料、本明細書に記載したように して標識した分析対象物に対するプローブの混合物、および分析対象物に対する 捕捉相の混合物を、分析対象物にとって最適の免疫化学的結合反応が起こるのに 充分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、捕捉相を分離し、洗浄 する。ついで、アルカリホスファターゼ標識に特異的な基質を加える。この基質 はこの酵素標識の作用によって化学ルミネッセンスとなる。酵素／基質反応が終 点に達した後、酵素標識に対応する生成した化学ルミネッセンスシグナルを統合 する。ついで、分離した反応混合物をアルカリ過酸化物溶液を用いて誘起する。

シグナルを数１００ミリセカンドにわたって回収し、このシグナルはアルカリ過 酸化物により誘起したアクリジニウムスルホンアミドの化学ルミネッセンスに対 応する。２つの分析対象物を試験する場合には、２つの時間間隔で回収したシグ ナルの相対的な大きさから２つの分析対象物のいずれかの存在または不存在を決 定する。

この発明のさらに別の態様において、目的とする分析対象物のいずれかまたはす べてを含有しているかもしれない試験試料、本明細書に記載したようにして標識 した分析対象物に対するプローブの混合物、および分析対象物に対する捕捉相の 混合物を、分析対象物にとって最適の免疫化学的結合反応が起こるのに充分な時 間および条件下でインキュベートする。ついで、捕捉相を分離し、洗浄する。

ついで、β−ガラクトシダーセ標識に特異的な基質を加える。この基質はこの酵 素標識の作用によって加水分解される。酵素／基質反応が終点に達した後、分離 した反応混合物をアルカリ過酸化物溶液を用いて誘起する。シグナルを約１秒に わたって回収し、統合してアルカリ過酸化物により誘起したアクリジニウムスル ホンアミドの化学ルミネッセンスを得る。残りのシグナルを４〜５秒の遅れの後 に回収し、等しい時間間隔について統合して定常状態にある酵素触媒生成物（ア ルカリ過酸化物の作用により化学ルミネッセンスとなる）を得る。２つの分析対 象物を試験する場合には、２つの時間間隔で回収したシグナルの相対的な大きさ から２つの分析対象物のいずれかの存在または不存在を決定する。

複数の分析対象物のための微細粒子に基づく１工程サンドイツチイムノアツセイ は、この発明に従って以下のようにして行う。目的とする分析対象物のいずれか またはすべてを含有しているかもしれない試験試料を、目的とする第一の分析対 象物に対するポリクローナル抗体をコーティングした第一のグループと目的とす る第二の分析対象物に対するポリクローナル抗体をコーティングした第二のグル ープとの２つのグループからなる微細粒子の混合物と接触させる。ついで、標識 抗体の結合体混合物を反応容器に加える。この混合物中の１つの抗体は第一の分 析対象物に対して特異的であり、短命な化学ルミネッセンスシグナル生成化合物 （標識）（アクリジニウムスルホンアミド、アクリジニウムエステルまたはフエ ナントリジン化合物など）で標識しである（に結合している）。結合体混合物の 第二の抗体はアルカリホスファターゼで標識しである。この混合物を分析対象物 に特異的な複合体（分析対象物と抗分析対象物抗体からなる）を形成するのに充 分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、微細粒子を分離し、洗浄 する。好ましい分離方法は、継続中の米国特許出願第０７／１８４．７２６号（ 本願と同じ出願人であり、参照のため本明細書中に引用する）に記載されている 流体除去法を用いたガラス繊維パッドを用いたものである。ついで、公開された ＥＰ　Ｏ２５４０５１号またはＷＯ８８１００６９４に記載されているような、 反応したときに長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成し得るアルカリホスフ ァターゼ基質を分離した粒子に加え、定常状態に達するのに充分な時間および条 件下で反応させる。これには一般に数分しかかからない。ついて、微細粒子と基 質との反応生成物を、継続中の米国特許出願第０７／２０６．６４５号に記載さ れているような装置中でアルカリ過酸化物溶液を用いて誘起する。

本発明の他の方法は、目的とする分析対象物のいずれかまたは両方を含有するか もしれない試験試料を、２つのグループの微細粒子からなる混合物と接触させる ことからなる。微細粒子の一方のグループは、第一の分析対象物のエピトープに 特異的に結合するモノクローナル抗体をコーティングしてあり、微細粒子の第二 のグループは、第二の分析対象物の１つのエピトープに特異的に結合するモノク ローナル抗体をコーティングしである。標識抗体の結合体混合物を反応容器に加 える。結合体混合物の１つの抗体は第一の分析対象物に特異的であり、短命な化 学ルミネッセンスシグナルを生成する標識（アクリンニウムスルホンアミド、ア クリジニウムエステル、またはフエナントリジン化合物（標識）など）で標識し である。結合体混合物の第二の抗体は第二の分析対象物に特異的であり、アルカ リホスファターゼで標識しである。この混合物を分析対象物／抗分析対象物／抗 抗分析対象物複合体を生成するに充分な時間および条件下でインキュベートする 。ついて、微細粒子を分離し、洗浄し、上記のようにして化学ルミネッセンスシ グナルを誘起し、測定する。

本明細書に記載する方法の他の態様において、微細粒子をポリクローナル抗体で コーティングし、結合体は標識ポリクローナル抗体の混合物である。

２つの分析対象物のための微細粒子に基づいた２工程サンドイツチイムノアツセ イは、本発明に従って以下のように行うことができる。目的とする分析対象物の いずれかまたは両方を含有しているかもしれない試験試料、および第一の分析対 象物に特異的なポリクローナル抗体をコーティングした第一のグループの粒子と 第二の分析対象物に対するポリクローナル抗体をコーティングした第二のグルー プの粒子との２つのグループの粒子からなる微細粒子の混合物を接触させる。

試験試料および微細粒子を、分析対象物が粒子に結合するのに充分な時間および 条件下でインキュベートする。ついで、微細粒子を分離し、洗浄する。好ましい 分離方法は、継続中の米国特許出願第１８４．７２６号（参照のためすでに本明 細書中に引用した）に記載されている流体除去法を用いたガラス繊維パッド上で のものである。標識抗体の結合体混合物をパッド上の分離した粒子に加える。こ の結合体混合物中の１つの抗体は第一の分析対象物に対して特異的であり、短命 な化学ルミネッセンス生成標識（アクリジニウムスルホンアミド、アクリジニウ ムエステルまたはフエナントリジン化合物（標識）など）で標識しである。結合 体混合物の第二の抗体は第二の分析対象物に特異的であり、アルカリホスファタ ーゼで標識しである。この結合体混合物を上記分離した粒子とともに複合体を形 成するのに充分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、過剰の結合 体混合物を洗浄により除去する。ついで、反応したときに長命な化学ルミネッセ ンスシグナルを生成し得るアルカリホスファターゼ基質を上記分離した粒子に加 える。この混合物を定常状態に達しそれゆえ基質反応生成物を形成するのに充分 な時間および条件下で反応させる。定常状態に達するまでの時間は、通常、数分 しかかからない。ついで、微細粒子と基質との反応生成物を、上記ですでに参照 のために引用した継続中の米国特許出願第２０６．６４５号に記載されているよ うな反応容器中でアルカリ過酸化物溶液を用いて誘起する。

本発明のさらに別の態様において、目的とする分析対象物のいずれかを含有して いるかもしれない試験試料、および第一の分析対象物のエピトープに対するモノ クローナル抗体をコーティングした第一のグループの粒子と第二の分析対象物の エピトープに特異的なモノクローナル抗体をコーティングした第二のグループの 粒子との２つのグループの微細粒子からなる混合物を接触させる。この混合物を 、分析対象物／抗分析対象物抗体の複合体を生成するのに充分な時間および条件 下でインキュベートする。ついで、微細粒子を分離し、洗浄する。ついで、かく して生成した複合体に標識抗体の結合体混合物を加える。結合体混合物の一つの 抗体は第一の分析対象物に特異的であり、短命な化学ルミネッセンス生成標識（ アクリジニウムスルホンアミド、アクリジニウムエステルまたはフエナントリジ ン化合物（標ｗ１）など）で標識しである。結合体混合物の第二の抗体は第二の 分析対象物に特異的であり、アルカリホスファターゼで標識しである。該結合体 が分析対象物／抗分析対象物複合体のいずれかまたは両方に結合するのに充分な 時間および条件下でインキュベートした後、過剰の結合体混合物を洗浄により除 去し、化学ルミネッセンスシグナルを生成させ、測定する。

別法として、微細粒子をポリクローナル抗体でコーティングし、結合体は標識ポ リクローナル抗体の混合物であってもよい。

速やかな溶液−相免疫化学反応を行うため、１９８８年１月２９日に出願した継 続中の米国特許出願第１５０．２７８号（本願と同じ出願人であり、参照のため 本明細書中に引用する）に記載されているような、固定化し得る反応複合体を負 に帯電したポリマーを用いて固定化するためのイオン捕捉法を本発明に従って用 いることができる。固定化し得る免疫複合体を、負に帯電したポリ−アニオン／ 免疫複合体と前以て処理した正に帯電した多孔質マトリックスとの間のイオン相 互作用により反応混合物の残り部分から分離し、継続中の米国特許出願第４２５ 、６４３号（上記ですでに参照のために引用した）に記載されているような化学 ルミネッセンスシグナルの測定により検出する。

２つのハブテンのためのイオン捕捉に基づく競合化学ルミネッセンスイムノアッ セイは、この発明に従って以下のようにして行うことができる。目的とする分析 対象物のいずれかを含有するかもしれない試験試料を標識抗体の混合物と接触さ せる。この混合物中の一つの抗体は第一のハブテンに特異的であり、アクリンニ ウムスルホンアミド、アクリジニウムエステルまたはフエナントリジン化合物（ 標識）で標識しである。この混合物の第二の抗体は第二のノ１ブテンに特異的で あり、アルカリホスファターゼで標識しである。試験試料および標識抗体の混合 物を、ハブテン／抗ハプテン複合体が反応混合物を生成するのに充分な時間およ び条件下でインキュベートする。ついで、この反応混合物に捕捉相の混合物を加 える。

捕捉相混合物は、２つの成分の混合物からなり、各成分はポリグルタミン酸残基 に結合したハブテンである。結合は直接、または担体を用いて行うことができる 。

本発明に従ってこれらアッセイを行うためのさらに別の方法は、微細粒子捕捉法 とイオン捕捉分離法との組合せを用いることである。それゆえ、２工程サンドイ ツチアツセイにおいて、複数の分析対象物を含有していると思われる試料を、一 つの分析対象物に対する特異的結合ペアの成員を結合させた微細粒子の混合物、 および第二の分析対象物に対する特異的結合ペアの成員を結合させたポリイオン 性残基とともにインキュベートすることができる。ついで、ポリイオン性残基と 反対の電荷を有するように処理しておいた多孔質マトリックスに反応混合物を移 す。微細粒子に捕捉された分析対象物は疎水的相互作用により多孔質マトリック ス上に保持され、ポリイオンに捕捉された分析対象物はイオン相互作用により反 対電荷の多孔質マトリックス上に保持される。保持された反応生成物を洗浄し、 結合体の混合物を多孔質マトリックスに加える。これら結合体の一つは、短命な 化学ルミネッセンスシグナルを生成するように誘起し得る標識で標識してあり、 他方は長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成する標識で標識しである。これ らシグナルを誘起し、時間分解により分離する。

本発明を実施例を用いて記載するが、これらは説明のためのものであり、本発明 の趣旨および範囲を限定するものではない。

実施例 実施例１．試薬の調製 フェンシフリジン（ＰＣＰ）捕捉試薬の調製は、遊離の酸の形態のポリグルタミ ン酸をフェニルジクリジン−４−クロロホルメートとカップリングすることによ り行った。この遊離の酸の形態のポリグルタミン酸は、以下の手順に従ってポリ グルタミン酸のナトリウム塩から調製した。Ｉｇｍのポリグルタミン酸ナトリウ ム塩（シグマ・ケミカル・カンパニー：セントルイス、ミズーリ州）を、水（２ ０ｍｌ）中に懸濁した７ｇｍのＡＧ５０Ｗ−Ｘ８カチオン交換樹脂（バイオ−ラ ド・ラボラトリーズ、リッチモノド、カリフォルニア州）とともに−夜撹拌した 。このイオン交換樹脂は前以て膨潤させ、蒸留水で洗浄した。上澄み液を樹脂か ら分離し、凍結乾燥して遊離の酸の形態のポリグルタミン酸（約０．８　ｇ）を 得た。

ＰＣＰ−４−クロロホルメートは、テトラヒドロフラン（０，５ｍ　ｌ　）中の ４−ヒドロキシフエニルンクリンン（１，１ｍｇ、４．２４Ｘ１０−’モル）を ベンゼン中のホスゲンの１０％溶液（０，５ｍ１）（１３０モル過剰）と反応さ せることにより調製した。反応は室温で２．５時間行った。窒素流下で溶媒を蒸 発させてＰＣＰ−４−クロロホルメートの残渣を得た。この残渣をテトラヒドロ フラン（０，５ｍ１）中に溶解し、これに１−メチル−２−ピロリドン（アルド リッチ・ケミカル、ミルウオーキー、ウィスコンシン州）（０，５ｍ１）中の遊 離の酸の形態のポリグルタミン酸（ＭＷ４０．０００）（１，７ｍｇ）を加えた 。室温で一夜反応させ、ついで反応混合物を蒸発乾固した。乾燥した生成物を０ ．１ＭＩＪン酸ナトジナトリウム緩衝液７．０　（１，５ｍ１）中に溶解し、３ ．５００分子量カットオフ透析バッグ中の所定容量の同緩衝液に対して室温で一 夜透析した。沈澱を濾過した。濁った水性の濾液を透明になるまでメチレンクロ リド（フィッシャー・サイエンティフィツク、イタスカ、イリノイ州）で抽出し た。

蛍光偏光イムノアッセイにより、ＰＧＡ残基上のＰＣＰの存在が確認された（ア ボットＴＤｘＲ（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州、６ ００６４から入手可能）上で行った）。水性層を、１％にべ、１００ｍＭ塩化ナ トリウム、２５ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０ １％アジ化ナトリウムを含有する溶液（ｐＨ７，２）中で希釈して１．８７５μ ｇｍ／ｍｌのＰＣＰ−ＰＧＡ捕捉試薬を得た。

モルヒネ捕捉試薬の調製は、遊離の酸の形態のポリグルタミン酸のイソチオンア ネート誘導体をモルヒネ−卵アルブミンとカップリングさせることにより行った 。遊離の酸の形態のポリグルタミン酸をイソチオンアネートに誘導体化する（ｒ Ｔｃ−ＰＧＡＦＡ）ことによって活性化した。このイソチオンアネート誘導体を 卵アルブミンと反応させて卵アルブミン−ＰＧＡを生成させた。最後に、イソブ チルクロロホルメートを用いてモルヒネを卵アルブミン−ＰＧＡにカップリング して捕捉試薬：モルヒネー卵アルブミン−ＰＧＡを得た。

使用した手順は以下の通りであった。遊離の酸の形態のポリグルタミン酸（１０ ｍｇ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍｌ）中に溶解した。ジメチルホ ルムアミド（０，２ｍ　ｌ　）中のプロトン吸収剤４−メチルモルホリン（０， ０１ｍ１）および１．４−フェニレンジイソチオシアネート（ＤＩＴＣ）（アル ドリッチ・ケミカル、ミルウォーキー、ウイスコンンン州から入手可能）（４， ８ｍｇ）をこの溶液に加えた（１００モル過剰）。この反応混合物を室温で一夜 撹拌し、ついでロータリーエバポレーターを用いて濃縮した。メチレンクロリド （２５ｍｌ）を滴下してＩＴＣ−ＰＧＡＦＡを沈澱させた。綿毛状の沈澱を遠心 分離にかけ、メチレンクロリドおよび未反応のＤＩＴＣをデカントした。ついで 、沈澱をジメチルホルムアミド（１ｍｌ）中に懸濁した。この沈澱／遠心分離／ 懸濁の手順を、シリカスライド上の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて 上澄み液中にもはやＤＩＴＣが検出されなくなるまで繰り返した。残留した固体 を真空乾燥してＩＴＣ−ＰＧＡＦＡを黄色の粉末として得た。

卵アルブミン−ＰＧＡを以下の手順に従って調製した。卵アルブミン（シグマ・ ケミカル、セントルイス、ミズーリ州より入手可能）（１０ｍｇ）を０．２Ｍリ ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５，１５ｍ１）中に溶解し、０．４５μｍ注射 器フィルターで濾過した。この溶液を、超音波処理によって３ｍｌの０．２Ｍリ ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）中に溶解させたＩＴＣ−ＰＧＡ　（１３３ ，３ｍｇ）と反応させた。ついで、ｐＨをＩＮ水酸化ナトリウムで８５に調節し た。

この混合物を３７℃で一夜インキユベートし、ついでＯ，１Ｍリン酸ナトリウム 、０．３Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ６，８）を用いて５ｍ１／分で行うＴＳＫ−３ ００ｏｓｗｃ分取ゲル濾過カラム（ベックマン・インスツルメンツ、アーリント ンハイツ、イリノイ州より入手可能）を用いたＨＰＬＣ装置上で分画した。フラ クションを２８０ｎｍで吸光度検出器を用いてモニターした。２ｍｌずつのフラ クションに分け、ボイド容量から出発して６つのフラクション（１２ｍｌ）を１ つにした。７７．１８μｇ／ｍｌ卵アルブミンを含有する卵アルブミン−ＰＧＡ の第二フラクション（６，５ｍ１）を、３．５００分子量カットオフ透析チュー ブ中、所定量の０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（＋）Ｈ８，５）に対して透析した。

１ｍｇのモルヒネ３−β−Ｄ−グルクロニド（シグマ・ケミカル、セントルイス 、ミズーリ州）　ＭＷ　４６１．５を、０℃にてＤＭＦ中の１００モル過剰のイ ソブチルクロロホルメート（ＭＷ　１３６．１５、シグマ・ケミカル、セントル イス、ミズーリ州より入手可能）および１００モル過剰の４−メチルモルポリン と１７２時間反応させることにより活性化した。活性化したモルヒネ誘導体を上 記透析した卵アルブミン−ＰＧＡに加え、水浴中、０〜４℃にて１時間保持した 。

ついで、この反応混合物を室温で一夜保持した。この生成物溶液を３．５００分 子量カットオフ透析バッグ中、ｐＨ８，５にて０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液 に対して透析してカップリングしていないモルヒネを除去した。回収した透析物 を、市販のアナライザー（ＴＤｘＲ，アボット・ラボラトリーズ、ノースジカゴ 、イリノイ州）を用いてモルヒネについて蛍光偏光イムノアッセイを行ったとこ ろ、卵アルブミン−ＰＧＡ残基当たり３．５モルヒネ分子が得られた。この捕捉 試薬（モルヒネ−卵アルブミン−ＰＧＡ）を、１％にべ、２５ｍＭトリス、１０ ０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛および０ ．１％アシ化ナトリウムを含有する緩衝溶液中で７．２のｐＨにて希釈した。最 終濃度　“は２４９．９ｎｇ卵アルブミン／ｍｌであった。

これら２つの個々のアッセイ捕捉試薬を混合することにより同時アッセイ捕捉試 薬を調製した。溶液を一緒に希釈して最終溶液（１％にべ、２５ｍＭトリス、１ ００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛および ０．１％アジ化ナトリウムをｐＨ７，２にて含有）中の１．８７５μｇ／ｍｌの フェニルジクリジン−ポリグルタミン酸および０２５μｇ／ｍｌのモルヒネ−卵 アルブミン−ポリグルタミン酸が得られた。

当該技術分野で知られたＥＤＡＣカップリング法を用い、モノクローナル抗フェ ニルジクリジン抗体をアクリジニウムスルホンアミドで標識した。ついで、これ を１％にべ、２５ｍＭトリス、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシ ウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、１０％正常マウス血清および０．１％アジ化ナトリ ウムをｐＨ７，２にて含有する緩衝液中に希釈した。最終抗体濃度は１１８μｇ ／ｍｌであった。

モノクローナル抗モルヒネ抗体を当該技術分野で知られた方法を用いてアルカリ ホスファターゼで標識した。これを抗フェニルジクリジンーアクリジニウムプロ ーブに用いたのと同じ緩衝液中に希釈した。その最終濃度は４８．２ｎｇ／ｍ１ であった。

同時アッセイプローブは、同じ緩衝液中に希釈したアクリジニウムに結合したモ ノクローナル抗フェニルンクリジン抗体（１１８μｇ／ｍｌ）およびアルカリホ スファターゼに結合したモノクローナル抗モルヒネ抗体（４８，２ｎｇ／ｍ＋） からなっていた。

アルカリホスファターゼ基質溶液は、ｐＨ９，５にて１ｍＭ塩化マグネシウムを 含有する０、　０５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液の溶液中の０．４ｍＭの３−　（ ２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ） フェニル−１，２，ジオキセタン、ＡＭＰＰＤ（ｈｏピックス（Ｔｒｏｐｉｘ　 Ｉｎｃ、）　、ベッドフォード、マサチューセッツ州より入手可能）二ナトリウ ム塩であった。

このアッセイに用いた使い捨て反応トレイは、継続中の米国特許出願第４２５゜ ６５１号（本願と同じ出願人であり、参照のため本明細書中に引用する）に記載 されたものであった。装置は、漏斗様構造、多孔質要素、および吸着物質がらな っており、これらは該多孔質要素と該吸着物質との間で密な接触が得られるよう に配列されていた。多孔質要素は、０．０５インチの規定の厚さを有しホリンゲ スワース・アンド・ボス（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ　ａｎｄ　Ｖｏｓｓ　Ｃ ｏ、）　、イーストゥオルポール、マサチューセッツ州から入手可能な繊維状ガ ラス物質、製品Ｎｏ、４１１１ガラス繊維濾紙からできていた。これをポリマー 性の第四級アンモニウム化合物、セルコート（Ｃｅｌｑｕａｔ）　”Ｌ−２００ （ナショナル・スターチ・アンド・ケミカル（Ｎａｔｉｏｎａｌ　５ｔａｒｃｈ 　ａｎｄ　ＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、ブリッジウォーター、ニューシ ャーシー州）の０．５％溶液で処理して固相物質に正の電荷を与えた。１０ｍＭ 塩化ナトリウム中の０．５％セルコートＴＭＬ−２００（８０μ］）を使い捨て 反応トレイの各多孔質要素に適用した。

実施例２　アクリノニウム標識フェニルジクリジンアッセイ使用した試験試料は 、市販の蛍光偏光キット（ＴＤｘ’キット、アボット・ラボラトリーズ、ノース ジカゴ、イリノイ州）からのフェニルジクリシンカリプレーターであり、ヒト尿 中の５００．２５０．１２０．６０．２５およびＯｎｇ／ｍｌ　ＰＣＰが含まれ ていた。８０μｍのトリス緩衝液（アボット・ラボラトリーズ、ノースジカゴ、 イリノイ州）を使い捨て反応トレイの検出壁の繊維状ガラスマトリックスパッド に分配した。そのつぎに、８０μｍの０５％セルコート”Ｌ−２００溶液を各パ ッドに分配した。２つのＦＭＩ−ＲＨポンプ（フルーイツト・メータリング（Ｆ ｌｕｉｄ　Ｍｅｔｅｒｉｎｇ　Ｉｎｃ、）　、オイスターベイ、ニューヨーク州 ）を用いて溶液を分配し、インテル３１０デベロツプメントシステム（Ｉ　ｎｔ ｅ１３１０　Ｄ６ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）　（インテル（Ｉｎｔｅ ｌ　Ｉｎｃ、）　、サニーベイル、カリフォルニア州）によりトライアックボー ドを介して制御した。このトレイをタイミングベルト（ｔｉａ＋ｉｎｇ　ｂｅｌ ｔ）およびステッパーモーター（ｓｔｅｐｐｅｒ　ｍｏｔｏｒ）を用いてリニア ートラック上を移動させた。ステッパーモーターは、当該技術分野て知られた要 素を使用したボードにより制御した。４．８分後、自動ピペッタ−を用い、試験 試料（５０μｍ）を使い捨て反応トレイの浅い反応ウェル中にピペットで入れた 。５０μｍのアクリジニウム−標識抗ＰＣＰ抗体を各インキュベーンコンウェル 中に分配した。３２℃で温度制御トンネル中で使い捨て反応トレイをトラック上 で移動させながら混合物を９６分間インキュベートした。タイミングベルトを０ ．８インチ／分の速度で進めていき、反応工程を起こすための各工程後に反応ト レイを３６秒静止させた。移動するタイミングベルト上で９゜６分間インキュベ ートした後、実施例１に記載と同様にして調製したＰＣＰ−ＰＧＡ捕捉試薬を１ １８μｇ　ＰＧＡ／ｍｌの濃度で含有する溶液＜５０ｕｌ）をウェルの中央にあ る先端を介してインキュベーションウェル中に分配し、テフロン８線によりＦＭ Ｉポンプに連結した。使い捨てトレイをトラックに沿って移動させ続けながら、 この反応混合物をさらにインキュベートした。４．８分後、第四級アンモニウム ポリマー処理した各ガラス繊維マトリックスを、検出ウェルの繊維状パッドの中 央にある先端から分配する１００μｍのＩＭｘＲトリス緩衝液（アボット・ラボ ラトリーズ、ノースジカゴ、イリノイ州より入手可能）で濯いだ。さらに４．８ 分後、継続中の米国特許出願第４２５．６４３号（上記ですでに参照のために引 用した）に記載の移転装置下に使い捨て反応トレイを置いた。ついで、１５０μ ｍアッセイ混合物を、浅いインキュベーションウェルから検出ウェル中の前処理 したガラス繊維マトリックス上に移転した。移転は、２１０ｃｍ／秒の一次速度 にて３つの隣接するノズルから一つの３５０μｌ適用量のＩＭｘ’トリス緩衝液 を射出することによって行った。移転流体をステッパー−モーター制御注射器ポ ンプによって射出した。バルブにより移転溶液を使い捨て反応トレイの各面に向 けた。ついで、移転した混合物を繊維状パッドを通して１２秒間排出した。つい で、５０μｍのＡＭＰＰＤ基質溶液を各検出ウェルに分配して繊維状マトリック スを飽和した。使い捨てトレイをタイミングベルト上で移動させて次のウェルベ アを移転装置下に置き、反応混合物を移転した。ついで、使い捨て装置を、化学 ルミネッセンス検出器（継続中の米国特許出願第４２５．６４３号に記載）が位 置する検出器！に移動させた。

検出ヘッドには２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）および光導波路があり、それぞれ 検出ウェルの中央に位置していた。各ＰＭＴの動力はパータン（Ｂ　ｅｒｔａｎ ）高ボルト電力供給（ｈｉｇｈ　ｖｏｌｔａｇｅ　ｐｏｗｅｒ　５ｕｐｐｌｙ） によるものであり、光子カウント増幅ボード（ｐｈｏｔｏｎ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ 　ａ＋ｎｐｌｉｆｉｅｒ　ｂｏａｒｄ）およびカウンター／タイマーボード（当 該技術分野で知られた成員および方法により構築）に連結されていた。各ＰＭＴ に連結した２つの誘起溶液インジェクターを、ブラックテフロン８チユーブおよ びマニホルドを用いてＦＭｒポンプに連結した。トレイが検出位置に達すると、 検出器ヘッドが下がって使い捨て品玉の表面特性により光を通さないソールを生 成した。ＰＭＴに高ボルトを負荷し、２つの誘起溶液ポンプおよびカウンター／ タイマーボードがインテル３１０デベロツプメントンステム（上記）により同時 に活性化された。基質を４８分間インキュベートした後、８５μｍの０３％アル カリ過酸化物誘起溶液を射出し、得られる化学ルミネッセンスを誘起溶液の射出 開始から８秒間測定して短命な化学ルミネッセンスシグナルの強度を得た。この アッセイの結果を表１に示す。短命なウィンドウ中の化学ルミネ・ソセンスング ナルは試料中のＰＣＰ濃度に従ったが、一方、長命なシグナルはＰＣＰ濃度のゆ っくりと変化する関数を有していた。当業者は、−署長期間のウィンドウまたは シグナル脱回旋（ｄｅｃｏｎνｏｌｕｔｉｏｎ）の式を適用し、第一のウィンド ウにおける用量作用曲線を改善し、第二のウィンドウにおける容量作用曲線を省 くことができる。また、洗浄溶液の容量、洗浄溶液の組成、移転緩衝溶液への界 面活性剤の添加、タンパク質（にべ、カゼインなど）の添加によるガラス繊維ノ く・ノドの前処理などのアッセイの最適化工程を変化させて用量作用曲線を改良 することも当業者に適用可能であり、これら変更も本発明の教示の範囲内に入る 。このアッセイのカットオフは２５　ｎ　ｇ／ｍ　ｌであると考えられた。表１ のデータは、２５ｎｇ／ｍｌ　ＰＣＰまたはそれ以上を含有する試験試料は陰性 コントロールと充分に識別でき、このことがアッセイ手順の有効性を示していた 。

！１ アクリシリニウム標識フェニルンクリジン化学ルミネッセンスイムノアッセイ（ ＣＬＩＡ） ［ＰＣＰ］　ｎｇ／ｍｌ　短命なシグナル　％Ｉ＊　長命なシグナル（０〜８秒 ）　（８〜１６秒） ０　１８８．３２９　０．０　２４，７１６２５　５０．３４７　７３．３　２ ０．５６０６０　３０．８３９　８３．６　１８．８９６１２０　２３．９７７ 　８７．３　１８．６３２２５０　２０．３７９　８９．２　１７．３８８５０ ０　１９．７５９　８９．５　１８．１８８＊％■＝抑制パーセント 実施例３４　アルカリホスファターゼ標識モルヒネアッセイ使用した試験試料は 市販のアヘン剤蛍光偏光キット（ＴＤｘ”キット、アボット・ラボラトリーズ、 ノースジカゴ、イリノイ州）からのカリブレーターであり、ヒト尿中の１０００ ．６００．３５０．２００．１００およびＯｎ　ｇ／ｍ　ｌ　モ／ｌ／ヒ不が含 まれていた。８０μｌのＩＭｘ’トリス緩衝溶液（アホット・ラボラトリーズ、 ノースジカゴ、イリノイ州より入手可能）、ついで８０μｍのセルコート”Ｌ− ２００溶液を実施例２にすでに記載した使い捨て反応トレイのガラス繊維マトリ ックス上に分配した。溶液を２つのＦＭＩ−ＲＨ水ポンプ用いて分配し、インテ ル３１０デベロソブメントシステム（インテル、サニーベイル、カリフォルニア 州）によりトライアックボードを介して制御した。このトレイをタイミングベル トおよびステッパーモーターを用いてリニアートラック上を移動させた。

ステッパーモーターは、当業者に知られた要素を使用したボードにより制御した 。

４．８分後、５０μｍのアルカリホスファターゼ標識抗モルヒネ抗体を各インキ ュベーションウェル中に分配した。３２℃にて温度制御トンネル中のトラック上 で使い捨て反応トレイを移動させながら、この混合物を９．６分間インキュベー トした。タイミングベルトを０．８インチ／分の速度で進めていき、反応工程を 起こすための各工程後に反応トレイを３６秒静止させた。移動するタイミングベ ルト上で９．６分間インキュベートした後、実施例１の記載と同様にして調製し たモルヒネ−卵アルブミン−ＰＧＡ捕捉試薬を０．２５μｇ　ＰＧＡ／ｍｌの濃 度で含有する溶液（５０μｍ）をウェルの中央にある先端を介してインキュベー ンコンウェル中に分配した。使い捨てトレイをトラック上で移動させ続けながら 、反応混合物をさらにインキュベートした。４．８分後、第四級アンモニウムポ リマーで処理した各ガラス繊維マトリックスを、２１０ｃｍ／秒の一次速度にて ３つの隣接するノズルから射出されるＩＭｘ’トリス緩衝液（１００μｍ）で濯 いだ。

移転した混合物を繊維状パッドを通して１２秒間排出した。ついで、実施例１に すでに記載したのと同様にして調製したＡＭＰＰＤ基質溶液（５０μｍ）を各検 出ウェル中に分配して繊維状マトリックスを飽和させた。使い捨てトレイをタイ ミングベルト上を移動させて次のウェルペアを移転装置下に置き、反応混合物を 移転した。ついで、使い捨て装置を、化学ルミネッセンス検出器（上記）が位置 する検出位置に移動させた。４８分間の基質インキュベーン３２時間が経過した 後、８５μｍの０３％アルカリ過酸化物誘起溶液を射出し、誘起溶液の射出開始 から８秒遅れた後の８秒間に得られる化学ルミネッセンスシグナルを統合して長 命な化学ルミ不ツセンスングナルの強度を得た。このアッセイの結果を表２に示 す。このアッセイのカットオフは１１００ｎ／ｍＩであると考えられた。表２の データは、１１００ｎ／ｍ１モルヒネまたはそれ以上を含有するすべての試験試 料が陰性のコントロールから充分に識別されることを示しており、このことから このアッセイ手順の有効性が示された。

短命なシグナル（回旋）　＝　短命なシグナル　−（長命なシグナル　×０．６ ５５） 上記に示すこの脱回旋式を用い、表２の最後の２つの列は、長命ウィンドウ中の 化学ルミネッセンスシグナルは試料中のモルヒネに対して用量応答するが、一方 、補正した短命なシグナルはモルヒネの濃度とは無関係であることを示している 。当業者は、異なる時間ウィンドウまたはシグナル脱回旋式を適用して、第一の ウィンドウにおける用量作用曲線を改良し第二のウィンドウにおいて該曲線を回 避することができる。また、洗浄溶液の容量、洗浄溶液の組成、移転緩衝溶液へ の界面活性剤の添加、タンパク質（にべ、カゼインなど）の添加によるガラス繊 維パッドの前処理などのアッセイの最適化工程の変更は、用量作用曲線を改良す るために当業者によって適用可能な変更であって、本発明の教示の範囲内に入ア ルカリホスファターゼ標識モルヒネ化学ルミネッセンスイムノアッセイ（ＣＬ　 Ｉ　Ａ） モルヒネ　短命なシグナル　長命なシグナル　％Ｉ　補正した短命なｎｇ／ｍＩ 　（０〜８秒）　（８〜１６秒）　シグナル０　１８１．１５２　２３５．１５ ５　０．０　２７．１２５１００　１３３．４７３　１６２．８７７　３０．７ ４　２６．７８８２００　１１９．６９５　１４４，３７１　３８．６１　２５ ．１３２３５０　１１９．４３１　Ｉ４０，３５５　４０．３１　２７．３５５ ６００　１１６．２６８　１３６．２３７　４２．０７　２７，０３３１０００ 　１１８．４８５　１３７，６４６　４１．４７　２８．３２７実施例４．フェ ニルジクリジンおよびモルヒネの同時アッセイ使用した試験試料は市販の蛍光偏 光キット（ＴＤｘ’キット、アボット・ラボラトリーズ、ノースジカゴ、イリノ イ州）からのフェニルジクリシンカリプレーター（ヒト尿中で調製した５００． ２５０．１２０．６０．２５およびＯｎｇ／ｍｌ）、またはＴＤｘ’アヘン剤カ リツカリブレークボット・ラボラトリーズ、ノースジカゴ、イリノイ州より市販 ）（ヒト尿中で調製した１０００，６００゜３５０．２００．１００およびＯｎ ｇ／ｍ＋）であった。

８０μｌのＩＭｘ″トリス緩衝溶液（アボット・ラボラトリーズ、ノースジカゴ 、イリノイ州より入手可能）、ついで８０μｍの０５％セルコートｔｔ″Ｌ−２ ００溶液をすでに記載した使い捨て反応トレイのガラス繊維マトリックス上に分 配した。溶液を２つのＦＭＩ−ＲＨ水ポンプ用いて分配し、インテル３１０デベ ロツプメントシステム（インテル、サニーベイル、カリフォルニア州〕によりト ライアックボードを介して制御した。このトレイをタイミングベルトおよびステ ッパーモーターを用いてリニアートラック上を移動させた。ステッパーモーター は、当業者に知られた要素を使用したボードにより制御した。４．８分後、自動 ピペッタ−を用い、５０μｍの試験試料を使い捨て反応トレイの浅い反応ウェル 中にピペットで入れた。実施例１の記載と同様にして調製した１１８ｎｇ／ｍｌ のアクリンニウム標識抗ＰＣＰ抗体および４８．２ｎｇ／ｍｌのアルカリホスフ ァターゼ標識抗モルヒネ抗体を各インキュベーションウェル中に分配した。３２ ℃にて温度制御トンネル中のトラック上で使い捨て反応トレイを移動させながら 、この混合物を９．６分間インキュベートした。タイミングベルトを０，８イン チ／分の速度で進めていき、反応工程を起こすための各工程後に反応トレイを３ ６秒静止させた。移動するタイミングベルト上で９．６分間インキュベートした 後、実施例１と同様にして調製したＰＣＰ−ＰＧＡ　（濃度１．８７５μｇ／ｍ ｌ）およびモルヒネ−卵アルブミン−ＰＧＡ　（濃度０．２５μｇ／ｍｌ）を含 有する同時アッセイ捕捉試薬溶液（５０μｍ）をウェルの中央にある先端を介し てインキュベー７ヨンウエル中に分配した。使い捨てトレイをトラックに沿うて 移動させ続けながら、反応混合物をさらにインキュベートした。４．８分後、第 四級アンモニウムポリマーで処理した各ガラス繊維マトリックスを、検出ウェル の中央に位置する先端から分配されるＩＭｘ’トリス緩衝液（１００μｍ）で濯 いだ。さらに４゜８分間インキュベートした後、使い捨て反応トレイを継続中の 米国特許出願第４２５．６４３号に記載された移転装置下に置いた。ついで、１ ５０μｍアッセイ混合物を浅いインキュベーションウェルから検出ウェル中の前 処理ガラス繊維マトリックス上に移転した。移転は、２１０ｃｍ／秒の一次速度 で３つの隣接するノズルから射出されるＩＭｘ’）リス緩衝液の一つの３５０μ ｍ適用量を用いて行った。１２秒の排出時間の後、５０μｌの基質溶液を各検出 ウェル中に分配して繊維状マトリックスを飽和させた。使い捨てトレイをタイミ ングベルト上を移動させて次のウェルペアを移転装置下に置き、反応混合物を移 転した。ついで、使い捨て装置を、化学ルミネッセンス検出器（上記）が位置す る検出位置に移動させた。４．８分間の基質インキュベーション時間が経過した 後、８５μｍの０゜３にアルカリ過酸化物誘起溶液を検出ウェル中に射出した。

誘起溶液の射出開始直後から８秒間に得られる化学ルミネッセンスを統合して短 命な化学ルミネッセンスシグナルの強度を得た。その後のさらに８秒間について 化学ルミネッセンスングナルを統合して長命な化学ルミネッセンスシグナルを得 た。このアッセイの結果を表３および４に示す。ＰＣＰアッセイのカットオフは ２５　ｎ　ｇ／ｍ　Ｉであると考えられた。表３および４のデータは、２５ｎｇ ／ｍｌ　ＰＣＰまたはそれ以上を含有する試験試料が陰性コントロールから充分 に識別されることを示している。モルヒネのアッセイのカットオフは１１００ｎ ／ｍｌであると考えられた。

表３および４のデータは、１１００ｎ／ｍ１モルヒネまたはそれ以上を含有する 試験試料が陰性のコントロールから充分に識別されることを示している。これら データはまた、いずれのアッセイのカットオフも本明細書に記載する同時アッセ イ法を用いることによって影響を受けないことをも示している。−署長期間のウ ィンドウまたはシグナル脱回旋式は、第一のウィンドウにおける用量作用曲線を 改善し第二のウィンドウにおける容量応答曲線を省くために当業者によって適用 することのできる変更である。また、洗浄溶液の容量、洗浄溶液の組成、移転緩 衝溶液への界面活性剤の添加、タンパク質（にべ、カゼインなど）の添加による ガラス繊維マトリックスの前処理などのアッセイの最適化工程の変更は、用量作 用曲線を改良するために当業者によって適用され得る変更であり、これら変更も 本発明の教示の範囲内に入る。

表３ 同時フェニルジクリジンおよびモルヒネ化学ルミネッセンスアッセイ［ＰＣＰ］ 　［モルヒネ］　短命なシグナル　％Ｉ　長命なシグナル　％Ｉｎｇ／ｍｌ　ｎ ｇ／ｍ１　（０〜８秒）　（８〜１６秒）０　０　１９９．４１４　０　７３． ８４５　−２５　０　７３．６６７　６３　６７．７１３　８６０　０　６８． ２９７　６６　７０．４１８　５１２０　０　７３．２７０　６３　７５．０１ ９　０２５０　０　６１．０３６　６９　６９．０２３　７５００　０　６２． ５２１　６９　７１．７６０　３０　０　２２９．８３６　０　８５，５５２　 ００　１００　２１１．１４９　８　７２．２４８　１６０　２００　１９５． ６０５　１５　５４．１８１　３７０　３５０　１９９．３２５　１３　５４． ９７５’　３６同時フェニルジクリシンおよびモルヒネアッセイ［ＰＣＰ］　短 命なシグナル　［モルヒネ］　長命なシグナルｎ　ｇ／ｍ　１　カウント／最初 の８秒　ｎｇ／ｍ１　カウント／第二の８秒同時アッセイにおける各分析対象物 の用量作用は分析対象物の個々のアッセイのものと類似しており、このことは本 発明の新規なアッセイ法を用いて試験試料中の２つの分析対象物のいずれをも検 出することができることを示している。

本発明を好ましい態様により記載してきたが、本発明を考慮して種々の修飾およ び改良が当業者によりなされるであろうことが予想される。それゆえ、種々の化 学ルミネッセンスシグナル寿命を用いた２以上の捕捉試薬および２以上の化学ル ミネッセンスプローブを含む他のアッセイ態様もこの発明の教示および範囲に包 含される。抗体の混合物をコーティングしチューブルミノメータ−で検出される プラスチックチューブや抗体の混合物をコーティングし結合反応の完了後に試験 管に移してチューブルミノメータ−で検出する１／４”ポリスチレンビーズなど のプラスチックビーズなどのような種々の固相を、化学ルミネッセンスシグナル 時間分解に基づく同時アッセイの媒体として用いることができる。

微細粒子は、ポリスチレン、ポリメチルアクリレート、誘導体化セルロース繊維 、ポリアクリルアミドなどのような当業者により容易に認識され得るあらゆる適 当な粒状物質からできていてよい。

すでに記載したイオン捕捉法では、ポリアニオンとしてポリグルタミン酸を、ポ リカチオンとしてセルコートＴＩ″Ｌ−２００を用いた。しがしながら、他のポ リアニオン性物質および他の誘導体化ポリカチオン性物質、並びにこれら化合物 をアッセイ成分や多孔質要素に結合させる他の方法もこの発明の明らかな変更と して考えることができ、この発明の範囲内に包含されると考えられる。

さらに、この発明のアッセイ法は、他の小分子、巨大分子、または核酸プローブ アッセイに拡張することもできる。さらに、トレーサーとしてアクリジニウムス ルホンアミド標識した化合物およびアルカリホスファターゼ標識した化合物を用 いて本発明を記載してきたが、他のアクリジニウム化合物またはその類似体、ま たは他の化学ルミネッセンス化合物（標識）を用いることもできる。

本発明のアッセイは、ＨＢｓＡｇやＨＩＶ抗原などのウィルス粒子、またはその 特定の断片の検出のために用いることができる。癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびα −フェトプロティン（ＡＦＰ）などの巨大分子疾患状態マーカーのための同時ア ッセイもまた、ビタミンＢ１２と累酸またはフェリチンの同時決定などのような 栄養状態マーカーと同様に行うことができる。ＬＨやＦＳＨなどのホルモン、細 菌（たとえば、連鎖球菌）、核酸種（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）もまた、 本発明の方法に従って有用に検出できる。本発明はまた、Ｔ３およびＴ４および ジゴキシンおよびその類似体などの小さな分子の競合結合アッセイにおいても有 用である。血清中のコカインおよびベンゾールコゴニン、ニコチンおよびコチニ ン、コディンおよびノルコディン、ジアゼパムおよびツルジアゼパムなどの乱用 物質およびその代謝産物を本発明の方法を用いて検出することができる。治療薬 剤の同時アッセイおよび２つのステロイドの同時決定もまた、本発明の方法に従 って行うことができる。この発明の方法を用い、分析対象物の他の組合せもまた 当業者により考えだしアッセイすることができる。

この発明の例示を２つの分析対象物の同時決定について示したが、３以上の分析 対象物もまた誘起条件および時間ゲーティング（ｔｉｍｅ　ｇａｔｉｎｇ）の選 択により行うことができる。当業者は、本発明によって提供される教示を考慮す ることにより、同じアッセイ中で３以上の分析対象物を決定するために反応条件 、タイミングスキームおよびシグナル脱回旋計算法を考えることができる。それ ゆえ、これら選択もまた本発明の範囲内にあると考えられる。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ゲンガー、ケビン・アールアメリカ合衆国６０６４５イリノイ 州シカゴ、ノース・ハミルトン６９３４番 （７２）発明者　コツター、ステフェン・エムアメリカ合衆国６００２０イリノ イ州フオツクス・レイク、グレン・アベニュー３６番（７２）発明者　ジュー、 イーバー アメリカ合衆国６００４８イリノイ州リバテイービル、スプリングヘイブン・ド ライブ９１７番 （７２）発明者　アブニメー、ノーマン・ニーアメリカ合衆国６００３０イリノ イ州グレイスレイク、ノース・アシ１１１３２９８３番（７２）発明者　ヒルデ ブランド、ロバート・ジ−アメリカ合衆国５３１０４ウイスコンシン州ブリスト ル、ツーハンドレッドス・アベニュー８２１４番 （７２）発明者　ストループ、ステフェン・ディーアメリカ合衆国６００４８イ リノイ州リバテイービル、ルーズベルト・ドライブ６０６番

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．試験試料中に存在するかもしれない複数の分析対象物の決定法であって、（ ａ）試験試料を、固相に結合した分析対象物に特異的な結合ペアの成員の混合物 とともに分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアを生成するのに充分な時間お よび条件下でインキュベートし； （ｂ）かくして生成した特異的結合ペアとともに各分析対象物に対する特異的結 合ペアの標識成員の混合物をインキュベートし、その際、各分析対象物は、誘起 溶液との接触によって短命なまたは長命な異なる化学ルミネッセンスシグナルを 生成し得る異なる化学ルミネッセンス標識に結合し；（ｃ）誘起溶液でシグナル を誘起し； （ｄ）検出された化学ルミネッセンスシグナルを測定し；ついで（ｅ）化学ルミ ネッセンス化合物から生成するシグナルの時間−プロフィルの違いを計算するこ とにより、試験試料中の各分析対象物の存在および量を決定することを特徴とす る方法。
2. ２．固相が、粒子のグループの混合物からなる微細粒子の懸濁液であり、各グル ープが一つの分析対象物に対する特異的結合ペアの成員を結合している請求項１ に記載の方法。
3. ３．固相が、分析対象物に対する特異的結合ペアの成員の混合物をコーティング したチューブである請求項１に記載の方法。
4. ４．固相か、粒子のグループの混合物からなる磁化可能な粒子の懸濁液からなり 、粒子の各グループが一つの分析対象物に対する特異的結合ペアの成員を結合し ている請求項１に記載の方法。
5. ５．固相が、分析対象物に対する特異的結合ペアの成員の混合物をコーティング したプラスチックビーズからなる請求項１に記載の方法。
6. ６．固相が、分析対象物に対する特異的結合ペアの成員が化学的結合によって結 合している誘導体化メンブランであり、該成員が全メンブランまたはメンブラン の個別領域をカバーするものである請求項１に記載の方法。
7. ７．分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアを有する固相の分離を、多孔質要 素上での微細粒子分離および該固相の洗浄により行う工程をさらに含む請求項１ に記載の方法。
8. ８．分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアを有する該固相の分離を磁気分離 により行う工程をさらに含む請求項４に記載の方法。
9. ９．競合結合化学ルミネッセンスアッセイを用いて分析対象物を含有しているか もしれない試験試料中で複数の分析対象物の同時決定を行う方法であって、（ａ ）試験試料を、短命なまたは長命な化学ルミネッセンスシグナルをそれぞれ生成 し得る化学ルミネッセンス標識した分析対象物の既知量、および該分析対象物に 対する特異的結合ペアの成員の混合物を結合した固相とともに分析対象物／抗分 析対象物特異的結合ペアを生成するのに充分な時間および条件下でインキュベー トし； （ｂ）該標識の一つに特異的な基質を加え、インキュベートして長命な化学ルミ ネッセンス生成反応を起こさせ； （ｃ）得られた混合物を他の標識に特異的な誘起溶液で誘起し；ついで（ｄ）生 成した化学ルミネッセンスシグナルの短命な成分および長命な成分を統合および 時間識別する ことを特徴とする方法。
10. １０．該分析対象物がハプテン、巨大分子、代謝産物および抗体よりなる群から 選ばれたものである請求項９に記載の方法。
11. １１．試験試料中に存在するかもしれない複数の分析対象物の同時化学ルミネッ センスアッセイを行う方法であって、 （ａ）試験試料を、分析対象物に対する特異的結合成員ペアの成員の混合物をコ ーティングした固相とともにインキュベートして分析対象物／抗分析対象物特異 的結合ペアを生成させ； （ｂ）該固相を分離し； （ｃ）誘起溶液との接触によって短命なまたは長命な異なる化学ルミネッセンス シグナルを生成し得る異なる化学ルミネッセンス標識が結合した分析対象物に対 する特異的結合ペアの成員の混合物を加え、これをインキュベートし；（ｄ）こ れら標識の一つに対する基質を加え、これをインキュベートして長命な化学ルミ ネッセンス生成反応を進行させ；（ｅ）得られた混合物を誘起溶液で誘起し；つ いで（ｆ）生成した化学ルミネッセンスシグナルを統合し、生成したシグナルの 短命な成分および長命な成分を時間識別することを特徴とする方法。
12. １２．該分析対象物が感染性疾患の抗原、ホルモン、癌マーカーおよびＤＮＡプ ローブ配列よりなる群から選ばれたものである請求項１１に記載の方法。
13. １３．いずれかの分析対象物を含有するかもしれない試験試料中の複数の分析対 象物の決定法であって、 （ａ）試験試料を、ポリマーイオン性分子に結合した各分析対象物の特異的結合 ペアの成員の混合物とともにインキュベートし；（ｂ）各分析対象物に対する特 異的結合ペアの化学ルミネッセンス標識した成員の混合物を加え、その際、各分 析対象物は、誘起溶液との接触によって短命なまたは長命な異なる化学ルミネッ センスシグナルを生成し得る異なる化学ルミネッセンス標識に結合し、これをイ ンキュベートして分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアを生成させ； （ｃ）ポリマーカチオン性化合物で処理した多孔質メンブランに反応混合物を移 し； （ｄ）誘起溶液を用いて化学ルミネッセンスシグナルを誘起し；（ｅ）生成した 化学ルミネッセンスシグナルを検出し；ついで（ｆ）化学ルミネッセンス化合物 から生成したシグナルの時間−プロフィルの違いから各分析対象物の存在および 量を決定することを特徴とする方法。
14. １４．分析対象物がハプテン、巨大分子、代謝産物、抗体、感染性疾患の抗原、 ホルモン、癌マーカーおよびＤＮＡプローブ配列よりなる群から選ばれたもので ある請求項１３に記載の方法。
15. １５．２つの分析対象物の同時決定を行うためのキットであって、各分析対象物 に対する特異的結合ペアの成員を含有する複数の容器からなり、その際、各分析 対象物は、誘起溶液との接触によって短命なまたは長命な異なる化学ルミネッセ ンスシグナルを生成し得る異なる化合物に結合することを特徴とするキット。
16. １６．短命な化学ルミネッセンスシグナルを生成する化合物がアクリジニウムス ルホンアミド化合物である請求項１５に記載のキット。
17. １７．長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成する化合物がアルカリホスファ ターゼ基質である請求項１５に記載のキット。
18. １８．長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成する化合物がβ−ガラクトシダ ーゼ基質である請求項１５に記載のキット。
19. １９．分析対象物を含有するかもしれない試験試料中の複数の分析対象物の決定 法であって、 （ａ）試験試料を、一つの分析対象物に対する特異的結合ペアの成員が結合した 微細粒子、および第二の分析対象物に対する特異的結合ペアの成員が結合したポ リイオン性残基とともにインキュベートし；（ｂ）各分析対象物に対する特異的 結合ペアの化学ルミネッセンス標識した成員の混合物を加え、その際、各分析対 象物は、誘起溶液との接触によって短命なまたは長命な異なる化学ルミネッセン スシグナルを生成し得る異なる化学ルミネッセンス標識に結合し、これをインキ ュベートして分析対象物／抗分析対象物特異的結合ペアの反応混合物を生成させ ； （ｃ）反対の電荷のポリイオン性化合物で処理した多孔質メンブランに反応混合 物を移し； （ｄ）誘起溶液を用いて化学ルミネッセンスシグナルを誘起し；（ｅ）生成した 化学ルミネッセンスシグナルを検出し；ついで（ｆ）化学ルミネッセンス化合物 から生成したシグナルの時間−プロフィルの違いから各分析対象物の存在および 量を決定することを特徴とする方法。
20. ２０．分析対象物のいずれかを含有するかもしれない試験試料中の複数の巨大分 子分析対象物の決定法であって、 （ａ）試験試料を、一つの分析対象物に対する特異的持合ペアの成員が結合した 微細粒子、および第二の分析対象物に対する特異的結合ペアの成員が結合したポ リイオン性残基とともにインキュベートし；（ｂ）反対の電荷のポリイオン性化 合物で処理した多孔質メンブランに反応混合物を移し： （ｃ）各分析対象物に対する特異的結合ペアの化学ルミネッセンス標識した成員 の混合物を加え、その際、各分析対象物は、誘起溶液との接触によって短命なま たは長命な異なる化学ルミネッセンスシグナルを生成し得る異なる化学ルミネッ センス化合物に結合し、これをインキュベートし；（ｅ）過剰の未結合結合体を 洗浄し； （ｆ）誘起溶液を用いて化学ルミネッセンスシグナルを誘起し；（ｇ）生成した 化学ルミネッセンスシグナルを検出し；ついで（ｈ）化学ルミネッセンス化合物 から生成したシグナルの時間−プロフィルの違いから各分析対象物の存在および 量を決定することを特徴とする方法。
21. ２１．競合結合化学ルミネッセンスアッセイを用いて分析対象物を含有するかも しれない試験試料中の複数の分析対象物の同時決定を行う方法であって、（ａ） 試験試料を、化学ルミネッセンス標識した特異的結合ペア成員であって各成員が 短命なまたは長命な化学ルミネッセンスシグナルを生成し得るものの既知量、お よび分析対象物誘導体の混合物が結合した固相とともに分析対象物／抗分析対象 物特異的結合ペアを生成するのに充分な時間および条件下でインキュベートし； （ｂ）これら標識の一つに特異的な基質を加え、インキュベートして長命な化学 ルミネッセンス生成反応を起こさせ； （ｃ）得られた混合物を他の標識に特異的な誘起溶液で誘起し；ついで（ｄ）生 成した化学ルミネッセンスシグナルの短命な成分および長命な成分を統合および 時間識別する ことを特徴とする方法。