JPH06508996A

JPH06508996A - Ｃｄ１８に対するヒト化抗体

Info

Publication number: JPH06508996A
Application number: JP5502459A
Authority: JP
Inventors: ワルドマン、ハーマン; シムス、マーチン; クロー、スコット
Original assignee: ケンブリッジ　ユニバーシティー　テクニカル　サービシズ　リミテッド
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2020-03-09
Also published as: WO1993002191A1; US5985279A; US6689869B2; JP3626753B2; DE69233192D1; ES2202303T3; ATE249518T1; GB9115364D0; EP0594732A1; US5997867A; JP2003199594A; US20030185818A1; DK0594732T3; EP0594732B1; DE69233192T2; EP1304379A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ１８に対するヒト化抗体この発明は、ＣＤ１８抗原に結合する抗体、そのような抗体の調製およびこの抗体を含有する医薬組成物に関する。

抗体は、典型的には、ジスルフィド結合および２つの軽鎖で互いに連結した２つの重鎮を有している。各々の重鎮は、多くの定常ドメインが後に続く可変ドメインをその一端に有している。各々の軽鎖は、その一端に可変ドメインを、他端に定常ドメインを有している。軽鎖可変ドメインは、重鎮の可変ドメインと並んでいる。軽鎖定常ドメインは、重鎮の第１定常ドメインと並んでいる。軽鎖および重鎮中の定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接は関わらない。

軽鎖および重鎮の多対の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。軽鎖および重鎮のドメインは同様の一般構造を有しており、各ドメインは、配列が比較的保全され、３つの相補性決定部位（ＣＤＲ）によって連結された、４つ領域からなるフレームワークを有している。この４つのフレームワーク領域は、βシート構造を大きく取り入れ、ＣＤＲはこのβシート構造に連結し、時にはその一部を形成するループを形成する。ＣＤＲは、フレームワーク領域によって非常に接近した状態に保持され、他のドメインからのＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与する。抗体のＣＤＲおよびフレームワーク領域は、Ｋａｂａｌ　ら（「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｊｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｔｅｒｅｓｔ　）、米国健康社会福祉省、米国政府印刷局、１９８７）を参照することにより決定することができる。

抗体の可変ドメインのフレームワークよりも、ＣＤＲが異なる種から誘導される改変抗体（ａｉｒｒｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）の調製がＥＰ−Ａ−０２３９４００に開示されている。このＣＤＲは、ラットもしくはマウスモノクローナル抗体から誘導することができる。改変抗体の可変ドメインおよび定常ドメインのフレームワークは、ヒト抗体から誘導することができる。ヒトに投与された場合、そのようなヒト化抗体が引き出す免疫応答は、ヒトによって高められたラットもしくはマウス抗体に対する免疫応答と比較して無視し得るものである。ヒト化ＣＡＭＰＡＴＢ−１抗体がＥＰ−Ａ−０３２８４０４に開示されている（Ｃａｍｐａｌｈは、ウェルカム企業グループの登録商標である）。

この発明の一側面によると、抗体がヒトＣＤ１８抗原に結合し得るように、下に示す各ＣＤＲの十分なアミノ酸配列が提示されているヒト化抗体が提供される。

軽鎖：ＣＤＲ１（配列番号３および４）ＣＤＲ２（配列番号５および６）ＣＤＲ３（配列番号７および８）重鎮＋ＣＤＲ１（配列番号１１および１２）ＣＤＲ２（配列番号１３および１４）ＣＤＲ３（配列番号１５および１６）他の側面によると、この発明は、抗体がヒトＣＤ−１８抗原に結合し得るように、上に示す各ＣＤＨの十分なアミノ酸配列が提示されているヒト化抗体をコードするＤＮＡ分子を提供する。

この抗体は、好ましくは、天然抗体またはそれらのフラグメントの構造を有している。したがって、この抗体は、完全抗体、（Ｆａｂ’）　２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、軽鎖ダイマーまたは重鎮ダイマーを含んでいてもよい。この抗体は、Ｉ　ｇＧｌ　、Ｉ　ｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧ、またはＩｇＭ、ＩｇＡＳ　ＩｇＥまたはＩｇＤであればよい。この抗体の重鎮の定常ドメインは、それに応じて選択することができる。軽鎖定常ドメインは、にまたはλ定常ドメインであってもよい。

この抗体は、ＷＯ８６１０１５３３に記述されるタイプのキメラ抗体であってもよい。Ｗｏ　８６１０１５３３によるキメラ抗体は、抗原結合部位および非免疫グロブリン部位を含む。抗原結合部位は、抗体軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインである。典型的には、このキメラ抗体は、軽鎖および重鎮可変ドメインの両者を含む。非免疫グロブリン部位は、抗原結合部位のＣ末端に融合している。この非免疫グロブリン部位は、典型的には非免疫グロブリンタンパクであり、酵素領域、公知の結合特異性を有するタンパクから誘導された領域、タンパク毒から誘導された領域または、まさに遺伝子によって発現したタンパクから誘導された領域であってもよい。非免疫グロブリン部位は、炭水化物（ｃａｒｂｏｎ　ｈ７ｄｒａｔｅ）領域であってもよい。このキメラ抗体の２つの部位は、開裂可能なリンカ−配列を介して結合していてもよい。

配列番号３ないし８および配列番号１１ないし１６の軽鎖ＣＤＲ１ないし３および重鎖ＣＤＲＩないし３は、それぞれ、ＣＤ１８抗体であるＹＦＣ５１，１，１ラット抗体のＣＤＲである。ヒトＣＤ１８抗原に対するヒト化抗体の特異性は、下記の通り、フローサイトメトリー、単球付着および／またはＴ細胞拡散アッセイによって測定することができる。

単球（ＭＮＣ）付着ＭＮＣを、抗体（２０μｍ）の存在下および非存在下において、ホルボールジエステルＰ　Ｄ　Ｂ　ｕ　（１（１−９Ｍ）で５分間処理する。次いで、これらの細胞をウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）単層に移し、９５％空気、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で３０分間インキュベートする。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄することにより、非付着細胞を除去する。次に、付着細胞を、５０μｍの０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを用いてその場で溶解させる。

各ウェルに０．４ｍＭ過酸化水素を含有するジアニシジン・ジハイドロクロライド（０，６３ｍＭ）を添加して（２５０μｌ）さらに１０分間インキュベートする。その後、吸光度の増加として記録される単球特異的ミエロペルオキシダーゼの存在を利用して酵素活性を評価する。試料の４５０ｎｍでの光学密度は、マルチウェルプレートリーダー（Ａｎｊｈｏｓシリーズ、Ｌａｂ　Ｔｅｃｋｉｎｓ＋ｒｕｍｅ＋＋ｔｓ　）を用いて記録することができる。その後、処理試料と未処理試料との間で比較を行なうことができる１７２、（１９９０）　）に従って、抗体を用いたラット、ウサギ、モルモットおよびヒト単球の表面標識を行なう。

簡単に述べると、細胞懸濁液（５ＸＩ０６）の一部１ｍｌを適切な抗体と共にインキュベートし、単分散させ、溶融氷上で３０分間インキュベートする。これらの細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ウサギ抗ラットＦ　（ａｂ−）　２　Ｆ　Ｉ　ＴＣ結合体の１：２００希釈液と共に溶融氷上でさらに３０分間インキュベートする。最後に、これらの細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％パラホルムアルデヒド中に固定する。表面標識の分析は、標準コンピューター、電子工学および光学を用いるエピクス・エリート（Ｅｐｉｃｓ　Ｅｌｉｔｅ）フローサイトメトリー（ＣｏｕＨｅｒ　ｃ７ｊｏｍｅｊｒ７゜Ｈｉａｌｈｅａ、ＦＬ　）を用いることにより行なうことができる。このエリートは、１５ｍＷ　４８８ｎｍアルゴンレーザー（Ｃ７ｏｎｉｃｓモデル２２０１、Ｓａｎ　ＪｏｓｅＳＣＡ）で構成されている。

単球およびリンパ球群を、前方角ライトスキャター（ｆｏｒｗａｒｄａｎｇｌ＜　ｌｉｇｈｔ　５ｃａＨｅｒ）およびサイドスキャターで分離する。

２ＸＩ０４単球についての緑色蛍光データをビット−マツプ・ゲート制御（ｂＩｔ−ｍａｐ　ｇａＨｎｇ）によって集め、３回のログ・スケールについて集める。同様の方法で、２Ｘ１０’好中球についての緑色蛍光データを集める。各試料について、−次ｍＡｂの存在下における平均蛍光強度を、ウサギ抗ラットＦ　（ａｂ−）　２Ｆ　Ｉ　ＴＣフラグメントのみと共にインキュベートした細胞と比較し、細胞標識の割合を決定する。試料は３重に標識することが可能であり、３回の別々の機会に繰り返し実験を行なうことができる。

フィコール−パックによる密度勾配分離を用いて脱フィブリン化血液からヒト単核球を調製する。リンパ球（２Ｘ１０５細胞）を、平底９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、　Ｒｏｓｋｉｌｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋ　）の各ウェル内で、１０％自己血清、２ｍＭグルタミンおよび１００　ｉ　Ｕペニシリン／１００μｇ−ｍ　１−’ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０において培養する。異なる濃度のモノクローナル抗体の存在もしくは非存在下における、培地単独、または抗原（Ｔ　ｅ　Ｉａ　ｎ　ｕ　５Ｔｏｘｏｉｄ、３μｇ− ｍｌ−’）　もしくはマイトジェン（ＰＨＡ、ｌμｇ−ｍｌ−１）を伴う３回培養を行なう。細胞を、９５％空（２Ｃｉ　−ｍｍｏ　１−’、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を規則的に供給し、１８時間後に回収してＢカウンター（ＬＫＢ、Ｂｅｔａｐｌａｔ！、　Ｓｗ！ｄｅｎ）を用いる液体シンチレーションにより放射活性を計測する。結果は、平均十／−５ＥＭとして表わされる。

ヒト化抗体のＣＤＲは、上述の軽鎖ＣＤＲＩないし３および重鎖ＣＤＲＩないし３であることが適当である。しかしながら、これらのＣＤＨのアミノ酸配列は変化してもよい。各ＣＤＲのアミノ酸配列は、アミノ酸置換、挿入および／または欠損により４０％まで、例えば３０％まで、２０％まで、あるいは１０％まで、変化させることができる。

したがって、各ＣＤＲは１もしくは２のアミノ酸置換、挿入および／または欠損を含む。軽鎖ＣＤＨにおいては、３つまでのアミノ酸置換、挿入および／または欠損があってもよい。軽鎖ＣＤＲＩもしくは重鎖ＣＤＲ３においては、４つまでのアミノ酸置換、挿入および／または欠損が存在してもよい。重鎮ＣＤＲ２においては、６つまでのアミノ酸置換、挿入および／または欠損が存在してもよい。

好ましくは、各ＣＤＲのアミノ酸配列は、ＹＦＣ５１，１，１の各ＣＤＨのそれと実質的に相同である。

抗体のフレームワークおよび定常ドメインは、ヒトフレームワークおよびヒト定常ドメインである。好ましくは、抗体重鎮の可変部位のフレームワークは、ヒトタンパクＮＥＷＭの対応フレームワーク（Ｓａｕｌら、Ｊ、Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、２５．　５８５−５９７、（１９８７）　）と実質的に相同である。フレームワークに係る相同性は、ＮＥＷＭに関して一般に８０％以上、例えば９０％以上あるいは９５％以上である。多くのアミノ酸置換、挿入および／または欠損が存在し得る。結合を保存するためになされることもあるフレームワーク変化の候補には、アミノ酸残基２７．３０．４８．６６．６７．７１．９１．９３および９４の変化が含まれる。

抗体軽鎖の可変部位のフレームワークは、典型的には、タンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワークＣＥｐＰ　ラ、Ｅｕｒ。

ｆ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４５．　５１３−５２４．　（１９７４）　）と実質的に相同である。フレームワークに係る相同性は、ＲＥＩに関して一般に８０％以上、例えば９０％以上、あるいは９５％以上である。多くのアミノ酸置換、挿入および／または欠損が、例えばＫａｂａｊらのナンバリングによるアミノ酸残基７１に、あってもよい。

この発明に従い、ヒト化抗体の軽鎖をコードする第１の発現ベクターおよび重鎮をコードする第２の発現ベクターで形質転換されたホストを、重鎖が発現するような条件下に維持し、それにより発現した鎖の集合体により産生されるヒト化抗体を単離することを具備する方法によって、ヒト化抗体が調製される。

第１および第２の発現ベクターは、同一のベクターであってもよい。この発明は、さらに、一ヒト化抗体の軽鎖および重鎮をコードするＤＮＡ配列；−前記ＤＮＡ配列を組み込む発現ベクアー；および一前記発現ベクターで形質転換されたホストを提供する。

抗体の重鎖は、ＣＤＲ置換により調製することもできる。

ヒト抗体の軽鎖もしくは重鎖の可変部位のＣＤＲは、得られた抗体がＣＤ１ｇ抗原と結合し得るに十分な、ラット抗ヒトＣＤ１８抗体ＹＦＣ５１，１，１の各ＣＤＨのアミノ酸配列によって置換される。ヒト抗体鎖の超可変部位をコードするＤＮＡのＣＤＲコード領域は、所望のＣＤＲをコードするＤＮＡによって置換される。適当であるならば、この改変ＤＮＡを、抗体鎖の定常ドメインをコードするＤＮＡに連結させる。このＤＮＡを発現ベクターにクローニングする。この発現ベクターを、抗体鎖が発現するような条件下で培養される適合ホスト細胞に導入する。その後、この方法で共に発現する相補抗体鎖を組み立ててヒト化抗体を形成することもできる。

この発明は、ラット抗体ＹＦＣ５１，１，１から直接もしくは間接的に誘導されるＣＤＲを有するヒト化抗体の生成に言及しつつここに記載される。しかしながら、ここに記載される技術は、他のヒト化抗ＣＤ１８抗体の誘導に等しく用いることができる。さらなる側面によると、この発明は、ヒト化（ＣＤＲグラフト化）抗ＣＤｌ８抗体を提供する。

モノクローナル抗体のヒト化には４つの一般工程がある。

すなわち、（１）開始抗体軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の決定；（２）ヒト化抗体の設計、すなわち、ヒト化プロセスにおいてどの抗体フレームワーク領域を用いるかの決定；（３）実際のヒト化方法論／技術；および（４）ヒト化抗体の形質導入および発現抗体をヒト化するためには、抗体重鎮および軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列のみが知られていることが必要である。

定常領域の配列は、これらが再造形戦略に寄与しないため、不適当である。抗体可変ドメインアミノ酸配列を決定する最も簡単な方法は、重鎮および軽鎖可変ドメインをコードするクローン化ｃＤＮＡからのものである。

所定の抗体重鎮および軽鎖可変ドメインｃＤＮＡをクローニングする一般的な方法には、（１）通常のｃＤＮＡライブラリーによるもの、または（２）ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）によるもの、の２通りがある。これらの両方法は、広く知られている。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が与えられると、この情報を抗体可変ドメインの推定アミノ酸配列に翻訳することは簡単なことである。この例において、鰯歯類ＹＦＣ５１，１，１の軽鎖および重鎮のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列が配列番号１および２並びに配列番号９およびｌＯに示されている。

工程２：ヒト化抗体の設計ヒト化においてどのヒト抗体配列を用いるかを決定するにあたり、幾つかの要素が考慮される。軽鎖および重鎮のヒト化は互いに独立している考えられているが、いずれについても論理は基本的に類似している。

この選択プロセスは、以下の原理に基づいている：所定の抗体の特異性および親和性は、主として、可変部位ＣＤＨのアミノ酸配列によって決定される。可変ドメインフレームワーク残基の直接の寄与は、はとんどないか、もしくは全（ない。フレームワーク領域の主な機能は、ＣＤＲを、抗原を認識するためのそれらの適切な空間内方位に保持することにある。このため、鰯歯類ＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークに置換することは、ヒト可変ドメインフレームワークが、それらが起源とする舊歯類可変ドメインと高度に相同である場合には、はとんど、それらの正しい空間内方位を保有する結果となるであろう。したがって、ヒト可変ドメインは、好ましくは、舊歯類可変ドメイン（複数）と高い相同性を有するべきである。適当なヒト抗体可変ドメイン配列は、以下の通りに選択することができる：１、コンピュータ・プログラムを用いて、全ての利用可能なタンパク（およびＤＮＡ）データベースを、鰯歯類抗体可変ドメインに最も相同なヒト抗体可変ドメイン配列について検索する。適切なプログラムの出力は、舊歯類抗体に最も相同な配列、各配列に対する％相同性、鰯歯類配列に対する各配列の位置合わせ（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　）のリストである。これは、重鎮および軽鎖可変ドメイン配列の両者について別々に行なう。上記分析は、ヒト免疫グロブリン配列のみが含まれるのであれば、より容易に達成される。

２、ヒト抗体可変ドメイン配列を列挙し、相同性を比較する。

この比較は、非常に変化しゃすいＣＤＲ３を除いて、最初にＣＤＨの長さについて行なう。ヒト重鎖およびにおよびλ軽鎖は、サブグループ（重鎖３サブグループ、に鎖４サブグループ、λ鎖６サブグループ）に分割される。

各サブグループ内のＣＤＲサイズは類似しているが、サブグループ間では変化する。通常、舊歯類抗体ＣＤＲを、相同性の第１近似としてヒトサブグループの１つと対にすることが可能である。次に、類似する長さのＣＤＲを有する抗体を、アミノ酸配列相同性について比較する。

これは、特にＣＤＲ内について行なわれるが、周囲のフレームワーク領域においても行なう。最も相同なヒト可変ドメインをヒト化のためのフレームワークとして選択する。

工程３：実際のヒト化方法論／技術抗体は、ＥＰ−Ａ−０２３９４００に従って、ヒトフレームワークに所望のＣＤＲをグラフト化することによりヒト化できる。したがって、所望の再造形抗体をコードするＤＮＡ配列は、再造形することを望むＣＤＲを含むヒトＤＮＡから始めて調製することができる。所望のＣＤＲを含む鰯歯類可変ドメインアミノ酸配列を、選択したヒト抗体可変ドメイン配列のものと比較する。鰯歯類の対応残基に変更してヒト可変部位に鰯歯類ＣＤＲを組み込むために必要なヒト可変ドメイン中の残基に印をつける。ヒト配列の置換、追加、削除を必要とする残基もまたあり得る。

ヒト可変ドメインフレームワークを所望の残基を有するように変異させるために用いることができるオリゴヌクレオチドを合成する。それらのオリゴヌクレオチドは、都合のよいいかなるサイズであってもよい。実施する人間は、通常、その人が利用可能な特定の合成機の能力によってのみ、長さに制限を受ける。オリゴヌクレオチド指向（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｊｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）イン・ビトロ変異の方法は良く知られている。

代わりに、Ｗｏ　９２１０７０７５の組換えポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）方法論を用いてヒト化を達成することができる。この方法論を用いて、ヒト抗体のフレームワーク領域間にＣＤＲをスプライスすることができる。

一般に、Ｗｏ　９２１０７０７５の技術は、２つのフレームワーク領域、ＡＢおよびＣＤ、並びにそれらの間の、ドナーＣＤＨによって置換されるＣＤＲを含むテンプレートを用いて行なうことかできる。プライマーＡおよびＢはフレームワーク領域ＡＢの増幅に用いられ、プライマーＣおよびＤはフレームワーク領域ＣＤの増幅に用いられる。しかしながら、プライマーＢおよびＣは、各々それらの５′末端に、ドナーＣＤＨの全てもしくは少なくとも一部に対応するさらなる配列をも有している。プライマーＢおよびＣは、ＰＣＲが実行可能な条件下で、互いにそれらの５′末端のアニーリングを行なうに十分な長さで重複している。これにより、増幅された領域ＡＢおよびＣＤは、重複伸長による遺伝子スプライシングを受けて、単一反応でヒト化生成物を生成することができる。

工程４：再造形抗体の形質導入および発現抗体を再造形するための変異反応に続いて、変異ＤＮＡを軽鎖および重鎮定常部位をコードする適当なりＮＡに連結し、発現ベクターにクローニングしてホスト細胞、好ましくは哺乳類細胞に形質導入することができる。これらの工程は、ルーチン様式で行なうことができる。したがって、再造形抗体は、（ａ）少なくともＩｇ重鎮もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作働し得るように連結された適切なプロモーターを含む、第１の複製可能な発現ベクターであって、前記可変ドメインがヒト抗体からのフレームワーク領域およびこの発明のヒト化抗体に必要なＣＤＲを含む発現ベクターを調製し、（ｂ）少なくとも相補１ｇ軽鎖もしくは重鎮の各々の可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作働し得るように連結された適切なプロモーターを含む、第２の複製可能な発現ベクタ−を調製し、（Ｃ）第１のベクター、または調製されたベクターの両者を用いて細胞系を形質転換し、および（ｄ）前記形質転換細胞系を培養して前記改変抗体を生成させる、ことを具備する。

好ましくは、工程（ａ）におけるＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖の両可変ドメインおよび特定の、もしくは各定常ドメインをコードする。このヒト化抗体は、適切な組換え発現系であればどのようなものを用いても調製することができる。改変抗体を生成させるために形質転換される細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系または、有利にリンパ組織を起源とする、ミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマもしくはクアドローマ細胞系のような不死化哺乳動物細胞系であってもよい。この細胞系には、ニブシュタイン・バールウィルス（Ｅｐｓｊｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）のようなウィルスを用いた形質転換によって不死化される、Ｂ細胞のような正常リンパ球も含まれる。最も好ましくは、不死化細胞系はミエローマ細胞系もしくはそれらの派生体である。

この発明による抗体の発現に用いられるＣＨＯ細胞は、ジハイドロフォレートリダクターゼ（ｄｈｆｒ）を欠失し、それ故成長のためにチミジンおよびハイポキサンチンに依存するものであればよい（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｃ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、７７．４２１６−４２２０　（１９８０））　。親ｄｈｆｒ　ＣＨＯ細胞系は、抗体および、ｄｈｆｒ陽性フェノタイプのＣＨＯ細胞形質転換体の選別を可能にするｄｈｆｒをコードするＤＮＡが形質導入されている。選別は、このコロニーをチミジンおよびハイポキサンチンを欠く培地で培養することにより行なう。これらの欠失は、非形質転換細胞の成長を妨げ、形質転換細胞がフオレート経路を再び拾い上げて選別システムを迂回することを妨げる。これらの形質転換体は、通常、形質導入された興味対象のＤＮＡおよびｄｈｆｒをコードするＤＮＡを一緒に組み込んだことによる効果により、低レベルの興味対象ＤＮＡを発現する。抗体をコードするＤＮＡの発現レベルは、メトトレキセート（ＭＴＸ）を用いて増幅することにより増加させることができる。この薬剤は酵素ｄｈｆｒの直接阻害剤であり、これらの条件下で生存するに十分なまでそれらのｄｈｆｒ遺伝子のコピー数を増幅する耐性コロニーの単離を可能にする。ｄｈｆｒをコードするＤＮＡ配列および抗体をコードするＤＮＡ配列は元の形質転換体では密接に連結しているので、通常、共存増幅（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　）が起こり、それ故に所望の抗体の発現が増幅する。

ＣＨＯもしくはミエローマ細胞と一緒に用いる他の好ましい発現系は、Ｗｏ　８７１０４４６２に記載されるグルタミン・シンセターゼ（ＧＳ）増幅系である。

この系は、酵素ＧＳをコードするＤＮＡおよび所望の抗体をコードするＤＮＡを用いた細胞の形質導入を含む。次いで、グルタミン非含有培地中で成長し、それ故ＧＳをコードするＤＮＡが組み込まれたことが推測できる細胞を選択する。次に、これらの選択されたクローンに対し、メチオニン・スルフォキシミン（Ｍｓｘ）を用いる酵素ＧＳの阻害を行なう。これらの細胞は、生き残るために、抗体をコードするＤＮＡの共存増幅を伴ってＧＳをコードするＤＮＡを増幅する。

ヒト化抗体を産生ずるために用いられる細胞系は、好ましくは、哺乳動物細胞系ではあるか、代わりに、細菌細胞系もしくは酵母細胞系のような他の適切な細胞系も用いることができる。特に、Ｅ、ｃｏｌｉ由来細菌株が使用可能であることは考慮される。選られた抗体は、その機能性について照合する。

機能性が失われている場合には、工程（２）に戻り、抗体のフレームワークを変える必要がある。

一旦発現した後は、この発明の抗体全体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎮、または他の免疫グロブリン形態を取り出し、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当分野の標準的な手順で精製することができる（一般的には、５ｃｏｐｅｓ、Ｒ，、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｔｉｆｉｃａｆｉｏｎ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ４ｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ。

（１９８２）を参照）。医薬上の使用には、少なくとも約９０ないし９５％の等質性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８ないし９９％以上の等質性を有していることが最も好ましい。望みのままに、部分的であれ、等質にまでであれ、一旦精製されると、治療に用い、あるいはアッセイ手順の開発及び実施、免疫蛍光染色等に用いることができる（一般的には、Ｉｍｍｕｌｌｌｏｌｏｇｉｃｘｌ　ＭＮｈｏｄｓ、Ｉおよび１１巻。

Ｌｅｌｋｏｖｉｔｓ　ａｎｄ　Ｐｅｒｎｉｓ編、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＣｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ。

（１９７９および１９８１）を参照）。

ヒト化ＣＤ１８抗体は、例えば、白血球介在状況の治療に用いることができる。

ヒト化ＣＤ１８抗体は、典型的には、敗血症または他の感染性もしくは非感染性外傷における白血球の肺および他の器官への流入の阻止にその用途を見出す。したがって、ヒト化ＣＤ１８抗体は、自前性ショックもしくは成人呼吸困難症候群の患者における白血球の肺および他の器官への侵入の阻止に用いることができる。この抗体は、血栓崩壊治療後の喘息もしくは白血球介在レバーフュージョン（ｒｅｐｅｒｌｕｓｉｏｎ　）損傷の治療、敗血症または他の感染性もしくは非感染性外傷に起因する炎症を有する患者の肺および他の器官における炎症の治療、抗感染症剤を投与されている患者の炎症の除去もしくは軽減、あるいは化学療法における患者への治療薬の投与の補助に用いることができる（ＥＰ−Ａ−０３４６０７８）。

この発明のヒト化抗体は、他の抗体、特に疾患に応答し得る細胞上の他のマーカーとの反応性を有するヒトモノク凸−ナル抗体と組み合わせて用いることもできる。例えば、適当なＴ細胞マーカーには、第１回国際白血球分化ワークショップ、Ｌｅｕｋｏｃｙｊｅ　Ｔ７ｐｉｎｇ、Ｂｅｒｎａｒｄ　ら編、Ｓｐｒ　ｉｎｇｅｒ４ｅｒｌａｇ、Ｎ、Ｙ、（１９８４）によって命名された、いわゆる“分化の集団（Ｃ１ｕｓｔｅｒｓ　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｆｔａ＋ｉｏｎ　）　”にグループ分けされるものが含まれる。

この抗体はまた、化学療法剤もしくは免疫抑制剤と連動して与えられる、分離投与組成物（ｓｅｐａｒａ＋ｅ１７ａｄｍｉｎｉｓｊｅｒｅｄｃｏｍｐｏｓｉｊｉｏｎ　）として用いることもできる。典型的には、これらの薬剤にはシクロスポリンＡもしくはプリン・アナローブ（例えば、メトトレキセート、６−メルカルブトプリン等）が含まれるが、さらに当業者に公知の多くの薬剤（例えば、シクロホスファミド、プレドニソン等）を利用することもできる。

この発明の抗体は、免疫毒素の一部を形成してもよい。免疫毒素は、２つの成分で特徴付けられ、イン・ビトロもしくはイン・ビボにおいて選ばれた細胞を殺すのに特に有用である。“移送坦体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｖｅｈｉｃｌｅ）　”として知られる第２の成分は、毒性作用物質を特定の細胞タイプ、例えばカルシノーマを含む細胞に移送する手段を提供する。２つの成分は、通常、種々の公知化学手段により互いに化学的に結合している。例えば、細胞毒性作用物質がタンパクであり、第２成分が完全免疫グロブリンである場合には、結合はへテロ三官能性架橋剤、例えば、５ＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等によるものであればよい。種々の免疫毒性の製造は、当分野では公知であり、例えば“モノクローナル抗体−毒素結合体；魔法の弾丸を目指して”、　Ｔｈｏｒｐｅら１Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　＆ｂｄｉｃｉｕ、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ｐｐ、１６８−１９０　（１９８２）に見出すことができる。

種々の細胞毒性作用物質が免疫毒素中での使用に適している。細胞毒性作用物質には、ヨウ素−１３１，イツトリウム−９０、レニウム−１８８、およびビスマス−２１２のような放射核；ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ　）　、メトトレキセート、アドリアマイシン、およびシスプラチンのような多数の化学療法剤；およびアメリカヤマゴボウ抗菌タンパク、シュードモナス外毒素Ａ１リシン、ジフテリア毒素、リシンＡ鎖等のリポソーム阻害タンパク、もしくはホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）のように細胞表面で活性な作用物質のような細胞毒性タンパクが含まれろる。一般には、“キメラ毒素”、　０ｌｓｎ＜ｓおよびＰｈ１ｌ、　Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｔｈｅｔ、、　２５．３３５−３８１　（１９８２）、および“癌検出および治療のためのモノクローナル抗体”。

ＢａｌｄｗｉｎおよびＢ７ｅｒｓ編、ｐｐ、１５９−１７９．２２４−２６６、　Ａｃｔｄｅａ＋１ｃＰｒｅｓｓ　（１９８５）参照。

免疫毒素の移送成分は、この発明によるヒト化抗体である。

完全免疫グロブリンまたはそれらの結合フラグメント、例えばＦａｂが好ましく用いられる。典型的には、免疫毒素中の抗体は、ヒトＩｇＡ、ＩｇＭもしくはＩｇＧイソタイプのものであるが、所望により他の哺乳動物定常部位を利用することもできる。

この発明は、さらに、薬剤掌上許容し得る坦体もしくは希釈剤および、活性成分として、この発明によるヒト化抗体を含有する医薬組成物を提供する。この組成物は、この発明による免疫毒素を含有していてもよい。この発明のヒト化抗体、免疫毒素およびそれらの医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下、筋肉内もしくは静脈内投与に特に有用である。

非経口投与用の組成物は、通常、抗体もしくはそれらのカクテルを許容しつる坦体、好ましくは水性坦体中に溶解した溶液を含む。種々の水性坦体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン等を用いることができる。これらの溶液は無菌であり、一般に特別な物質は含んでいない。

これらの組成物は、通常の公知滅菌技術により滅菌される。

これらの組成物は、生理学的条件を近づけるために、ｐＨ調節および緩衝剤、毒性調節剤等の薬剤学的に許容しうる補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を所望により含むことができる。これらの処方における抗体の濃度は大きく変化しうる。例えば、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から１５もしくは２０重量％もの間であり、選ばれた特定の投与方式に従い、主に流体容積、粘度等に基づいて選択される。

このため、筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、無菌緩衝水１ｍｌおよび抗体５０ｍ　ｇを含むように調製することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、無菌リンゲル溶液２５０ｍ　ｌおよび抗体１５０ｍ　ｇを含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者には公知もしくは明らかであり、例えば、Ｊｌｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１５版、　Ｍａｃｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａＢ、　Ｅａｓｆｏｎ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ　（１９３Ｑ）により詳細に記載されている。

この発明の抗体は、保存のために凍結乾燥し、使用の前に適切な坦体中でもどすことができる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示されている。あらゆる適切な凍結乾燥並びに再構成技術を用いることができる。凍結乾燥および再構成が抗体活性損失の程度を変化させ（例えば、通常の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性損失が大きい傾向にある）、使用レベルを調節して補償しなければならないことがあり得ることは当業者には認識されるであろう。

このヒト様抗体もしくはそれらのカクテルを含有する組成物は、予防および／または治療処置のために投与することができる。治療目的の適用においては、組成物は、すでに疾患に罹患した患者に、治療に十分であるか、あるいは少なくともその疾患および余病の進行を止め、もしくは緩和させる量が投与される。これを達成するに適した量は、“治療上の有効投与単位量”と定義される。この用途に有効な量は、感染の重篤性および患者自身の免疫系の一般状態に依存するが、一般に、投与単位量当り抗体的１ないし約２００ｍ　ｇの範囲をとり、より一般的には患者当り５ないし２５ｍ　ｇの投与量が用いられている。この発明の物質は、一般に、疾患が重篤な状態、すなわち生命が脅かされているか、もしくは潜在的に生命が脅かされている状況で用いられることは心に留めておくべきである。

そのような場合には、この発明のヒト様抗体によって達成される外部発生物質の最小化および“外来物質”拒絶の恐れをより少なくするという観点から、治療医師によってこの抗体の実質的な過剰量を投与することが可能であり、望ましいものと感じられる。

予防目的の適用においては、この抗体もしくはそれらのカクテルを含有する組成物は、患者の抵抗力を増強させるために、また疾患状態にはない患者に投与される。そのような量は、“予防上の有効投与単位量”と定義される。この用途においては、正確な量は同様に患者の健康状態および免疫の一般レベルに依存するが、一般に、単位投与量当り０．１な１．１Ｌ２５ｍ　ｇの範囲をとり、特に患者当り０．５ないし２．５ｍ　ｇである。好ましい予防用途は、腎臓移植拒絶の予防に対するものである。

この組成物は、治療医師によって選択された投与量レベルおよびパターンで、単一もしくは複数投与することができる。

いずれにしても、この医薬処方は、この発明の抗体を、患者を効果的に治療するに十分な量提供するべきである。

この発明のヒト様抗体は、イン−ビトロにおいて、非常に多様な用途をさらに見出すことができる。例として、例示抗体は、Ｔ細胞タイピング、特異ＣＤ１８抗原保有細胞もしくは受容体のフラグメントの単離、ワクチン調製等に用いることができる。

診断の目的には、この抗体は標識されていても、されていなくてもよい。未標識抗体は、ヒト化抗体と反応する他の標識抗体（二次抗体）、例えばヒト免疫グロブリン定常部位に特異的な抗体、と組み合わせて用いることができる。代わりに、この抗体を直接標識することができる。非常に多様な標識、例えば、放射核、蛍石、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、リガンド（特に）１ブテン）等を用いることができる。多くのタイプのイムノアッセイを利用することができ、それらは当業者に公知である。

キットもまた、細胞活性もしくは選択された抗原の存在に対する防御またはその検出に使用するために、この主題の抗体を具備することができる。したがって、この発明のヒト化抗体は、通常、容器内に凍結乾燥された形で、単独に、もしくは所望の細胞タイプにたいする特異性を有するさらなる抗体と一緒に供給される。標識もしくは毒素と結合していてもいなくてもよいこれらの抗体は、トリス、リン酸塩、炭酸塩のような緩衝剤、安定化剤、殺生物剤、不活性タンパク、例えば血清アルブミン等と共にキットに含まれる。一般に、これらの物質は活性抗体の量に対して約５重量％未満存在し、通常、抗体濃度に対して総量で少なくとも約０．００１重量％存在する。しばしば、活性成分を希釈するために、不活性エクステンダー（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）または賦形剤を含むことが望ましく、賦形剤は組成物全体の約１ないし９９重量％存在し得る。アッセイにおいて、キメラ抗体に結合し得る二次抗体が用いられる場合には、これは通常別のバイアル中に収容される。二次抗体は、典型的には標識と結合しており、上述の抗体処方と同様の様式で処方されている。このキットは、一般に、−揃いの使用説明書も含んでいる。

以下の例はこの発明を説明する。

２．５Ｘ１０７ＹＦＣ５１，１，１発現細胞から、ＣｈｏｍｃＢｎｓｋｉおよび５ａｃｃｈｉの方法（Ａｎａｌ、　ＢｉｏｃｈＣｍ、、１６２．　１５６−１５９．　（１９８７））に従い、１×１０７細胞当り　１ｍｌの抽出溶液を用いて、全ＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡペレットを、分光光度計の測定で４μｇ／μｌの濃度となるようにジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理蒸留水５０μｍに再溶解する。製造者のプロトコルを用い、７５μｇの全量ＲＮＡからｍＲＮＡを抽出するために、ダイナビーズ−オリゴ（ｄ　Ｔ）　２５　（ＤＦｎａｌ　）を用いた。ｃＤＮＡ合成用のスーパースクリプト（ＳＵＰＥＲ５ＣＲＩＰＴ　）　・プラスミド・システムおよびプラスミド・クローニング・キット（ＢＲＬ）を用い、製造者が推奨する方法に従って、単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。

得られたｃＤＮＡ／ｐＳＰＯＲＴ−１ライゲーシヨンを用いて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉマックス・エフイシエンシ（ＭＡＸＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ）　ＤＨ５αコンペテント・セルズ（ＢＲＬ）を形質転換した。Ｂｕｌｕｗｅｌａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７゜４５２、（１９８９）　）に従い、約５０００コロニーをＨ７ｂｏｎｄ−Ｎナイロンフィルター（Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ）上にのせて溶菌し、変性させて固定した。このフィルターを、０．２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中において、５５℃で、プロテイナーゼＫ（５０Ｈｇ／ｍｌ）を用いて３０分間処理し、過剰の残骸をティ・ンシュで除去した。

（ｉ）重鎮ラットγ−ＣＨＩ定常部位（塩基４９６−５１５）のタンパクに相補的な、配列番号１７に示すオリゴヌクレオチドの末端を標識し、標準プロトコルに従うＹ　Ｆ　Ｃ５１，１，１重鎖についてのフィルターのスクリーニングに用いた。約５０の潜在的な陽性コロニーが検出され、さらに分析するために２０個を選択した。

Ｄｅｌ　Ｓａｌ　らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１６．９８７８．　（１９８８））を用いてプラスミドＤＮＡが調製され、２０のうちの１２が期待通りのサイズを有するラット免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡのインサートを有していた。クローンｐ　５１Ｈ，６を選択し、シークエンスψキット（ＵＳＢ）のプロトコルにより、ジデオキシ鎖末端法（Ｓａｎｇｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、７４、　５４６３−５４６７、（１９７７）　）に従い、プラスミド・プライミングにより可変部位の配列を両方向決定した。可変部位の配列を配列番号９および１０に示す。

（ｉ　ｉ）軽鎖非放射性ＤＮＡ標識および検出キット（Ｂｏ＜ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用い、製造者のプロトコルに従って、ラットミエローマＹ３−Ａ　ｇ　１．２．３軽鎖のクローン（Ｃｒｏｗｅら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、１７．７９９２．　（１９８９）　）をジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、ＹＦＣ５１，１，１軽鎖についてのフィルターのスクリーニングに用いた。

約４０の潜在的な陽性コロニーが検出され、さらに分析するために２４個を選択した。上述と同様にプラスミドＤＮＡを調製した。Ｙ３−Ａ　ｇ　１．２．３およびＹＦＣ５１，１，１軽鎖の両方が単離された（Ｙ３細胞系は）１イブリド一マ融合パターン）が、それらは異なる制限パターンを有することにより分別可能であった。ＹＦＣ５１，１，１軽鎖を有する１つのクローンｐ　５１Ｌ、　４を選択し、重鎮についての記述と同様に配列を決定した。可変部位の配列を配列番号１および上記工程（２）に記述した選別手順を用いて、ヒト化プロセスに用いるＮＥＷＭ重鎖およびＲＥＩ軽鎖のヒト可変ドメイン・フレームワーク（Ｋａｂａｔら、１９８７）を選択した。

に従い、ヒト化重鎮および軽鎖を構築した。

（１）軽鎖軽鎖オリゴヌクレオチドプライマーＡ、：配列番号１８Ｂ、：配列番号１９ＣＬ　：配列番号２０Ｄ、：配列番号２１Ｅ、：配列番号２２Ｆ、：配列番号２３Ｇ、：配列番号２４Ｈ５：配列番号２５ＰＣＲ反応（Ｓａｉｋｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ　、　４８７−４９１　（１９８８））を、プログラム可能な加熱ブロック（１！ｙｂａｉｄ）内で、２０回の温度サイクル（９４℃で１分、５０℃で２分および７２℃で３分）および続＜７２ ℃での最終１０分工程を用いて行なった。製造者が推奨する通り、各プライマーｌμｇ、特定量のテンプレート、およびＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）　２．５ユニツトを反応緩衝液と共に最終容積１００μ ｍで用いた。

ＰＣＲの開始テンプレートはＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ軽鎖（ＲＥｌフレームワーク上のヒト化ＣＡＭＰＡＴＨ−１；　ＰａｇｅおよびＳｙｄｅｎｈａｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｒ、９．　６４−６８．　（１９９１）　）である。

プライマ一対Ａ　およびＢＬｌＣＬおよびり５、ＥＬおよびＦ　１並びにＧ、および顯をそれぞれを用いて、反応光りしテンプレート１０ｎｇで、４通りの初期ＰＣＲ反応を行なった。

これらのＰＣＲ反応の生成物、フラグメントＡＢＬ、ＣＤＬ。

ＥＦ　およびＧＨＬの各々を、Ｐｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）を用いて、製造者が推奨するプロトコルに従って精製した。各精製生成物の１７４を用いて、フラグメントＡＢＬとＣＤＬ。

およびＥＦ　とＧＨ，とを結合させ、プライマーＡＬおよびＤ　１並びにＥ　およびＨＬをそれぞれ用いる組換えＰＣＲＬ　Ｌ反応を行なった。これらの反応の生成物、フラグメントＡＤ、およびＥＨ，を上述の通りに精製し、各々の１／４をプライマーＡ　およびＨＬを用いる組換えＰＣＲ反応において結し合した。最終ヒト化軽鎖組換えＰＣＲ生成物ＡＨ，を、プライマーＡ　およびＨＬのＢｉｎｄｌ１１部位を利用し、Ｃｒｏｗ＊ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１９．　１８４．　（１９９１）の方法に従って、ｐＵＣ−１８（ＢＲＬ　）のＨｉｎｄｌ１１部位にクローニングした。ジデオキシ鎖末端法によりプラスミド単離体の配列を決定し、正しい配列のクローンを選択した。

（１１）重鎮重鎮オリゴヌクレオチドプライマー：Ａｎ：配列番号２６ＢＨ：配列番号２７ＣＨ：配列番号２８ＤＨ：配列番号２９ＥＨ：配列番号３０Ｆ８：配列番号３１ＧＨ：配列番号３２ＨＥ：配列番号３３ＰＣＲの開始テンプレートはＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ重鎖である。上述と同様ではあるが、オリゴヌクレオチドプライマーＡＨないしＨＨを用いて、組換えＰＣＲ法により舊歯類ＣＤＲをテンプレートにグラフト化した。最終ＰＣＲ，すなわち、フラグメントＡＤＢおよびＥＨＨとプライマーＡＨおよびＨＨは、生成物の収率は高くはない。そこで、（フラグメントＡＤＨおよびＥＥＥから）フラグメントＡＦＢを生成し、フラグメントＥＨＢと共にプライマーＡＨおよびＨＨを用いるＰＣＨに用いた。オリゴヌクレオチドＡ　およびＨＨは、ヒ■ ト化可変部位の初期クローニングを可能ならしめるために、それぞれ１ｌｉｎｄｌｌ！およびＥｃｏＲ１部位を有するように設計し、それに続く、選択された適切な定常部位を用いる可変部位のクローニングを容易にするために、オリゴヌクレオチドＧＨ（Ｋａｂｘｌ　ら、１９８７によるナンバリング）のロイシン残基を変えることがないように選択した。６つのヒト重鎖Ｊ−ミニ遺伝子のうちの４つは、この位置にロイシンを有している（Ｋａｂａｆ　ら、１９８７）。コツタめ、一般に、操作しり’５ｐｅ１部位の使用は適当である。

ＥｃｏＲＩ　切断ｐＵＣ−１８（ＢＲ′Ｌ）にクローニングし、正しい配列を有するプラスミド単離体を選択した。ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ重鎖のＦＲ４およびγ １１定部位を、オリゴヌクレオチドプライマーＸ　（配列番号３４）およびＹｌＮ（配列番号３５）を用いてｐＵＣ−１８（ＢＲＬ）ｉ：ＰｃＲクローニングした。

プライマーＸ　は５ｐｅｌおよび旧ｎｄｌ１１部位を有し、ＹＨはＨ−□ ＥｃｏＲ１部位を有する。旧ｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲ１部位をＰＣＲ生成物のｐ　Ｕ　Ｃ−１８へのクローニングに用い、正しい配列を有するプラスミド単離体を選択した。続いて、操作したＦＲ４５ｐｅ１部位を用いて、ヒト化可変部位およびγｌ定常部位から完全重鎮を再構成した。

ＣＯ８細胞における一過性発現ヒト化重鎮および軽鎖をコードするＤＮＡをベクターｐＥＥ６．ｈＣＭＶおよびｐ　Ｅ　Ｅ　＋２にそれぞれクローニングした。　５ｆｅｐｈｅｎｓ　＆　Ｃｏｃｋｅ目、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７．　７１１０（１９８９）　；　Ｂｅｂｂｉｎｇｊｏｎ　ら、Ｂｉｏｔｅｃｂ＋＋ｏｌｏｇ７．　１０．　１６９（１９９２）　；およびＢｅｂｂｉｎｇｌｏｎおよびＨｔｎｔｓｃｈｓｌ、　Ｇｌｏｖｅｒ編ＤＮＡクローニング第１Ｉ＋巻、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８７）を参照。ベクターｐ　Ｅ　Ｅ　１２は、ｐＢＲ３２２をベースとし、ｈ−ＣＭＶ−・１ＩｌＥＩプロモーターおよびＳＶ４０早期（ｅａｒｌｙ　）領域プロモーターの制御の下のハムスターΦグルタミン・シンセターゼ（ＧＳ）ｃＤＮＡを有するベクターである。ベクターｐＥＥ１２は、ＳＶ４０プロモーター転写１：ヨリｈ−ＣＭＶ−ＭＥＩフロ（−−９−と同じ方向に誘導されたＧＳｃＤＮＡ発現カセットを有するｐ　Ｅ　Ｅ　６　（ＥＰ−Ａ−０３３８８４１参照）に対応する。ベクターｐＥＥ６　、ｈＣＭＶおよびｐ　Ｅ　Ｅ　１２を形質導入した細胞は、ＧＳｃＤＮＡの存在により、グルタミン非含有培地において成長可能である。選択はｐＥＥ１２プラスミドに対してのみ行なわれるが、効果的な発現は、両プラスミドの共組込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に依存する。

トランスフエフタム試薬（ＴｒａＩＩ百ｅｃｔａｍ　ｒｅａｇｅｎｊ　）（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｓｏｕｔｈａｍｐｆｏｎ、　Ｕ、に、）を用い、製造者が推奨する条件下で、組換えプラスミド（各５μｇ）を５Ｘ１０５ＣＯ３−１細胞に形質導入した。ストックＣＯＳ−１細胞（ｓｏｕｒｃｅＥＣＡＣＣ，Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　Ｕ、に、　）は、１０％仔ウシ血清（ＡＰＰ。

Ｄｕｄｌｅｙ、　Ｕ、に、　）を補ったＤＭＥＭ培地（Ｆｌｏｗ、Ｉｒｖｉｎｅ。

Ｕ、　Ｋ、　）中に維持した。ＣＯ８細胞形質導入は、ＤＭＥＭ培地（Ｆｌｏｗ、ｆｒｙｉｎｅ、　Ｕ、に、）中で行なった。形質導入の４日後のＣＯＳ−１細胞からの成長培地のアッセイを、捕獲抗体としてポリクローナル抗ヒトＩ　ｇＧ　（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、　Ｕ、に、）を固相した可撓性マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｊｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏａ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、　Ｕ、に、　）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより行なった。

アッセイ試料を加え、抗ヒトＩｇＧ　γ鎖−特異的パーオキシダーゼ結合体（Ｓｅｒａｌａｂ。

Ｃｒ＋＋ｗｌｅ７　Ｄｏｗｎ、　Ｕ、に、　）および基質としてのオルソフエニレンジミンーＨＣ１（Ｓｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｅ　Ｕ、に、　）を用いて検出を行（１９９０）の方法に従い、消耗したＣＯ８細胞上清をＦＡＣ３分析のためのＭＦ−１４（Ｔ細胞クローン）の表面標識に用いることにより、ＣＯ８細胞においてヒト化抗体が一時的に発現したことが示された。簡潔に述べると、細胞懸濁液（１０”）の一部１００μｍを、適当な抗体（消耗したＣＯ８細胞上清）と共に、溶融氷上で３０分間インキュベートした。これらの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、適当な二次抗体と共にさらに３０分間インキュベートした（下記参照）。細胞を再び洗浄し、溶融氷上で、抗ラットＩｇ−ＦＩＴＣもしくは抗ヒトＩｇ−ＦＩＴＣ結合体を添加した。最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％パラホルムアルデヒドで固定した。表面標識の分析は、標準コンピュータ、電子工学および光学を用いるＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣ３ｃａｎを用いて行なった。

ＣＯ８細胞上清中のヒト化抗体は、ラットＹＦＣ５１，１，１の結合の阻害の他に、Ｍ　Ｆ−１４細胞と結合することが示された。

このヒト化抗体が、ラットモノクローナル抗体の結合をブロックすることによりＣＤ１８に対する結合性を保持することが示されたので、安定なＮＳＯ形質導入体を作製した。

ＮＳＯ細胞における安定発現ＮＳＯ細胞における安定な形質導入を生じさせるシングル発現ベクターは、ｐＥＥ１２−軽鎖プラスミドのＲａｍ旧の中のｐＥＥ６から完全重鎖発現カセットをクローニングして生成させた。

すなわち、配列をコードする重鎮及び軽鎖の両方は、同じベクターから同じ方向に転写された。形質導入のためのプラスミド４０μｇを、細菌性プラスミド配列の中に認識配列を有する５ａｌｌ制限酵素による消化によって直線化した。直線化されたＤＮＡをエタノールを用いて溶液から沈殿させ、７０％エタノール中で洗浄し、乾燥して滅菌水に再び懸濁させた。

ＮＳＯ細胞（ヒト骨髄腫（ｍｙｃｌｏｍａ）細胞系；　Ｊａｒｖｉｓ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｏｘｙｍｏｌｏｇｙ、　７３Ｂ、３（１９８１）；５ｏｕｒｃｅＥＣＡＣＣ。

Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　Ｕ、に、参照）の指数関数的な増殖は、非選択的ＤＭＥＭ培地（すなわち、グルタミン及び硝酸鉄がなく、ピルビン酸ナトリウムｌｌｏｍｇ／ｌ　（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｐａ１ｓｌｅｙ、Ｕ、に、）を用い、　ｌ×非必須アミノ酸（Ｆｌｏｗ、Ｉｒｖｉｎｅ、　Ｕ、に、）　２ｍＭ　グルタミン（ＧＩＢＣＯ）および１０％子ウシつ児血清（ＡＰＰ、　Ｄｕｄｌｅ７゜Ｕ、Ｋ、）が補填されている）中で続けられた。ＮＳＯ細胞を遠心分離し、洗浄し、且つ、ＤＮＡを添加した後に、細胞が１０７細胞／ｍｌの濃度になるように冷ＰＢＳ中に再懸濁した。

直線化されたプラスミドＤＮＡ　（４０Ｂｇ）を、エレクトロポーレーションキュベット中の１０７細胞に氷上で添加した。細胞およびＤＮＡを泡立たないように穏やかに混合し、混合物を氷上に５分間放置した。キュベツトの外側を拭いて乾燥し、１５００Ｖ、３ｍ　Ｆの二連続パルスを、Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　（ＢＩＯ−Ｒａｄ）を用いて加えた。このキュベツトを、５分間、氷に戻した。

形質移入した細胞を、非選択的培地５０μｌ中に３×１０５．７．５Ｘ］０４および１．５Ｘ１０４細胞／ｍｌの濃度で、９６ウエルプレートに移し、３７℃で２４時間インキュベートした。次に、選択的培地（すなわち、グルタミン及び硝酸鉄がなく、ピルビン酸ナトリウム１００ｍｇ／　１　（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｐａ１ｓｌｅｙ、Ｕ、に、）を用い、グルタミン酸（６０ｍ　ｇ／　１　）　、アスパラギン（６０ｍｇ／ｍ　１　；　Ｓｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｅ、　Ｕ、に、）、ｌ×非必須アミノ酸、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジン各７ｍｇ／ｍｌ、チミジン２．４ｍ　ｇ　／　１　（Ｓｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｃ、　Ｕ、　Ｋ、　）並びに１０％未溶解子ウシ血清（ＡＰＰ、　Ｄｕｄｌｅｙ、　 υ、に、）が補填されている）１００μｌを、結合および形質導入されたプラスミドを有する、選択されたクローンに添加した。このプレートを培養器に戻し、実質のある細胞の死が起こり、分離している生き残ったコロニーか現れるまで放置した。一旦、グルタミン依存性形質導入体が認められたら、単一のコロニーを有するウェルを選択し、使用した組織培養懸濁液を集めて、ヒトＩｇＧ分泌をアッセイした。

次に、ＩｇＧ分泌について陽性である単一のコロニーを有するウェルを、選択的培地を使用した培養に発展させた。細胞を、９６ウエルプレートの中に、培地１００μｍ中１０４細胞／ウェルで分布させ、−晩インキユベートした。Ｌ−メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）の濃縮物を含有する選択的培地１００μｍを添加した。ＭＳＸは、ベクターの分泌を増幅させる毒性グルタミン類似物である。各々の９６−ウェルプレートは、２００μＭ〜１２．５μＭの範囲内で異なるＭＳＸの最終濃度を有する。個々のコロニーを、Ｍ　Ｓ　Ｘ耐性を起こしたＭＳＸ最高濃度で、各々の依存性形質導入体から分離した。コロニーを発展させ、抗体分泌速度（μｇ／１０６細胞／日）を、増幅されていない場合の速度と比較した。　１〜３μｇ／１０６細胞／日でヒト化抗体を発現するクローンを得た。

ヒト化抗体を、使用した組繊細胞懸濁液から、スーパーロース　プロティン−Ｇ　カラム（ファルマシア）上のアフィニティークロマトグラフィーで精製し、Ｔ細胞増殖アッセイおよびＣ＋ｑ結合研究に使用した。

Ｔ細胞増殖末梢性ヒト単核細胞を、リンホブレプ（Ｌ７ｍｐｈｏｐｒ！ｐ）（Ｎ７ｃｏｍｅｄ、　０ｓｉｏ、　Ｎｏ＋ｗａ７）を用いて脱線維素ヒト全身血液から分離し、製造業者のプロトコールを続けた。３倍培養液を、中間クローン（１０％自己血清、２１グルタミンおよび１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ　１６４０）、または、培地および抗原（Ｔｅｔａｎｕｓｔｏｘｏｉｄ、５ｕ　ｇ／ｍｌ）若しくは培地およびマイトジェン（ＰＨＡ。

５μｇ／ｍｌ）　と共に、ＹＦＣ５１，１，ｌ　またはヒト化抗体の存在下或いは存在なしで、９６ウエル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ、　Ｒｏｓｋｉｌｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋ）の中に供給した。細胞を、ｍｍｏｌ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ）でパルスを送り、４時間後集め、βカウンター（ＬＫＢ、Ｂｅｊａｐｌａｔｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した液体シンチレーションにより、放射能計数をした。

ラットＹＦＣ５１，１，１モノクローナル抗体およびヒト化抗体の両方は、抗原特異的Ｔ細胞反応を強く阻害したが、増殖を誘発したＰＨＡについて僅かな効果を有した。しかしながら、抗体（５０μｇ／ｍ　１　）の高いレベルおよびＰＨＡ　（２，５１１ｇ／ｍ１）の低いレベルでは、８０％阻害まで得られた。

補体結合ヒト単核細胞（上記調製）を、ＰＨＡ　５μｇ　／　ｍ　１を用いて刺激し、３７°Ｃで３日間インキュベートした。細胞をＰＢＳで細胞を洗浄し、ＰＨＡを除去した。次に、細胞を、テスト抗体ＩＯμｇ／ｍｌと共に氷上で２０分間インキュベートし、水冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、水冷ヒト血清と共に２０分間インキュベートした。水冷ＰＢＳで洗浄し、ヒト血清を分離した。

次いで、細胞を、フルオロセイン化（ｆ　Ｉｕｏｒｅｃｅｉｎａｊｅｄ）ポリクローナルヒツジ抗ヒトＣ１ｑと共に、２０分間インキュベートした。結合していない抗−Ｃ１ｑを、ＰＢＳで細胞を洗浄して除去し、細胞を、Ｂ＜ｃｊｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣ５ｃａｎ　で分析した◇ＹＦＣ５１，１，１は、ヒトＣ１ｑと弱く結合していることが認められ、ヒト化抗体との結合は検出されなかった。抗−ＣＤ１８抗体の可能性のある治療的使用は、ＣＤ１８陽性細胞の枯渇よりも、白血球のＣＤ１８−仲介粘着の一過性阻害に頼っている。従って、ヒト抗体がＣＤ１８陽性細胞の上へヒト補体を固定できないことは、インビボで、抗体が補体を使用し尽くさないがブロッキング抗体として機能し得るので、好都合である。

ＦＡＣ３分析ＣＤ１８　陽性Ｔ細胞クローン（ＭＦ１４）を、ラット抗体と比較したヒト化抗体の結合の測定に使用した。細胞をラットまたはヒト化抗体を氷上で３０分間インキュベートした。結合していない抗体を洗浄して除去し、２番目の抗体を添加（すなわち、ラット抗体をヒト化抗体と共に予備インキュベートした細胞に添加した。逆もまた同様である。）し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄して結合していない抗体を除去し、ＦＩＴＣ−標識抗ヒト抗体または抗ラット抗体を添加した。

結合していない標識を洗浄により除去し、細胞をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣ５ｃａｎで分析した。ＹＦＣ５１，１，１１０μｇ／ｍ　１を用いたＭＦＩ４細胞の予備インキュベーションは、ヒト化抗体０．１μｇ／ｍｌの結合を完全にブロックした。相反する実験では、ヒト化抗体ｌＯμｇ／ｍｌを用いた予備インキュベーションは、ＹＦＣ５１，１，１０，１μｇ　／　ｍ　１の結合を完全にブｏ　ツクした。第１の抗体１．０および０．１μｇ／ｍｌを使用した場合の両方とも、ブロッキングの滴定に至った。

（１）配列番号：１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３７５塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（首）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｌ）起源：（Ａ）生物者　：Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉＸ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：　１．．３７５（Ｄ）他の情報　：／生成物＝“可変部領域軽鎖” ／ｌｌＪ準名＝”　ＹＦＣ５１，１，１”（ｉＸ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　：　ｗｉｓｅ、−ｓｉｇｎａｌ（Ｂ）存在位置　：１１．６０ Φ）他の情報　：／機能＝”シグナル配列”（ｉｘ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　：　ｗｉｓｅ−ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　１３０．　、１６２（Ｄ）他の情報　：／機能＝”ＣＤＲ１″（ｉｘ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　：　ｗｉｓｅ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　２０８．　、２２８（Ｄ）他の情報　：／機能＝“ＣＤＲ２”（ｉＸ）配列の特徴（Ａ）名称／記号　：　ｗｉｓｅ−ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　３２５．．３５１■）他の情報　：／機能＝“ＣＤＲ３”（ｘｌ）配列　：配列番号：１：Ｍｅｔ　入ｒｇ　ＶａＬ　ＧＬｎ　ＶａＬ　ＧＬｎ　Ｐｈｓ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　二ａｕ　Ｌｓｕ　τ；Ｐ　τ正　５ｕＧＬｙ　入１ａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＧＬｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｅ　ＧＬｒｒ　Ｓｓｒ　Ｐｒｏ　ｓ・ｅ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　ＡＬ■ ＾上ａ　ｓａｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　Ｓａｔ　ＶａＬ　５ａｒ　ｚニー　５ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　ＡＬａ　ｓｇａｒ　Ｌｙｓ　Ｓａ凵F 工Ｌｍ　Ｓａｔ　Ａｇｎ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ａ工１−τｆ　τｙｒＧ工ｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　＾１れＬｙｓ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＶａＬ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ＧＬｙ　Ｓｉｒτｈｒ　Ｌａｕ　ｋｒｑ　Ｓｍｒ　ＧＬｙ　ＸＬ会Ｐｒｏ　Ｓｅｒｋｒｑ　Ｐｈ＠５＠ｒ　ＧＬｙ　Ｓｉｒ　ＧＬｙ　５＊ｒ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅτｈｒ　Ｌ榔ｕ　Ｔｈｅ　ＸＬａ　Ａｒｇ＋１５　９０　９５ＡＡＣＣａＣＧＡＣ’　ＣＣ？　ＧＣＡ　ＧＡτ　Ｔ？Ｔ　ＧＣＡ　にＴＣτＡＣτＡＣ’！’ＣＴ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　τλτ　フλτ　コR６＾ｓｎ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ａｓｐ　ＰＭ　ＡＬＪＬ　ＶＪＬＬ　Ｔｙｒ　７７＝　Ｃｙｓ　ＧＬｎ　ＧＬｎ　Ｔｙｒ　τ７■ ＧＬｕ　ｋｒｑ　ＰｒＱ　’−ｍｕ　Ｔｈｅ　Ｐ＋’ｌ＠　ＧＬＹＳ＠ｔ　ＧＡＹτｈｒ　Ｌｙｅ　Ｌａｕ　ＧＬｕ（２）配列番号＝２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：１２５アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸ＣＤ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（Ｘｉ）配列　：配列番号＝２：Ｍ＊ｔ　ＪＬｒｇ　ＶａＬ　Ｇｉｎ　ＶａＬ　Ｇｉｎ　ＰＭ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｔｒｐτｈｒ　５＠ｒＧＬｙ　ＡＬａ　ＧＬｎ　Ｃａ１Ａｓｐ　ｖａｌＧｉｎ　Ｍａ＋：Ｔｈｅ　ＧＬｎ　５ｓｒ　Ｐｒｏ　Ｓａｔτｙｒ　Ｌｓ＋ｕ＾工１＾工ａ　５ａｒ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　Ｓａｔ　ＶａＬ　Ｓａｙ：　工Ｌｅａ　Ｓａｗ　Ｃｙｍ　Ｌｙｓ　入Ｌａ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　５≠■ ＸＬ＠　Ｓｉｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　入１１　τｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　ＧＬｒｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　ＡＬａ　＾５■ Ｌｙｓ　Ｌｗａ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　でｙｒ　にＩＹ　Ｓ＠！？　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　入ｒｑ　Ｓｓ「Ｇｌｙ　ｒｌｓ　Ｐｒａ−５ｅｘ６Ｓ　フσ　フ５　８０Ａｒｇ　Ｐｈ＠Ｓａｔ　ＧＬｙ　ｍｙ　ＧＬｙ　Ｓａｔ　ＧＬｙτｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅτｈｒ　Ｌａｕフｈｒ　ｒｌｓ　ｋｘｑＡｍｎ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｐｈｓ　Ａｌａ　ＶａＬτγ；τＹ＝　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　にＬｒ＋τＹττＹ：１００　：口５１１０ＣＬｕ　ｋｔｑ　？＝ロ　Ｌａｕ　Ｔ？、＝　Ｐｈｓ　ＧＬｙ　ｓｉｒ　ＧＡＹ　丁：、二　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　ＧＬｕ二二５　工２〇　二２５（３）配列番号：３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３３塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物基　：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃＪｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：１．．３３（Ｄ）他の情報　：／機能＝”ＣＤＲ１”（ｉＸ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：１．．３３（ｘｉ）配列　：配列番号：３：入ＡＧ　ＧＣＡ　λＧフ　入ＡＧ　ＡＧＣＡＴ？　ＡＧＣＡＡτ　τλτ　ττ λＧＣＣ３コ（４）配列番号：４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：１１アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（百）配列の種類　：タンパク質（ｘｉ）配列　：配列番号：４；Ｌｙｓ　ＡＬａ　Ｓｅｘ　ニーｙｓ　５＠？　！ｉｌｌ　Ｓａｔ　Ａｇｎτｙｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ１５工０（５）配列番号：５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：２１塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源二（Ａ）生物基　：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃ−ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：１．．２１（Ｄ）他の特徴　：／機能＝”ＣＤＲ２”（１ｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤＳ（Ｂ）存在位置　：１．．２１（Ｘｉ）配列　：配列番号：５：Ｔｙｒ　ＧＬｙ　Ｓ＠ｇ　？ｈｒ　Ｌ壷ｕ　ｋｒｑ　Ｓ＠ｘ（６）配列番号：６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　＝７アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（ｘｉ）配列　：配列番号：６：Ｔｙｒ　ＧＬｙ　５ｇ５ｔ　？ｈｒ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｔ（７）配列番号ニアの情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：２７塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（の鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物基　：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉＸ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃＪｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：１．．２７ ”　（Ｄ）他の特徴　：／機能＝“ＣＤＲ３”（１ｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：１．．２７（ｘｉ）配列　：配列番号＝７＝ＣＡＡＣλＧでＡＴ　？λＴ　ＣＡＡ　ＡＧＡ　ＣＣＣＣＴＣｋｃＧ　２：Ｇｉｎ　ＧＬｎ　Ｔｙｒ　Ｔｙ：　ＧＬｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕτｈ；（８）配列番号：８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：９アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（ｘＩ）配列　：配列番号：８：ＧＬｎ　Ｇ工ｒ１　Ｔｙｒ　ＴＹｒ　（Ｌｕ　入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　τｈｒ（９）配列番号：９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４１７塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（の鎖の数　：二本鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物基　：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ＩＸ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：　１．．４１７（Ｄ）他の情報　：／生成物＝“シグナル配列を有するＨ鎖可変部領域” ：／標準名＝　’　ＹＦＣ５１，１，１（ｉＸ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃ　ｓｉｇｎａｌ（Ｂ）存在位置　：１．．５７（Ｄ）他の情報　：／機能＝”シグナル配列″（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃＪｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　１４８．．１６２（Ｄ）池の情報　：／機能＝”ＣＤＳ　ｌ″（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃＪｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　２０５．．２５５（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｗｉｓｅ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　３５２．．３８４（ｘｌ）配列　：配列番号：９：Ｍｔ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｉｒ　Ｔｒｐ　！Ｌ＠　Ｍｎ　Ｌａｕ　Ｐｈ＊　Ｌａｕ　Ｍｅｔ　ＡＬａ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙＶａＬ　ＴＹｒ　Ａｌａ　ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　ＧＬｎ　Ｇｉｎ　５ｅｒ　Ｇ１７　：ｌｒ＊　ＧＬｕ　Ｌａｕ　ａｒｇ　入ｒX Ｐｒｏ　ＧＬｙ　Ｓｅｔ　Ｓ＠ｒ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　５ａｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　τｈｒ　Ｓａｒ：　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　５ａｒ　ｒＬ■ ユ５　４０　４５Ｌｙｓ　入ｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　ＨＬｓ　Ｔｒｐ　ｖａ上　Ｌｙｓ　ＨＬｓ　Ａｒｇ　？ｒり　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＬａｕＧＬｕ　Ｔｒｐ　ＸＬｅＧλｙ　Ｔｒｐ　Ｘｉｓ　ｕｐ　Ｉ’ｒａ　Ｇｌｕ　Ｍｐ　ＧＬｙ　ＧＬｕでｈｒ　Ｌｙｔ、Ｔｙｒ　ＧｌｙＧｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＊　ｃ工ｎ　５＠Ｌ”　ｋｒｑ　Ａ工１τｈｒ　Ｌ＊ｕτｈｒ＾工ａ　Ａｓｐτｈｒ　Ｓａｔ　Ｓａｙ：　Ａ＊ｎａｓ　９０　９５＾ＧＡ　ＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡ　ＣＴＣＡＧＣＡＧＣ（ＴＧ　Ａｃｔ：　τ Ｃ）　ＧＡＣＧＡＣＡＣＡ　ＧＣＡ　ＡＣＣコニ６τｈｒ　ＡＬａ　Ｔｙｒ　Ｍ・ｔ　ＧＬｎ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｓａｔ　Ｌｓｕ　τｈｒ　Ｓｓｒ　ＮＩＰ　＾ｓｐ　τｈ；　ＡＬａ　丁ｈｒ工０ロ　１０５　１１０ τＡτ　τフτ　τＣ？　ＡＣＴ　ＡＧＡ　ＧＧＣＧ入＾　τ入τ　Ａ（：Ａ　ＴＡＣ入ＡＣτＣＣ）ＧＧ　ＴフτＧλτ　ＴＡＣコ８４τＣＧ　ＧＧＣＣＡＡ　ＧＧＣＡＣＴ　ＣＴＣＣＴＣＡＣＴ　Ｇフｃ　τｃフ　τＣＡ　Ｇ７τ：ｐ　ＧＬｙ　Ｇよｎ　Ｇ’、ｙτｈｒ　Ｌａｕ　Ｖａｎフ？、ｒ　ＶａＬ　Ｓｕｒ　Ｓａｔエコロ　ニコ５（１０）配列番号：１ｏの情報（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　＝１３９アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（ｘｉ）配列　：配列番号：１ｏ：Ｑｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＧＬｙ　Ｇｌｕτｙ＝　ＡｒｇτＹｒ＾ｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔ＝ｐ　Ｐｈｅ　ＭｐτＹ；（１１）配列番号：１１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：１５塩基対（Ｂ）配列の璽　：核酸（Ｃ）鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｖｉ）起２１！：（Ａ）生物基　：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｗｉｓｅ−ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：　１．．１５（Ｄ）他の情報　：／機能＝”ＣＤＲ１″（ｉＸ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：　１．．１５（ｘｉ）配列　：配列番号＝１１：ＧＡＴ　ＴＡＣＣＴ？　（Ｔｅｌ：　ＣＡＣＡｓｐ　Ｔアｒ　Ｌａｕ　Ｌｍ。９４．　”（１２）配列番号：１２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：５アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（ｘｉ）配列　：配列番号：１２：入−ｐ　τ７＝　＋＋ａｕ　Ｌａｕ　Ｈｈｓ（１３）配列番号：１３の情報（ｉ）配列の特徴：（４へ）配列の長さ　：５１塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（１１）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｌ）起源：（Ａ）生物基　：　Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃＪｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位１　：　１．．５１（Ｄ）他の情報　：／機能＝”ＣＤＲ２”（１ｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：１．．５１（Ｘｉ）配列　：配列番号＝１３： ’：’ＣＧ　ＡＴ？　ＧＡＴ　ＣＣ”ｌ：　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　Ｇ入＾　ＡＣλ　入λＧ　τλ：　ＣＧＴ　ＧＡＧ　入ＡＧ　フフフ@Ｃλ＾　４８ τｑ！Ｌ・　Ａｓｐ　？＝ロ　ＧＬｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｙ　ＧＬｕ　？！’ｊ　ＬＹｌｌ　τｙ：　ＧＬｙ　ＧＬｒ、Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＧＬｉ−ロ　−５ λＧＣ５・；（１４）配列番号：１４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：１７アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（ｘｉ）配列　：配列番号：１４：（１５）配列番号：１５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３３塩基対（Ｂ）配列の型　：核酸（の鎖の数　コニ重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物基　：Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ｍ１ｓｃＪｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置　：１．．３３（Ｄ）他の情報　：／機能＝”ＣＤＲ３”（１ｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／記号　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置　：１．．３３（ｘｌ）配列　：配列番号：１５：ｃａｃｃλλ　τλτ　入Ｇλ　でλＣ入ＡＣτＣＧ　τりＧ　τフッ　Ｇλτ 　：Ａｃ　ココＧＬｙ　ＧＬｕτｙ：　ｋｘｑ　Ｔｙ＝＾ａｎ　ｓｉｒ　？りＰｈ＊＾ｓｖ　）：（１６）配列番号：１６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：１１アミノ酸（Ｂ）配列の型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：タンパク質（ｘｉ）配列　ご配列番号：１６：ＧＬｙ　ＧＬｕτｙｒ　Ａｒｇτｙｒ　Ａｓｎ　５ｓｒ　？Ｆｐ　？ｈ＠＾ｓｐ τ７；（１７）配列番号：１７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：２０塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（１１）配列の種類　：ｃＤＮＡ（ｉ目）ハイボテティカル　：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス　：Ｎｏ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名　：　Ｒａｔｅｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｘｉ）配列　：配列番号：１７：ＡＧτｃｃλτλＧＡ　ＣＸＧλでｃｃｃｃｃ　”口（１８）配列番号：１８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　＝３０塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボデディカル　：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス　＝ＮＯ（Ｘｉ）配列　：配列番号：１８：（１９）配列番号：１９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４３塩基（Ｂ）配列の型　：核酸ＣＣ）鎖の数　ニー重鎖 ■）トポコシ−：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎ　○ （ｉＶ）アンチセンス　：ＹＥＳ（Ｘｉ）配列　：配列番号：１９：ＧＣＴ入入五人入Ａτ　τｃｃ？入入τ五人？　Ｃτフ入Ｃτ〒Ｇｃ？　τ丁ＡＣＡＧＧτＧλ　フロσ　４コ（２０）配列番号：２０の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４３塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　Ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス　：ＮＯ（、ｉ）配列　：配列番号：２０：ＡＧＡＧＣ入フτ入ｃｃλλ：フＡτフフＡ　ＧＣＣτｃ＝λＣＣλｃｃλＧ入 λＧＣＣＡＧＯ４ユ（２１）配列番号：２１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４１塩基（Ｂ）配列ので　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス　：ＹＥＳ（Ｘｉ）配列　：配列番号：２１： λＧＡτＣＣＣＡＡＡ　Ｇ？：ＧｋＣＣＣ；％Ｔ　ＡＧ”、ＡＧＡＴＣＡＧ　ＣＡＧＣτττＣＧＡ　Ｇ　４１（２２）配列番号：２２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４１塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉンハイボテティカル　：Ｎｏ（１ｖ）アンチセンス　：Ｎ。

（Ｘｉ）配列　：配列番号：２２：（２３）配列番号二２３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　＝４７塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（１１）配列の種類　：　ｓ　ＳＤＮＡ（山）ハイボテティカル　：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス　：ＹＥＳｏｌ）配列　：配列番号：２３：ｃｃ？ｃｘｃｃｃａフ　ｒττＣＡＴＡＡＴ　ＡＣＴＩ：フッｃｓｃλ　Ｃフλ Ｃフλｃｃ７Ｇ　ＣＣＣλ：Ｃフ　４７（２４）配列番号：２４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４７塩基（Ｂ）配列の璽　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス　：Ｎ。

（Ｘｉ）配列　：配列番号：２４：（２５）配列番号：２５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　＝３０塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎｏ（Ｉ■）アンチセンス　：ＹＥＳ（ｘｌ）配列　：配列番号：２５：ＧＡＴＣλλＧＣ？’：　ＣフＭＣＡＣ？ＣＴ　ＣＣＣｌ：”ｉ、−ＧＡ　３０（２６）配列番号：２６の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３１塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡへり配列　：配列番号：２６：フＣＣａλ丁ＣＧλτ　Ｃ入ＡＧＣフｉτ＾Ｃ＾Ｇτフ入ＣフＧ入ＧＣ３ユ（２７）配列番号：２７の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３６塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（の鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス　：ＹＥＳ（、ｉ）配列　：配列番号：２７：ＣフＣＣＡＧＡＡＧＣ’：’ＡＡ？Ｃ１：ＧＴ；Ａ　ＡＧＧＴＣＡＡＧＣ：　ＡＣＡＣＡＣコロ（２８）配列番号：２８の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３６塩基（Ｂ）配列の壓　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　：Ｎｏ（ｉｖ）アンチセンス　：Ｎｏ（ｘｉ）配列　：配列番号：２８：ＧＡＴＴＡＣＣ？”ＣＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴ　ＣＡＧＡＣＡＧＣＣ！　ＣＣＴＧＧＡ　コロ（２９）配列番号：２９の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：５４塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス　：ＹＥＳ（ｘｉ）配列　：配列番号：２９：ＡＴＡＣτττσττ　τロλＣ：Ａ”；ＣＣτ　ｃ、ｔＣａλ：Ｃ入＾τ　ＣロＡ？Ｃロλ＾τＣＣλＣτ；λＡＧλＣＣフＣＣ；　５４（３０）配列番号：３０の情報（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　＝５４塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　二Ｎ０（ｘｉ）配列　：配列番号：３０：ＧＧＴＧＡＭＣＡＡ　ＡＧＴＡＴＣＧＴＣＡ　ＧＡＡＧＴＴＴＣＪＡ　ＡＧ（ＪＬＧＡＧ’１ｍＡ　ＣＡＡτＧＣＴＧＧＴ　ＡＧＡＣ５４（３１）配列番号：３１の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４５塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（の鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　二ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　＝Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス　：ＹＥＳ（Ｘｉ）配列　：配列番号＝３１：ＣＣＡＣＣλＧ：τＣ：λ？ＣフＡ’：’ＡＴフ　ＣＧＣＣフＣτフ（：ＣＡＣ入＾τ入＾丁λＧ　ＡＣＣＣ（：　４５（３２）配列番号：３２の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：５４塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖 ■）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　Ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス　二Ｎ０（Ｘｉ）配列　：配列番号：３２：ＡＧＡＴＡｃＡＡＣ？　ＣにＴＷｅＡ　τ丁ＡＣτｃｃｃｃτ　ＣＡＡＧＧＣτ ＣλＣ丁λＧτＣＡＣＡＣｔ　ＣフＣＣ５４（３３）配列番号＝３３の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３６塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖 ■）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス　：ＹＥＳ（ｘｉ）配列　：配列番号：３３：フＡＧＡＣ−，ＣＣ？：　ＡＧＣＧＡＡＴ？ＣＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＧ　；ｕＧＧＴＧ　３６特表平６−５ｏ６−５ｏ　（１７）（３４）配列番号：３４の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４８塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（Ｃ）鎖の数　ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　：直鎖状（首）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス　＝ＮＯ（ｘｉ）配列　：配列番号：３４：ｃｃ’ｒｃ口：ＣＣＴ”：　ＴＴＭＧＣＴＴＴＧ　ＧにＧ”ｌ”ＣＡＡＧにＣＴＣＪＣＴＡＧＴＣＡ　ＣＡＧＴｒＣＣ４ｇ（３５）配列番号：３５の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：３３塩基（Ｂ）配列の型　：核酸（の鎖の数　ニー重鎖 ■）トポロジー　：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　：　ｓ　５ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボテティカル　二Ｎ０（ｉＶ）アンチセンス　：ＹＥＳ（ｘｉ）配列　：配列番号：３５：国際調査報告　ＰＣＴ／Ｇ８９２１０１２８９、　、−ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０１２ｇ９フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０／／（Ｃ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｒ１：１９）　７８０４−４Ｂ（７２）発明者　ワルドマン、バーマンイギリス国、シービー２・１キユーピー、ケンブリッジシャー、ケンブリッジ、テニスコート・ロード（番地なし）、デパートメント・オス・パソロジー、ザ・ユニバージティー・オス・ケンブリッジ内Ｉ（７２）発明者　シムス、マーチンイギリス国、ピーアール３・３ビーニス、ケント、ベラケンハム、ラングレイ・コート（番地なし）、ザ・ウェルカム・ファウンデーション・リミテッド内（７２）発明者　クロー、スコツトイギリス国、ピーアール３・３ビーニス、ケント、ベラケンハム、ラングレイ・コート（番地なし）、ザ・ウェルカム・ファウンデーション・リミテッド内

Claims

【特許請求の範囲】

１．抗体がヒトＣＤ−１８抗原に結合し得るに十分な、下記の各ＣＤＲのアミノ酸配列を具備するヒト化抗体。軽鎖：ＣＤＲ１（配列番号３および４）ＣＤＲ２（配列番号５および５）ＣＤＲ３（配列番号７および８）重鎖：ＣＤＲ１（配列番号１１および１２）ＣＤＲ２（配列番号１３および１４）ＣＤＲ３（配列番号１５および１６）
２．軽鎖の可変ドメインフレームワークがタンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワークであるか、もしくはそれと実質的に相同である請求の範囲第１項記載の抗体。
３．重鎖の可変ドメインフレームワークがタンパクＮＥＷＭの可変ドメインフレームワークであるか、もしくはそれと実質的に相同である請求の範囲第１項または第２項記載の抗体。
４．ＣＤＲが、請求の範囲第１項において特定される軽鎖ＣＤＲ１ないし３および重鎖ＣＤＲ１ないし３である請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の抗体。
５．請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載されるヒト化抗体の調製方法であって、（ｉ）ヒト化抗体の軽鎖をコードする第１発現ベクターおよびヒト化抗体の重鎖をコードする第２発現ベクター；または（ｉｉ）ヒト化抗体の軽鎖および重鎖の両方をコードする単一の発現ベクター；のいずれかを用いてホストを形質転換し、該ホストを各鎖が発現する条件下に維持し、並びに発現した鎖の集合体により産生されるヒト化抗体を単離することを具備する方法。
６．抗体がヒトＣＤ−１８抗原に結合し得るに十分な、下記の各ＣＤＲのアミノ酸配列を具備するヒト化抗体をコードするＤＮＡ分子。軽鎖：ＣＤＲ１（配列番号３および４）ＣＤＲ２（配列番号５および６）ＣＤＲ３（配列番号７および８）重鎖：ＣＤＲ１（配列番号１１および１２）ＣＤＲ２（配列番号１３および１４）ＣＤＲ３（配列番号１５および１６）
７．軽鎖の可変ドメインフレームワークがタンパクＲＥＩの可変ドメインフレームワークであるか、もしくはそれと実質的に相同である請求の範囲第６項記載のＤＮＡ分子。
８．重鎖の可変ドメインフレームワークがタンパクＮＥＷＭの可変ドメインフレームワークであるか、もしくはそれと実質的に相同である請求の範囲第６項または第７項記載のＤＮＡ分子。
９．ＣＤＲが、請求の範囲第６項において特定される軽鎖ＣＤＲ１ないし３および重鎖ＣＤＲ１ないし３である請求の範囲第６項ないし第８項のいずれか１項に記載の抗体。
１０．発現ベクターの形態にある請求の範囲第６項ないし第９項のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
１１．請求の範囲第１０項記載の発現ベクターで形質転換されたホスト。
１２．薬剤学的に許容し得る担体もしくは希釈剤および、活性成分として、請求の範囲第１項ないし第４項に定義されるヒト化抗体を包含する医薬組成物。