JPH06507316A - 増幅生成物の迅速アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増幅生成物の迅速アッセイ 発明の分野 本発明は、増幅核酸配列の検出および定量に関する。

さらに詳しくは２本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅生成物中の関心核酸被 検物質の、迅速な一工程均一アッセイによる検出または定量に関する。

本明細書においては、いくつかの報文を、括弧内の番号によって引用する。これ らの引用報文は９本明細書の末尾にその詳細を記述する。これらの引用論文には 本発明に関連する技術の現在の水準が記述されている。

発明の背景 疾患状態および感染源の検出のための核酸／Ｘイブリダイゼーシ１ン法は、急速 に進展してきた技術である（１）。

これらの方法は、大部分が簡単な非放射性フォーマットによるもので、臨床検査 室での採゛用が可能であることを目標としている（２．３）、これらのアッセイ には、所望の感度を得るために、化学ルミネッセンスもしくは酵素標識またはこ れらの組合せが使用されている（４）、ＰＣＨによって達成された迅速なサンプ ル調製により、迅速かつ簡単なアッセイの開発の可能性が生れたのである。

核酸増幅方法 デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のような核酸が、自己複製時には、それ自身の鋳型 としても働くことはよく知られている。また、二本鎖もしくは二重鎖核酸がその 成分の一本鎖に分離できることもよく知られてｔ）る、これらの性質を利用して 、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ｉこよる核酸配列のインビトロでの増幅およ び修飾が可能になっている。

ＰＣＲは、対立鎖にノビイブリダイズし標的ポリヌクレオチド配列上の関心領域 に隣接するように設計された２つのオリゴヌクレオチドブライマーを使用する。

核酸配列の、インビトロでの酵素ベースによる複製である１反復サイクルの間に 核酸は１通常は熱変性による鎖の分離を受け、プライマーが一本鎖の鋳型にハイ ブリダイズしく熱サイクルを用いた場合はアニーリングによる）、酵素たとえば ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡプライマー伸張へのＤＮＡ鋳型）または逆転写酵素 （ＤＮＡプライマー伸張へのリボ核酸もしくは”ＲＮＡ”鋳型またはＤＮＡプラ イマー伸張へのＤＮＡ鋳型）がプライマーを鋳型上に延長させる。新たに合成さ れた鎖を含めて２両鏡（プラスおよびマイナス）とも、鎖の分離工程によりそれ ぞれ両プライマーの伸張のための鋳型として利用される。

２つのプライマーにより、結果は、各サイクル毎に鋳型核酸コピー数（プラスお よびマイナスの両鏡）は指数関数的な増加を招くことになる（したがって「連鎖 反応」の名がある）、各サイクルで、プラスおよびマイナスの両鏡が複製される からである。生成した核酸二本鎖は。

使用した特定のプライマーの端に相当する末端をもつことになる。ＰＣＲによれ ば、インビトロでの核酸の増幅。

検出、または別の修飾が可能である。

ＰＣＲ用のプライマーの製造には、増幅または検出すべき核酸鎖（プラスおよび マイナス鋳型の両者）の末端配列がわかっている必要がある（５）６配列情報は 、関心核酸の末端の直接配列決定、またはポリペプチドの末端の配列決定および 相当するコピーオリゴヌクレオチドブライマーの製造によって誘導できる。至適 なプライマーサイズは通常約２０〜３０塩基長であるが、実際に使用できるプラ イマーは特定の環境に応じてもつと短くても長くてもよい、よく知られているよ うに、プライマーサイズが小さくなると、プライマーは関心配列上の期待外の部 位にハイブリダイズする可能性が高（なる８期待外のハイブリダイゼーションは 、所望の生成物の増幅を妨害し。

サイズが小さいか、望ましくないプライマー挿入体を有する生成物の産生を招（ ことがある、すなわち、ＰＣＨのための２つの至適プライマーの選択は、実用上 、関心配列の期待外のハイブリダイゼーシヨンの回避に必須テある。

期待外のハイブリダイゼーションを避けるための、プライマー配列の合理的な選 択法はよく知られている。技術者が提案されたプライマー配列を全鋳型配列（知 られている場合）およびアブセイ混合物中に存在が知られている他の配列と比較 できるアルゴリズムが知られている。

関心核酸配列の対立鎖の末端部分の決定およびそれにハイブリダイズできる２つ のプライマーの製造の必要性は、ユニバーサルなプライマーを用いることによっ て回避される。存在するすべてのＤＮＡ配列は、ユニバーサルプライマー結合部 位を受入れ、ユニバーサルブライマーによって増幅されることになる。

ＰＣＲ増幅は、ポリヌクレオチド配列ライブラリーから新しい遺伝子配列を単離 するために使用されてきた。

新しい遺伝子は、その新しい遺伝子の部分配列を導入する十分に相補性のプロー ブを用いることによっても単離できるが、このようなプローブ単離法は、ＰＣＨ によって得られるような感度はない。

ＰＣＲに基づ（従来技術のアッセイでは、５°末端が標識されたプローブを、関 心核酸被検物質へのハイブリダイズに使用してきた。これらのプローブは９時に 、その非標識３°末端でポリメラーゼ連鎖反応に入って、偽りの結果を与えるこ とがある。従来のアッセイはまた。

不均一法、すなわち分離アッセイである。このため時間がかかり、何回もの洗浄 工程があって、これがアッセイサンプルの汚染の可能性を高めることになる。

樟議核酸配列の検出 生化学的および生物学的物質中の関心核酸被検物質の検出および定量のためには 、数多（の方法およびシステムが開発されてきた６通常、関心核酸被検物質の存 在は。

関心被検物質に結合するプローブに付着した観察可能な「標識」の存否によって 指示される。と（に興味がある標識は、光化学、化学、および電気化学的手段を 介してルミネッセンスを発光できる標識である。

「ホトルミネッセンス」とは、物質が電磁波を吸収したときに誘導される発光過 程である。蛍光およびリン光はホトルミネッセンスの１種である。「化学ルミネ ッセンス」過程はエネルギーの化学的遷移によるルミネッセンス橿の生成を包含 する。「電気化学ルミネッセンス」とは、電気化学的なルミネッセンス種の生成 を包含する。

電気化学ルミネッセンス（Ｅ　ＣＬ）アッセイ法は、化学ルミネッセンス法の改 良法である。これは、関心被検物質の存在および濃度の、高感度、高精度な測定 を可能にする。この方法では、インキュベートしたサンプルをボルタメーター作 動電極に暴露して、ルミネッセンスを誘発する。適当な化学的環境では、特定の 時間、特定の様式で作動電極上に加えられた電圧によって、電気化学ルミネッセ ンスが誘発される。標識によって生じた光を測定すると、被検物質の存在または 量が指示される。このＥＣＬ技術の詳細な記述については、ＰＣＴ公開出願第Ｕ Ｓ８５１０１２５３号（ＷＯ８６１０２７３４）　、Ｐ　ＣＴ公開出願第ＬＩＳ ８７１００９８７号（Ｗ０１１７１０６７０６）およびＰＣＴ公開出願第ＵＳ８ ８１０３９４７　（ＷＯ８９／４３０２）を引用する。上述の出願の開示は参考 として本明細書に導入される。

電気化学ルミネッセンスアッセイは、アッセイ操作時に分離工程を設けても設け なくても実施できて、正確かつ高感度の測定が可能なように被検物質の異なる濃 度でのシグナルの変化を最大にすることができる。

ＰＣＴ公開出願第ＵＳ８９１０４９１９号（Ｗ０９０１０５３０１）には。

ルミネッセンス現象に基づく高感度の特異的結合アッセイ方法において、不活性 微粒子物質をアッセイシステムの結合性反応物の一つに特異的に結合させる方法 が教示されている。このアッセイは不均一（１回または２回以上の分離工程を含 む）アッセイフォーマットで実施してもよいが、均一（分離工程のない）アッセ イフォーマットも使用できて、それが最も有利である。

ルミネッセンスは、標識化合物が特異的結合パートナ−に結合していても結合し ていなくても、それをボルタメーター作動電極に暴露することによって電気化学 ルミネッセンス（ＥＣＬ）から発生する。ＥＣＬ反応性混合物には、特定の時間 ９発光のための特定の様式で作動電極上に加えられた電圧によって、制御可能な 発光が誘発される。

米国特許出願一連番号笛２６７、５０９号および米国特許出願一連番号笛２６６ 、９１４号は、好ましいアッセイ組成物に関する。これらの出願における開示は 寥考として本明細書に導入する。

米国特許出願一連番号笛２６７、２３４号、米国特許第５．０６１゜４４５号お よび米国特許出願一連番号笛７４４．８９０号、米国特許第　号は、ＥＣＬに基 づくアッセイの実行のための好ましい装置を教示する。米国特許出願一連番号笛 ６５２．４２７号にはＥＣＬに基づくアッセイを実行するための好ましい方法お よび装置が記載されている。これらのすべての出願の開示は、研究および臨床の 場で実施される多様なアッセイにおける極めて少量の被検物質の検出および定量 を可能にするものであり、これらも参考として本明細書に導入する。

グし、直接ＥＣＬアナライザーに入れる。この迅速なサンプル処理では通常のハ イブリダイゼーションアッセイに含まれる洗浄工程は回避される。

結果である。

図３は、Ｉｌｌ注性線維症遺伝子迅速な一工程ア、セイのアッセイ結果である。

図４は２合成嚢胞性線維症遺伝子の特異性を示すその図６は、ノースカロライナ 大学から得たヒトサンプルにおける嚢胞性線維症遺伝子のアッセイである。

について定義する。

「ヌクレオチド」とは４種の塩基の一つ、すなわちアデニン、シトシン、グアニ ン、およびチミン（ＤＮＡ）またはウラシル（ＲＮＡ）に糖が付加しくＤＮＡで はデオキシリボース、ＲＮＡではリボース）、さらにホスフェートが付加してい る。ＤＮＡの重合反応のためのモノビオチンおよびジゴキシゲニン（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ製のジゴキシゲニン−１１−Ｕ　 Ｔ　Ｐ　）に連結した塩基、ならびにビオチン−２１−Ｕ　Ｔ　Ｐおよびアミノ −７−ｄ　Ｕ　Ｔ　Ｐ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、Ｃａ１ｉｆ ｏｒｎｉａ）を包含する。これらは、増幅時にプライマーまたはプライマー伸張 生成物に直接導入して、増幅配列の選択的結合を与えることができる。

「オリゴヌクレオチド」は少なくとも２個のヌクレオチドから形成された配列で ある。「ポリヌクレオチド」は長いオリゴヌクレオチドであり、ＲＮＡでもＤＮ Ａでまたはそれらのフラグメントを含めて長い核酸鎖を指して使用されるが２本 明細書ではいずれの語を使用しても。

とくにその旨言及されない限り、そのサイズを限定または記述するものではない 。

「核酸」の語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ染色体またはそれらのフラグメントを含 めて、上述の修飾塩基を有す［配列ｊ　（たとえば、配列、遺伝子配列、ポリヌ クレオチド配列、核酸配列）の語は、ポリヌクレオチド鎖中に存在する。５゛か ら３°方同に読んだ実際の塩基列（リポースまたはデオキシリボース）を意味す る。

第一のヌクレオチド配列に対して「相補」とは、第二の配列が、第一の配列とＷ ａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋハイブリダイゼーションによって対合する塩基からなる ことであることば環ビーズが包含される。標識またはタグを付したプローブ、タ グを付した二重鎖が形成された場合、その二重鎖はそのタグまたは標識の特徴的 性質によって検出できる。

標識残基をもつプローブはその標識残基とともにノーイブＩＪ　ｆイゼーション および二重鎖形成を介して標的に捕捉され、標識による検出が可能になる。

「プライマー」は、関心配列（関心配列は大きな核酸配列内のサブフラグメント であってもよい）の部分に相補性の比較的短いセグメントである。プライマーは 産生ずる伸張生成物の５°末端に相当する。鋳型鏡上の関心配列にその３°末端 で相補性のプライマーは、鋳型へのハイブリダイゼーシヨンにおいて、この３“ 末端がポリメラーゼによって作用されることを可能にする。プライマーはまた。

検出可能な標識でその５゛末端が修飾されていてもよい。

「鎖分離」とは、二本鎖もしくは二重鎖核酸の、２つの相補性の一木組ポリペプ チドへの変換を意味する９分離過程にはよ（知られた技術を採用できる。たとえ ば。

酵素仲介分離［たとえば酵素へリカーゼ（５）によるコ。

物理化学約分１１１１（ｐＨ，イオン濃度等）、および熱変性とも呼ばれる熱分 離がある。熱変性（また「溶融」ともいう）は、二本鎖ポリヌクレオチド（完全 または部分的二重鎖）の少なくとも２本の一本鎖ポリヌクレオチドへの分離であ り、ポリヌクレオチドを含む溶液の温度を上昇させることによって行われる。

「ハイブリダイゼーション」とは、相補性の一本鎖核酸からの二重鎖核酸の生成 をいう　／％イブリダイゼーンヨンは十分な相補性を有する一本鎖ＤＮＡおよび ／またはＲＮＡの間で起こり、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡまたはＲＮ　Ａ 　−ＲＮ　Ａを形成する。

ＤＮＡのインビボでの増幅はＤＮＡポリメラーゼによって触媒される０本技術分 野では様々なりＮＡポリメラーゼが知られている。これらは、二本鎖ＤＮＡ配列 の合成を触媒するという共通の性質を有し、−木組鋳型を用いてプライマーをア ニーリングさせる。大部分の生物体から抽出されるＤＮＡポリメラーゼは、核酸 の熱変性に必要な温度では不活性化される。したがって、このような熱感受性酵 素を利用する場合には、各熱サイクルの開始時における酵素の置換、または熱不 活性化を防止できる因子の添加が要求される。インビトロＰＣＲならびに本発明 に好ましいＤＮＡポリメラーゼは、高い温度で生育する生物体に由来し、したが って熱抵抗性で、二重鎖ＤＮＡが変性する温度で適当な触媒活性を維持するもの である。

ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応は１本技術分野ではよく知られてい る０本明細書ではｒＤＮＡＤＮＡポリメラー４反応ぶ、この反応には、４種のデ オキシリボヌクレオチド三リン酸の一部もしくはすべて、プライマーの好ましく はモル濃度過剰と、循環鎖分離のための手段を必要とし、鎖分離は好ましくは、 アニーリング温度と変性温度の間の熱サイクルによって行われる。

逆転写酵素は、ＲＮＡのＤＮＡへのコピーおよびＤＮＡのＤＮＡへのコピーの両 者を仲介することが知られている。したがって、現在知られている酵素はいずれ も連鎖反応を触媒する。

「電気化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）標識」とは、電気化学的な作用を受けた場 合、ルミネッセンス種になりうる標識である。ＥＣＬ標識については、　Ｂａｒ ｄらおよびＭａｓｓｅｙらのＰＣＴ公開出願（ＰＣＴ　ＵＳ８５１０２１５３． ＷＯ３６１０２７３４およびＰＣＴ　ＵＳ８７１００９８７．ＷＯ３７１０６７ ０６）に記載されている。

「検出」および「定量」は、「測定」ともいわれ、定量には対照組成物および検 量線の調製が必要な場合があることを理解すべきである。

ｒＥＣＬ装置」およびｒＥＣＬアナライザー」は、電気化学ルミネッセンスに基 づくアッセイを実施するための任意の装置をいう。

詳細な説明 増幅核酸配列の、改良された。迅速な、非分離アッセイが、３゛または３゛５゛ 電気化学ルミネフセンス標識を有するオリゴヌクレオチドの使用によって開発さ れた。

３′または３°５°標識を有するオリゴヌクレオチドは。

ＰＣＲまたは他のプライマー指示反応においてプライマーとして作用できる。こ れらは、増幅過程の末期においても、過剰の増幅核酸へのハイブリダイゼーショ ンに利用可能な状態を保持する。

このプローブ系を利用するアッセイは、プローブが熱サイクラ−プログラムの間 にハイブリダイズできるので。

迅速である。結合事象の検出にＥＣＬ技術を使用することにより、外部洗浄また はその他の操作の必要性が回避される。もちろん、洗浄工程を任意に使用するこ ともできる。これらのアッセイフォーマットは、別個の添加の必要性や汚染の危 険性を消失させる０本発明は、以下に主としてＰＣＲ反応との関係で説明するが 、任意のプライマー指示反応に使用できるものである。

従来のＰＣＲプロトコール（６，７）に基づ（旧Ｖｌ　ｇａｇ遺伝子およびヒト 嚢胞性線維症遺伝子の検出のためのアッセイを以下に説明する。また、１５例の 患者サンプルについての嚢胞性線維症の状態の試験についても述べる。

使用したサンプルは、５例の正常サンプル、５例の５０８欠失の異型接合体、お よび５例の５０８欠失同型接合体である。

好ましい実施態様によれば１本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライ マー指示増幅反応の生成物中の関心核酸配列を検出する方法において、（ａ）ポ リメラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示増幅反応中に。

電気化学ルミネッセンスの発光が可能で、上記核酸配列に相補性である標識核酸 配列、すなわち９式（式中１Ｍはルテニウム、オスミウムまたはレニウムであり ＋　Ｒ１＋　Ｒ２＋　Ｒ３＋　ＲＡｔ　ＲＳおよびＲ６は互いに同種でも異種で もよく、それぞれＨ９炭素原子１〜４個を有するアルキルまたはリンカ−基であ り、ＮＡは上記核酸配列であって、その３°末端において１個のビピリジル基に またはその３゛および５°末端において２個のビピリジル基に連結し、ｎは１ま たは２である）で示される少なくとも１種の標識核酸配列を導入し、（ｂ）ポリ メラーゼまたは他のプライマー指示反応を実施し、ついで（Ｃ）上記の標識増幅 生成物の電気化学ルミネッセンスを測定する各工程からなる方法である。とくに 好ましい実施態様においては、複数種の３゛標標識核酸列をプライマー指示反応 中に導入する。

オリゴヌクレオチドは、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３１１０８ 型のＤＮＡシンセサイザーによって合成し、　Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ製のＡｍ１ｎｏ 　ｍｏｄｉｆｉｅｒを使用して、３゛アミノ基を機能化した。

ＢＩＶ　ｇａｇ遺伝子ＰＣＲアッセイに特異的なオリゴヌクレオチドは既に報告 されているように（６）、　３に３８プライマー　（ＡＴＡＡＴＣＣＡＣＣＴＡ ＴＣＣＣＡＧＴＡＧＧＡＧＡＡＡＴ）　、　３に３９プライマー（ＴＴＴＧＧＴ ＣＣ丁ＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣ）　、　および５Ｋ１９プロー ブ（ＡＴＣＣＴＧＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＡ ＧＣＣＣＴＡＣ）とした、プローブ５Ｋ１９はｔａｇ−ＮＨＳを用いて、３°お よび５゛の両者で標識した　Ｉｆ胞性線維症遺伝子の場合は、ブライミングのオ リゴヌクレオチドはＯＦＦ　（ＧＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＴＧＡ）お よびＣＦＲ（ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴＧＣＴ）とした、プローブは、 正常遺伝子についてはＣＦＮ２　（ＧＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴ ）　、　５０８欠失遺伝子についてはＣＦＤ２　（ＡＡＣＡＣＣ−ＡＡＴＧＡＴ ＡＴＴＴＴＣＴＴ丁）とした、これらは、　Ｒｕ（ｂｐｙ）３”のＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステルにより、アミノ基を介して、３°および３°５゛部位 を標識した（８．９．１１）、プライマー５Ｋ３９およびＣＦＦは、それぞれ非 標識５Ｘ３ＢおよびＣＦＲでの増幅反応における５°ビオチン化プライマーとし た。

非特異的オリゴヌクレオチドλ１　（ＧＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＧＡＣ ＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧ　’）も合成し、３°末端を標識してバックグランドシ グナルに対する対照として使用した。オリゴヌクレオチドは、　０．３Ｍ　Ｎａ Ｃ１中Ｂｉｏｇｅｌ　ＰＳカラムクロマトグラフィー、ついで排除されたオリゴ ヌクレオチドビークの沈殿により、標識用に調製した１通常、０．１μｍｏｌｅ のオリゴヌクレオチドを８０％ジメチルスルホキシド／リン酸緩衝食塩溶液、ｐ ｉ（７，４中０．５μｍｏｌｅの０ＲＩＧＥＮ　Ｌａｂｅｌと反応させた。オリ ゴヌクレオチドのビオチン化はＳＯ％ジメチルスルホキシド中ビオチンＸ−ＮＨ Ｓ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）を用いて標識を行ったほかは、はぼ上述のように実施 した。

標識オリゴヌクレオチドはエタノールで沈殿させ、洗浄特表十６−５０７３１６ 　（６） して導入されなかった標識を除去した。システムの特異性を試験するために使用 した合成嚢胞性線維症配列ｌよ。

正常配列、　ＣＦ正常については：　ＧＡＣＴＴＣＡＣＴＴＣＴＡＡＴＧＡＴＧ ＡＴＡＡＡＧＡ　ＡＡ　ＡＴＡＴＣＡ　ＴＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴＡ　Ｔ ＧＡＴＧＡ　ＡＴＡＴＡ　ＧＡＴＡＣＡ　ＧＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＧＣＣＡＡＣ ＴＡＧＡＡＧＡＧ、変異配列ＣＦ　Ｄ５０８につ０ては：ＧＡ　ＣＴＴＣＡ　Ｃ ＴＴＣＴ　ＡＡ］ＧＡ　ＴＧＡ　ＴＡＡ　ＡＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡ　ＴＴＧＧＴ ＧＴＴＴ　ＣＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＧＡＧＣＡ ＴＧＣＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＡＧであった。

ＨＩＶＩ　ｇａｇ遺伝子のＰＣＲには２反応容量２Ｓｔｔ　ｌに７５ｎｇ（７， ５ｐｍｏｌｅ）のビオチン化５Ｋ３９および７５ｎｇ　（７，５ｐｍｏｌｅ）の ５Ｋ３８ならびに１．２５ｎｇの５Ｋ１９を含有させて使用し、１ｔ４ｚ既報（ ６）に従って実施した。　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒサーモサイクラ−を用い、 熱サイクルは、９５℃１分、　６０℃１分、サイクル数４０を使用した。続いて 、６０℃３０分のサイクルを行つた。

嚢胞性線維症遺伝子および合成遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応は９反応容量２５ μｍに７５ｎｇ　（７，５ｐｍｏｌｅ）のＣＦＲおよび７５ｎｇ　（７，５ｐｍ ｏｌｅ）のビオチン化ＣＦＰ、ならび↓こ３°または３°５°末端を標識した５ ｎｇのＣＦＮ２またはＣＦＤ２を含有させて使用し、はぼ既報（７）に従って実 施した。嚢胞性線維症アッセイのサイクル条件は、９４℃１分、５５℃２分。

７２℃２分の３０サイクルとした。これに続いて、９８℃５分。

６５℃３０分のサイクルを行った１合成遺伝子は、単一コピーについて、正常ヒ トＤＮＡの濃度すなわち３　Ｘ　１０５／μｇＤ　Ｎ　Ａを真似た濃度で使用し た。これらの合成遺伝子増幅反応には、非特異的ＤＮＡとしてサケ精子ＤＮＡを 用いた。

ＰＣＲ／ハイブリダイゼーションサイクルに続（Ｘで。

２μｌのサンプルを、ＥＣＬアナライザー上ＥＣＬア・ツセイｍｌ液２４０μｌ 中１５μｇの２．８μ謂ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｇｒ ｅａｔ　Ｎｅｃｋ、Ｎ、Ｙ、）に加え、１５分間インキュベートシ、ついでＥＣ Ｌを分析した。嚢胞性線維症アッセイの場合には、サンプルは２４０μｍの３０ ％ホルムアミド１０ＲＩＧＥＮアツセイ緩衝液ζこ添加した。

ＰＣＲ反応はビオチン化プライマーと非標識プライマーを用いて行った。ＰＣＲ 熱サイすルは２通常、　４０サイクル実施した。熱サイクル終了後、ノ＼イブ１ ノダイゼーシ曹ンのために、延長インキユベーションを付加した。最終インキコ ベーションサイクルの終了後のサンプルζまそのままビーズに結合できる。サン プルを採取し、ＥＣＬアナライザー上室温で、結合用ピーズシこ加え（１５分） 。

ついで電気化学ルミネッセンスを分析した。結果（よ図１肚−」■互１１ニ二旦 二二至並 ＰＣＲは、　５Ｋ１９３°５″標識プローブを含む１ｉｌＶ１　ｇａｇ特異的プ ライマーで３５サイクル行った。陽性ＨＩＶＩＤ　Ｎ　Ａのサンプルは、　Ｐｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｋｉｔｌこ備えられた標準の希釈液とした 。ＰＣＨのサンプル２μｍをストレプトアビジンビーズに加え、振盪しながら１ ５分間インキユベートシ、ついでＥＣＬアナライザーを用０て電気イヒ学ルミネ ッセンスを分析した。

結果を図２に示す１図２は、　ＨＩＶｌｇａｇの迅速な検出のための単純化ＰＣ Ｒアッセイを実証するものである。この性能は、一部はＥＣＬシステムおよびＥ ＣＬベースのアクセイフオーマ・ノドによる。ＥＣＬシステムζよとく（こ。

（ｉ）安定な標識、ＰＣＲの厳格な条件を撤回できる。　（ｉｉ）ＥＣＬの本質 によるア、ノセイの属性が外的洗浄の必要性を除去する。　（ｉｆｆ）被検物質 の検出の感度１よ放射分析↓こ匹敵する。ものである。

）１１ＶＩ　ｇａＨの試験結果から、コピー数の検出は＋１とんと努力なしに１ ２．５コピーまで低下することが明らかにされた。迅速スクリーニングシステム によるこの方法の有用性は明臼であり、熱サイクラ−の改良により、さらに低い コピー数の検出も可能となろう。

本発明のアッセイを、ＩＩ飽性線維症遺伝子の５０８フドン欠失の場合のように 、正常遺伝子に比べてわずかな変異しかない遺伝子の識別に使用した。アッセイ を、細胞系、ヒト胎盤、正常対象からのヒトＤＮＡを用（Ｘ、また合成遺伝子に より、試験した。

ＰＣＲは、３’５’標識ＣＦＮ２を含む嚢胞性線維症特異的プライマーを用いて ３０サイクル実施した。ＤＮＡサンプルは、ヒト細胞系（ＨｅＬａ、　８）から 単離されたＤＮＡの希釈液とした。ＰＣＨのサンプル２μｌをストレプトアビジ ンビーズに加え、振盪しながら１５分間インキュベートし、ついでＥＣＬアナラ イザーを用いて電気化学ルミネッセンスを分析した。

結果を図３に示す、嚢胞性線維症遺伝子のアッセイの成功、および期待されたよ うに、ヒトＤＮＡ１ｎｇ未満の遺伝子の検出を可能にするこのシステムの感度力 ｆ実証さ嚢胞性線維症遺伝子に対する本発明の特異性を検討するため、それぞれ 正常遺伝子配列および５０８欠失を有する変異遺伝子配列を含む２つの合成遺伝 子を生成させた。

これらの遺伝子鎖をヒトＤＮＡに見られる濃度に希釈し。

増幅された嚢胞性線維症配列の本質に関して確実な／％イブリダイゼーシヲン反 応の特異性を調べた。

ＰＣＲは、３゛標識プローブＣＦＮ２およびＣＦＤ２を含む嚢飽性線維症特異的 プライマーを用いて３０サイクル実施した。ＤＮＡサンプルは、サケ精子ＤＮＡ 中に作成した合成りＮＡの希釈液とした。これらの配列の濃度は、ヒトＤＮＡ中 に見られるのと同レベルとした。ＰＣＨのサンプル２μｌをストレプトアビジン ビーズ１５μｇに加工、振盪しながら１５分間インキュベートし、ついでＥＣＬ アナライザーを用いて電気化学ルミネッセンスを分析した。

図４に示した結果は、このアッセイが、正常および変異遺伝子を特異的に検出で きることを示している。この迅速アッセイフォーマットは、極めて類似した配列 を迅速に検出し、識別できる。

五ヱ 正常ヒトサンプル中の嚢胞性線維症゛伝子のアッセイＰＣＲは、３゛５°標識プ ローブＣＦＮ２およびＣＦＤ２を含む嚢胞性線維症特異的プライマーを用いて３ ０サイクル実施した。ＤＮＡサンプルは９個体の絨毛膜から単離されたヒトＤ　 Ｎ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ　Ｌｔｄ）とした、ＰＣＨのサンプル２μｌをストレプト アビジンビーズ１５μｇに加え、振盪しながら１５分間インキユベートシ、つい でＥＣＬアナライザーを用いて電気化学ルミネッセンスを分析した。

例■ ノースカロライナ大学からのヒナサンプル中の嚢胞性線維症遺伝子のアッセイ 例■のデータをノースカロライナ大学から入手したヒ）ＤＮＡの一群のサンプル のアッセイによって確証した。

すなわち、各サンプルを１本発明の方法を用いて正確にアッセイし、従来法（７ ）の場合と比較した。データは。

ＰＣＲの不安定性およびサンプル中のＤＮ、ｌｌ１度の変動により、広範囲のシ グナルを示したが、バックグランドは一定し、　ＣＦＮ２プローブで得られたシ グナルによる正常遺伝子の存在、およびＣＦＤ　２プローブでの変異遺伝子の存 在を評価することが可能であった。これらの試験中、サンプル１５は最低のシグ ナルを示したが、依然として非特異的プローブシグナルよりも有意に高かった。

データは図６にまとめる。

ＰＣＲは、３°標識プローブＣＦＮＺ、　ＣＦＤ２を含む嚢胞性線維症特異的プ ライマーおよび非特異的プローブ（λ１）を用いて３０サイクル実施した。ＤＮ Ａサンプルは、ヒトＤＮＡ０．５〜２．５μｇ／μｌの個体サンプルで、これら の各１μｍをＰＣＲに使用した。ＰＣＨのサンプル２μｌをストレプトアビジン ビーズ１５μｇに加え、振盪しながらＩＳ分間インキユベートシ、ついでＥＣＬ アナライザーを用いて電気化学ルミネッセンスを分析した。

３、Ａｒｎｏｌｄ、　Ｌ、Ｊ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈ＠ｍ、　 １９８９；　１５：１５８８−１７：５１１５−５１２３゜ ５、Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ、Ｂ、、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ、Ｎｏｓ、４，６８３，１９５　 ａｎｄ４　、６８３　、２０２　。

６、Ｏｕ　Ｃ−Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１９８Ｂ；　２３９： ２９５−９７゜７、Ｐｒ１ｏｒ、　Ｔ、Ｗ、、　ａｔ　ａｌ、、　Ｃｈｉｎ、　 Ｃｈｅｍ−１９９０；　３６：１７５６−ｓ、Ｋｅｎｔｅｎ、　Ｊ、Ｈ，、ａｔ 　ａｌ、、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｉｒ！１．１９９１；　３７：１．６２６−（Ｗ ＯＢ７１０６７０６）　。

３１：１５３４−３９゜ 浄書（内容に変更なし） 及パム◆グジリＨＩＶ１ｇα９痩イ云÷、コ・ビーＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、５ ＤＮＡ　フン２ル ＤＮＡ　ｖｙｒｃ　（ｕＮ（Ｊｒ） 手続補正書（方式） ％式％ 図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）フロントページの続き （７２）発明者　グディバンデ、サツトヤナラヤナ、アール。

アメリカ合衆国２０８５１　メリーランド州ロックビル、ツインプルツク　パー ク １２８０３　、アパートメント　２０４（７２）発明者　ケントン、ジョン、エ イチ。

アメリカ合衆国２０８７９　メリーランド州ゲイサースバーグ、ウィンドジャマ ー　ウェイ１９２１

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応の増幅生成物中の関心 核酸配列を検出する方法において，（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応混合物または他 のプライマー指示反応混合物中に，（ｉ）３′末端または（ｉｉ）３′および５ ′末端において電気化学ルミンネッセンスの発光が可能な化合物で標識された， 上記関心核酸配列に相補性の少なくとも１種の核酸配列を導入し，（ｂ）ポリメ ラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応を実施し，ついで（ｃ）標識増幅 生成物の電気化学ルミネッセンスを測定する各工程からなる方法。
2. ２．複数種の３′標識核酸配列をプライマー指示反応中に導入する「請求項１」 記載の方法。
3. ３．ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応の増幅生成物中の関心 核酸配列を検出する方法において，（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応混合物または他 のプライマー指示反応混合物中に，（ｉ）３′末端または（ｉｉ）３′および５ ′末端において電気化学ルミンネッセンスの発光が可能な，式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中，ＭはＲｕ，ＯｓおよびＲｅからなる群より選ばれ，Ｌ１，Ｌ２およびＬ ３は互いに同種または異種で，それぞれ式▲数式、化学式、表等があります▼ （式中，Ｒ１およびＲ２は互いに同種または異種で，それぞれＨ，炭素原子１〜 ４個を有するアルキルまたは上記核酸に対するリンカー基である）である］で示 される化合物で標識された，上記関心核酸配列に相補性の少なくとも１種の核酸 配列を導入し，（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応を実 施し，ついで（ｃ）標識増幅生成物の電気化学ルミネッセンスを測定する各工程 からなる方法。
4. ４．ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応の増幅生成物中の関心 核酸配列を検出する方法において，（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応混合物または他 のプライマー指示反応混合物中に，電気化学ルミンネッセンスの発光が可能で， 上記関心核酸配列に相補性である標識核酸配列，すなわち，式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中，Ｍはルテニウム，オスミウムまたはレニウムであり，Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３ ，Ｒ４，Ｒ５およびＲ６は互いに同種でも異種でもよく，それぞれＨ，炭素原子 １〜４個を有するアルキルまたはリンカー基であり，ＮＡは上記核酸配列であっ て，その３′末端において１個のビピリジル基にまたはその３′および５′末端 において２個のビピリジル基に連結し，ｎは１または２である）で示される少な くとも１種の標識核酸配列を導入し，（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応または他のプ ライマー指示反応を実施し，ついで（ｃ）上記の標識増幅生成物の電気化学ルミ ネッセンスを測定する各工程からなる方法。
5. ５．ポリメラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応の増幅生成物中の関心 核酸配列を検出する方法において，（３）ポリメラーゼ連鎖反応混合物または他 のプライマー指示反応混合物中に，（ｉ）３′末端または（ｉｉ）３′および５ ′末端において電気化学ルミンネッセンスの発光が可能な化合物で標識された， 上記関心核酸配列に相補性の少なくとも１種の核酸配列を導入し，（ｂ）ポリメ ラーゼ連鎖反応または他のプライマー指示反応を実施し，（ｃ）標識増幅生成物 を濃縮，洗浄し，ついで（ｄ）標識増幅生成物の電気化学ルミネッセンスを測定 する各工程からなる方法。
6. ６．プライマー指示反応の増幅生成物中の関心核酸配列を検出する方法において ，（ａ）プライマー指示反応混合物中に，３′末端において標識された，上記関 心核酸配列に相補性の少なくとも１種の核酸配列を導入し，（ｂ）プライマー指 示反応を実施し，ついで（ｃ）標識増幅生成物を測定する各工程からなる方法。