JPH06508357A - 標識ポリペプチド、その製造法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

標識ポリペプチド、その製造法および使用本発明は診断または治療に使用される 金属放射性核種で標識されたポリペプチドに関する。 放射性核種で標識された化合物は例えば内臓の形状および機能の逸脱、並びに体 内の病気の存在および位置を診断検査するのに使用できる。この目的のために、 放射性化合物を含有する組成物が例えば注射液の形態で患者に投与される。例え ばγ−カメラのような適当な検出装置を用いて放射線を検出すること（“スキャ ニング）により、例えばその中に活性化合物が含まれる臓器または病状の画像を 得ることができる。 放射性標識された生物学的高分子、特にポリペプチドは診断用として興味のある 展望を示す。特定のポリペプチドは非常に大きな標的器官特異性を有し、患者の 体内に導入されるとその中に存在する生物学的高分子と非常に選択的に反応する ことができる。結合研究により、特定の内分泌に関係のある腫瘍はソマトスタチ ンおよびソマトスタチンに関係のあるポリペプチドに対して高い親和性を有する 多数の結合部位を含むことがわかっている。多数のソマトスタチン受容体を有す るこのような腫瘍の例は下垂体腫、中枢神経系の腫瘍、悪性乳房腫瘍、胃腸−膵 腫瘍およびこれらの転移である。各種の金属放射性核種は腫瘍選択的なポリペプ チドに結合されるという条件で腫瘍を抑制するのにうまく使用できるため、放射 線療法において強力な手段となる。したがって、使用されるポリペプチドは放射 線に暴露される腫瘍に所望の放射線量の金属放射性核種を輸送するためのビヒク ルとして役立つ。 金属放射性核種を用いたポリペプチドの直接標識は２つの欠点を有する。第１に 、良好な標的器官特異性または選択性に必要なペプチドの生物学的に活性な部位 はこの反応により容易にブロックされ、それにより生物学的高分子の通常の作用 は妨げられる。第２に、金属放射性核種と高分子の親和性は不十分なことが多い ため、形成された結合は生理的条件でそのまま残る程十分に安定ではない。投与 された物質はその後、診断剤（それはポリペプチドが体内でどのように作用する が、これ以上検出できない）として、または治療剤（放射線量はもはや所望の標 的に輸送されず、どこか他の所に望ましくない放射線負荷量を生じさせる）とし てもはや有用でない。 これらの欠点を軽減するため、欧州特許明細舎弟２３７，１５０号において、初 めにジスルフィド結合を含むタンパク質様物質をジスルフィド還元剤、例えばジ チオトレイトールで処理し、次いで遊離のメルカプト基を含む還元されたタンパ ク質様物質を放射性核種、例えばＴｃ−９９ｍ−タルトレートまたはＴｃ−９９ ｍ−グルコヘプトネートと反応させることが提案されている。しかしながら、タ ンパク質がジスルフィド結合の所望のメルカプト基への開裂により“変性”され るこのタンパク質の還元的処理において、タンパク質分子の損失が容易に起こり 、その結果選択性が妨げられることがわがっている。 ここ数年の間に、所望の金属放射性核種と結合するためのキレート化基を含む生 物学的高分子が記載されている多数の刊行物が出ている。例えば、国際特許出願 Ｗ０　９０’１０６９４９には検出可能な成分と結合するための、好ましくはＴ ＤＰＡなどから誘導されたキレート化基を含むソマトスタチン類似体が記載され ている。その例として、診断または治療のためにそれぞれＩｎ−ＩＩＩまたはＹ −９０で放射性標識することのできるＤＴＰＡ−変性オクトレオチドが記載され ている。 しかしながら、これらの使用により良く適した同位体は放射性テクネチウム、特 にＴｃ−９９ｍ、並びに放射性レニウム、特にＲｅ−１８６およびＲｅ−１８８ であり、それはこれらの放射性同位体がより良い放射性を有し、またより容易に 入手できるためである。しがし、今までのところこれらの放射性同位体で上記の ソマトスタチン類似体を標識して、インビボでの使用に適し、十分に安定な組成 物とすることはうまくいってない。ソマトスタチンそれ自体は体内で急速に生物 学的に変換されるため、一般に放射性標識に適していないとみなされる。したが って、今までは、明らかに不安定性の原因である２個のシスティンアミノ酸基が 共にシスチン基に酸化された安定化ソマトスタチン誘導体に頼っていた。 商業的に入手できるソマトスタチンおよび上記の特許出願ＷＯ９０１０６９４９ に記載のオクトレオチドは共に、２個のシスティンアミノ酸基から酸化により形 成されたシスチンブリッジを含む。 本発明の目的はインヒポで使用するのに十分安定な、選択的検出／局部化または ソマトスタチン受容体を用いた腫瘍の選択的治療のための容易に人手しやすい放 射性テクネチウム標識または放射性レニウム標識ポリペプチドを提供することで ある。この目的は一般式％式％（） 〔式中、Ｒ，は水素原子またはＣＩ　Ｃ４アルキルカルボニル基であり、Ｒ２は アミノ基、ヒドロキシ基またはＣＩ　Ｃ４アルコキシ基であり、 ＡＩおよびＡ、はそれぞれ独立してＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ’ 、Ｔｒｌ）、Ｎａ　ｌまたはＣｙｓであり、Ａ、はＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰ ｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＮａｌであり、 Ａ、はＬｙｓ、ＭｅＬｙｓまたは（ε−Ｍｅ）Ｌｙｓであり、Ａ４はＴｈｒまた はＶａｌであり、 Ｓ、はＡｌａｌＣｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔ ｒｐ、ＮａＩ、Ｇｌｙ、、ＬｙｓＳＭｅＬｙｓｌ（ε−Ｍｅ）Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａ　Ｌ　ＡｓｎおよびＳｅｒからなる群より選択される１〜６個のアミノ酸の アミノ酸配列であり、Ｓ２は上記の８１群より選択される０〜３個のアミノ酸の アミノ酸配列であり、そして 金属放射性核種はカチオンとしてシスティンアミノ酸基のメルカプト基に共有結 合される放射性Ｔｃ同位体またはＲｅ同位体から選択される（但し、ポリペプチ ドは２個のシスティンアミン酸基を含む）〕 で表わされる本発明の標識ポリペプチドを用いて達成することができる。 上記式中、Ｎａｌはナフチルアラニルを示す。 驚ろくべきことに、本発明の標識ポリペプチドは容易に製造することかでき、ま た所望の検査および所望の治療的処置をそれぞれ行なうのに十分な程インビボで 安定であることがわがった。本発明の標識化合物は注射後少なくとも１時間安定 したままであることが確認された。選択性は放射性テクネチウムまたはレニウム を用いた標識により悪影響を受けることはない。例えば、本発明のＴｃ−９９ｍ −標識ポリペプチドは特異的にソマトスタチン受容体部位に結合される。 本発明の適当な標識ポリペプチドは上記のオクトレオチドおよびその類似体から 誘導され、一般式 ％式％（） （式中、Ｒ＋　、Ｒｔ　、Ａｘ　、ＡｎおよびＡ４は上記の意味を有し、Ａ６ル カプト基に共有結合されるＴｃ−９９ｍ、　Ｒｅ−１８６およびＲｅ−ｔ８８か らなる群より選択される）で表わすことができる。 本発明の他の適当な標識ポリペプチドはソマトスタチンおよびその類似体から誘 導され、一般式 ％式％） 〔式中、Ｒ，、Ａ、、Ａ、、Ａ４およびＲ７は上記の意味を有し、Ａｌｏおよび Ａｓ’はそれぞれ独立してＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐま たはＮａｌであり、Ｓｔ’はＡｌ　ａ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、ＭｅＰｈｅ、 ＥｔＰｈｅ−Ｔｙ　ｒ、Ｔｒｐ、Ｎａ　１、Ｇｌｙ、ＬｙｓＳＭｅＬｙｓ。 Ｃｅ−Ｍｅ）Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａ　ｌ　Ａｓｎおよび５ｅｒ７！ｌｓらなる群 より選択される１〜６個のアミノ酸、好ましく（よ５個のアミノ酸のアミノ酸配 列であり（但し、Ｓ＋’はシスティンアミノ酸基を含む）、 Ｓ２’は上記のＳ＋’群より選択される１〜３個のアミノ酸、好ましくは２個の アミノ酸のアミノ酸配列であり（但し、Ｓ、°（まシスティンアミノ酸基を含む ）、そして 金属放射性核種はカチオンとしてシスティンアミノ酸基のメルカプト基に共有結 合されるＴｃ−９９ｍ、　Ｒｅ　−１８６およびＲｅ−１８８からなる群より選 択される〕で表わすことができる。 標識生成物のすぐれた特性および出発ペプチドとしての゛ソマトスタチンの即座 の入手可能性と関連して、一般式％式％ （式中、金属放射性核種はカチオンとしてシスティンアミノ酸基のメルカプト基 に共有結合されるＴｃ−９９ｍ、　Ｒｅ　−１８６およびＲｅ−１８８からなる 群より選択される）で表わされる標識ポリペプチドが好ましい。 本発明はまた、システィンアミノ酸基がシスチン基に酸化された環状ポリペプチ ドから出発して本発明の金属放射性核種で標識されたポリペプチドを製造する方 法に関する。このような環状ポリペプチドの例は上記のソマトスタチン商品およ びその類似体である。［類似体」とはアミノ酸配列は異なるが、同様の生物活性 、すなわち特性のソマトスタチン受容体結合親和体を有するポリペプチドを意味 すると理解される。この環状ポリペプチドは優良に還元することができ、次いで ポリペプチド分子を攻撃することなく還元条件下で標識できることがわかった。 還元剤として好ましくは亜鉛イオンまたは例えば亜鉛粉末の形態の金属亜鉛が選 択される。このような還元剤はポリペプチドの環状物質からの製造およびペルテ クネテートまたはベルレネートの製造の両方に適しているためである。その優良 な例はいわゆる５ＰＥＤ　（固相電子供与体）技術における金属亜鉛粉末の使用 であり、そこで環状ポリペプチドは例えば０．２２μフイルター上で亜鉛粉末を 用いてインキュベートされ、その後Ｔｃ−９９ｍペルテクネテート溶液の添加に より直ちにろ液中に純粋なＴｃ−９９ｍ標識ポリペプチドの溶液が得られる。汚 染物質および未反応の出発物質はフィルター上に残るため、ろ液はすぐ使用でき る。 金属亜鉛はまた、管または他の反応容器の内壁上に亜鉛鏡として付与することが できるため、その管または反応容器中において所望の変換を行なうことができる 。 さらに、本発明は本発明の金属放射性核種で標識されたポリペプチドを含有する 医薬組成物、および本組成物の診断または治療目的のための使用に関する。診断 目的のために、すなわち上記したような特定の腫瘍組織を検出および局部化する ために、活性物質は放射性テクネチウムで標識すべきであり、また治療目的のた めには、活性物質は放射性レニウムで標識すべきである。これはすべて特許請求 の範囲の請求項８および９により詳細に定義されている。 最後に、本発明は場合によっては乾燥状態で上記で定義された環状ポリペプチド 、還元剤、好ましくは金属亜鉛または亜鉛イオン、並びにキットの成分および得 られる生成物をＴｃ−９９ｍペルテクネテートまたはＲｅ−１８６もしくはＲｅ −１８８ベルレネートと反応させるための使用説明書を含む放射性医薬組成物を 製造するためのキ・ソトに関する。 このようにして、キットの使用者は自分で臨床実験室において投与用組成物形態 の本発明の標識ポリペプチドを製造することができる（環状ポリペプチドの標識 用ポリペプチドへの還元および所望の標識を行なう）。 ２つの反応について１つの反応試薬を使用することは製造法を簡単にする。 次の実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。

【実施例】

【実施例１】 商業的に入手できるソマトスタチンを上記のいわゆる５ＰＥＤ技術によりｐＨ８ の０．２２μフイルター上で３０分間処理する。次に、新しく溶離されたナトリ ウムペルテクネテート溶液を加え、そして混合物を室温で１５分間インキュベー トする。標識ポリペプチドはろ液として得られる。沈殿物と液体はデカントし、 シリンジで液体を抜き取ることによりフィルターなしで分離することができる。 ９０％の標識率が得られる。 遊離のテクネチウムは５ＰＥＤに結合され、生成物を汚染できない。標識化は薄 層クロマトグラフィーおよびイオン交換カラムクロマトグラフィーにより確認さ れる。標識化合物はインビトロで４時間まで安定である。 ２２ＭＢＱ量の標識化合物が結腸直腸癌に患っているラットに投与され、そして その生物分布は注射後１時間まで動的γ−カメラシンチグラフィーにより測定さ れる。 腫瘍の吸収量は注射後約４分で最大になる。測定時間中、腫瘍の有意な放射能減 少は観察されない。甲状腺および胃に放射能が存在しないことかられかるように 、標識化合物は全測定時間の間インビボで安定である。腫瘍のシンチグラムは注 射してから４分後に行なわれる。腫瘍対血液比の好ましい吸収量比は５：ｌであ る。 テクネチウムの腫瘍蓄積が腫瘍中の受容体と結合するソマトスタチンと関係があ ることは、標識化合物の投与前に腫瘍を有する実験動物の１群をＳｕｒｓａｍｉ ｎｅ　（登録商標）で処理して受容体部位をブロックすることにより確認された 。これらの動物において腫瘍による吸収は観察されず、それにより結合が腫瘍中 のソマトスタチン受容体で起こることがわかる。

【実施例２】 成熟した雌のラットの１群にソマトスタチン受容体を有することが知られている ＣＣ５３１結腸癌を移植した。皮下腫瘍移植片が直径±１．５印の大きさに達し た時、第１群に静脈注射によりテクネチウム、ソマトスタチン錯体を注射し、そ して第２群に同様に比較用インジウム−１１１オクトレオチド錯体を注射した。 動物をネンブタールにより麻酔し、そして連続シンチグラムを行なった。テクネ チウムソマトスタチンは注射後４〜５分内で腫瘍中にはっきりと目に見えた。注 射してから６分後に動物を頚部の脱臼により致死させ、組織サンプルを採取し、 そして測定した。注射された投与量の約ｌ１％が腫瘍全体に存在し、腫瘍対軟組 織の吸収量比は４．２：ｌであった。 血中濃度は０．２３という比較的高い腫瘍対血液比を示した。放射能の大部分は 、胃、肝臓、牌臓および腎臓で回収された。 インジウムオクトレオチド錯体を注射した動物の場合、腫瘍の視覚化はテクネチ ウム錯体のものと同様であった。ヒトでの最適なスキャニング時間である注射し てから２４時間後に動物を致死させ、そして組織サンプルを測定した。平均濃度 で、注射された投与量の４．９％が腫瘍全体に存在し、腫瘍対軟組織の比は９． ８：ｌであった。テクネチウムソマトスタヂンと比べて高いこの値は主として低 い血中濃度によるものである。 テクネチウム錯体と同様に、放射能の大部分は肝臓、牌臓、ＧＩ管および腎臓か ら回収された。 これらの結果から、２つの錯体の生物分布特性の違いは僅かにあるが注射してか ら初めの１５分間の動力学は同様であり、そしてこの期間中にテクネチウム錯体 を用いてγ−カメラにより腫瘍の良好なシンチグラフィー画像を得ることができ ることがわかった。 、、　Ａ−−Ｎ＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０４５５９フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／　ＣＯ７Ｋ　９９： ６０ Ｉ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．一般式 Ｒ１−Ｓ１−Ａ１−Ａ２−（Ｄ）ＴｒＰ−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ｔｈｒ−Ｓ２−Ｒ ２（Ｉ）〔式中、Ｒ１は水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキルカルボニル基であり 、Ｒ２はアミノ基、ヒドロキシ基またはＣ１−Ｃ４アルコキシ基であり、 Ａ１およびＡ５はそれぞれ独立してＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ、 Ｔｒｐ、ＮａｌまたはＣｙｓであり、Ａ２はＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、 Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＮａｌであり、 Ａ３はＬｙｓ、ＭｅＬｙｓまたは（ε−Ｍｅ）Ｌｙｓであり、Ａ４はＴｈｒまた はＶａｌであり、 Ｓ１はＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔ ｒｐ、Ｎａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＭｅＬｙｓ、（ε−Ｍｅ）Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖ ａｌ、ＡｓｎおよびＳｅｒからなる群より選択される１〜６個のアミノ酸のアミ ノ酸配列であり、Ｓ２は上記のＳ１群より選択される０〜３個のアミノ酸のアミ ノ酸配列であり、そして 金属放射性核種はカチオンとしてシステインアミノ酸基のメルカプト基に共有結 合される放射性Ｔｃ同位体またはＲｅ同位体から選択される（但し、ポリペプチ ドは２個のシステインアミン酸基を含む）〕 で表わされる金属放射性核種で標識されたポリペプチド。
2. ２．一般式 Ｒ１−Ａ６−Ｃｙｓ−Ａ２−（Ｄ）ＴｒＰ−Ａ３−Ａ４−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ４ （ＩＩ）（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ２、Ａ３およびＡ４は請求の範囲第１項で定義 された意味を有し、Ａ６はＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐま たはＮａｌであり、そして金属放射性核種はカチオンとしてシステインアミノ酸 基のメルカプト基に共有結合されるＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１ ８８からなる群より選択される）を有する請求の範囲第１項記載の標識ポリペプ チド。
3. ３．一般式 Ｒ１−Ｓ１′−Ａ１′−Ａ２−（Ｄ）Ｔｒｐ−Ａ３−Ａ４−Ａ５′−Ｔｈｒ−Ｓ ２′−Ｒ２（ＩＩＩ）〔式中、Ｒ１，Ａ２，Ａ３，Ａ４およびＲ２は請求の範囲 第１項で定義された意味を有し、 Ａ１′およびＡ５′はそれぞれ独立してＰｈｅ、ＭｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙ ｒ、ＴｒｐまたはＮａｌであり、Ｓ１′はＡｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｍ ｅＰｈｅ、ＥｔＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｎａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、ＭｅＬｙｓ 、（ε−Ｍｅ）Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＡｓｎおよびＳｅｒからなる群より選 択される１〜６個のアミノ酸、好ましくは５個のアミノ酸のアミノ酸配列であり （但し、Ｓ１′はシステインアミノ酸基を含む）、 Ｓ２′は上記のＳ１′群より選択される１〜３個のアミノ酸、好ましくは２個の アミノ酸のアミノ酸配列であり（但し、Ｓ２′はシステインアミノ酸基を含む） 、そして 金属放射性核種はカチオンとしてシステインアミノ酸基のメルカプト基に共有結 合されるＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８からなる群より選択さ れる〕を有する請求の範囲第１項記載の標識ポリペプチド。
4. ４．一般式 Ｒ１−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−（Ｄ）Ｔｒ Ｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｒ２（ＩＶ）（式中、 金属放射性核種はカチオンとしてシステインアミノ酸基のメルカプト基に共有結 合されるＴｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８からなる群より選択さ れる） を有する請求の範囲第３項記載の標識ポリペプチド。
5. ５．一般式Ｉ（式、各記号は請求の範囲第１項で定義された意味を有する）のポ リペプチドは、対応する環状ポリペプチド（そのシステインアミノ酸基は共にシ ステイン基に酸化されている）を適当な還元剤で還元し、その結果得られたポリ ペプチドを還元条件下でペルテクネテート溶液の形態のＴｃ−９９ｍまたはペル レネート溶液の形態のＲｅ−１８６もしくはＲｅ−１８８と反応させることによ り製造されることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項の何れかの項記載の金 属放射性核種で標識されたポリペプチドの製造法。
6. ６．金属亜鉛または亜鉛イオンが環状ポリペプチドのための還元剤として使用さ れることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．薬学的に許容しうる液状担体物質および場合によっては１種以上の薬学的に 許容しうる補助剤の他に、請求の範囲第１項〜第４項の何れかの項記載の金属放 射性核種で標識されたポリペプチドを活性物質として含有する医薬組成物。
8. ８．請求の範囲第７項記載の組成物を場合によっては薬学的に許容しうる液体で 希釈した後、温血動物に外部で映像化するのに十分な量で投与し、次いでその温 血動物を外部映像化技術に付して体内の放射性標識された部位をバックグラウン ドの放射能と相対して測定することを特徴とする温血動物の体内の腫瘍組織を検 出および局部化する方法。
9. ９．請求の範囲第７項記載の組成物を場合によっては薬学的に許容しうる液体で 希釈した後、温血動物に腫瘍を抑制するのに有効な量で投与することを特徴とす る温血動物の体内の腫瘍を治療する方法。
10. １０．（１）場合によっては乾燥状態で一般式Ｉ（式中、各記号は請求の範囲第 １項で定義された意味を有するが、そのシステインアミノ酸基は共にシスチン基 に酸化されている）の環状ポリペプチド、（２）還元剤、並びに（３）上記の（ １），（２）の成分および得られる反応生成物をペルテクネテート溶液の形態の Ｔｃ−９９ｍまたはペルレネート溶液の形態のＲｅ−１８６もしくはＲｅ−１８ ８と反応させるための使用説明書を含む、放射性医薬組成物を製造するためのキ ット。