JPH06505145A - ヘテロマーリセプターの表面発現ライブラリー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘテロマー・リセブターの表面発現ライブラリー主五恋！１ 本発明は一般に、ヘテロマーリセプターの組換え発現、より詳細には、繊維状バ クテリオファー・ジの表面上のそのようなりセブターの発現に関する。

抗体は、を椎動物の免疫系で生成され、抗原に結合するヘテロマーリセブターで ある。この分子は、互いにジスルフィド結合している２本の重鎮と２本の軽鎖で 構成される。抗体はＹ′Ｆ−型の構造を有しており、抗原結合部分は、このＹ字 型の２本の短い腕部分の端に位置している。抗原結合部分に対応する重鎮および 軽鎖のポリペプチドの領域は、可変領域として知られる。抗体間での、この領域 内での相違は、抗体分子間の結合特異性の変異に、主として関連する。この結合 特異性は、重鎮および軽鎖ポリペプチドに対する抗原の複合的な相互作用である 。

免疫系は、はとんど無限の数の異なる抗体を生成する能力を有する。そのような 大きな多様性は、重鎖の可変領域を形成するための主として組換えによる方法、 ならびに重鎮および軽鎖の異なる組み合わせを用いて、生成される。天然の免疫 系を模倣し、任意の所望の分子と結合する抗体を生成する能力は、そのような抗 体が診断および治ｆｊＩ巨的で使用され得るために、価値がある。

最近まで、所望の分子に特異的な抗体の生成は、天然の免疫応答の操作を用いて のみ、遂行された。この方法には、実験動物およびモノクローナル抗体産生の古 典的な免疫化技法を用いることを包含する。モノクローナル抗体の生成は、労力 を要し、時間のかかる作業である。それは一連の異なる技法を包含し、動物細胞 にのみ行われる。動物細胞は、相対的に長い世代時間を有し、原核細胞に比較し て培養物の生存性を確実にするための余分の注意が要求される。

細菌中の多様な抗体分子の大きなレパートリ−を生成するための方法は、Ｈｕｓ ｅら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４５．１２７５−１２８１　（１９８９）に記載さ れ、本明細書に参考として援用している。この方法は、バクテリオファージλを ベクターとして用いる。λベクターは、長い、ｌ［Ｍｉ状の二本鎖ＤＮＡ分子で ある。このベクターを使用する抗体の産生は、重鎖および軽鎖の集合体のＤＮＡ 配列を、異なるベクター中にクローニングすることを包含する。このベクターを 次にランダムに組み合わせて、抗体フラグメントを形成する重鎮および軽鎖の同 時発現を行わせる単一のベクターを形成する。この方法の不利な点は、同時発現 ベクターを生成するときにベクタ一部分の好ましくない組み合わせがもたらされ ることである。これらの好ましくない組み合わせは、生存ファージを生じないけ れども、しかしながらそれらによって、集合体から有意な量の配列の損失が生じ 、またそれ故に、重鎮および軽鎖の間に得られる異なる組み合わせの多様性の数 が損失することになる。さらに、λフアージ遺伝子のサイズは、抗体セグメント をコードする遺伝子と比較すると大きい。このことは、他の入手可能なベクター 系と比較して、λ系の固有の操作困難性を浮き彫りにしている。

従って、天然の免疫系を模倣し、迅速で効率的で、および多様性を損失すること なく所望の組み合わせのみが得られるヘテロマーリセプターの多様な集合体を生 成する方法に対する必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たすとと もに、それに関連する利点も提供する。

１肚旦！亙 本発明は、ヘテロマーリセブターを形成する第一および第二のポリペプチドをコ ードする箪−および第二のＤＮＡ配列の多様な組み合わせを有する多数の細胞に 関連し、該ヘテロマーリセブターは、細胞表面上、特にＭ１３のような繊維状バ クテリオファージを生成するものの表面上で、発現される。ヘテロマーリセブタ ーを作製しスクリーニングする、ベクター、クローニング系、および方法が提供 される。

殴旦旦旦亙ユ且里 図１は、重鎮および軽鎖のライブラリーからの表面発現ライブラリー構築に使用 される２つのベクターの模式図である。

Ｍ１３１Ｘ３０　（図ＩＡ）は、重鎮配列（無印の箱型）をクローニングするた めに使用される。矢印が一端だけのものはＬａｃ　ｐ１０発現配列を示し、両端 に矢印があるものはＭ１３１Ｘ１１と組み合わされるＭ１３１Ｘ３０の部分を示 す。アンバー終止コドンおよび関連制限部位もまた示している。Ｍ１３１Ｘ１１ 　（図ＩＢ）は、軽鎖配列（線引き箱型）のクローニングに使用されるベクター である。太い線は、プソイド野生型（ｇＶＩ［Ｉ）および野生型（ｇＶ目Ｉ）の 遺伝子Ｖ１１［配列を示す。両端に矢印があるものは、Ｍ１３１Ｘ３０と組み合 わせられるＭ１３１Ｘ１１の部分を示す。関連する制限部位もまた示されている 。図１０は、機能性表面発現ベクターＭ１３［Ｘ■Ｌを生成するための、重鎮お よび軽鎖ライブラリーからの、ベクター集合体の結合を示す。図ＩＤは、非抑制 株中の表面発現ライブラリーの生成およびファージの生成を示す。このファージ を、表面発現のために抑制株（図ＩＥ）を感染させ、ライブラリーをスクリーニ ングするために使用する。

図２は、ＭＬ３１Ｘ３０ノヌクレｔ　＋　Ｆ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　１） を示す。

図３は、Ｍ１３１Ｘ１１のヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２）を示 す。

図４は、Ｍ１３１Ｘ３４ノヌクレｔ　ｆ　）’配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３ ）を示す。

図５は、Ｍ１３１Ｘ１３（７）　ヌクレｔ　ｆ　ト配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ： 　４）を示す。

図６は、Ｍ１３１Ｘ５Ｑノヌクレｔ　ｆ　Ｈ配列（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　ｓ＞ を示す。

発エコと１預」己Ａ朗 本発明は、広いレパートリ−のヘテロマーリセブターの多様な組み合わせを生み 出す単純で効率的な方法を意図している。　この方法の利点は、集合体のサイズ または多様性を損失することなく、異なるＤＮＡ配列の同時発現のために発現ベ クターのみの適切な組み合わせがランダムに集められる点にある。

これらのりセブターは、繊維状バクテリオファージを生成するような細胞の細胞 表面上で発現され得、多数がスクリーニングされ得る。繊維状バクテリオファー ジは、効率的な配列決定および変異誘発法のための一本鎖ＤＮＡを産生ずるので 、リセプターをコードする核酸配列は容易に特徴付けされ得る。

そのように産生されたヘテロマーリセプターは、数限りない診断および治療方法 に有用である◎ １つの実施態様では、多様な重鎮（Ｈｃ）および軽鎖（Ｌｃ）配列の２つの集合 体がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成される。これらの集合体は、 発現のために必要な成分を有する、別々のＭ１３に基づくベクター中にクローニ ングされる。重鎮ベクターは、遺伝子ｍ　（ｇＶｍ）のコートタンパク質を含有 しているので、Ｈｅ配列の翻訳によりｇＶＩＩＩ−Ｈｅ融合タンパク質が産生さ れる。２つのベクターの集合体はランダムに組み合わされるので、ｌ（ｃおよび Ｌｃ配列を有するベクタ一部分のみが単一の環状ベクターに連結される。組み合 わされたベクターはＨｅおよびＬｃ配列の同時発現を指示し、２つのポリペプチ ドとＭ１３の表面発現が組立られる。メカニズムは、ライブラリー構築およびス クリーニングの間、ｇＶｍ−Ｈｅ融合タンパク質の発現を制御するためにも存在 する。

本願で使用される用語「ヘテロマーリセブター」は、特定の分子に対する結合活 性と強力し合って発揮する２つ以上のサブユニットから構成されるタンパク質を 指す。この用語は、ポリペプチドの組立ておよび組立てられた複合体が維持され る限り、サブユニットのフラグメントを含むことが理解される。ヘテロマーのサ ブユニットには、例えば、抗体ならびにＦａｂおよび（Ｆａｂ）２部分のような そのフラグメント、Ｔ細胞リセブター、インテグリン、ホルモンリセプターおよ びトランスミッターリセプターを含む。

本願で使用される用語「予め選択された分子」とは、多数の選択肢から選ばれる 分子を指す。この分子は、例えば、タンパク質またはペプチド、あるいは薬剤の ような有機分子であり得る。ペンゾジアザバムは、予め選択された分子の特殊な 例である。

本願で使用される用語「同時発現」とは、通常側々のポリペプチドとして発現さ れる２つ以上の核酸配列の発現を指す。

ヘテロマーゾセブターのために、この同時発現されたポリペプチドは組み立てら れてヘテロマーを形成する。従って、本願で使用される「発現成分」とは、ヘテ ロマーリセブターを作製する発現されたポリペプチドの転写、翻訳、調節および 分類のために必要な配列を指す。この用語はまた、結合されているがヘテロマー リセプターに組立て得る２つのサブユニットのポリペプチドの発現を含む。結合 されたポリペプチドの同時発現の特殊な例は、ＨｃおよびＬｃのポリペプチドが 、２つのサブユニットを単一の鎖に連結するしなやかなペプチドまたはポリペプ チドのリンカ−とともに発現される時に見られる。このリンカ−は、充分にしな やかで、■ＣおよびＬｃ部分を機能性Ｆａｂフラグメント中に組立得る。

本発明は、第一および第二のポリペプチドをコードする第一および第二のＤＮＡ 配列の多様な組み合わせを含有する多数の原核生物を有する組成物を提供し、こ の第一および第二のポリペプチドは、予め選択された分子に対する結合活性を示 すヘテロマーリセプターを形成し、該ヘテロマーリセプターは、繊維状バクテリ オファージ表面上に発現される。

ヘテロマーリセプターのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、当業者に公知 の方法により得られる。そのような方法には、例えば、ｃＤＮＡ合成およびポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が含まれる。どの方法あるいは方法の組み合わせが 、配列の所望の集合体を得るために０！月されるべきかを決定する必要がある。

発現は、任意の適合性のあるベクター／宿主中で行われ得る。そのような系には 、例えば、Ｌ」旦■のような原核細胞、酵母および補乳動物細胞などの他の真核 系中のプラスミドまたはファージミドを含み、本願では、現在好ましいその実施 態様、即ち繊維状バクテリオファージの表面上での発現の状況で記載される。繊 維状バクテリオファージには、例えば、Ｍ１３、ｆｌおよびｆｄが含まれる。さ らに、ヘテロマーリセブターは、その必要性および使用されるベクター／宿主系 次第で、可溶性または分泌形態で発現され得る。

抗体またはその機能性フラグメントのようなヘテロマーリセプターのＭ１３表面 上での発現は、例えば、図１に示されるベクター系を使用して遂行され得る。当 業者にそれらを作製さぜ得るベクターの構築は、実施例１に明示的に記載されて いる。

完全なヌク１／オチド配列は、図２および図３に表される（　５ＥＱＩＩ）　Ｎ Ｏ５：　１および２）。この系は、発現成分に作動可能に連結されるＮ鎖（Ｈｅ ）および軽１（Ｌｅ）の抗体フラグメントのランダムに組み合わされた集合体を 産生ずる。ｌ（ｅポリペプチドは、遺伝子■によりコードされるＭ１３コートタ ンパク質との融合タンパク質として産生される。ｇＶｍ−Ｈｅ融合タンパク質は 、Ｍ２Ｓの表面で組み立てられたＨｃおよびＬｅポリペプチドを据え付ける。こ の系によって得られる多様なＨｅおよびＩ、ｃの組み合わせは、５　！　１０７ 以上であり得る。５　ｘ　１０７未満の多様性も得られ得、発現されるヘテロマ ー・リセブターの必要性および型により決定される。

同時発現のためにベクター中に結合されるＨｅおよびＬｃのコーディング配列の 集合体は、それぞれ別々のベクター中にクローニングされる。図１に示されるベ クターのために、Ｈｅポリペプチドをフードする配列の多様な集合体がＭ２Ｓ　 １Ｘ３０中にクローニングされる（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）　、　Ｌｃポリペ プチドは、Ｍ１３１Ｘ１１中にクローニングされる（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２） 。これらの集合体は、Ｍ１３１Ｘ３０のＸｈｏ　ｌ−５ｐｅ部位またはＳｔｕ　 Ｉ制限部位中に、あるいはＭ１３１Ｘ１１のＳａｃ　［−Ｘｂａ　ＩまたはＥｃ ｏ　ＲＶ部位中に挿入される（それぞれ図ＩＡおよびＢ）。

ベクターに挿入されるＨｃまたはＬｃ配列の集合体は、コーディング配列の両端 をはさむ適切な制限認識配列とともに合成されるが、これは必須ではない。これ らの部位は、アニーリンクオヨび、適切な制限酵素で制限消化される二本鎖ベク ター中にこれらの配列の発現成分を読み枠内に結合させる。あるいは、好ましい 実施態様では、ＨｅおよびＬｃ配列は、ＤＮＡの制限なしにベクター中に挿入さ れ得る。クローニングのこの方法は、天然にコードされる制限酵素部位がそれら の配列内に存在１−１従って制限酵素で処理されたときに配列の破壊を生じるた めに、有利である。制限なしのクローニングのために、配列は、Ｔ４　ＤＮＡポ リメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ■のような３゛から５゛のエキソヌクレア ーゼで短時間で処理される。

５゛から３゛のエキソヌクレアーゼもまた、同じ機能を遂行する。

保持されている突出５°末端は、クローニング部位での制限とエキソヌクレアー ゼ処理後に保持される、ベクター内の一本鎖の突き出し部分と相補的であるべき である。エキソヌクレアーゼ処理された挿入物は、当業者に公知の方法により、 制限されたベクターとアニールされる。エキソヌクレアーゼ法は、バックグラウ ンドを低下させ、遂行し易い。

Ｈｅ集合体のために使用されるベクターであるＭ１３１Ｘ３０　（図ＩＡ、　Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）は、発現成分に加えて、下流にプソイド野生型ｇＶＩ［ ［産物をコードする配列および、クローニング部位と読み枠を合わせて含有して いる。この遺伝子は、野生型のＭ２Ｓのｇｖｍのアミノ酸配列をコードするが、 同じベクター中に含有される野生型ｇｖ■との相同組換えを減少させるために、 ヌクレオチドレベルで変更している。野生型ｇＶ■は、少なくともい（つかの機 能性の、非融合コートタンパク質が産生されるごとを確実にするために存在する 。従って、野生型ｇｖ■を含むことで、非生存ファージ産生の可能性および特定 の融合タンパク質ペプチドに対する生物学的選択の可能性を減少させる。２つの 遺伝子の異なる調節もまた、プソイド野生型と野生型のタンパク質の総体的比率 を制御するために使用され得る。

アンバー終止コドンもまた、下流に、そしてクローニング部位と読み枠を合わせ て含有される。この終止コドンは、挿入されるＨｅ配列とｇｖ■配列との間に位 置し、読み枠内にある。

野生型ｇ■■の機能と同じように、アンバー終止コドンもまた、ベクタ一部分と 組み合わされたとき生物学的選択を減少させて、機能性表面発現ベクターを産生 ずる。これは、非抑制法（ｓｕｐ　Ｏ）がＨｅ配列の後、偽ｇＶｍ配列より前を 除いて、発現を終止させるので、非抑制宿主株を使用することによって遂行され る。従って、偽ｇｖｍは、これらの状況下ではファージ表面上では本質的に発現 されない。そのかわり、可溶性Ｈｅポリペプチドのみが産生される。非抑制宿主 株中での発現は、抗体フラグメントの大きな集合体を産生ずることが望まれると き、有利に使用され得る。ｏｐａｌおよびｏｅｈｒｅのようなアンバー以外の終 止コドン、または誘導リプレッサー成分のような分子スイッチもまた、表面発現 からペプチド発現をはずすために使用し得る。

Ｌｃ集合体のために使用されるベクターであるＭ１３１Ｘ１１　（ＳＥＱＩＤ　 ＮＯ：２）は、必要な発現成分およびＬｃ配列のためのクローニング部位を含ん でいる（図ＩＢ）。Ｍ１３１Ｘ３０と同様に、ファージ表面に対して分類するた めのリーダー配列がクローニング部位の上流および読み枠内にある。さらに、リ ポソーム結合部位およびＬａｃ　Ｚプロモーター／オペレーター成分もまた、Ｄ ＮＡ配列の転写および翻訳のために存在する。

両方のベクターとも、ＨｃおよびＬｃのコーディング配列とそれらの関連するベ クター配列とを連結するための２組のＭｌｕ［４ｉｎｄ　ＩＩＩ制限酵素部位（ 図ＩＡおよび８）を育する。Ｍｌｕ　＋および旧ｎｄ　ｍは非適合性制限部位で ある。この２つの組は、クローニング部位に関して対称的に配向しており、その ため発現されるべき配列を有するベクタ一部分のみが正しく単一のベクターに結 合される。この２組の部位は、両方のベクター上で互いに全（同じように配向し ており、２つの部位間のＤＮＡは、両ベクター間でアニーリングがなされるよう に充分に相同でなければならない。この配向により、環状ベクターの各々が２つ の部分に開裂され、コードされたポリペプチドが同時発現され得るように、各ベ クター中の本質的成分が単一環状ベクター中に結合される（図ＩＧ）。

いかなる２組の制限酵素部位も、それらがクローニング部位に関して対称的に配 向され、両ベクターに同じように配向されている限り、使用され得る。しかし、 各組内のそれらの部位は、弁間−のものとして、あるいは開裂基質として個々に 認識され得るべきである。例えば、図１に示されるベクター内に含有される２組 の制限部位は、Ｍｌｕ　Ｉおよび■ｉｎｄ　Ｉ［［である。これらの部位は、そ れぞれＭｌｕ　＋およびＢｉｎｄ　ｍによって個々に開裂される。当業者は、上 述のＭｌｕ　Ｉ−Ｈｆｒ＋ｄ　ｍの組を、制限酵素部位の代わりの組でいかにし て置き換えるかを知っている。さらに、２つのＨｉｎｄ　ｍ部位および２つのＭ ｌｕ　１部位の代わりに、Ｅｌｉｎｄ　ＩＩ［およびＮｏｔ［部位が、例えばＭ ｌｕ　ｌおよびＳａｌ　１部位と組になり得る。

結合工程は、２つの多様な集合体内の異なるＨｃおよびＬｅのコーディング配列 を単一のベクター内にランダムに集める（図ＩＣ；Ｍ１３１ＸＨＬ）。各独立し たベクターであるＨ１３１Ｘ３０およびＭ１３１Ｘ１１から得られるベクター配 列は、生存ファージの産生のために必要である。さらに、偽りｖ■配列はＭ１３ １Ｘ３０中に含まれているので、Ｌｃ関連ｇＶＩＩＩ−Ｈｅ融合タンパク質とし ての機能性抗体フラグメントの同時発現は、ベクター配列がＭ１３１ＸＨＬに示 されるように結合されるまで、ファージ表面上では遂行され得ない。

結合工程は、ＨｅおよびＬｃを含有するベクターの各集合体をＭＬｕ　Ｉおよび Ｂｉｎｄ　ＩＩ［で、それぞれ制限することによって行われる。各制限ベクター 集合体の３°末端は、上述のように、クローニング部位に配列を挿入するために 、３°から５°のエキソヌクレアーゼで消化される。ベクター集合体は混合され 、アニールがなされて、適切な宿主中に導入される。非抑制宿主（図ＩＤ）は、 配列が融合タンパク質としての発現によっては選択されないことを保証するため に、好ましくはライブラリーの初期の構築の開に使用される。非抑制株中に構築 されたライブラリーから単離されたファージは、抑制株に感染して抗体フラグメ ントを表面発現させるために使用され得る。

多様なヘテロマーリセプターの集合体から、予め選択された分子に対して結合活 性を示すヘテロマーリセプターを選択する方法は、以下を包含する：（ａ）第一 のポリペプチドの多様な集合体をコードする多様なりＮＡ配列の第一の集合体を 第一のベクターに作動可能に連結し、該第−ベクターはクローニング部位に関し て対称的に配向した２組の制限部位を有する；（ｂ）第二のポリペプチドの多様 な集合体をコードする多様なりＮＡ配列の第二の集合体を第二のベクターに作動 可能に連結し、該第二ベクターは、クローニング部位に関して対称的に配向した ２組の制限部位を第一ベクターと同一の配向で有する；（Ｃ）工程（ａ）および （ｂ）のベクター産物を、該第−および第二のＤＮＡ配列を含有するベクター配 列の作動可能な連結のみを行わせる条件下で結合させる；（ｄ）該結合されたベ クターを適合性の宿主中に、該第−および第二のＤＮＡ配列の集合体を発現させ るのに充分な条件下で導入する；および（ｅ）該予め選択された分子に結合する ヘテロマーリセプターを決定する。本発明はまた、そのようなポリペプチドをコ ードする核酸配列を決定するためにも提供される。

抗体ライブラリーの表面発現は、アンバー抑制株中で行われる。上述したように 、Ｈｅ配列とｇＶｍ配列との間のアンバー終止フドンは、非抑制株中の２つの成 分をはずす。非抑制株から産生されたファージを単離し、抑制株を感染すること により、発現の間にＨｅ配列をｇｖｍに結合させる（図ＩＥ）。感染後に抑制株 を培養することにより、ライブラリー中の全ての抗体覆をｇＶｎｒｌｙ１合タン パク質として、Ｈ１３の表面上で同時発現させる。あるいは、ＤＮＡは、非抑制 株から単離され得、次に抑制株中に導入され得て、同様の効果を得る。

ｇＶｍ−Ｆａｂ融合タンパク質の発現レベルは、さらに転写レベルで制御され得 る。ｇｖ■〜Ｆａｂ融合タンパク質の両方のポリペプチドは、Ｌａｃ　Ｚプロモ ーター／オペレーター系の誘導制御下にある。他の誘導プロモーターも同じよう に機能し得、当業者に公知である。高レベルでの表現発現のために、抑制ライブ ラリーはイソプロピル−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）のようなＬａｃ　Ｚプロ モーターの誘導剤の存在下培養される。誘導制御は、非機能性ｇＶ　ｍ−Ｆａｂ 融合タンパク質に対する生物学的選択が非発現条件下でライブラリーを培養する ことによって最小化され得るので、有利である。次に発現は、ライブラリー内の 抗体の全集合体がファージ表面上で正しく示されることを確実にするために、ス クリーニング時にのみ誘導され得る。さらに、ファージ表面上での抗体のバラン スを制御するために、これは使用され得る。

表面発現ライブラリーを、予め選択された分子に結合する特殊なＦａｂフラグメ ントを標準的な親和性単離手順によってスクリーニングする。そのような方法に は、例えば、パニング、アフィニティークロマトグラフィ、および固相ブロッテ ィング法が含まれる。ＰａｒＩｌｌｅｙおよびＳ＋ｗｉｔｈ、　Ｇｅｎｅ　７３ ：３０５−３１８　（１９８８）に記述されているパニングは、本明細書中で参 考として援用されており、高力価のファージが容易に、迅速に、そして少量でも スクリーニングされ得るために、好ましい。さらに、この方法は、あるいは検出 されなかったかもしれない集合体中の小量のＦａｂフラグメント橿を選択し得、 実質的に相同な集合体にまで増幅される。選択されたＦａｂフラグメントは、フ ァージ集合体の増幅後、ポリペプチドをコードする核酸について配列決定するこ とによって、特徴付けられ得る。

下記の実施例は、例示することのみを意図しており、本発明を制限するものでは ない。

Ｌ五五工 Ｈ１３フラグメントの　およびスフ基−ニングこの実施例では、重鎖（Ｈａ）お よび軽鎖（Ｌｃ）抗体フラグメントの種々の集合体の合成、およびそれらの、Ｍ １３表面上での遺伝子Ｖｌｌｌ−Ｆａｂ融合タンパク質としての発現を示す。発 現される抗体は、ＦｌｃおよびＬａ対のランダム混合された、そして同時発現さ れたのもである。さらに、ペンゾジアザパム（ＢＤＰ）およびそれらの対応する ヌクレオチド配列に結合している、発現されたＦａｂフラグメントの単離および 特徴づけも行う。

フラグメントの　＋５ＲＮＡの　およびＰＣＲ表面発現ライブラシーを、にＬト 結合ペンゾジアザバム（ＢＤＰ）で免疫したマウスから単離したｍＲＮＡから構 築した。ＢＤＰを、ｔ’ｂｏｄｉｅｓ：　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａ、　 ＨａｒｌｏｔおよびＬａｎｅ編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８ｇ）に記載の方法により、Ｊ＝　、、、、、、、、　 ｒＪ：　、−、、、、、、、（ｐ　＋）ニア　ヘ１Ｉ＝−モ／γニン（Ｉｉ’Ｌ １１）　Ｊこ結＆した１、４．、■ 文献（ｉ本明細書ｉｉψ考）６Ｉ、ζ、”１駁用されている。３簡単に（訳　１ ゜、０ミリグ・：ｊ　、、ｉ＋、ｈｇ）の凛−ホールリンペクトへモジアニンお 」―び０、；ｊ）４の８１）Ｐ’１ｇ、グルクリルスベー・−サ・−７”　・ム のＮ−Ｆ、ドー゛！ゼシ人りシンイミド結合技で結合１、た。結合をＪｏｒｉｄ ａら５．５ｃ−ｉ７±ら２４１：１１８８　（１９８８）に従・）で行った。こ れは本明細書に参考と１．て援用されＬ−いる、、に１、Ｈ−ＢＤＰ庫合体を、 ５ｅｐｈａｄｓｘ　Ｇ−２５のゲル濾過り１η“７トグブ・フ（−により取り出 した。

［ＬＨ−ＢＤＰ祷合体を、１００μｇの複合体を２５０μｌのリン酸緩衝溶液（ ＰＢＳ）’　＋Ｃ加えて、マウスへ、の注射用に開裂した。等容量のフロイント の完全アジュバント・を加え、全溶液を５分間乳化した。この乳化液３ＱＯ７７ １を７ウスに注射した。注射は、２】ゲージ針を使用して、数カ所の皮下！、″ 行った。、　ＢＤＰでの第２回目の免疫は、２週間後に行った。・−の注射は、 以下のように調製した。５０μｇのＢＤＰを２５０＃、ｌのＰＢＳに希釈１７、 等容量のみょうばんをその溶液にａ合した。、：の溶液の５ｏｏμｍを２３ゲ〜 ジ針を使用しで、マウスの腹腔内に注射した。ｊケガ後、マウスに、２００μｌ のＰＢＳに希釈（７た５０１１ｇの複合体を最終的に注射した。この注射は、３ ０ゲーン針を使用して、尾の外側静脈に静脈注射１、た。この最終注射の５日後 、マウスを殺して全細胞ＲＮＡを肺臓から単離した１゜ 全１？ＮＡを、上記のように免疫した一匹のマウスの肺臓から、ＣｈｏｍＣｚｙ ｎｓｋｉおよび５ａｅｅｈｉ、　Ａｎａｌ、Ｂｉ四工１．１６２：１５６−’１ ５９　（１９８７）の方法により単離［７た。この文献は、本明細書に１考と１ 、て援用さイ゛？１ている１、簡単には、免疫しｔτマ゛ウスがらＩ’ｌｌ！臓 を取り出１．た買後（ｉ゛、組織を、４．０　Ｍグアニンインチオシアネー・１ ・、ｐＨ１，０（１）０２５　Ｍ’ｙ　ｘ　：／酸すｌ−ＩＪ　ウＪ、および０ 、Ｉ　Ｍ　２−メルｈ７ｊト：ｆ−タノールを含む変性溶液１０＋ｍｌ中で、ガ ラλホそ；２ナイヂーを使用り、てホモジナイズした。ｐＨ４，０の２　Ｍ７Ｊ １度の酢酸すトリウム１ｍｌを、ホモシナ・イズ【５た肺臓に混合した。さらに 、飽和フェノールｌｔｌを、ホモジナイズ１、た肺臓を含むｉ性溶岐に混合した 。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１　ｖ／ｖ）混合物の２ｍｌを 、このホモジネートに加えた。このホモジネートを１０秒間激１、く攪拌し、１ ５分間氷上に置いた。

次に、このホモジネートを、５ｈ＋１の肉厚ポリプロピレン遠心チューブ（、Ｆ ｊｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ 、　ＰＡ）　ｌこ移した。溶液を、１０．０００　Ｘ　ｇ、４℃で２０分間遠心 分離Ｉ７た。上層のＲＮＡを含有する水相を、新しいＳＯ＋ｍｌポリプロピレン 遠心チ、１−ブに移し、等容量のイソプロピルアルコールと混合した。

この溶液を、少なくとも１時間−２０”Ｃに維持して、ＲＮＡを沈澱さぜた。沈 澱させたＨＡを含有する溶液を、４℃で２０分間、１゜、０００　ｘ　ｇで遠心 分離した。ペレットにされた全細胞ＲＮＡを集めて、上記の変性溶液３η目ご溶 解した。再懸濁された全細胞ＲＮΔに、３謬１のイソプロピルアルコールを加え て、激しく攪拌した。

この溶液を、少なくとも１時間−２０’Ｃに維持して、ＲＮＡを沈澱させた。沈 澱させたＲＮＡを含有する溶液を、４°Ｃで１０分間、１゜、０００　Ｘ　ｇで 遠心分離した。ペレットにされたＲＮＡを、７５％エタノールを含む溶液で１度 洗浄した。ベレツトにされたＲＮＡを、Ｍ圧下で１５分間乾燥し、次に、ジメチ ルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理した（　ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ）Ｈ２Ｏに再懸 濁させた。

ホリＡ″ＲＮＡを、ｅＤＮＡ合成の最初のストランドに使用するために、スピン カラムキット（Ｐｈａｒ＋１ａｃｉａ、　Ｐｉｓｅａｔａｖａｙ、　ＮＪ）を製 造業者の推奨通りに使用して、上記の単離された全ＲＮＡから調製した。基本的 な方法論は、ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　。

ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、６９：１４０８−１４１２　（１９７２）ｌこぎ己 載されている。

この文献は、本明細書に参考として援用されている。簡単には、−匹の免疫され たマウスの肺臓から単離し、上記のように調製した全ＲＮＡの半分を、１ｍｌの ＤＥＰＣ処理ｄ［１２０に再懸濁させ、６５℃に５分間維持した。１ｍｌの２ｘ 高塩負荷緩衝溶液（ｐＨ７，５の１００　ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、Ｉ　Ｍ塩化 ナトリウム、ｐ［＋８．０の２．０ｍＭ！−チレンジアミン四酢酸（Ｅｌ）ＴＡ ）、および０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を、再懸濁ＲＮＡに加 え、混合物を室温に冷却した。

次に、この混合物を、オリゴ−ｄＴ　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ２型あるいは３型、Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）カラムにかけた。このカ ラムは、Ｑ、１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液でオリ ゴ−ｄＴを洗浄し、ＤＥＰＣ処理ｄＨ２０でカラムを平衡化して、前もって調製 した。溶出物を滅菌ポリプロピレンチューブに集めて、６５℃で５分間その溶出 物を加熱した後に、再度同じカラムにかけた。次に、オリゴｄＴカラムを、５０ 　ｍＭ　Ｔｒｊｓ４ＣＩ　ｐＨ７゜５．５００　ｍＭ塩化ナトリウム、１　ｍＭ 　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０、および０．１％ＳＤＳを含む、２ｍｌの高塩負荷緩衝 溶液で洗浄した。次に、オリゴｄＴカラムを、２層１の１ｘ中程度塩緩衝溶液（ ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｐｉ（７，５，１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｌ　ｉ Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ＆、Ｑ、および０．１％５ＤＳ）　テ洗浄した。ｍＲＮＡを 、１０　ｉＭ　丁ｒｉｓ−ｆ（ＣＩ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８， ０、およびＯ，Ｏ５％ＳＯＳを含む緩衝溶液１＋ｓｌで溶出した。メツセンジャ ーＲＮＡを、この溶液をフェノール／クロロホＡムｔ’抽出し、その後１回１０ ０％クロロホルムで抽出シ、エタノールで沈澱させ、そしてＤＥＰＣ処理ｄＨ２ ０に再懸濁させて、Ｍ製した。

ＰＣＲ増幅用の調製においては、ｍＲＮＡｔｅｃＤＮＡ合成の鋳型として使用し た。典型的に２５０μｌの逆転写反応混合物においては、５−１０μｇの水中の 肺臓ｍＲＮＡを、最初、６５℃で５分間、５００　ｎｇ　（０，５ｐ＋ｍｏｌ） の３’ＶＨプライマー（プライマー１２、表りあるいは３°ＶＬプライマー（プ ライマー９、表目）のいずれかに７ニールサセタ。続イテ、その混合物を、ＯＪ 　＋ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．８　＋１ＭｄＣＴＰ、　０．８　ｄ　ｄＧＴＰ、　 ０．８　ｍＭ　ｄＴＴＰ、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，６）、１ ０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２、４０　ｍＭ　ＭＣＩおよび２０　ｍＭ　２−ＭＥを含有 するように調整した。モロニーマウス白血病ウィルス（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ ５ａａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｆｅｓ　（ＥＲＬ）、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ、　ＮＯ）逆転写酵素、２６ユニットを加え、溶液を４０℃で１時間イン キュベートした。得られた第一ストランドｃＤＮＡをフェノール抽出し、エタノ ール沈澱させ、次に重鎮および軽鎖の配列を増幅するために、復製連鎖反応（Ｐ Ｃ１＋）に使用した。この方法は以下に記載する。

Ｍ１３１Ｘ３０ライブラリーの構築用の重鎖Ｆｄフラグメントの増幅に使用した プライマーを、表１に示す。増幅は、本明細書に磐考として援用されている５ａ ｉｋｉら、欽ｌ匪鯰、　２３９：４８７−４９１　（１９８８）に記載されてい るように、８つの別々の反応で行った。

各反応は、表Ｉに挙げた５°プライマー（プライマー２から９；ソれぞれＳＥｏ 　１０　ＮＯニアから１４）の１つと、３°プライマー（プライマー１２；　Ｓ Ｅｏ　１０　ＮＯ：１７）の１つとを含有していた。１反応の増幅に使用された 残りの５°プライマーは、縮重プライマー（プライマー１；　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：６）か、あるいは４つの縮重した位置にイノシンを取り込んだプライマー（ プライマー１０：　５ＥＱＩＤ　ＮＯ：１５）である。残りの３°プライマー（ プライマー１１；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）は、Ｆｖフラグメントを構築する ために使用した。

発現のための予め決定されているリーディングフレームで、増幅されたフラグメ ントをＭ１３１Ｘ３０ベクターにクローニングするために、５°プライマーの下 線部分が、Ｘｈｏ　１部位を組み込み、３°　プライマーの下Ｍ部分はＳｐｅ　 ｌ制限部位を組み込む。

２）　５１−　ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧｚ工２直ＴＣＴＧＧ　−３’コ）　５響 　−ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧｑ二ＱΔ１ＴｃＡにＧ　−コ曹４）　５’　−ＡＧ ＧＴＣＣＡＧＣＴＴｑ二Σ込ΩＴＣｒにＧ　−］’５）　５’−ＡＧＧＴＣＣＡ ＧＣＴＴｑ工限屋ＴＣＡＧＧ　−：ｌ’６）　５’−ＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧｑ 二＝ｆ二ＴＣＴＧＧ　−コ！７）　５’　−ＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧｑ巧＝込Ω ＴＣＡにＧ　−コ嘗８）　５１　−　ＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＴｑＴＣＴにに　− １１９−）　５’　−人ＧＧＴＣＣＡＡＣＩＴｑ工ΩＱΔｑＴｃＡＧＧ　−コ書 １０）　５’　−人ＧＧＴ工工Ａ工ＣＴ工ｇユ３＝１八ｑＴＣＧＧ　−３１１１ ）　５’−ＣＴＡＴＴ八Ｎ＝３へ工λ）、ＣＧＧＴＡＡＣＡＧＴ　−ＧＧＴＧＣ ＣＴＴＧＣＣＣＣＡ　−３’Ｍ１３１Ｘ１１ライブラリーの構築のためのマウス に軽鎖配列の増幅用に使用したプライマーは、表Ｉ＋に示す。これらのプライマ ーは、ベクターに適していて、マウス軽鎖ｍＲＮＡの保存配列に存在しない制限 部位を含むように選択した。増幅を、上記のように５つの別々の反応で行った。

各反応では、表１１に挙げた５°プライマー（プライマー３から７；それぞれＳ ＥＱ　ＩＤＮ０：２０から２４）の１つ、および３′プライマー（プライマー９ ；５ＥＱＩＤ　ＮＯ：２６）の１つを含んでいた。残りの３′プライマーぐプラ イマー８；　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋２５）は、Ｆｖフラグメントの構築に使用し た。発現のための予め決定されているリーディングフレームで、増幅されたフラ グメントをＭＨＩＸＩＩベクターにクローニングするための、５゛プライマーの 下線部分は、Ｓａｃ　ｌ制限部位を」Ｌ−二 濁Ｅ体屹プライマー 転写反応産物（約５μｇのｌ：ＤＮＡ−ＲＮＡ／リブリッド）、重鎮増幅用には 、３００　ｎ＋＋ｏｌの３°ｖＨプライマー（プライマー１２、表１；増幅月に は、３００　ｎｌ１ｏｌの３゛■、プライマー（プライマー９、表ＩＩ；　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２６）および５°Ｖ、プライマー（プライ−７−３−７、表］ １；それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０から２４）の１つ、２００　＋ａＭのｄ ＮＴＰ混合物、　５０　ｍＭ　ＭＣＩ、　１０　ｍＭ　丁ｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ ８，３）、　ｌｊ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１％ゼラチンおよび２ユニｌトのＴ ｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌの反 応混合物で行った。反応混合物を鉱油で重層し、４０サイクルの増幅を行った。

各増幅サイクルには、９２°Ｃ１分間の変性、５２°Ｃ２分間のアニーリング、 および７２°Ｃ１，５分間の伸長が含まれた。増幅された試料を７エ／−ル／Ｃ ＨＣ＋、で２回抽出し、Ｃ）Ｉｃ１３Ｆ１回抽出し、”　９　／　−／ｌ／沈澱 させ、そして１０　ｍＭ　Ｔｒｆｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５１ｖｒＭ　ＥＤＴＡ 中、−７０”Ｃで保存した。得られた産物をＭＩＨＸ３０およびＭ１ｆｆｌＸ１ １ライブラリーの構築に使用した（以下参照）。

ユニ久二互！且 Ｍ１３１ｍ基づく２つのベクター、Ｍ１３１Ｘ３０　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ）　オヨびＭ１３１ＸＬ１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を、抗体フラグメント のＨｅおよびＬｃそれぞれの集合体のクローニングおよび増殖用に構築した。

ベクターを、抗体フラグメント集合体のランダム結合ならびに次の表面発現を促 進させるために構築した。

ＭＬ３１Ｘ３０　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｌ）　、すなわちＨｅベクターを、Ｈ ｅ抗体フラグメントの種々の集合体を宿すために構築した。Ｍ］Ｊｍｐ１９　（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ、　ＮＪ）が開始ベクターであっ た。

このベクターを、フードされた野生型Ｍ１３遺伝子Ｖｌ１１に加えて：（１）自 身とオリゴヌクレオチドクローニング用の制限部位との間にアンバー終止コドン を有するｐｓｅｕｄｏ−野生型遺伝子ＶｌｌＩ配列；（２）ハイブリダイゼーシ 目ンによる配列挿入用の５ｔｕＩ制限部位、およびｐｓｅｕｄｏ−野生型遺伝子 Ｖｌ１１配列とフレームであった、Ｈｅ配列クローニング用のＳｐｅ　Ｉおよび Ｘｈｏ　ｌ制限部位；（３）プロモーター、シグナル配列および翻訳開始シグナ ルなどの発現に必要な配列；　（４）ＨａおよびＬｃベクタ一部分のランタム結 合用のＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　１部位の２つのベアー；なラヒニ（５）余分 な制限部位およびＬａｃ　Ｚのアミノ末端部分を除去するための他の変異；を含 むように改変した。

Ｍ１３１Ｘ３０の、構築を５１丁程で実施した。第一の工程ン了は、ｐｓｅｕｄ ｏ１目Ｉおよび踵ノ？の他の変異を含む１．１１３に基づくベクター、Ｍｉ３［ Ｘ（ＩＩＰ’Ｊ−５ｉ　１−１、ＸＩ）　”１５１Ｚ、Ｈ４で（よ、Ｍ１３１Ｘ （１３９〕３Ａ、る、、別のＭ１３ａｐｌａベクターｌノ）小さなりロー！゛／ グ部位の構築を行った。

次に１．−のベクターを広げて、発現配列およびＨｃ配列用の制限部位を含まＩ ′ｉ、　Ｍ１３１Ｘｏ＋Ｒを形成した。第四の最終工程では、Ｍ１３１ＸＯ４Ｂ 中（Ｑ新たに構築された配列を、Ｍ１３１ＸＯＩＦニ組み込んで帽３１Ｘ３０を 得た。

Ｍ１３１ＸＯＩＦの構築は、まず、抗体フラグメントの表面発現用のｐｓａｕｄ ｏ−野生型遺伝子ｇＶＩ１１配列を生成した。ｐｓｅｕｄｏ−野生型遺伝子は、 野生型遺伝子のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする。しかし、その核 酸配列は変化して、この遺伝子とコードされた野生型遺伝子Ｖ［ＩＩと間の相同 性は６３％のみである。表面発現に使用される遺伝子ＶＩＮヌクレオチド配列の 改変は１．同じベクター上に含まれる野生型遺伝子Ｖｌｌｌと相同な組換えの可 能性を低減させた。さらに、野生型Ｍ１３遺伝子Ｖ１１１は、ベクター系に残っ て、少なくともいくつかの機能性非融合コートタンパク質が産生されることを確 実にした。野生型遺伝子Ｖｌ１１の組み込みは、ポリペプチドの表面発現が存在 する条件下でのファー・・の増殖を促進させ、そのために融合遺伝子からの非生 存ファージ産生の可能性を低減させる。

ｐｓｅｕｄｏ−野生型遺伝子ｖ１１１を、遺伝子の両ストランドをコードする一 連のオリゴヌクレオチドを化学的に合成して構築した。そのオリゴヌクレオチド は、表１１１に挙げた。

−も−、二工 と１４．す、’ｇ千苓２１！多簾１　。−＝８．・但ニー、−、リシ′イ、７ト メ゛是笠−８、ｖｌ、ＩＩ　Ｏコ　ＧＡＴＣＣＴＡＧ　ＧＣｒ　ＧＡＡ　ＧＧＣ ＧＡＴ　ＧＡＣＣＣＴ　ＧＣＴ　ＡＪｋＧ　ＧＣＴＶｌエエ０４　人ＴＴＣＡＡ Ｔ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＣＡＧＧＣＡ　ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＣ Ｖｍエエ　０５　ＴＴ　ＧＧＣＴＡＣＧＣＴ　ＴＧＧ　ＧＣＴＣＴＣＧＴＡ　Ｇ ＴＡ　ＧτＴ　ＡＴＡ　ＧＴＴＶＸＸ工　０６　ＧＧＴ　ＧＣｒ　ＡＣＣＡＴＡ 　にＧＧ　ＡＴＴλＡＡ　’！ＴＡ　ＴＴＣ入λＡ　ＡＡＧ　ＴｒＶ工Ｚ工　０ ７　Ｔ　ＡＣＧ　ＡＧＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴＡ Ｖエエエ　０８　ＡＧＣＴＴＡ　ＡＧＡ　ＡＧＣＣＴｒ　ＧＣＴＣＧτ入ＡＡ　 ＣＴｒ　Ｔ’ＩＴ　ＧＡＡ　Ｔ入ＡＶエエエ　０９　ＡＡＴ　ＣＣＣＴＡＴ　Ｇ ＧＴ　ＡＧＣＡＣＣ入ＡＣＴＡＴ　ＡＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡτＶｍｌ：Ｉ　１０ 　ＡＧＣＣＣＡ　ＡＧＣＧＴＡ　ＧＣＣＡＡＴＧτ入　ＣＴＣＡＧＴ　ＡＧＣＡ ＣＴ　ＴにＶエエエ　１１　ＣＣＴＧ　Ｔ鮎　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＧＡＡＴにＣＡ ＧＣＣＩＴ　ＡＧＣＡＧＧ　ＧＴＣＶエエエ　１２　人ＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣ ＣＴＡ　Ｇ末端ｔ　！Ｊ　コヌクレ：ｔ　チトＶＩ［ｌ　０３　（ＳＥＱ　１０ 　ＮＯニア、７）およびＶＩＩ＋　０８　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　３２）を除 いて、上記オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＶＩＩ＋　０４−０７（そ れぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８から３１）ならびニＶＩ［［０９−１２（それ ぞれＳＥｏ　１０　ＮＯ：３３力）ら３６））を、各２００ｎｇずつ混合して最 終容量を１０μｌにし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｅｉａ） および１　ｉＭ　ＡＴＰを使用して３７℃で１時間リン酸化し、５分間７０℃に 加熱し、そして３分間６５℃に加熱してアニールして二本鎖を形成し、その後、 ３０分間に渡り室温に冷却した。反応物を室温で１時間、Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ （ＢＲＬ）　１．ＯＵ、および１　ｍＭ　ＡＴＰで処理し、その後、５分間７０ ℃に加熱した。次に、末端オリゴヌクレオチドを、連結されたオリゴヌクレオチ ドにアニールした。アニールおよび連結されたオリゴヌクレオチドは、５′末端 にＢａｇ旧部位、ならびに３゛末端に旧ｎｄｌ［１部位に側面を接した二本鎖Ｄ ＮＡを与えた。翻訳終止コドン（アンバー）は、Ｂａａ旧部位の直後に続く。遺 伝子Ｖｌｌ＋配列は、終止コドンに２′りのコドンのコドンＧＡＡ　（Ｇｌｕ） ３’からで始まる。二本鎖挿入断片をＭ１３ポリリンカー内のＥｃｏＲＩおよび Ｓａｃ　Ｉ部位にフレームであわせてクローン化した。

そして、Ｍ１３＋５ｐ１９をＢａａ　Ｈｌ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ ｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、　ＭＡ）および旧ｎｄ　ＩＩＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、モル比１：１０で二本鎖挿入断片と混 ぜた。連結は、１．ＯＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）を含む１ｘリガーゼ緩衝溶液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ Ｈ７，８，１０ｉＭ　ＭｇＣｌ２．２０　ｍＭ　ＤＴＴ、　１園Ｍ　ＡＴＰ、５ ０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）中で、−夜室温で実施した。連結混合物を、当該分野の 標準的な方法により、宿主に形質転換し、陽性クローンをスクリーニングした。

数種の変異を構築物中に生成して機能性Ｍ１３［Ｘ０ＩＦを得た。

変異は、本明細書に寥考として援用したｌ：ｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　１５４：３６７−３８２　（１９８７）に記載の部位特異的変異誘 発の方法により生成した。試薬、菌株およびプロトコルは、Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｍ ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ Ａ）から得、変異誘発は製造業者の推奨通りに実施した。

変異体オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＡＧＡ −３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７）および５’−ＴＡＧＣＡＴＴＡＡＣＧＴ ＣＣＡＡＴＡ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８）を使用して、ベクターから ２つのＦｏｋ　［部位を、ならびにｐｓｅｕｄｏ遺伝子Ｖｌ１１配列の末端の旧 ｎｄＩＩＵＫ位を除去した。

さらに、新しいＨ８ｎｄ　ｆ［［およびＭｌｕ　１部位を、Ｍ１３１ＸＯＩＦの ３９１９位および３９５１位に導入した。この変異誘発に使用したオリゴヌクレ オチドは、それぞれ、配列５’　−ＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡ ＴＣＴＴＣＴ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９）および５’　−ＧＡＣＡＡ ＡＧＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’　（ＳＥＱ　ｆＤ　ＮＯ＋４０） を有していた。［、ａｃ　Ｚのアミ／末端部分を、変異体オリゴヌクレオチド５ ’　−ＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＡＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧ ＣＣＴ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１）を使用したオリゴヌクレオチド特異 的変異誘発で欠損した。上記の変異体を構築するのに、Ｍ１３コーディング領域 の全ての変化は、アミノ酸配列が変化せずに残っているように実施した。得られ たベクター、Ｍ１３１ＸＯＩＦを最終工程で使用して、Ｍ１３１Ｘ３０を構築し た（以下参照）。

軍二工程では、Ｍ１３ｍｐ１ｇを、Ｌａｃ　Ｚの５゛末端を、　Ｌａｃ　Ｚリポ ソーム結合部位および開始コドンを含めて、Ｌａｃ　ｆ結合部位まで除去し、変 異させた。さらに、ポリリンカーを除き、Ｍｌｕ　１部位をＬａｃ　Ｚのコーデ ィング領域に導入した。１つのオリゴヌクレオチドをこれらの変異誘発に使用し 、それは、配列５−ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＴＧＡＣＧＣＧ ＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

：４２）を有していた。旧ｎｄ　ＩＩＩおよびＥｃｏ　Ｒ１の制限酵素部位を、 オリゴヌクレオチド５°−ＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＧ　Ｃ ＧＡＴＴＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＣＣ−３°（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：４３ ）を使用してＭｌｕ　１部位の下流に導入した。ＭＬ３ｍｐ１８のこれらの改変 は、前駆体ベクターＭ１３１ＸＯ３を与えた。

発現配列およびクローニング部位を、所望の配列の両ストランドをコードする一 連のオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによってＭ１３１ＸＯ３に導入 した。オリゴヌクレオチドを表ＩＶに挙げる。

（以下余白） 」ニ： オリボッフレ丁　゛ 上記表ＩＶ中のオリゴヌクレオチドを、末端オリゴヌクレオチド０８４　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：４４）および０８５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８）を除いて 、実施例Ｉに記載のように、混合し、リン酸化し、アニールして、そして連結し て二本鎖挿入断片を形成した。しかし、中間産物のベクターに直接クローニング するかわりに、その挿入断片をまずＰＣＲにより増幅した。末端オリゴヌクレオ チドは、ＰＣＲ用のプライマーとして使用した。オリゴヌクレオチド０８４　（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４）は、その５′末端から内側へ１０ヌクレオチドに、 ）Ｉｉｎｄ　Ｉｌ１部位を有し、オリゴヌクレオチド０８５　（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：４８）は、その５°末端にＥｃｏ　Ｒ［部位を有する。増幅の後、実施例 Ｉに記載のように、産生物を旧ｎｄｌｌＩおよびＥｃｏ　Ｒ１で消化して、同じ ２つの酵素で消化したＭ１３ｍｐ１８のポリリンカーに連結した。得られた二本 鎖挿入断片は、リポソーム結合部位、翻訳開始コドン、その後にリーダー配列お よび任意のオリゴヌクレオチドのクローニング用の３つの制限部位（Ｘｈ。

Ｌ　Ｓｔｕ　Ｌ　Ｓｐｅ　Ｉ）を含有した。この中間産物のベクターをＭ１３１ ＸＯ４と呼ツタ。

二本鎖挿入断片のクローニング中に、オリゴヌクレオチド０２８中のＧＣＣコド ンの１つと、０３１中のその相補体とが欠損していることが認められた。この欠 損は機能には影響しなかったので、最終構築物には２つのＧＣＣＣＣコドンちの １つがない。

さらに、オリゴヌクレオチド０３２　（ｓＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０）は、ＧＡＧ コドンが必要とされるところにＧＴＧコドンを含んでいた。変異誘発は、オリゴ ヌクレオチド５°−ＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＡＧ丁ＧＣＣＡＧＴＧＣ−３°（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：５２）を使用して実施し、コドンを所望の配列に変換した。得 られたベクターをＭ１ｆｆｌＸ０４Ｂと呼んだ。

Ｍ１３１Ｘ３０の構築での篤三工程では、Ｍ２Ｓ　［Ｘ０４Ｂからの発現および クローニング配列を、Ｍ１３１ＸＯＩＦ中のｐｓｅｕｄｏ野生型ｇＶＩＩｌの上 流に挿入した。この工程は、Ｍ２Ｓ　１ＸＯ４ＢをＤｒａ　ＩＩＩおよびＢａｇ 　ＨＩで消化し、目的の配列を含む７００塩基対の挿入断片をゲル分離すること により完了した。Ｍ１３１ＸＯＩＦを、同様にＤｒａ　ｆｉｌおよびＢａｍＩＩ で消化した。挿入断片を、実施例■に記載のように、モル比１：１で二重消化し たベクターと混ぜて連結した。最終構築物Ｍ１３１Ｘ３Ｑ）配列は、図２　（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１）　ニ示す。さらに、図ＩＡには、ｌ（ｃフラグメントの 表面発現に必要な各エレメントに印をつけたＭ２Ｓ　１Ｘ３０を示した。ベクタ ーの改変の間に、ある種の配列は、Ｍ１３ｍｐｌａの報告された配列とは異なっ たことは注目されるべきである。新しい配列は、本明細書に報告されている配列 に加えている。

Ｍ１３１Ｘ１１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）　、すなわちＬｃベクターは、Ｌ ｃ抗体フラグメントの種々の集合体を宿すために構築した。このベクターは、Ｍ １３ｍｐ１９からも構築され、以下の（１）から（４）を含んでいる：（１）プ ロモーター、シグナル配列および翻訳開始シグナルなどの発現に必要な配列；（ ２）ハイブリダイゼーションによる配列挿入用のＥｃｏ　ＲＶ制限部位、および Ｌｃ配列のクローニング用のＳａｃ　ｌおよびＸｂａ　ｌ制限部位：　（３）Ｈ ｃおよびＬｃベクタ一部分のランダム結合用の旧ｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　１部位 の２つのペアー；ならびに（４）余分な制限部位を除去するための他の変異。

発現、翻釈（肯始−／グナル５．７　＋コ・−ニング部位おＪ、びＭｌｕ　１部 位の１つを、１”、記のｊ、うζ［１重複オリゴヌクレオチドのアー！、・−リ ンｒ　ｌ；：　Ｊ、り構築！、−１゛５゛Ｅ開−１゛部位、Ｉζ３よび３′旧ｎ ｄｌ１１部位４゛・含む一本晴挿入断片を作成した□、この重複オリゴヌク１． 個チトは、表Ｖに示す１１４゛−のオリゴヌクレオチドを１，１：ｉ己のように 、Ｍ１３ｍｐＨｌのＥｅｏ　Ｒ１部位と旧ｎｒｌ　１１１部位と間の拝人断ハと しで、Ｍ１３１ＸＯ３ｚ挿入される発現配列用に連結Ｉまた。リボ゛バーム結合 部位（ＡＧＧＡＧＡＣ）は、オリゴヌクレオチド０１５中に位置し、そして、翻 訳開始コドン（ＡＴＧ）は、オリゴヌクレオチド０１６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ５５）の最初の３ヌクレオチドである。

（以下余白） 圭−ｙ Ａリゴ／′７し才→ト′　−迫ふ夕１．．．ゴ５゜＋、、　ｔ；９−：Ｌ・）。

０８２　ＣｋＣＣＴＴＣＡＴＧ　ＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡ　ＧＴＣ ＡＴ ０１５　人Ａ’！Ｔ　ＣＧＣＣＭＧ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＴＣＡＴ０１６　ＡＡ ＴＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＣＴＡ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＡＣＧＧＣＡ　ＧＣＣＧＣｒ　 ＧＧＡ　Ｔ’ｒＧ　ＴＴ０１７　Ａ’ｎｌ’Ａ　ＣｒＣＧＣｒ　ＧＣＣＣＡＡ　 ＣＣＡ　ＧＣＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧ　ＣｒＣＧＴＧ　ＡＴ０１１３　ＧＡＣＣＣ ＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴＡＴＣＣλＡＣＡＧ　Ｇ大入τＧＡ　ＧＴＧ　Ｔ ｒＡ　Ａτ０１９　ＴＣＴ　ＡＧλλｃｃ　ＣＧＴ　Ｃ０８）　ＴｒＣＡＧＧＴ ｒＧＡＡＧＣＴＴＡ　ＣＧＣＧＴＴＣＴＡ　ＣＡＡ　ＴＴＡ　ＡＣＡ　ＣＴＣＡ ＴＴＣＴＧＴ ０２１　τに　ＧＡＴ　ＡＴＣＴＧＧ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴＣＡＴ　ＣＡＣ ＧＡＧ　ＣＴＣＧＧＣＣＡＴ　Ｃ０２２ＧＣＴＧＧ　ＴｒＧ　ＧＧＣＡＧＣＧＡ Ｇ　ＴＡＡτλＡＣ入Ａ　ＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣ０２）　ＧＴ　ＡＧＧ　 ＣＡＡ　ＴＡＧ　ＧＴＡ　ＴＦｒ　ＣＡＴＴＡＴ　ＧＡ（ＴＧＴ　ＣＣＴ　ＴＧ Ｇ　ＣＧオリゴヌクレオチド０１７　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６）は、ＡＴＧ コドンから下流の６７ヌクレオチドにＳａｃ　Ｉ制限部位を有する。天然のＥｃ 。

Ｒ１部位を除去して、新しいＥｅｏ　Ｒ［および旧ｎｄ　Ｉ１１部位を５ａｃＩ から下流に導入した。オリゴヌクレオチド５°−ＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＧ ＧＣＧＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡ〜３°（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３）および ５°−ＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＴＧ ＧＧＴ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４）を、各変異を生成するために、そ れぞれを使用した。Ｌａｃ　Ｚリポソーム結合部位を、Ｍ１３＋ａｐｌＳ中のも とのＥｅｏ　Ｒ１部位を変異させたときに除去した。さらに、新しいＥｃｏ　Ｒ １および［ｆｉｎｄ　Ｉ１１部位をつくるときに、１００ｂｐの自然欠損が、ち ょうど３′からこれらの部位までに認められた。この欠損は機能に影響しないの で、最終ベクター中に存在していた。

上記変異に加えて、種々の他の改変で、ある種の配列の組み込みおよび除去がな された。二本鎖挿入断片を連結するのに使用した旧ｎｄ　Ｉ＋１部位を、オリゴ ヌクレオチド５’　−ＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＴＧＡＣＧＣＧＴＴＣＴＡ−３ °（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６５）により除去した。第二のＨｉｎｄ　ＩＩＩおよ びＭｌｕ　１部位を、Ｈｉｎｄ　ＩＩ＋変異誘発にはオリゴヌクレオチド５’− ＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＴ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０：６６）を使用し、Ｍｌｕ　Ｉ変異誘発にはオリゴヌクレオチド５’−ＧＡ ＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ６７）を使用して、それぞれ３９２２位および３９５２位に導入した。再度コー ディング領域内の変異は、アミノ酸配列を変化させなかった。

邊られたベクター、Ｍ１３！Ｘｌｌの配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）は、図３ に示す。図ＩＢには、Ｌｃフラグメント間の表面発現ライブラリーを産生ずるた めに必要な各エレメントに印をつけたＭ２Ｓ　１Ｘｌｌを示す。

ライブラリーの 上記ＰＣＨにより合成されたＨｃおよびＬｃ配列の各集合体を、それぞれＭ１３ １Ｘ３０ならびｉｃＭ１３１ＸＩＮ、：、別々ニｙａ−：／化しｒＨｃおよびＬ ｃライブラリーを構築する。

ＨｅおよびＬｃ産物（５μｇ）を混合し、エタノール沈澱させ、そして２０μｌ のＮａ０Ａｃ！！衝溶液（３３ｒａＭ　Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ７，９，１０ｍＭ　 Ｍｇ−酢酸、ＨｍＭ　Ｋ−酢酸、０．５　ｄ　ＤＴＴ）に再懸濁させる。

Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを５ユニット加え、反応物を５分間３０℃でインキュ ベートしてエキソヌクレアーゼ消化により３°末端を除去する。５分間７０℃で 加熱して反応を停止する。Ｍ２Ｓ［Ｘ３０をＳｔｕ　Ｉｔ”消化し、Ｍ１３１Ｘ １１はＥｃｏ　ＲＶで消化する。両ベクターを、上記のように７４　ＤＮＡポリ メラーゼで処理し、適切なＰＣＲ産物とモル比１：１．１０ｎｇ／μＩで混合し 、室温で一夜、上記緩衝溶液中でアニールさせた。各アニーリングからのＤＮＡ を、エレクトロポレーシヨンによりＭＫ３０−３　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｉ ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に導入し、以下に記載するように、Ｈｅおよび Ｌｃライブラリーを構築する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＫ３０−３に、本明細書に参考として援用したＳｓ＋ｉｔｈ ら、Ｆｏｃｕｓ　１２：３８−４０　＜１９９０＞に記載されているように・　 エレクトロポレーシｌンを行った。細胞は、ＭＫ３０−３の新鮮コロニーを、５ ｍｌのマグネシウムを含まないＳＯＢ　（２０ｇ　ｍｅｎ用トリプトン、５ｇ細 菌用酵母二牛ス、０．５８４　ｇ　ＮａＣ１，０，１８６ｇ　ＫＣＩ、ｄｔ１２ ０で１０００　ｍｌにしたもの）に播種して調製し、３７℃で一夜、激しく通気 して増殖させる。マグネシウムを含まないＳＯＢ　（５００ｍｌ）を、−夜培養 したもので１：ＩＱＯＯに播種し、０ＤｓｓａがＯ，ａになるまで（約２から３ 時間）、３７℃で激しく通気し増殖させる。細胞を、Ｇ５３Ｃｆｆ−ター（Ｓｏ ｒｖａｌｌ、　Ｎｅｗｔｏｖｎ、　ＣＴ）中で、４℃で１０分間、５．００Ｏｒ ｐｍ　（２，６００ｘ　ｇ　）で遠心分離して回収し、５００１１１の水冷した 滅菌１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール中に再懸濁させ、遠心分離し、そして同様の 様式で第２回目の再懸濁を行う。

三度巨の遠心分離の後、細胞を１０％滅菌グリセロールに再懸濁して、０Ｄｓｓ ａが２ｏｏから３００になるように最終容量を約２　ｍｌにする。通常は、上清 を取り除いた後の瓶に残る１０％グリセロール中で再懸濁がなされる。細胞は、 微量遠心分離チューブ中の４０μｌを、ドライアイス−エタノール浴を使用して 凍結し、−７０℃で保存する。

凍結細胞は、使用の前に氷上で徐々に解凍して、細胞懸濁物４０μｌあたり約Ｉ Ｑ　ｐｇからｓｏｏ　ｎｇのベクターと混合して、エレクトロポレーシタンを行 う。４０μｍ分を０．１ｃｍエレクトロボレーシコンチャンバー（Ｂｉｏ−［？ ａｄ、　Ｒ４ｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）に入れ、０℃で、パルス長（τ）約４　ｍ ｓを与える、４にΩ並行抵抗機２５ｔｔＦ、　１．８１１１［Ｖにより１回パル スを行う。パルスされた細胞の１０μｌを、１２−　ｘ　７５−ｍ＋ｗ培養培養 −ブ中テｌ　ｍｌ　ＳＯＣ（９８ｍｌ　ＳＯａに、１　ｍｌ〕２　Ｍ　ＭｇＣＩ ｚおよび１　ｍｌの２Ｍグルコースを加えたもの）に希釈し、選択培地中で培養 する（以下会照）前に、培養物を３７℃で１時間振盪する。

各ライブラリーを、当業者に公知の方法により培養する。

このような方法は、５ａｎｂｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｎｇ ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕｅｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｉａｒｂｏ ｒ、　１９ｇ９およびＡｕ５ｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｔｓ ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　ｆｉｌｅｙおよび５ｏ ｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８９に記載されている。この両方は、本明細書に参考として援用されている 。簡単には、上記の１−１のライブラリー培養物を２ＸＹＴ培地（１６ｇトリプ トン、ｔｏ　ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣ１）中に５０倍に希釈して、３７℃で５ −１時間培養して、増殖する。

ファージを含有する上溝を滅菌チューブに移し、４℃で保存する。

ＨｅおよびＬｃ抗体フラグメントを有する二本鎖ベクターＤＮＡを、各ライブラ リーから単離する。簡単には、ベレットをＴＥ（ｔ。

＠Ｍ　ＴｒｉｓＳｐＫ　８．０．１　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ）中で洗浄し、Ｓｏｒｖ ｇｌ遠心分離機（Ｎｅｗｔｏｗｎ、　ＣＴ）で、７．００Ｏｒｐｍ、　５分間遠 心分離して回収する◇　ベレットを、１０％スクロース　６　ｍｌ、　５０　ｇ ＋Ｍ　ＴｒｉｓＳｐＨ８，０中に再懸濁する。１０ｍｇ／μｌリゾチームを３． ０ｍｌ加え、氷上テ２Ｑ分間インキュベートスる。０．２　Ｍ　Ｍａｉｌ、１＄ ＳＤＳを１２　ｍｌ加え、その後、１０分間水上におく。次に、懸濁物に３　Ｍ 　Ｎａ０ＡｃｐＨ４，６を７．５ｍｌ加えた後、２０分間氷上でインキュベート する。

試料を４℃で１５分間、１５．０００　ｒｐ＋ｓで遠心分離し、ＲＮアーゼで処 理し、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後、エタノールで沈澱させる。

ベレットを再懸濁させ、ひょう量し、密Ｗが１＞０ｇ７曹ｌになるまで、等重量 のＣ＄ＣＩ２を各チューブに溶解する。ＥｔＢｒを６００μｇ／ｍｌになるよう に加え、二本鎖ＤＮＡを、Ｔ’／（６６５ｅｌ−ター（Ｓｏｒｖａｌ）で、５０ ．００Ｏｒｐｍ、　５時間、平衡遠心部離して単離した。各右および左半分のサ ブライブラリーからのＤＩＩＩＡを使用して、ランダム化オリゴヌクレオチドの 右および左半分をランダムに結合させた４０のライブラリーをつくる。

表面発現ライブラリーを、Ｍ２Ｓ　ｒＸ３０の部分を含むＨＣと、Ｍ１３ＩＸＩ Ｉの部分を含むＬｃ部分とをランダムに結合することにより作成する。各ライブ ラリーからのＤＮＡを別々に、過剰の制限酵素で消化した。Ｌｃ集合体（５Ｍｇ ）は、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで消化する。

Ｈａ集合体（５Ｍｇ）は、Ｍｌｕ　＋で消化する。反応を、フェノール／クロロ ホルム抽出して停止し、その後、エタノールで沈澱させる。ベレットを７０％エ タノール中で洗浄し、２０μｌのＮａ０Ａｃ緩衝溶液に再懸濁させる。５ユニツ トの７４　ＤＩＩＩＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒａａｃｉａ）を加え、反応物を３ ０℃で５分間インキュベートする。反応を５分間７０℃で加熱して停止する。Ｈ ｃおよびＬＣＤＮＡを混合して、最終濃度をμｌあたり各ベクター１０　ｎＨに し、室温で一夜アニールさせる。混合物を、上記のように、エレクトロポレーシ ョンによりＭＫ３０−３細胞に導入する。

（以下余白） ライブラリーの　ｉ 精製ファージは、４℃で保存したファージを１０ｔｏ、ｉで感染地５０ｉ１から 調製した。

培養物を２ｍＭの［ＰＴＧで誘発した。上澄は二度の遠心分離で澄明にし、ファ ージは、１／７．５の容量のＰＥＧ溶液（２５％ＰＥＧ−１１０００゜２．５Ｍ 　ＮａＣ１）を加えて沈澱させ、次に４℃で一夜インキユベートシタ。沈澱物は １０．ＯＯＯＸｇで９０分間遠心分離して得た。ファージベレットを２５ｍ１（ ７＞０．ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｅｌ　ｐＨ７，６，１，０＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ、お 、Ｊ、　ヒｏ、　１％サルコシルに再懸濁して、室温で３０分間ゆるやかに振盪 する。溶液を０．５Ｍ　ＮａＣｌに調整し、および最終的には５％ポリエチレン グリコール濃度になるようにＨ整する。４℃で２時間放１１Ｅしたのち、ＩＳ、 ＯＯＯＸｇで１時間遠心分離して、ファージを含む沈澱物を回収する。沈澱物を ＮＥＴバッファー（０，ＬＭ　ＮａＣ１，１，ＯｍＭ　ＥＤＴＡ、およびＯ，Ｏ ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐ［１７，６）１０＋＊ｌｌ：再懸濁し、よく攪拌 し、１７０，０ＱＱｘｇで３時間遠心分離して、再びファージベレットを得る。

７アージベレソトはＺ＋＊Ｉの１ｒＥＴバツフアーに再懸濁して一夜放置、１１ ０，０ＱＱｘ　ｇで１８時間、塩化セシウム遠心分離（バッファー１０ｍ１中に ３．８６ｇの塩化セシウム）ヲ行う。ファージのバンドを集め、ＮＥＴバッファ ーで７倍に希釈、再び１７ｏ、ｏａａｘｇで３時間遠心分離して、０．１ｉＭの アジ化ナトリウムを含む０．３ｍｌのＮＥＴバッファーに再懸濁して４℃で保存 する。

ストレプトアビジン被覆プレートのパニングに用いるＢＤＰは、まずビオチン化 したのちＵＶ不活性化阻害ファージ（以下参照）に対して吸収される。ビオチン 化試薬は、ジメチルホルムアミドに、溶媒１ｍｌに対して、２．４Ｂの割合で固 体のＩＪＨｓ−ＳＳ−ビオチン（スルホスクシンイミジル　２−（ビオチンアミ ド）エチル−１，３−一ジチオプロピオネート；　Ｐｉｅｒｃｅ、［１ｏｃｋ４ ｏｒｄ、　ＩＬ）を溶解し、製造者の指示に従って使用する。小規模の反応は、 溶解した試薬１μｌを、滅菌した重炭酸バッフｙ　−（０，ＩＭ　ＮａＨＣＯ３ ，ｐＨｆｌ、　６）でｌａｇ／ｍｌに希釈したＢＤＰ４３μｌと混合して行う。

２５℃で２時間数ｌｌ後、残ったビオチン化試薬を１Ｍエタノールアミン（塩酸 にてｐＨ９にＩＭ整）５００μｍと更に２時間反応させる。試料全体をｌａｇ／ ｌｌのＢＳＡを含む１１のＴＢＳで希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０　（Ａｍｉ ｃｏｎ）で限外濾過し約５０μｌまで濃縮し、同じフィルター上で２ｍｌのＴＢ Ｓで３回、次ニ０．０２％ＮａＮｔおよび７Ｘ１０”’の［不活性化された阻害 ファージを含有する１鱈のＴＢＳで１回洗浄する。（以下参照）：最終的な保持 物質（６０−８０μｍ）は、４℃で保存する。ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン試薬によ ってビオチン化したＢＤＰはジスルフィド含有鎖を介してビオチンと結合してい る。

ＵＶ照射Ｍ１３ファージは偶然にも一般的に繊維状ファージと結合できるビオチ ン化ＢＤＰのいずれを阻害するのにも使用される。

Ｍ１３ｍｐ８　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、Ｇｅｎｅ　１９：２ ６２−２７６（１９８２）、ここで参考として援用する）を選んだのは、それが ２つのアンバー変異を有するので、表面発現ライブラリーのタイター測定に用い るｓｕｐ　０株では照射で生き延びたわずかのファージを、確実に生育させない からである。上述の方法で精製した５×１０′３のＭ１３＋ｍｐ８ファージを含 む試料５醜ｌを小ベトリ皿に置き、２フイートの距離で７分間（フラツクス１５ ０μＷ／（２）２）殺菌灯を照射する。ＮａＮ３を０．０２％になるように加え 、ファージ粒子を１０１４粒子／ｌｌになるようＣｅｎｔｒｉｅｏｎ　３０−ｋ Ｄａ（Ａｍｉｅｏｎ）で限外濾過して濃縮する。

パニングは、ポリスチレン製ベト９皿（６０Ｘ１５園）に、ｐＦ［ｌｌ。

６の０．ＩＭ　ＮａＨＣＯ３−０，０２％ＮａＮ３にｌａｇ／ｍｌのストレプト アビジン（ＢＲＬ）が入った溶液１ｍｌをいれ、低星室に置いた小さな気密プラ スチック箱中で一夜インキコベートして行う。次の日、ストレプトアビジンを取 り除き、少なくとも１０ｍ１の阻害液（ＢＳＡ２９呵／■ｌ：ストレプトアビジ ン３μｇ／ｍｌ：　ｐＨ８，６のＯ，ＬＭ　ＮａＨＣＯｘ−０，０２％ＮａＮｘ ）に置換し、室温で少なくとも１時間インキュベートする。阻害液を取り除き、 すばやく、０．５％ツイーン２０　（ＴＢＳ−Ｑ、５％ツイーン２０）を含有す るトリスバブファー添加生理食塩水にて３回洗浄する。

ＢＤＰを結合して抗体フラグメントを発現したファージの選択は、ライブラリー の５０μｌ量と反応した、阻害されたビオチン化ＢＤＰを５μ！（２，７Ｍｇ　 ＢＤＰ）を用いて行った。それぞれの混液を、４℃で一夜インキ１ベートした後 １ｍｌのＴＢＳ−０，５％ツイーン２０で希釈して、上述のように調製したスト レプトアビジン被覆プレートに移す。室温にて１０分間揺すった後、未結合のフ ァージを取り除き、プレートをＴＢＳ−０，５％ツイーン２０で１０回、３０− ９０分以上かけて洗浄する。結合したファージは、８００μｌの滅菌した溶出バ ッファー（１ｌｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、０．１Ｍ塩酸、グリセロールにてｐＨ２，２ に調整〉でプレートから１５分間溶出させ、溶出液は４８μｌの２Ｍ　Ｔｒｉｓ （ｐＨ未調整）で中和する。それぞれの溶出液２０μｌ量を、投入するファージ を希釈して、ＭＫ−３０−３の濃縮細胞でタイターする。

蔦二回巨のパニングは、ライブラリーからの最初の溶出液７５０μｍを５μｍＭ のＤＴＴで１０分間処理して、残ったビオチン化結合たんばくをビオチン基に結 び付けているジスルフィド結合を切断する。処理した溶出液は、Ｃｅｎｔｒｉｃ ｏｎ３０　（Ａ■１ｃｏｎ）で限外濾過して濃縮し、ＴＢＳ−０，５％ツイーン ２０で３回洗浄し、最終的に約５０μｍにする。最終的な保持物質は、５．０μ ｍ（２，７Ｍｇ　ＢＤＰ）の阻害されたビオチン化ＢＤＰを含有するチューブに 移し、−夜インキュベートする。溶液をｌｌ１ｌのＴＢＳ−０，５％ツイーン２ ０で希釈し、パニングして、新たにストレプトアビジン被覆したベトリ皿上で上 述のように溶出する。二回目の溶出液全体ｃａｏｏμｍ）を４８μｌの２Ｍ　Ｔ ｒｉｓで中和し、その２０μｍを、最初の溶出液と投入したファージの希釈液で ただちに測定する。必要ならば、均質のファージ集合体が得られるまで更にノ（ ンニングを行うことが出来る。加えて、試薬類が検出に有用ならばファージをプ ラーク精製することができる。

の・　＋１ 配列決定に用いる鋳型は、精製した集合体から得られた個々のプラークを冑する ＸＬＩを一夜培養し、培養液の１：１００希釈液を含む１ｍｌの２ＸＹＴ培地を 接種して調製する。プラークは、滅菌したつまようじで採取する。３７℃で５− ６時間振盪培養した後、１、５ｍｌのマイクロフニージチ）−ブに移す。２００ μｍのＰＥＧ溶液を加え、次にボルテブクススターラーで攪拌したのち氷上に１ ０分間放置する。ファージ沈澱物はマイクロフユージで１２．０００×ｇで５分 間遠心分難して回収する。上澄を捨て、ベレットを２３０μｌのＴＥ（１０ｄ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１＋ｍＭ　ＥＤＴＡ、）に黄色のピペットチッ プで静かにピペッティングして再懸濁する。フェノール（２００μｍ）を加え、 続いてボルテｙクススターラーで軽く攪拌シ、マイクロフニージで相に分離する 。水相を別ノチューブに移して、フェノール／クロロホルム（１：１）２００μ ｌで、フェノール抽出について上述したように抽出する。３Ｍ　Ｎａ０Ａｅ　０ ．１容量を加え、次に２．５容量のエタノールを加えて一２０℃で２０分間沈澱 させる。沈澱した鋳型は、マイクロッ１−ジで１２，０００Ｘｇで８分間遠心分 離して回収する。ベレツトは７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、２５μｍのＴ Ｅに再懸濁する。配列決定は、５ｅｑｕｅｎａｓｅ”シーケンシングキットを製 造者（Ｕ、　Ｓ、　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ） が提供するプロトコールに従って、行う。

１１医１ この実施例は、抗体の重鎖および軽鎖フラグメントをコードする配列を制限エン ドヌクレアーゼを使用してＭ１３ＩＸ肛型ベクター中に同時取り込みすることを 示す。

重鎮および軽鎖をコードする配列を一個の共同発現ベクターに同時取り込みする ために、マウスモノクローナル抗体（ＤＡＮ−１８Ｈ４：Ｂｉｏｓｉｔｅ、Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の重鎖および軽鎖をコードする配列を含有する一つのＭ ２Ｓ　１ＸＨＬベクターが製造された。挿入された抗体フラグメント配列は、ハ イブリッド形成用の相補的配列として部位突然変異誘発による［ＩｃおよびＬｃ の取り込みに対して、使用され得る。重鎮および軽鎖ポリペプチドをコードする 遺伝子はそれぞれ、Ｍ１３１Ｘ３Ｇ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１）およびＭ１３１ Ｘ１１（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２）中に挿入され、実施例Ｉに述べたようにして 、単一の表面発現ベクターに結合される。生じるＭ１３ＩＸＨＬ型ベクターを、 Ｍ１３１Ｘ５０と名付ける。

この結合は、一つのＨｅベクターと一つのＬｃベクターの半分が一個の環状ベク ターを形成するのを促進するような条件下で行われる。すなわち、Ｍｌｕ　Ｉま たはＨｉｎｄ　ｍによる制限後の制限部位ペアおよびエクソヌクレアーゼ消化の 間に生じる突出が等しくない（すなわち６４のヌクレオチドが３２のヌクレオチ ドと比較されたとき）ときに、発生する。これら等しくない長さは、それぞれの ベクターの相補的な末端の特異的なアニーリングのためにハイブリッド形成温度 が興なる結果となる。

それぞれのベクターのそれぞれの末端の特異的なノ＼イブリッド形成は、一つの Ｈｅベクターの半分と一つのＬｃベクターの半分で二量体を形成する、小容量（ 約１００μｇ／μｌ）の６５℃での最初のアニーリングにより行われる。二量体 は混合物を希釈（約２０μｇ／μｍにする）して温度を２５−３７℃に下げてア ニーリングさせることによって環状化される。Ｔ４　リガーゼは環状ベクターを 共有結合で閉環する。

Ｍ２Ｓ　１Ｘ５０は修飾されて、ＤＡＮモノクローナル抗体のための機能的ポリ ペプチドを産生じなかった。これを行うために、重鎮の可変領域において約８個 のアミノ酸を突然変異誘発によって変化した。Ｌｅ可変領域はオリゴヌクレオチ ド５−−ＣＴＧＡＡＣＣＴＧ　ＴＣＴＧ　ＧＧＡ　ＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＴＧＣ ＴＡＴＡＧＧＡＴ　ＣＡＧ　Ａ　ＴＣＴＡＧＡ　ＡＴＴＣＡ　ＴＴ　ＴＡ　ＧＡ ＧＡＣs ＧＧＣＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣ−３−（ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ＋６８）を用いて突 然変異誘発を行ったｏ　［！ｃ配列はオリゴヌクレオチド５−−ＴＣＧＡＣＣＧ ＴＴＧＧＴＡＧＧＡＡ　ＴＡＡＴＧＣＡ　ＡＴＴＡＡＴＧＧＡＧＴＡＧＣＴＣＴ ＡＡＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＡＴＴＣＡ　ＴＣＴＡ　ＣＡＣＣＣＡ　ＧＴＧＣＡＴＣ ＣＡＧＴＡＧＣＴ−３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：６９）により突然変異誘発を行 った。

付加的な突然変異も、ベクターの最終的な形態を与えるために、Ｍ１３１Ｘ５０ に導入された。Ｍ１３１Ｘ５０の中間体（実施例Ｉに述べたＭ１３１ＸＯ４）を 構成する間に、６つのヌクレオチド配列がオリゴヌクレオチド０２７とその相補 体０３２へ複製された。この、５−−ＴＴＡＣＣＧ−３−配列は、オリゴヌクレ オチド５″−ＧＧＴＡＡＡＣＡＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＣＣＡＧ−３− （ＳＥＱ　１０　Ｎｏニア０）を用いた突然変異誘発により除去した。生じたベ クターを、Ｍ１３１Ｘ５３と名付けた。

Ｍ１３１Ｘ５３は、一本鎖として製造され得、機能的な抗体ヘテロマーを発現し ないことを除いては、前述したＭ２Ｓ　ＩＸＨＬベクターの機能的な要素をすべ て含んでいる。この一本鎖ベクターは、一本鎖ＨｅおよびＬｃをコードする配列 の集合体を、ベクターに取り込むために、突然変異誘発によりノ＼イブリ・ノド 形成することができる。一本鎖ＨｅおよびＬｃをコードする配列の集合体は、実 施例１に述べたＰＣＲ生成物から当業者により、またはプライマーおよびここに 述べた教示を用いて、当業者によく知られている他の方法により、製造され得る 。結果として得られたベクターは、ランダムに取り込まれたＨｃおよびＬｃのを コードする配列とともに増殖し、実施例■に述べたよう所望の結合特異性が選択 される。

Ｍ１３１Ｘ５３ニ類似する他のベクターおよびＭ１３１Ｈ１、Ｍ１３１Ｘ３０１ ｉ１−由来するベクターは、ＨｃおよびＬｃをコードする配列を取り込むために 、やはり制限なしで製造された。Ｍ２Ｓ［１５３とは対照的に、これらのベクタ ーは、ヒト抗体配列を含み、効率的に）−イブリダイズし、ヒトＨＣおよびＬｃ 配列の集合体に取り込まれる。これらのベクターを、以下に簡単に述べる。開始 ベクターは、前述しりｌ（ｃバク９−　（Ｍ１３１Ｘ３０）か、あるいはＬＣＣ ツクー（Ｍ１３１Ｈ１）のいずれかである。

Ｍ１３１Ｘ３２は、Ｍ１３１Ｘ３０から、上述の６つのヌクレオチド重複配列５ −−ＴＴＡＣＣＧ−３−を取り除き、生成物の分泌を増加させるようにリーダー 配列を変異して、生成される。重複配列を取り除（のに用いたオリゴヌクレオチ ドは上に示したものと同じである。リーダー配列における変異はオリゴヌクレオ チド５−−ＧＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＴ−３−を用いて行った。こ の突然変異誘発は、結果として、Ｍ１３１Ｘ３０の６３５３位のＡ残基をＧ残基 に変化させる。

抗体フラグメントをアフィニティー精製するためのデカペプチドのタッグを、Ｍ １３１Ｘ３２にあるＨｃ発現部位のカルボキシル末端で適切なリーディングフレ ームに取り込んた。この突然変異誘発に用いたオリゴヌクレオチドは５−−ＣＧ ＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＣ ＧＧＧＴＡＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧ−３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

ニア１）であった。生じたベクターは、Ｍ１３１Ｘ３３と名付けられた。

このベクターあるいは他のベクターに対する修飾は、当業者に知られている種々 の特徴を包含することが予想される。例えば、あるペプチダーゼ切断部位を、デ カペプチドのタッグの後ろに取り込み、そのことにより、融合タンパクの■遺伝 子部分から抗体が分離される。

Ｍ１３１Ｘ３４（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：３）は、ヒトＩｇＧ１重鎖をコードする 遺伝子中にクローニングによってＭＬ３１Ｘ３３から作成される。可変領域のリ ーディングフレームを変えて、ストップコドンを導入して、機能的ポリペプチド が製造されないことを確実にした。

可変領域の突然変異誘発に用いられたオリゴヌクレオチドはＳ　−−ＣＡＣＣＧ ＧＴＴＣＧＧＧＧＡＡＴＴＡＧＴＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＣ −３−（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏニア２）であった。このベクターの完全なヌクレオチ ド配列を図４（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：３）に示す。

Ｍ１３１Ｘ１１（７）　シＩＪ−ズノイ＜ツかノヘクターがまた、Ｍ１３１Ｘ５ ３およびＭ１３１Ｘ３４ベクターについて記載したものと類似の修飾を含むよう に生成された。Ｍ１３１Ｘ１１のプロモーター領域を変異し、３５コンセンサス 配列を造るようにして、Ｍ２Ｓ［Ｘ１２を生成した。

この突然変異誘発に用いられたオリゴヌクレオチドはＳ　−−ＡＴＴＣＣＡＣＡ ＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＧＣＣＧＧＡＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧ ＧＧＧＴＧＣＣ−３＝　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏニア３）テあった。ヒトカー、／ ４軽鎖配列はＭ１３１Ｘ１２ニア０−ンサｔＬ、次に可変領域を除去して、Ｍ１ ３１Ｘ１３（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４）を生成した。このベクターの完全なヌク レオチド配列を図５（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：４）ニ示す。Ｍ１３１Ｘ１４と名付 けられた類似のベクタ−もまた、ヒトラムダ軽鎖をＭ１３［Ｘ１２の中に挿入し 続いて可変領域を除去することによって生成した。Ｍ１３１．０３とＭ１３ＩＸ １４の可変領域を除去するのに用いられたオリゴヌクレオチドはそれぞれ、５− −ＣＴＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＴＧＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＧ ＣＴＧＧＴＴＧ−３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋７４＞、およびＳ　−−ＧＡＡＣ ＡＧＡＧＴ　ＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧ ＴＴＧ−３−（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏニア５）であったＯＨａおよびＬｃベクター またはそれらの修飾体は、実施例Ｉに述べた方法を用いて結合し、Ｍ１３１Ｘ５ ３に類似する単一ベクターを、突然変異誘発によって製造し、ヒトＨｅおよびＬ ｅをコードする配列を効果的に取り込ませ得る。それらのベクターの一例は、１ １３１ＸＩ！およびＭ１３１Ｘ３４の組合せである。このベクター、Ｍ１３１Ｘ ６０．の完全なヌクレオチド配列を図６（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：５）に示す。

前述したベクターのいずれに対する付加的な修飾も、Ｈｅおよび１．Ｃ配列を効 果的に取り込んで表面発現するベクターを生成させるために、用い得る。例えば 、突然変異誘発過程における野生型鋳型に対するウラシル選択の使用を緩和する ために、そのベクター中の可変領域の位置は回文的な制限酵素部位（すなわち反 対方向に２つの類似した部位）の−・組によって置換され得る。回文的部位は突 然変異誘発の間に環から出て、たがいにハイブリダイズし、制限エンドヌクレア ーゼ消化のための二本鎖基質を形成する。部位の開裂は野生型鋳〒を破壊する。

挿入されたｌｉｅおよびＬｃＣ配列可変領域は、−零値の形をとっているので、 影響されることはない。

実施例■の方法に従い、−零値ＨｅまたはＬｃＣ集合体、適業゛者に知られてい る種々の方法によって製造され得る。例えば、実施例１に述べたＰＣＲプライマ ーは、不斉ＰＣＲ（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｅ　ＰＣＲ）に用いてそのような集合体 を生成することができる。Ｇｅ１ｆａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　”ＰＣＲＰｒｏｔ ｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａ ｉｉｏｎｓ”、Ｅｄ　ｂｙ　Ｍ、Ａ、　Ｉｎｎ１ｓ（１９９０）を参考としてこ こに援用する。不斉ＰＣＲは、二本鎖鋳型から一本鎖だけを差別的に増幅するＰ ＣＲ法である。そのような差別的増幅は、望ましくない鎖に対するプライマー量 を望ましい鎖に対するそれと比べて１０倍減少させることによって行われる。別 の方法では、−末鎖集合体が実施例■に述べたように生成した二本鎖ＰＣＲ生成 物から作られるが、二本鎖生成物の望ましくない鎖の生成に使用されたプライマ ーを、まず５−末端をキナーゼでリン酸化する点が異なる。生じた生成物は。ラ ムダ　エクソヌクレアーゼ（ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）のような５ −から３−へのエクソヌクレアーゼで処理１２て望ましくない鎖を消化して除き 得る。

上述の方法や当業者に知られた池の方法によって生成された一本鎖Ｈｅおよび１ 、Ｃ集合体は、前述したベクター中の相捕的な配列とハイブリダイズする。配列 の集合体は、ハイブリダイズした鋳型のボリメラー・ゼ延伸によ−）て順次取り 込まれ、ベクターの二本鎖になる。ランダムに結合１５たｄｃＨおよび■、Ｃ配 列の増殖と表面発現は、実施Ｌｆ４４Ｎに述べたようにし、て行われる。

本発明を、現時点で、好ましい実施態様を引用して説明１１、てぎたが、本発明 の精神を変えることなく、種々の修飾が行われ得ることが、理解されなければな らない。従って、この発明はクレームによってのみ制限される。

（以下余白） 配列表 （１）一般的情＠： （ｉ）出願人：フ七７　フイリアム　ディー。

（ｉ　ｌ）発明の名称：ヘテロマーリセブターの！！面発現ライブラリー（ｉｌ ｉ）配列数ニア５ （ｉｖ）関連住所＝ （Ａ）住所人：ブリティ、シェローグー、ブリエーゲマン　アンド　クラーク（ Ｂ）番地ニスイードＺｏｏ、　４ｔウス　フラワー　ストリーｈ　４４４（Ｃ） 市：ロサンノｔルス （Ｄ）州二カリフ愛ルニア （Ｅ１国：アメリカ合衆国。

（Ｆ）郵便番号：　９００７１ （Ｖ）コンビ講−ター跣み出し形態： （＾）媒体型：フロプビーディスク （Ｂ）コンビ１−ター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システム＋ＰＣ−凶Ｓ ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリースｔ１．０、バージ箸 ン＃１２５（ｖｌ）現在の出關デーク： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｙｌｉ＋）代理人／事務所清ｔｇ： （＾）氏名：キャンベル、キャサリン　エイ（Ｂ）登録番号８３１．８１５ （Ｃ１ｕ会／ＥＷｈ番号：　Ｐ３１８８８２（ｉＸ）電話回線情報： （ＡｉＮ話：　（８１９）　Ｓｆｆ！−９００１（Ｂ）テレファツクス：　（６ １９）　５Ｏ５−８９４９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１の情報：ＣｋＣ；０Ｃ ＴｋＡＡＣ；　ＡＣＣＴＣ：ｋＴＴＴＴ〒ＣＡＴｒＴＡτ■τＣＡＴＴＣＴＣＣ Ｔ　ＴｌＴローμＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＣａ　S１１０ ＧＡＴ＋ゴー、ＡＴＴＡ丁（ＳＡＡＡＡにＡτｃｃＱすＡｃｃｃ’ｒ　ＡＡτＡ Ａ（：（：にＣＣＣＴＡτＣＡＣＣＣＡ　ＡＡＡτ（：ＣＣbＡＴ　２４６０ ＣｋｋＡＡＣＧＣＣＣＴＡＣＡ（ＴＣＴＣＡ　ｃｃｃＴＡＡＡ＋１；Ｃ；ＣＡＡ ＡＣＴＴＣＡＴｒ　ＣＴＣ：ＴＣＣＣＴＡＣＴＧＡＴＴＡＩhＪＩ；ＣＴ　−２ ５２０ ＴＣττττ人・：ｃｒ　Ｌ：Ｃ’ｒＡＡＴＡＡＴＴ　ＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴ　 ＴｃｃττＣＡＡＴτ　ｃｃｒ丁ＣＣＡＴＡＡＴＴＣＡ（ｊ`ＡＣＴＡ　４５０ ０ τンσＣＣＡＡＡＣＡＡＴＣＡ（：（：ＡＴ’ｒ　ＡＴＡＴＴＧＡπＡ　ＡＴＴ ＣＣムＴＣＡ真ゴＧＡτＡＡＴＣＡＣ（：ＡＡτ八丁へ：Ａ@４５６０ ＴＣＡＩｌｉＡ（、ＡＴＴ　ＣＣＣＴＡＣ（：ＣＴＴ　Ｇ（：ＧＣＴＡＴＣ（ｉ 　ｋＣτＡＣＩＴＡＴＡ　（：ττＣＣτＣＣτＡ　ＣＣＡsＭ：ＣＣｋＴ　６ ５４Ｃ 丁Ａ＾＾ττＡＴＴＣＡＡＡＡＡ（ＴｒＴＡＣＣ：Ｍ；ＣｋＡＧＧＣ丁７て＝ｒ ｒ＾Ａ（：ＣＡＡＴＡ（：ＣＣＡＡＣＡＧｃＣＣＣＧＣＡＣb６６００ （２）ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２の情報：（１）配列の特色： （Ａ）長さ：　７３１７塩基対 （Ｂ）！！：核酸 （Ｃ）鎖の数：Ｒ形態 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｘｉ＞配列記載：　ＳＥＱ　＋０　！１０：２：ＡＡＴＴＣＣＴｒＴＴ　Ｇに ＣＣＴＴＡＴＣＴ　ＡＴＣＴＣ：ＣＡＴｒＡ　（ＴＴＣＡＡＴＣＴに　（ＴＡＴ 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ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　０ Ａ（ＢＦ、　ＢＪ、　ｃｊ、　ｃｃ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ 、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、 　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＣ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、 ＳＵ Ｉ

Claims (75)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘテロマーリセプターを形成する第一および第二のポリペプチドをコードす る第一および第二のＤＮＡ配列の多様な組み合わせを有する複数の細胞を含有す る物質の組成物であって、該ポリペプチドの１つまたは両方が細胞の表面上に融 合タンパク質として発現される、組成物。
2. ２．前記複数の細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記ヘテロマーリセプターが抗体、Ｔ細胞リセプター、インテグリン、ホル モンリセプター、およびトランスミッターリセプターからなる群より選択される 、請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記第一および第二のＤＮＡ配列がヘテロマーリセプターの機能性部分をコ ードする、請求項１に記載の組成物。
5. ５．前記第一および第二のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性 部分をコードする、請求項４に記載の組成物。
6. ６．前記細胞が繊維状バクテリオファージを産生する、請求項１に記載の組成物 。
7. ７．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌからなる群より選 択される、請求項６に記載の組成物。
8. ８．前記コードされた第一および第二のポリペプチドの少なくとも１つが遺伝子 ＶＩＩＩとの融合タンパク質として発現される、請求項６に記載の組成物。
9. ９．２つのベクターを含有し、ヘテロマーリセプターを形成するポリペプチドを コードする２つ以上のＤＮＡ配列の同時発現に有用なベクターの調製のためのキ ットであって、第一ベクターが第二ベクターに結合され得るクローニング部位に 関して対称的に配向された２組の制限部位を有し、該第二ベクターがクローニン グ部位に関して対称的に配向された、第一ベクターの配向と同一の配向にある２ 組の制限部位を有し、ここで１つまたは両方のベクターが該クローニング部位に 挿入されたＤＮＡ配列によりコードされたポリペプチドの発現のために必要な配 列を含有する、ベクターの調製のためのキット。
10. １０．前記第一および第二のベクターが環状である、請求項９に記載のキット。
11. １１．前記発現ペプチドが細胞表面上の融合タンパク質として発現される、請求 項９に記載のキット。
12. １２．前記細胞が繊維状バクテリオファージを産生する、請求項９に記載のキッ ト。
13. １３．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌからなる群より 選択される、請求項９に記載のキット。
14. １４．前記ＤＮＡ配列の少なくとも１つが遺伝子ＶＩＩＩとの融合タンパク質と して発現される、請求項１３に記載のキット。
15. １５．前記２組の制限部がＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　ＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩ Ｉ−Ｍｌｕ　Ｉである、請求項９に記載のキット。
16. １６．ヘテロマーリセプターを形成するポリペプチドをコードする２つ以上のＤ ＮＡ配列の同時発現のためのクローニング系であって、第一のＤＮＡ配列の多様 な集合体を有する第一ベクターの１組、および第二のＤＮＡ配列の多様な集合体 を有する第二ベクターの１組を含有し、該第一および第二ベクターが、該第一お よび第二のＤＮＡ配列を有するベクター配列の作動可能な連結のみを行わせる様 に、該第一および第二のＤＮＡ配列の集合体を含有するためのクローニング部位 に関して対称的に配向された２組の制限部位を有する、クローニング系。
17. １７．前記第一および第二ベクターが環状である、請求項１６に記載のクローニ ング系。
18. １８．前記ヘテロマーリセプターが抗体、Ｔ細胞リセプター、インテグリン、ホ ルモンリセプターおよびトランスミッターリセプターからなる群より選択される 、請求項１６に記載のクローニング系。
19. １９．前記第一および第二のＤＮＡ配列がヘテロマーリセプターの機能性部分を コードする、請求項１６に記載のクローニング系。
20. ２０．前記第一および第二のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能 性部分をコードする、請求項１９に記載のクローニング系。
21. ２１．ヘテロマーリセプターを形成するポリペプチドをコードする２つ以上のＤ ＮＡ配列の前記同時発現が細胞表面上で行われる、請求項１６に記載のクローニ ング系。
22. ２２．前記細胞が繊維状バクテリオファージを産生する、請求項１６に記載のク ローニング系。
23. ２３．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌからなる群より 選択される、請求項２２に記載のクローニング系。
24. ２４．前記ＤＮＡ配列の少なくとも１つが遺伝子ＶＩＩＩのタンパク質産物との 融合タンパク質として発現される、請求項２３に記載のクローニング系。
25. ２５．前記２組の制限部位がＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩ Ｉ−Ｍｌｕ　Ｉである、請求項１６に記載のキット。
26. ２６．予め選択された分子に対して結合活性を示すヘテロマーリセプターを形成 するポリペプチドをコード可能な、複数の第一および第二ＤＮＡ配列を含有する 、複数の発現ベクターであって、ヘテロマーリセプターをコードする該ＤＮＡ配 列が、細胞の表面タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結される、複数 の発現ベクター。
27. ２７．前記発現ベクターが環状である、請求項２６に記載の発現ベクター。
28. ２８．前記ヘテロマーリセプクーが抗体、Ｔ細胞リセプター、インテグリン、ホ ルモンリセプターおよびトランスミッターリセプターからなる群より選択される 、請求項２３に記載の発現ベクター。
29. ２９．前記第一および第二のＤＮＡ配列がヘテロマーリセプターの機能性部分を コードする、請求項２６に記載の発現ベクター。
30. ３０．前記第一および第二のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能 性部分をコードする、請求項２９に記載の発現ベクター。
31. ３１．前記細胞が繊維状バクテリオファージを産生する、請求項２６に記載の発 現ベクター。
32. ３２．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌからなる群より 選択される、請求項２６に記載の発現ベクター。
33. ３３．前記コードされた第一または第二のポリペプチドの少なくとも１つが遺伝 子ＶＩＩＩとの融合タンパク質として発現される、請求項３２に記載の発現ベク ター。
34. ３４．ヘテロマーリセプターの多様な集合体を発現可能なベクターの多様な集合 体を構築する方法であって、該方法は以下の工程を包含する： （ａ）クローニング部位に関して対称的に配向した２組の制限部位を有する第一 ベクターに、第一ポリペプチドの多様な集合体をコードする多様なＤＮＡ配列の 第一の集合体を作動可能に連結する工程； （ｂ）クローニング部位に関して対称的に配向した２組の制限部位を、該第一ベ クターと同一の配向で有する、第二ベクターに、第二ポリペプチドの多様な集合 体をコードする多様なＤＮＡ配列の第二の集合体を作動可能に連結する工程；お よび（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程のベクター産物を、該第一および第二ＤＮ Ａ配列を有するベクター配列の作動可能な連結のみを行わせる条件下で結合する 工程。
35. ３５．前記第一および第二ベクターが環状である、請求項３４に記載の方法。
36. ３６．前記ヘテロマーリセプターが抗体、Ｔ細胞リセプター、インテグリン、ホ ルモンリセプターおよびトランスミッターリセプターからなる群より選択される 、請求項３４に記載の方法。
37. ３７．前記第一および第二のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能 性部分をコードする、請求項３４に記載の方法。
38. ３８．ヘテロマーリセプターの多様な集合体の前記発現が細胞の表面上である、 請求項３４に記載の方法。
39. ３９．前記細胞がバクテリオファージを産生する、請求項３７に記載の方法。
40. ４０．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌからなる群より 選択される、請求項３９に記載の方法。
41. ４１．前記第一または第二のＤＮＡ配列の少なくとも１つが遺伝子ＶＩＩＩの融 合タンパク質として発現される、請求項３４に記載の方法。
42. ４２．前記２組の制限部位がＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　ＩおよびＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩ−Ｍｌｕ　Ｉである、請求項３４に記載の方法。
43. ４３．請求項３４に記載の方法であって、前記結合工程がさらに以下の工程を包 含する方法： （Ｃ１）前記第一のベクターを、前記２組の制限部位中にコードされる制限部位 の１つを認識する制限酵素で制限する工程； （Ｃ２）前記第二のベクターを、前記２組の制限部位中にコードされる第二の制 限部位を認識する異なる制限酵素で制限する工程； （Ｃ３）該制限された第一および第二のベクターの３′末端をエキソヌクレアー ゼで消化する工程；および（Ｃ４）該第一および第二のベクターをアニーリング する工程。
44. ４４．予め選択された分子に対する結合活性を示すヘテロマーリセプターを多様 なヘテロマーリセプターの集合体から選択する方法であって、該方法は以下の工 程を包含する：（ａ）クローニング部位に関して対称的に配向された２組の制限 部位を有する第一ベクターに、第一のポリペプチドの多様な集合体をコードする 多様なＤＮＡ配列の第一の集合体を、作動可能に連結する工程； （ｂ）クローニング部位に関して対称的に配向された２組の制限部位を、該第一 ベクターと同一の配向で有する、第二ベクターに、第二のポリペプチドの多様な 集合体をコードする多様なＤＮＡ配列の第二の集合体を、作動可能に連結する工 程；（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程のベクター産物を、該第一および第二のＤ ＮＡ配列を含有するベクター配列の作動的な組み合わせのみ行わせる条件下で結 合する工程；（ｄ）結合されたベクターの該集合体を、第一および第二のＤＮＡ 配列の該集合体を発現させるのに充分な条件下で適合する宿主中に導入する工程 ；および （ｅ）該予め選択された分子に結合する該ヘテロマーリセプターを決定する工程 。 方法。
45. ４５．前記第一および第二ベクターが環状である、請求項４４に記載の方法。
46. ４６．前記ベテロマーリセプターが抗体、Ｔ細胞リセプター、インテグリン、ホ ルモンリセプターおよびトランスミッターリセプターからなる群より選択される 、請求項４４に記載の方法。
47. ４７．前記第一および第二のＤＮＡ配列がヘテロマーリセプターの機能性部分を コードずる、請求項４４に記載の方法。
48. ４８．前記第一および第二のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能 性部分をコードする、請求項４７に記載の方法。
49. ４９．ヘテロマーリセプターの多様な集合体の前記発現が細胞の表面上である、 請求項４４に記載の方法。
50. ５０．前記細胞が繊維状バクテリオファージを産生する、請求項４９に記載の方 法。
51. ５１．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌからなる群より 選択される、請求項５０に記載の方法。
52. ５２．前記第一および第二のＤＮＡ配列の少なくとも１つが遺伝子ＶＩＩＩの融 合タンパク質として発現される、請求項５１に記載の方法。
53. ５３．前記２組の制限部位がＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　ＩおよびＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩ−Ｍｌｕ　Ｉである、請求項４４に記載の方法。
54. ５４．請求項４４に記載の方法であって、前記結合工程が、さらに以下の工程を 包含する方法： （Ｃ１）前記第一のベクターを、前記２組の制限部位中にコードされる制限部位 の１つを認識する制限酵素で制限する工程： （Ｃ２）前記第二のベクターを、前記２組の制限部位中にコードされる第二の制 限部位を認識する異なる制限酵素で制限する工程： （Ｃ３）該制限された第一および第二のベクターの３′末端をエキソヌクレアー ゼで消化する工程；および（Ｃ４）該第一および第二のベクターをアニーリング する工程；
55. ５５．予め選択された分子に対する結合活性を示すヘテロマーリセプターをコー ドする核酸配列を、多様なヘテロマーリセプターの集合体の中から決定する方法 であって、該方法は以下の工程を包含する。 （ａ）クローニング部位に関して対称的に配向された２組の制限部位を有する第 一ベクターに、第一のポリペプチドの多様な集合体をコードする多様なＤＮＡ配 列の第一の集合体を、作動可能に連結する工程； （ｂ）クローニング部位に関して対称的に配向された２組の制限部位を、第一ベ クターと同一の配向で有する、第二ベクターに、第二のポリペプチドの多様な集 合体をコードする多様なＤＮＡ配列の第二の集合体を、作動可能に連結する工程 ；（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程のベクター産物を、該第一および第二のＤＮ Ａ配列を含有するベクター配列の作動可能な組み合わせのみ行わせる条件下で結 合する工程；（ｄ）結合されたベクターの該集合体を、第一および第二のＤＮＡ 配列の該集合体を発現させるのに充分な条件下で、適切な宿主中に導入する工程 ； （ｅ）予め選択された該分子に結合する、ヘテロマーリセプターを決定する工程 ； （ｆ）該第一および第二のポリペプチドをコードする核酸配列を単離する工程； および （ｇ）該核酸配列を配列決定する工程。 方法。
56. ５６．前記第一および第二ベクターが環状である、請求項５５に記載の方法。
57. ５７．前記第一ヘテロマーリセプターが抗体、Ｔ細胞リセプター、インテグリン 、ホルモンリセプターおよびトランスミッターリセプターからなる群より選択さ れる、請求項５５に記載の方法。
58. ５８．前記第一および第二のＤＮＡ配列がヘテロマーリセブターの機能性部分を コードする、請求項５５に記載の方法。
59. ５９．前記第一および第二のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能 性部分をコードする、請求項５８に記載の方法。
60. ６０．ヘテロマーリセプターの多様な集合体の前記の発現がＭ１３、ｆｄおよび ｆｌからなる群より選択される繊維状バクテリオファージの細胞表面上であり、 前記第一および第二のＤＮＡ配列の少なくとも１つが遺伝子ＶＩＩＩの融合タン パク質として発現される、請求項５５に記載の方法。
61. ６１．前記細胞が繊維状バクテリオファージを産生する、請求項５５に記載の方 法。
62. ６２．前記繊維状バクテリオファージがＭ１３、ｆｄおよびｆｌか、らなる群よ り選択される、請求項６１に記載の方法。
63. ６３．前記第一または第二のＤＮＡ配列の少なくとも１つが遺伝子ＶＩＩＩの融 合タンパク質として発現される、請求項６２に記載の方法。
64. ６４．前記２組の制限部位がＨｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｍｌｕ　ＩおよびＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩ−Ｍｌｕ　Ｉである、請求項５０に記載の方法。
65. ６５．請求項５０に記載の方法であって、前記結合工程が、さらに以下の工程を 包含する方法： （Ｃ１）前記第一のベクターを、前記２組の制限部位中にコードされる制限部位 の１つを認識する制限酵素で制限する工程； （Ｃ２）前記第二のベクターを、前記２組の制限部位中にコードされている第二 の制限部位を認識する異なる制限酵素で制限する工程； （Ｃ３）該制限された第一および第二のベクターの３′末端をエキソヌクレアー ゼで消化する工程；および（Ｃ４）該第一および第二のベクターをアニーリング する工程。
66. ６６．繊維状バクテリオファージのコートタンパク質をコードする遺伝子の２つ のコピーを含有するベクターであって、該遺伝子の１つのコピーがヘテロマーリ セプターのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結され得、ここ で、該ＤＮＡ配列が該繊維状バクテリオファージの表面上に融合タンパク質とし て、あるいは可溶性ポリペプチドとして発現され得る、ベクター。
67. ６７．前記遺伝子の前記２つのコピーが実質的に同じアミノ酸配列をコードする が、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項６６に記載のベクター。
68. ６８．前記遺伝子の前記１つのコピーが前記繊維状バクテリオファージの表面上 で発現される、請求項６６に記載のベクター。
69. ６９．前記繊維状バクテリオファージのコートタンパク質がＭ１３の遺伝子ＶＩ ＩＩである、請求項６６に記載のベクター。
70. ７０．前記ベクターが図２に示される配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）と実質的 に同ヒ配列を有する、請求項６６に記載のベクター。
71. ７１．ヘテロマーリセプターを形成するポリペプチドをコードする２つ以上の挿 入されたＤＮＡ配列および繊維状バクテリオファージのコートタンパク質をコー ドする遺伝子の２つのコピーの同時発現のために必要な配列を含有するベクター であって、該遺伝子の１つのコピーが、該２つ以上の挿入されたＤＮＡ配列の１ つに作動可能に連結され得、ここで、該ＤＮＡ配列が該繊維状バクテリオファー ジの表面上で融合タンパク質として、あるいは可溶性ポリペプチドとして発現さ れ得る、ベクター。
72. ７２．前記遺伝子の前記２つのコピーが実質的に同じアミノ酸配列をコードする が、異なるヌクレオチド配列を有する、請求項７１に記載のベクター。
73. ７３．前記遺伝子の前記１つのコピーが前記繊維状バクテリオファージの表面上 で発現される、請求項７１に記載のベクター。
74. ７４．前記繊維状バクテリオファージのコートタンパク質がＭ１３の遺伝子ＶＩ ＩＩである、請求項７１に記載のベクター。
75. ７５．前記ベクターが図６に示される配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）と実質的 に同じ配列を有する、請求項７１に記載のベクター。