DD273839A5 - Verfahren zur herstellung neuer insulinderivate - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Insulinderivate. Erfindungsgemaess werden Verbindungen der Formel (I) hergestellt,A(1-3)E1A(5-6)CysA(8-16)E2A(18-19)CysW(A-Kette) SS SS(I) B(1-6)CysB(8-12)E3B(14-18)Cys (B-Kette)RZnYmLysProXB(26-22)E4Glyworin beispielsweise bedeuten: A und B mit Ziffern in Klammern die Peptidfragmente der A- und B-Ketten, die durch die Ziffern in den Klammern benannt werden, E1, E2, E3, E4 gleich oder verschieden einen Glutaminsaeurerest u. a.; X einen L-Threonin, L-Argininrest u. a.; Y und Z gleich oder verschieden einen Aminosaeurerest, in dem jede Seitenketteaminogruppe acyliert sein kann u. a.; m und n 0 oder 1, R einen Hydroxyl-, Amid- oder Esterrest, W einen Aminosaeurerest u. a.: Injizierbare Loesungen mit verlaengerter Insulinwirkung werden hergestellt, indem eine Loesung einer Verbindung der Formel I, die gegebenenfalls Zink enthaelt, mit einer Loesung von Zink vermischt wird, die gegebenenfalls eine Verbindung der Formel (I) enthaelt, so dass ein Gemisch hergestellt wird, das eine Zinkkonzentration von bis zu 2 mg/ml enthaelt, und wobei der Gehalt an Zink in jeder der beiden Loesungen vorzugsweise weniger als ungefaehr 4 mg/ml betraegt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Insulinderivate.
Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen werden angewandt als Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes.
Bei der Behandlung von Diabetes mellitus wurden verschiedene Insulin-Präparationen vorgeschlagen und verwendet. Einige dieser Präparationen wirken schnell, und andere Präparationen haben eine mehr oder weniger verlängerte Wirkung. Eine solche verlängerte Wirkung kann dadurch erhalten werden, daß das Insulin als eine Suspension von Insulinkristallen verabreicht wird. Die kristallinen Piäperationen können durch Kristallisation von Insulin in Gegenwart von Zink (z.B. Lente™, sieh»?: Schlichtkrull, Insulin Crystals, Chemical and Biological Studies on Insulin Crystals and Insulin Zinc Suspensions, Munksgaard, 1958) oder durch Kristallisation von Insulin in Gegenwart von Zink und Protamin (z.B. NPH-Insulin, siehe: Rep. Steno Mem. Hosp. 1 [1946], 60) erhalten werden.
Ein Nachtoil bei der Verwendung der bekannten Suspensionen der 2'ink-lnsulin-Kristalle oder des Zink-Protamin-Insulins ist die Notwendigkeit, die Ampulle zu schütteln, um sicherzustellen, daß di 3 richtige Menge Insulin injiziert wird, und um sicherzustellen, daß die Konzentration des Insulins in der Ampulle während ihrer Verwendung konswit bleibt. In Penfill™-Patronen, bei denen Luft ausgeschlossen werden muß, wird bei den Insulin-Suspensionen mit verlängerter Wirkung die Einarbeitung eines festen Körpers in die Patronen notwendig, um eine Durchmischung möglich zu machen. Das Schütteln von Insulin-Suspensionen und Insulin-Lösungen mit Luft ist an sich ein unerwünschter Vorgang, da Insulin dazu tendiert, an Wasser-Luft-Grenzflächen unter Bildung von Fibrillen zu denaturieren. Folglich ist die Herstellung von Insulin-Lösungen mit verlängerter Wirkung erwünscht.
Lösungen von Insulin-Derivaten mit verlängerter Wirkung wurden aus Insulin erhalten, das in seinen Aminogruppen durch Umsetzung mit Phenylisocyanat modifiziert worden war (sogenanntes Isoinsulin, siehe: Hallas-Moeller, Chemical and Biological Insulin Studies Based Upon the Reaction Between Insulin and Phenylisocyanate, Copenhagen, 1945). Gleichfalls wurde berichtet, daß A1, B29-di-Bocsubstituiertes Insulin (Boc bedeutet eine tertiäre Butyloxycarbonylgruppe) nach der subcutanen Verabreichung eine verlängerte Insulinwirkung aufweist (siehe Geiger & Enzmann in: Proinsulin, Insulin, C-Peptide: Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima, 1978; Amsterdam-Oxford, 1979,306-310). Es wurde festgestellt, daß das A1, B 29-di-Boc-substituierte Insulin eine zu wenig verlängerte Wirkung aufweist, um von klinischem Nutzen zu sein.
Lösungen unmodifizierter Insuline erfordern große Mengen an Zinkionen (z. B. 0,4 bis 1 mg/U Insulin), um verlängert wirksam zu sein (siehe: J. Pharmacol. 55 [1935], 206). Die Injektion solch großer Dosen an Zinkionen wird möglicherweise Schmerz hervorrufen, so daß solche Lösungen niemals in der Therapie angewendet worden sind.
Der isoelektrische Punkt des Insulins beträgt ungefähr 5,5, und es wurden Versuche unternommen, die Löslichkeit von Insulinderivaten bei neutralem pH-Wert dauurch zu erniedrigen, daß der isoelektrische Punkt nach oben verschoben wird, z. B. durch Addition einer basischen Aminosäure wie Lysin oder Arginin (siehe z. B. DE-OS 2.042.299) oder des basischen Dipeptide Arginyl-arginin (siehe Geiger & Enzmann, Zitat wie oben) am N-Terminus der B-Kette. Nahe seines isoelektrischen Punktes war die Löslichkeit von ArgB(""-ArgB0-lnsulin jedoch viel größer als die des Stamminsulins.
Die Japanische Patentanmeldung Nr.55-144.032 bezieht sich auf Humaninsulin-Analoge, in denen die B30-Aminosäure durch eine Aminosäure mit wenigstens fünf Kohlenstoffatomen sowie Amiden und Estern davon ersetzt worden ist. Diese Insulin-Analoga wurden bei Patienten angewendet, die Antikörper gegen Insuline von Säugetieren gebildet hatten. In der Japanischen Patentanmeldung werden sechs spezielle Verbindungen beschrieben, von denen jedoch keine mit verlängerter Wirkung eingeschätzt wurde. In der Japanischen Patentanmeldung werden auch keine speziellen, injizierbaren Präparationen beschrieben.
Die EP-Patentanmeldung Nr. 84108442.9 bezieht sich auf Insulin-Analoga, in denen an die B30-Aminosäure eine basische, organische Gruppe gebunden ist, wodurch bei neutralem pH-Wert eine positive Ladung eingeführt wird. In diesen Insulin-Analoga ist die B -iO-Aminosäure neutral und vorzugsweise Threonin wie im Humaninsulin. Die DE-Patentanmeldung 3.327.709.5 bezieht sich auf e ne Suspension von Kristallen der Derivate, die in der oben genannten Europäischen Patentanmeldung beschrieben sino, sowie auf eine aromatische Hydroxylverbindung. Die DE-Patentanmeldung 3.326.473.2 bezieht sich auf ein Medikament, das ein Gemisch von Insulin-Verbindungen enthält, von denen wenigstens eine in der oben genannten Europäischen Patentanmeldungen beschrieben ist.
Die EP-PS Nr. 194.864 mit der beanspruchten Priorität vom 12. März 1985 bezieht sich auf Insulin-Derivate, in denen der B 30-Rest des C-Terminals immer durch eine Amid- oder Estergruppe blockiert ist und in denen die A 21 -Aminosäure immer Asparagin ist, wie es im Humüninsulin der Fall ist.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Insulin-Verbindungen und neuer injizierbarer Lösungen mit verlängerter Wirkungsdauer.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Insulin-Derivate mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie injizierbare Lösungen aufzufinden.
Erfindungsgemäß werden neue Analoga des Humaninsulins zur Verfügung gestellt, die sich vom Humaninsulin durch folgende Merkmale unterscheiden:
a) gegebenenfalls Anwesenheit eines Amid- oder Esterrestes an der Carbonylgruppe des C-Terminals der B-Keite;
b) Vorhandensein von wenigstens einer Ladung mehr als Humaninsulin bei pH = 7, vorzugsweise mahr als 4 Ladungen mehr als Humaninsulin bei pH = 7;
c) der Asparaginrest des C-Terminals der Α-Kette, AsnA2), kann durch eine andere, natürlich vorkommende Aminosäure substituiert sein, die für eine Nucleotidsequenz kodiert;
d) wenn die Veränderung in der Ladung durch die Blockierung der Carbonsäuregruppe der B30-Aminosäure erzielt wird, ist der A21-Aminosäurerest von einem Asparaginrest verschieden.
Die Veränderung in der Ladung wird durch Substitution eines oder mehrerer Aminosäurereste im Vergleich zum HumaninE jlin, und, we in es gewünscht wird, durch die Blockierung der Carbonsäuregruppe in der B 30-Aminosäure erzielt. Speziell können die Verbindungen, die für die praktische Ausführung dieser Erfindung interessant sind, wie folgt charakterisiert werden: Einer oder mehrere der vier Glutaminsäurereste bei A4, A17, B13 und B21 werden durch einen anderen, natürlich vorkommenden Aminosäurerest ersetzt, vorzugsweise durch einen Glutaminsäurerest, und/oder der Threoninrest bei B 27 wird durch einen natürlich vorkommenden, basischen Aminosäurerest, vorzugsweise einen L-Arginin- oder L-Lysinrest, ersetzt, und/oder der Threoninrest bei B 30 wird durch einen oder zwei basische Aminosäurereste ersetzt, wobei ein Rest bevorzugt wird, die Carbonsäuregruppe des C-Terminals in der B-Kette kann geschützt sein, und der Asparaginrest bei A21 kann durch einen L-Aminosäurerest substituiert sein. Durch die Erfindung werden weiterhin Lösungen der unten aufgefüh.ien Verbindungen der Formel I zur Verfugung gestellt, die gegebenenfalls einen eingestellten Gehalt an Zinkionen enthalten. Der Grad der Verlängert, ng der Insulinwirkung wird dadurch verstärkt und gesteuert
Genaue Ausführung des erfindungsgemäßens Verfahrens
Überraschenderweise wurde gefunden, daß injizierbare Lösungen mit einer kombinierten kurzzeitigen und verlängerten Insulinwirkung dadurch hergestellt werden können, daß als aktiver Bestandteil ein einziges Insulinderivat der allgemeinen Formel I verwendet wird:
(A-Kette)
<B-Kette>
worin die Buchstaben A und B mit daran anschließenden Zahlen in Klammern die Peptidfragmente der A- bzw. B-Kette bezeichnen, die durch die Ziffen in den Klammern bezeichnet sind, E', E2, E3 und E*, die gleich oder verschieden sein können, jeweils einen Glutaminsäurerest oder den Rest einer neutralen Aminosäure, der für Nucleotidsequenzen kodiert, darstellt, X einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysinrest bedeutet, Y und Z, die gleich oder verschieden voneinander sein können, einen Aminosäurerest darstellen, in dem jede Aminogruppe an der Seitenkette acyliert sein kenn, m und n, die gleich oder verschieden sein können, jeweils O oder 1 bedeuten, R einen Hydroxy-, Amido- oder Esterrest bedeutet, der die Carbonsäuregruppe des C-Terminus der 8-Kette blockiert, und W einen Aminosäurerest bedeutet, unter der Voraussetzung, daß, wenn W ein Asparaginrest bedeutet, R eine Hydroxylgruppe ist, und, wenn W ein Asparginrest ist, sowohl X als auch -Ym-Zn-R ein Threoninrest bedeuten, und E3 gin Glutaminrest ist, nicht alle drei E1, E2 und E4 Glutaminsäureraste sind, und unter der weiteren Voraussetzung, daß wenigstens einer der sechs Aminosäurereste E1, E2, E3, E4, W und X sich von dem Aminosäurerest unterscheidet, der an den entsprechenden Positionen im Humaninsulin anwesend ist, und daß wenigstens einer der acht Aminosäurereste E1, E2, E3, E4, W, X, Y und Z und die Gruppe R so gewählt werden, daß die Verbindung der Formel I wenigstens eine Ladung mehr aufweist als Humaninsulin bei einem pH-Wert von 7.
Eine Untersuchung von Verbindungen der Formel I ist neu, nämlich Verbindungen der allgemeinen Formel I, worin die Buchstaben A und B mit anschließenden Zahlen in Klammern die Peptidfragmente der A- bzw. B-Kette bezeichnen, die durch die in Klammern angefügten Zahlen bezeichnet werden, E', E2, E3 und E4, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils einen Glutaminsäurerest oder den Rest einer neutralen Aminosäure, die für eine Nucleotidsequenz kodiert, bedeuten, X einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysin-Rest bedeutet, Y und Z, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils einen Aminosäurerest bedeuten, in dem jede an einer Seitengrupra vorhandene Aniinogruppe acyliert sein kann und in dem jede an einer Seitenkette befindliche Hydroxylgruppe alkyliert sein kann, m und n, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils O oder 1 bedeuten, R einen Amid- oder Ester-Rest, der die Carboxylgruppe des C-Terminus blockiert, bedeutet und W von einem Asparaginrest verschieden ist.
Im Vergleich zu Humaninsulin wird die Veränderung der Ladung dadurch erreicht, daß der Threoninrest in der B27-Position durch einen Arginin-oc ar Lysin-Rest substituiert wird und/oder daß einer der vier Glutaminsäurereste in der A4-, A17-, B13-und B 21 -Position durch einen neutralen Aminosüurercst, vorzugsweise durch einen Glutaminrest, substituiert wird. Zusätzlich dazu kann die Carbonsäuregruppe am C-Terminus der B-Kette durch eine Estergruppe oder eine Amidgruppe blockiert werden, wodurch die negative Ladung der Carbonsäuregruppe beseitigt wird. Weiterhin kann eine positive Ladung dadurch eingeführt werden, daß ein basischer Aminosäurerest in der B30-und/oder B31-Position eingeführt wird.
Da die Verbindungen der Formel I in der Klinik als Lösungen mit verlängerter Wirkung verwendet werden können, kann eine Verminderung der Immunogenität im Vergleich 2u den üblicherweise verwendeten Suspensionen von Porcin oder Humaninsulinen eingetreten. Das Ausmaß der Verlängerung der Wirkung kann durch die Zugabe von Zinkionen verstärkt und gesteuert werden.
Hauptsächliche Parameter, die das Ausmaß der Verlängerung der Insulinwirkung steuern, sind die Konzentration an Zinkionen und die Auswahl der Verbindung der Formel I. Der Bereich für den bevorzugten Gehalt an Zinkionen iiegt zwischen 0 und ungefähr 2 mg/ml, vorzugsweise zwischen 0 und 200^g/ml Zinkionen bei einer Substitution in dor B13- und/oder B27-Position und vorzugsweise zwischen 20 und 200pg/ml bei anderen Analoga in einer Präparation, die 240nmol einer Verbindung der Formel I je ml enthält. Bei Verwendung anderer Konzentrationen der Verbindung der Formel I muß der Gehalt an Zinkionen entsprechend eingestellt werden.
Die verlängerte Wirkung der Lösungen von Verbindungen der Formel I in Gegenwart von Zinkionen wird der schlechten Löslichkeit solcher Verbindungen bei neutralem pH-Wert zugeschrieben.
Der pH-Wert der erfindungsgemäßen, injizierbaren Lösungen sollte vorzugsweise unterfKiO des physiologischen pH-Wertes liegen; der obere Grenzwert ist der pH-Wert, bei dem die Fällung einsetzt. Beim physiologischen pH-Wert weisen die erfinduiigsgemäßen Verbindungen der Formel I eine niedrige Löslichkeit auf. Stabile Lösungen, die ungefähr 240nmol der Verbindung der Formel I je ml enthalten, wurden bei einem pH-Wert von ungefähr 5,5 erhalten. Der obere Grenzwert hängt von den Bestandteilen der Lösung ab, d. h. vom Isotonikum, Schutzmitteln und von der Zinkionenkonzentration, und von der Auswahl der Vorbindung der Formel I. Es gibt keine untere Grenze des pH-Wertes der Lösungen, und die chemische Stabilität der Verbindungen der Formel I, in denen sich W von Asparagin unterscheidet, ist hoch, sogar bei einem pH-Wert von 3. Der bevorzugte pH-Wert-Bereich für injizierbare Lösungen nach dieser Erfindung liegt/wischen ungefähr 2,5 bis 8,5 und bevorzugter zwischen ungefähr 4,5 und 3. Besonders bevorzugt ist der pH-Wert-Bereich zwischen ungefähr 2,5 und 5,5 und am meisten bevorzugt der Bereich zwischen 3 und 4,5.
Ein weiterer Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine verbesserte Einstellbarkeit für die Patienten. Mit zwei wäßrigen Lösungen, von denen die eine eine Verbindung der Foimull und die andere ein Zinksalz enthält, kann beim Patienten ein gewünschtes Maß an verlängerter Wirkung und ein gewünschtes Profil durch Vermischen der beiden Lösungen auf entsprechende Art und Weise eingestellt werden. Somit hat der Patient, bei Verwendung dieser zwei Vorratslösungen, die Möglichkeit der Wahl einer Wirkung und eines Profils für die morgendliche Injektion und einer anderen Wirkung und eines anderen Profils für die abendliche Injektion. Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Lösung des Zinksalzes zwischen ungefähr 2 pg und 20 mg Zink je ml. Als Alternative dazu können beide Vorratslösungen Zinkionen enthalten, entweder mit gleicher oder unterschiedlicher Konzentration, und/oder beide Vorratslösungen können eine Verbindung der Formel I enthalten, entweder die gleiche oder unterschiedliche Verbindungen.
Vorzugsweise haben die erfindur.gsgerriäßen injizierbaren Lösungen eine Konzentration zwischen ungefähr 60 und 6000nmol der Verbindung der Formel I je ml.
Wenn VV nicht L-Asparagin bedeutet, kann es eine neutrale L-Aminosäure soin, z. B. Valin, Glutamin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin oder vorzugsweise Glycin, Serin, Threonin, Alanin oder Homoserin. W kann eine saure Aminosäure darstellen, nämlich Glutaminsäure oder vorzugsweise Asparaginsäure, oder eine basische Aminosäure, nämlich Lysin, Arginin oder vorzugsweise Histidin.
Dio ..rutrale Aminosäure (E1 bis E4) ist z.B. Glycin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Methionin oder vorzugsweise Asparagin, Glutamin, Alanin, Serin oder Threonin.
Beispiele für R sind Estergruppen, z.B. niedere Alkoxygruppen, vorzugsweise Methoxy- und Ethoxygruppen, und am meisten bevorzugt tertiäre Butoxygruppen.
Weiterhin kam. R eins Gruppe der allgemeinen Formel -NR1R2 bedeuten, worin R1 und R2 gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten. Hier und im folgenden bezeichnet der Begriff „niedere" eine in Frage kommende Gruppe, die weniger als 7 Kohlenstoffatome, vorzugsweise weniger als 5 Kohlenstoffatome, enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutet R -NH2. Weiterhin kann R einen Laciamrest darstellen, der vorzugsweise weniger als 8 Atome im Lactamring enthält, z. B. ein Lactam einer Diaminocarbonsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform des orfindungsgemäßen Verfahrens ist R ungeladen.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Aminosäurereste, die mit Y und Z bezeichnet sind, Rsste von L-Aminosäuren, die für Nucleotidsequenzen kodieren.
Jede Aminogruppe an einer Seitenkette in den Aminosäureresten, die mit Y und Z bezeichnet sind, kann durch eine Säure mit 2 bis 18 Kohlenstoffatomen acyliert sein, vorzugsweise durch eine Fettsäure mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen, z. B. durch Laurinsäure. Folglich kann durch -Y1n-Zn-R die Gruppierung -Lys(Lau)-NH2 dargestellt sein.
Beispiele für bevorzugte alkylierte Hydroxylgruppen sind Methoxy-, Ethoxy- und tert-Butoxygruppen.
In einer Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I bedeuten Y und/oder Z einen basischen Aminosäurerest, bei dem die Aminogruppe der Seitenkette gegebenenfalls acyliert ist (m = 1). In einer anderen Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I sind η gleich 0 und Yeinbasischei Aminosäurerest (m = 1). In einoi weiteren Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I sind Y und Z beides basische Aminosäurereste (m = 1,n = 1). Eine andere bevorzugte Ausführurigsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bezieht sich auf Präparationen, die eine Verbindung der Formel I enthalten, worin E1, E?, E3 und/oder E* einen Glutaminrest bedeuten, und/oder X Lys oder Arg darstellt und W GIy, Ser, Thr, Ala, His, Asp oder hSer ist.
Innerhalb dieser Unterklasse von Verbindungen der Formel I sind weitere bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Ven-hrens Präparationen, die eine Verbindung der Formel I enthalten, worin die Gruppierung -Yn,-Zn-R entweder-Thr-NH2 oder-LyS-NH2 bedeutet.
Spezielle bevorzugte Verbindungen der Forme! I sind die folgenden:
G:/2l,L/sB2',ThrP30-NH2 Humaninsulin,
SerA2',LysB27,ThrB3c-NH2 Humaninsulin,
ThrA2',Lysfl27,ThrB3O-NH2H'imaninsulin,
AlcA2\LysB27,ThrB30-NH2Human'nsulin,
HisA21,LysB27,ThrB30-NH2Humanir,sulin,
AspA21 /LysB27,ThrB10-NH2Humaiiinsulin,
Gl/2l,ArgB27,ThrB30-NH2 Humaninsulin,
Ser*21, Arg827, ThrB30-NH2 Humaninsulin, Thr*11, Arg8", ThrB30-NH2 Humaninsulin, Ala*21, Arg827, ThrB30-NH2 Humaninsulin, His*21, Arg827, ThrB30-NH2 Humaninsulin, Asp*21, Arg827, ThrB3O-NH2 Humaninsulin, Gin613, GIy*21, ArgB27,ThrB30-NH? Humaninsulin, Gin013, Ser*21, Arc ThrB30-NH, Hurrmninsulin,
Gin813, Thr*21, / VO-NH2 Humaninsulin,
G!nB13,Ala*'',/μy ", IlirB3O-Nri2 Humaninsulin, Gin813, His*21, Arg827, ThrB30-NH2 Humaninsulin, Gin813, Asp*21, Arg827, ThrB30-NH2 Humaninsulin, Gin813, GIy*", LysB27, ThrB3O-NH2 Humaninsulin, Gin313, Ser*21, LysB27, ThrB3O-NH2 Humaninsulin, Gin813, Thr*21, LysB27, ThrB30-NH2 Humaninsuün, Gin813, Ala*21, LysB27, Thr830· NH2 Humaninsulin, Gin813, His*11. LysB27, ThrB30-NH2 Humaninsulin, Gin813, Asp*21, LysB27, ThrD30-NH2 Humaninsulin.
Eine vvsitore bevorzugte Ausführungsform das erfindungsgemäßen Verfahrens sind Präparationen, die eine Verbindung der Formel I enthalten, ir> der m gleich 1, η gleich 0, Y gleich Thr, AIa oder Ser, R eine Hydroxylgruppe und W GIy, Ser, Thr, Ala, His oder Asp ist. Beispiele für sDiciiC Verbindungen sind die folgenden:
Asn*21, LysB" Humaninsuün,
Ser*21, Lys827 Humaninsuün,
Thr*21, LysB27 Humaninsulin,
AIa*21, Lys827 Humaninsulin,
His*31, LysB27 Humaninsulin,
Asp*21, LysB27 Humaninsuün,
GIy*21, Lys827 Humaninsulin,
Αεη*21, Arg827 Humaninsulin,
Ser*21, Arg827 Humaninsulin,
Thr*21, Arg827 Humaninsulin,
AIa*21, Arg827 Humaninsuün,
His*21, Arg827 Humaninsuün, ,
Asp; 21, Arg827 Humaninsuün,
GIy*21, Arg827 Humaninsulin,
GIn*17, Asn*21, Arg827 Humaninsulin, GIn*17, Ser*21, Arg827 Humaninsulin, GIn*17, Thr*21, Arg827 Humaninsuün, GIn*17, AlaA:l1,ArgBi7 Humaninsuün, Gin*17, His*21, Arg"'7 Humaninsuün, GIn*17, Aip*21, Arg"27 Humaninsuün, Gin*17, GIy*21, Arg827 Humaninsuün, GIn*17, Asn*21, GIn013 Humaninsuün, Gin*17, Ser*21 GIn813 Humaninsuün, Gin*17, Thr*21, GIn813 Humaninsulin, Gin*17, Ala*21, GIn813 Humaninsulin, Gin*1', His*21, Gin813 Humaninsuün, Gin*17, Asp*21, Gin813 Humaninsulin, Gin*17, GIv*21, Gin813 Humaninsul η, Arg827, Asn*21, Gin813 Humaninsuün, Arg827, Ser*21, Gin813 Hur.oninsulin, Arg8;7,Thr*21,Gin813Hume, insulin, ArgB27,Ala*21,GlnB13HuTianinsulin, Arg827, His*21, Glnb13 HimaninsuPn, Arg827, Asp*:i, Gin813 Humaninsuün, Arg827, GIy*21, Gin813 Humaninsuün, Gin*17, Asn*21, Lys827 Humaninsulin, Gin*17, Ser*21, Lys027 Humaninsulin, Gin*17, Thr*21, LysBr iumaninsulin, Gin*17, Ala*21, Lys82 HumaninsLÜn, Gin*". His*21, LysB27 Humaninsi" .
Gin*17, Asp*21, Lys827 Humanins.:.iP, Gin*17, GIy*21, Lys827 Humanir.sulin.
Gin813, Asn*21, Lys027 Hun.ar.msuli'i, GIfP13, Ser*71, l.ys827 Humaninsulin, G.nB13, Thr*21, Lys82' Humaninsulin, Gin813, Ala*21, Lys827 Human! -.sulin,
Gin"13, His*21, LysB" Humaninsulin,
Gin8'3, Asp*21, LysB" Humaninsulin,
Gin813, Gl/2', LysB" Humaninsulin.
In einer Gruppa bevorzugter Verbindungen der Κ,τηβΙ! bedeuten E2 und E3 einen Glutaminrest.
In einer anderen Gruppe bevorzugter Verbindungen Je: Formel I stellt X einen Arginin- oder Lysin-Rest dar.
In einer weiteren Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I bedeutet W GIy, Ser, Thr, Ala, His, Λ.*|Γ oder hSer.
Wie nach dem Stan ^ der Technik bekannt ist, sind nicht alle Aminosäurereste im Humaninsulin für die Insulinwirkung essentiell.
Tatsächlich wurden Schweineinsulin und Rinderinsulin, die sich vom Humaninsulin in Aminosäurerasten unterscheiden, zur Behandlung von Diabetes verwendet. Es existieren beträchtliche Unterschiede in den Insulinmolekülen von Art zu Art. Folglich können viele Aminosäurereste im Humaninsulinmolekül verändert werden, ohn'. daß eine nachteilige Verminderung der Insuiinwirkung eintritt, wobei einige Reste eingeschlossen sind, die den isoelektrischen Punkt des Moleküls beeinflussen.
Es ist offensichtlich, daß die mit E1, E2, E3, E4, R, W, X, Y und Z bezeichneten Gruppen so ausgewählt werden müssen, daß die resultierende Verbindung der Formel I pharmazeutisch geeignet ist. In den bekannten zweiphasigen Insulinpräparationen ist es üblich, schnell wirkendes, lösliches Insulin mit kristallinem Insulin, das eine verlängerte Wirksamkeit aufweist, für die gleiche Injektion zu kombinieren. Bei Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I kann eine ähnliche kombinierte kurzzeitige und langzeitige Wirkung mit einer Lösung einer einzigen Verbindung der Formel I erhalten werden. Das Verhältnis zwischen der kurzzeitigen und langzditigen Wirksamkeit vermindert sich in dem Maße, wie die Konzentration an Zinkionen in der Lösung erhöht wird.
Verbindungen der Formel I können durch eine Transpeptidierungsreaktion hergestellt werden, bei der eine biosynthetische Vorläuferverbindung mit don richtigen Insulindisulfidbrücken und der allgemeinen Formel II:
X-B(26-22)-E4-B(20-14)-E3-B(12-1) (II)
B(28-29MQq-T),-A(1-3!-E1-A(&-16)-E2-A(18-20)-W
worin A und B, mit anschließenden Ziffern in Klammern, die entsprechenden Peptidfragmente in der A- bzw. B-Kette bezeichnen, wie sie durch die Ziffern in den Klammern bezeichnet werden, Q eine Peptidkette mit q Aminosäuren darstellt, q eine ganze Zahl zwischen 0 und 33 ist, T Lys ode.· Arg bedeutet, r 0 oder 1 bedeutet und E1, E2, E3, E4, W und X jeweils wie weiter oben definiert sind, mit einer Aminverbindung der allgemeinen Formel III umgesetzt wird:
H-Ym-Zn-R
worin Y, Z, R, m und η jeweils wie weiter oben definiert sind und v/orin Seitenkettenaminogruppen urvJ Hydroxylgruppen in Y und Z gegebenenfalls mit Schutzgruppen für Amino- und Hydroxylgruppen blockiert sind, wobei Trypsin oder ein trypsinähnliches Enzym als Katalysator in einem Gemisch aus Wasser und organischem Lösungsmittel, analog dem in der US-PS 4.343.8Ö8 beschriebenen, verwendet wird. Wenn W hSer bedeutet, werden Nucleotide, für die Met kodieren, an der A21-Positionind!;sGen eingeführt. Im exprimierten Protein wird die Umsetzung von Met in hSer durch Bromcyan bewirkt. Bevorzugte Verbindungen der Formel III, dia in diesem Verfahren verwendet werden können, sind TfU-NH2, l.ys(Bos)-NH2, Thr(Eu')-OBu', Th r-OBu1, AIa-NH2 und Arg(Boc)-MH2. Die Aminogruppen können durch Acylierung mit einer Fettsäure derivatisiert sein W~nn Y und Z Gruppen enthalten, die durch Aminschutzgruppen reversibel blockiert sind, können diese Gruppen in einer nachfolgenden Reaktionsstufe entfernt werden, nachdem die Zwischenstufe mit der geschützten Aminogruppe vom Trypsin oder trypsinähnlichen Enzym abgetrennt worden ist. Von den trypsinähnlichen Enzymen kann Lysyl-endopeptidase aus Achromobacter lyticus verwendet werden.
Die Verbindung dor Formel it kann in einem Wirtsorganismus, z. B. in Hefen, exprimiert werden, ähnlich wie es in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 163.529 beschrieben worden ist, wobei ein (Jen mit den richtigen Codons in bezug auf die in Frage stehenden Aminosäuren verwendet wird. Das Gen, das für die neuen Insulinderivate kodiert, wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut, der, wenn er in Hefen transferiert wird, in der Lage ist, die gewünschte Verbindung zu exprimieren. Das exprimierte Produkt wird dann von den Zellen oder von der Kultur in Abhängigkeit davon isoliert, ob es von den Zellen sekretiert wird oder nicht.
Ein Beispiel für eine die Aminosäure rover, !bei schützende Gruppe Gruppe ist die t-Butoxycarbonylgruppe und eine reversibel schützende Gruppe für die Hydroxylgruppe ist eine t-Butylgruppe. Diese Gruppen können wieder entfernt werden, indem Bedingungen angewendet werden, die keine unerwünschte Veränderung in der Verbindung der Formel I hervorrufen, z. B. durch Trifluoressigsäure. Änderungen in den A4-, A17-, A21-, B13-, B 21- oder B27-Positionen können leicht durch gentechnische Verfahren eingeführt werden, wobei für die durch Trypsin katalysierte Halbsynthose die Einführung des gewünschten Restes am C-Torminal der 8-Kelte belassen wird.
Der Vorteil der Einführung zusätzlicher positiver Ladungen innerhalb des Bestandes der 51 Aminosäuren des Insulinmoleküls unter Bildung der neuen Verbindungen der Formel I und nicht durch Verlängerung der B-Kette über die 30 Reste des Insulins der Säugetiere hinaus besteht in der Leichtigkeit der Herstellung. Bei der halbsynthetischen Transpeptidierungsreaktion wird ein großor Überschuß des Aminosäureamids oder des Aminosäureesters verwendet. Wenn bei dieser Transpeptidierungsreaktion ein Dipeptidamid odor -ester verwendet werden soll, stehen entweder der Preis oder die löslichkeit oder beide der Verwendung in großem Überschuß entgegen und folglich wird die Ausbeute an dem gewünschten Produkt niedriger. Sogar in dem Falle, daß der gleiche molare Überschuß z. B. von l.ys(Boc)-NH2 oder Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2 in der Transpeptidierungsreaktion unter ähnlichen Bedingungen verwendet wird, ist die Ausbeute ui, werwendung des Aminosäureamids wesentlich höher als mit dem Dipeptidamid.
Die erfindungsgemäßen Insulinpräparationen werden dadurch hergestellt, daß eine Verbindung der Formel I in einem wäßrigen Medium bei leicht sauren Bedingungen z. B. mit einer Konzentration von 240 oder 600 nMol/ml gelöst wird. Das wäßrige Medium wird isotonisch eingestellt, z. F·. mittels Natriumchlorid, Natriumacetat oder Glycerol. Weiterhin kann das wäßrige Medium Zinkionen in einer Konzentration bis zu ungefähr 30Mg Zn+* je nMol der Verbindung der Formel I, Puffer wie Acetat, Citrat und Histidin sowie Schutzstoffe wie m-Kresol, Nipagin oder Phenol enthalten. Der pH-Wert der fertigen Insulinpräparation hängt von
der Anzahl der Ladungen, die in der Verbindung der Formel I verändert worden sind, von der Konzentration an Zinkionen, der Konzentration der Verbindung der Formel I und der speziellen Verbindung der Formel I ab. Der pH-Wert wird auf einen Wert eingestellt, der zur Verabreichung geeignet ist, z. B. ungefähr 2,5 bis 4,5, jedoch bei Verhinderung einer Ausfällung. Die Insulinpräparation wird durch Sterilfiltration sterilisiert.
Die erfindungsgemäßen Insulinpräparationen werden ähnlich denen verwendet, die bekannt sind.
Jede neue Eigenschaft oder Kombination an Eigenschaften, die hierin beschrieben worden sind, werden als wesentlich für die Erfindung betrachtet.
Die hierin verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuran sind diejenigen, die in J. Bio). Chem. 243 (1968), S.3558 benannt werden. Die hierin verwendeten Aminosäuren sind in der L-Konfiguration. In der Formel I und ansonsten in dieser Beschreibung bedeuten A(1-3) GIy-IIe-VaI, A(5-6) Gln-Cys usw., vergleiche die Aminosäuresequenz des Humaninsulins. Wenn es nicht anders benannt ist, bezieht sich die hierin bezeichnete Insulinart auf Humaninsulin.
Synthese der Insulinverbindungen
Insulin wurde von einem Ins· ilinvorläuter, der in Hefe exprimiert worden ist, bezogen, wie es in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 163.5C ) beschrieben ist.
Die Insülinvorläufei wurden aus den Fermentationsbrühen durch Adsorption an LiChroprep™ RP-18 gewonnen, wie es in Beispiel 7 der gleichen Europäischen Patentanmeldung beschrieben worden ist. Die Vorläufer wurden von der Säule mit 0,2 M KCI, 0,001 M HCI in 33% (v/v) Ethanol eluiert. Die Insulinvorläufer wurden aus dieser Lösung durch portionsweise Zugabe von Wasser (1 Volumenanteil je Volumenanteil Lösung), festem Trinatriumcitrat, um eino Molarität von 0,05 M einzustellen, und schließlich von Zinkacetat, um eine Molarität von 0,00G einzustellen, kristallisiert. Der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und das Gemisch über Nacht bei 40C stehengelassen. Die Kristalle wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Die geschützten Aminosäuren und geschützten Peptide Tür die enzymatische Halbsynthese wurden entweder nach Standardmethoden hergestellt oder von entweder Nova Biochem oder Bachern, beide in der Schweiz (Kundensynihese), bezogen.
Die Buchstaben „TM" hinter einem Namen weisen darauf hin, daß es sich urn einen Handelsnamen handelt.
Bei den Ausgangsstoffen in den Beispielen 1 bis 14 wurde (0,,-T), der Formel Il als Ala-Ala-Lys ausgewählt und konstruiert, wie es für das Hefeplasmid pMT610 in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 163.529 beschrieben worden ist.
Die Nucleotide, die für GIn0'3, GlnA16, Arg827, LysB", AspA2\ Gl/2', His*21, Ser*21 und Thr*21 kodieren, wurden in pMT610 durch ortsspezifische Mutagenese substituiert, wobei die Methode nach Nucl. Acids Res. 11 (1983), S. 5103-5112, verwendet wurde.
Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
Synthese von GIn", Arg"7-Humaninsulin
Zu einer Suspension von 5g GIn813, Arg827, B(1-29)-Ala-Aia-Ly=-A(i-21)-lnsulin-Vorstufe in 50 ml 2 M Thr-OBu1, CH3COOH (L-Thrdonin-t-butylester-hydroacetat) in DMF, wurden 25ml 25,5% (v/v) Wasser in DMF (25,5 ml Wasser, DMF bis 100) hinzugefügt. Die Suspension wurde unter Rühren auf 12°C abgekühlt. Dazu wurde eine Lösung von 0,5g Schweinotrypsin in 12,5 ml einer 0,05 M wäßrigen Lösung von Calciumacetat hinzugefügt. Es wurde so lange gerührt, bis sich alles gelöst hatte. Nach 48 Stunden bei 120C wurden die Proteine dadurch gefällt, daß das Gemisch in 600 ml Aceton gegossen wurde. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert, einmal mit 200ml Aceton gewaschen, erneut zentrifugiert und unter einem S tickstoffstrom getrocknet. Der Niederschlag wurde in 100 ml 0,04 N Salzsäure gelöst der pH-Wert auf 2,5 eingestellt und diese L isung auf eine präparative Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Säule (hierin irr folgenden als HPLC bezeichnet), die mit Kies elgelteilchen, die durch Octadecyldimethylsilylgruppen substituiert waren, gepackt war (mittlerer Teilchendurchmesser 15 Mikron, Porengröße 100 Angstr0m> gegeben. Die Säule wurde mit Ethanol/0,3 M wäßriger Lösung von Kaliumchlorid, 0,001 N Salzsäure in einem Verhältnis von 35,5/64,5 (Teile je Volumon) äquilibriert. Die Proteine wurden mit dem gleichen Puffer mit einer Geschwindigkeit von 2l/h von der Säulr aluiert. GIn813, Arg827, ThrB30-OBu'-Humaninsulin wurde in einem Peak festgestellt, der nach 55 bis 100 Minuten Durchlaufzeit aus der Säule erschien. Das GIn813, Arg027, ThrB30-OBu'-Humaninsulin wurde aus dem Eluat dadurch isoliert, daß Wasser prctionsweise zugegeben wurde, so daß die Ethanolkonzentration 15% (v/v), festes Trinatriumcitrat, so daii eine Molarität von 0,05 M in bezug auf Zitrat eingestellt wird, und festes Zinkchlorid, so daß eine Molarität von 0,006M in bezug auf Zink eingestellt wird. Der ,oH-Weu wurde auf 6,8 eingestellt und nach einer Stunde bei Zimmertemperatur wurde das Kristallisationsverfahren unter Rühren 24 Stunden bei 40C fortgesetzt. Die Kristalle werden abzentrifugiert, zwei mal mit je 20ml eiskaltem Wasser gewaschen, abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,51 g GIn813, Arg827, ThrB30-OBt'-Humaninsulin.
GIn8'3, Arg827, Thr^-OBu'-Humaninsulin wurde in 100 ml Trifluoressigsäure gelöst und zwei Stunden bei Z'.nmertemperatur stehengelassen. Die Trifluoressigsäure wurde dann durch Lyophilisierung entfernt. Das Lyophilat wurde in 100ml Wasser gelöst, der pH-Wert auf 2,5 eingestellt und 20g Natriumchlorid zugegeben. Der Salzkuchen bestand aus GIn8'3, Arg827-Humaninsulin und wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Dieser Salzkuchen wurde in 850ml Wasser gelöst. Das GIn8'3, ArgB27-Humaninsulin wurde durch portionsweise Zugabe von 150ml Ethanol, 14,7g Trinatiumcitrat-dihydrat und 0,82g Zinkchlorid kristallisiert, wobei der pH-Wert schließlich auf 6,8 eingestellt wurde. Nach einer Stunde bei Zimmertemperatur wurde die Kristallisation bei 40C fortgesetzt, wobei 24 Stunden gerührt wurde. Die Kristalle wurden abzentrifugiert, 2rnal mit je 20ml eiskaltem Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,71 g GIn8'3, ArgB27-Humaninsulin, entsprechend 36%.
Die Aminosäurenzusammensetzung entsprach der theoretisch berechneten, d. h. es waren 2 Argininreste/Molekül enthalten. Nach der DISC-PAGE-Elektrophorese war das Produkt reir, die Wanderungsgeschwindigkeit betrug 55% derjenigen des Humaninsuiins, was einem Ladungsunterschied von ungefähr 2 entspricht. In bezun auf Einzelheiten die DISC-PAGE-Elektrophorese betreffend sei auf Horm.Metab. Rss. Supplement Series Nr. 5 (1974), S. 134, verwiesen. Der Zinkgehalt in den Kristallen betrug 0,42% (Gew.-%).
Beispiele 2-6
Die fünf Titelverbindungon wurden aus den entsprechenden Einzelketten-Insulin-Vorstufen hergestellt, nämlich GlnBU,GlnA17,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21),
GlnAl7,ArgB27,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21),
ArgB27,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21),
L>.-. 27,B(1-29)-Ala-Ala-A(1-21) und
HisA21,ArgB27,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), wobei die Verfahren angewendet wurden, die in Beispiel 1 beschrieben worden sind.
Die Ausbeuten, Ladungen in bezug auf Humaninsulin, Wanderungsgeschwindigkeiten in der DISC-PAGE-Elektrophorese bei pH 8,9 in bezug auf das Humaninsulin und Abweichungen in der Aminosäurenzusammensetzung, bezogen auf das Humaninsulin, sind in der Tabelle I weiter unten zusammengestellt.
Beispiel 7-13
Synthese von AspA21,ArgB27,ThrB30-NHrHumaninsulin, Gl/21,ArgB",ThrB30-NH2-Hunianinsulin, HisA21,ArgB27,ThrE3O-NHr Humaninsulin, Gl/2\ArgB27,GlnB",ThrB30-NH2-Humaninsulin, Ser^'.Arg^Gln"13 JhrB30-NH2-Humaninsulin, Th^21, Arg627, GlnBn, ThrB30-NH2-Humaninsulin und SerA21,ArgB27,ThrB30-NH2-Humaninsulin Dio 7 Titelverbindungen wurden aus den entsprechenden Einzelketten-Insulin-Vorstufen hergestellt, näm'ich: AspA2',Arg827,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), GlyA21,ArgB27,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), HisA2',ArgB27,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), GlyA2',ArgB27,GlnB13,3(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), SerA2',ArgB2;,GlnBI3,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), ThrA2l,ArgB27,GlnB'3,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)und
SerA2',ArgB27,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21), wobei die Methode der Transpeptidierung in Gegenwart von Trypsin in wäßrigorganischer Lösung in Gegenwart von Thr-NH2 angewendet wurde, wie sie in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 194.864, in den Beispielen 4 und 6, beschrieben worden ist. Die Ausbeuten, Ladungen in bezug auf Humaninsulin, Wanderungsgeschwindigkeiten in der DISC-PAGE-Elektrophorese bei pH = 8,9 in bazug auf Humsninsulin ind Abweichungen in der Aminosäurenzusammensetzung in bezug auf Humaninsulin sind in der Tabelle I zusammengestellt.
Die Titelverbindurg wurde aus der entsprechenden Einzelkettenlmulinvorstufe, nämlich AspAZl,ArgB",B{1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21) durch die Methode der Transpeptidierung in Gegenwart von Trypsin in wäßrig-organischer Lösung in Gegenwat von Lys(Boc)-NH2, Reinigung der Zwischenstufe Lys(Boc)B30-NH2-Humaninsulin, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe durch Trifluoressigsäure, wie es in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 194.864, Beispiele 5 und 7, beschrieben worden Lc, hergestellt. Ausbeute und analytische Werte sind in der Tabelle I aufgeführt.
| Substitution im Humaninsulin | Ausbeute | Ladung in | Wanderungs- | Abweichungen in der Amino- · |
| (%) | be^ugauf | geschwindig | Säurenzusammensetzung vom | |
| Humaninsu | keit bei pH | Humaninsulin nach saurer | ||
| lin bei | 8,9;% in | Hydrolyse, | ||
| pH = 7 | bezug auf | Reste/Molekül | ||
| Humaninsulin | ||||
| Glnai3,GlnA17 | 46 | +2 | 55 | ohne |
| GlnA17,ArgB27 | 32 | +2 | 55 | + 1Arg,-1Thr |
| Arg827 | 35 | •H | 75 | +1Arg, -1Thr |
| LysB2? | 39 | +1 | 75 | + 1Lys,-1Thr |
| HisA21,ArgB27 | 16 | + 1,1 | 75 | +1His, +1Arg, -1Asp, -1Thr |
| AspA21,ArgB27,ThrB30-NH2 | 23 | + 1 | 75 | + 1Arg,-1Thr |
| Gl/^Arg^Vrhr^-NHj | 32 | +2 | 55 | +1GIy, HArg, -1Asp, -1Thr |
| HisA2l,ArgB27,ThrB"-NH2 | 20 | +2,1 | 55 | + 1His, +1Arg, -1Asp, -1"hr |
| GlyA21,ArgB27,Gi.->B13,ThrB30-NH2 | 23 | +3 | 35 | + 1GIy, +1Arg, -1Asp, -1Thr |
| SerA2l,Arg927,Glnti'3,ThrA30-NH2 | 21 | +3 | 35 | +1Ser,+1Arg, -1Asp, -1Thr |
| ThrA2I,ArgB27,Gln813,Thr830-NH2 | 29 | +3 | 35 | + 1Arg,-1Asp |
| SerA21,ArgB27,ThrB3C-NH2 | +2 | 55 | + 1Ser, +1Arg, -iAsp, -1Thr | |
| AspA21,ArgB27,LysB30-NH2 | 13 | +2 | 55 | +1Arg,+1Lys,-2Thr |
Sterile, injizierba. e Lösungen von Verbindungen der Formel I zur Untersuchung des Ausmaßes der verlängerten Wirkung wurden unter Verwendung von 1,6% (w/v) Glycerol als Isotonicum, 0,3% (w/v) m-Kreso! als Schutzmittel und mit 0,01 M Natriumqcetat als Puffer hergestellt. Die Konzentration an Zinkionen betrug 8 oder 80 Mg/ml. Die pH-Werte der Lösungen wurden ausreichend weit vom isoelektrischen Punkt der Verbindungen der Formel I eingestellt, so daß die Lösungen bei der Lageiung bei 40C klar blieben. Die Lösungen enthielten 240nMoi/ml der Verbindungen der Formel I. Die Konzentration von 24OnMoIZmI wurde durch Messung der Absorption bei 276nm einer konzentrierteren Stammlösung ohne m-Kresol unter Verwendung dos
molaren Extinktionskoeffizienten für Schweineinsulm bei 6100 für diese Derivate (siehe: Handbuch der inneren Medizin, Band 7, Teil 2A, Herausgeber: Obßrdisse, 1975, S. 113) eingestellt. Für Schweineinsulin aus einer Komponente beträgt die eingestellte Wirksamkeit 28,5U/mg Trockensubstanz (siehe: Diabetes Cai e, Vol.6, Supplement 1 [1983], 4), so daß 1U 5,95nMol entspricht. Injizierbrro Lösungen, die 240nMol/m! der Verbindungen der Formel I enthielten, wurden hergestellt und wissen den pH-Wert und Zink onengehalt auf, der in der Tabelle Il angegeben !st
UnVersuchung der Verlängerung der insullnwirkung
Die Verlängerung des hypoglycemischen Effektes, der durch die injizierbaren Insulinlosungen hervorgerufi?:-. wird, wurde nach der British Pharmacopoeia 1980, A142 bei Kaninchen, die ohne Nahrung gehalten waren, untorsucht. Jede Testlösung wurde subcutan mit einer Dosis von 14,3nMol pro Kaninchen bei 12 Tieren von jeweils 3-4 kg Gewicht verabreicht und der Verlauf der Hypoglycemie über eine Periode von 6 Stunden verfolgt. Zum Vergleich wurde die
Nr. der Verbindung der Formel 1
Zn++ pH Glucose in Prozent vom
Ausgangswert Mg/ml 1h 2 h
| 80 | 4,5 | 53 | 47 | 50 | 66 |
| 80 | 4,5 | 55 | 46 | 61 | 91 |
| 80 | 4,5 | 53 | 47 | 55 | 82 |
| 80 | 4,5 | 45 | 34 | 51 | 91 |
| 80 | 4,5 | 47 | 40 | 55 | 93 |
| 80 | 4 | 60 | 54 | 58 | 60 |
| 80 | 4 | 72 | 67 | 61 | 59 |
| 8 | 4 | 59 | 62 | 71 | 74 |
| 80 | 4 | 72 | 73 | 74 | 74 |
| 80 | 4 | 65 | 53 | 66 | 88 |
| 80 | 4 | 61 | 52 | 52 | 72 |
| 80 | 4 | 82 | 86 | 85 | 9 |
| 80 | 4 | 90 | 91 | 88 | 9 |
| 80 | 4 | 90 | 90 | 88 | 9 |
| 80 | 4 | 60 | 62 | 64 | 6 |
| 15 | 7 | 46 | 44 | 74 | 9 |
| 80 | 7 | 54 | 43 | 50 |
GlnA17,Arg?27-Humaninsulin GlnB13,Argt>27-Humaninsulin GlnA17,Glnei3-Humaninsulin ArgB27-Humaninsulin
LysB2/-Humaninsulin
AspA?WqB27,ThrB30-Humaninsulin AspA21,Arg:'27,Lyse3O-NH2-Humaninsulin GI/2',ArgR2',ThrB30-NH2-Humaninsulin GlyA2l,ArgB",ThrB3O-NH2-Humaninsulin HisA2',ArgB27-Humaninsulin HisA2l,ArgB27,ThrB30-NH2-Humaninsulin GI/2l,ArgB27,GlnB13,ThrB3O-NH2-Humaninsulin SerA2',ArgB27,GlnB13,ThrB::o-NHrHumaninsulin ThrA21,ArgB27,Gln3l3,ThrB30-NH2-Humaninsulin SerA21,ArgB27,ThrB3O-NH2-Humaninsulin Actrarapid™, Schweineinsulin Monotard™, Humaninsulin
schnell wirkende Präparation Actrapid™-Schweineinsulin und die mittelschnell wirkt nde Präparation Monotard™-Humaninsulin in die Untersuchungen mit aufgenommen. Dir Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der Tabella Il zusammengestellt.
Die Wirksamkeit der Insulinverbindungen wurde nach dem Test zur Untersuchung der Verminderung des Zuckergehaltes im Blut von Mäusen (British Pharmacopoeia 1980, A141-A142) festgestellt. Um das Problem der Bestimmung der Wirksamkeit der Insuline, die eine vom Standard abweichende zeitliche Wirkung aufweisen, auf ein Minimum zu reduzieren, wurden die Insulinlösungen zur Bestimmung der Wirksamkeit ohne die Zugabe von Zinkionen hergestellt. Die Lösungen wurden mit einem Gehalt von 240 nMol/ml auf der Grundlage der Bestimmung der Absorption bei 276 nm hergestellt. Der Zinkgehalt der Lösungen betrug 8-10pg/ml und stammte aus den kristallinen Derivaten. Die für einige !nsulinverbindungen bestimmten Wirksamkeiten sind in der Tabelle III unte ι zusammengestellt.
Tabelle III Insulinverbindung
GlnA17,ArgB"-Humaninsulin GlnB13,ArgB27-Humaninsul:n GlnBI3,GlnA17-Humaninsulin ArgB27-Humaninsulin
LysB27-Humaninsulin
AspA2',ArgB2',ThrB30-NH2-Humaninsulin AspA21,ArgB27,L/sB30-NH2-Humaninsulin Gl/'21,ArgB2',ThrB3O-NH2-Humaninsulin HisA2\ArgB27-Humaninsulin HisA2',ArgB27,ThrB?<1-NH2-Humaninsulin GI/2\ArgB27,GlnB13,ThrB30-NH.-Humaninsulin SerA21,ArgB27,GlnB13,ThrB30-NH2-Humaninsulin ThrA2I,ArgB27,Gln313,ThrB30-NH2-Humaninsulin SerA2',ArgB",ThrB30-NH2-Humaninsulin
Bericht über das Ergebnis der Prüfung auf Schutzfähigkeit und Bewertung der technisch-ökcr omischen Effektivität
Zu 1) sind keine Angaben bekannt.
Zu 2) Der Patentanmeldung liegan folgende Veröffentlichungen zugrunde:
EP-PS 163529
EP-PS 194864
| Wirksamkeit im | Vertrauensbereich |
| Vergleich zu Human | (P = 0,05) |
| insulin (%) | (%) |
| 6Γ | 79-62 |
| 7'j | 88-69 |
| ö0 | 63-40 |
| 87 | 95-80 |
| 88 | 97-88 |
| 83 | 92-74 |
| 69 | 77-62 |
| 75 | 83-68 |
| 71 | 79-63 |
| 72 | 81-64 |
| 49 | 54-4Λ |
| 47 | 54-40 |
| 28 | 32-24 |
| 76 | 83-68 |
Geiger und Enzmann, Proinsulin, Insulin, C-Peptide:
Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-Peptide, Tokushima, 1978; Amsterdam-Oxford, 1979,306-310 J. Pharmacol., 55 (1935), 206 J. Biol. Chem., 243, (1968), 3558 Nucl. Acids Res. 11 (1983), 5103-5112 Horm. Metab. Res. Supplement Series Nr.5 (1974), S. 134 Diabetes Care, Vol. 6, Supplement 1 (1983), 4 British Pharmacopoeia 1980, A141-A142
FUr die Behandlung von Diabetes inellitus wurden verschiedene Insulin-Präpai ate vorgeschlagen und verwendet. Einige dieser Präparate wirken schnell, andere haben eine mehr oder weniger verlängerte Wirkung. Es ist bekannt, eine verlängerte Wirkungsdauer dadurch zu erreichen, daß Insulin in Form einer Suspension von Insulinkristallen verabreicht wird. Die kristallinen Präparate können erhalten werden durch Kristallisation von Insulin in Gegenwart von Zink und Protamin.
Ein Nachteil beider Verwendung der bekannten Suspensionen der Zink-Insulin-Kristalle oder des Zink-Protamin-Insulins ist die Notwendigkeit, die Ampulle zu schütteln, um sicherzustellen, daß die richtige Menge Insulin injiziert wird und um sicherzo-'ollen, daß die Konzentration des Insulins in der Ampulle während ihrer Verwendung konstant bloibt. Das Schütteln von Insulin-Suspensionen und Insulin-Lösungen mit Luft ist unerwünscht, da Insulin dazu tendiert, an Wasser-Luft-Grenzflächen unter Bildung von Rbrillen zu denaturieren. Es ist daher wünschenswert, über Insulin-Lösungen mit verlängerter Wirkung zu verfügen.
Es ist bereits bekan.it, Lösungen aus Insulin-Derivaten mit verlängerter Wirkung herzustellen. Sie werden hergestallt aus Insulin, das in seinen Aminogruppen durch Umsetzung mit Phenylisocyanat modifiziert worden ist. Weiterhin ist bekannt, daß A1, B29-di-Boc-substituiertes Insulin nach der subcutanen Verabreichung eine verlängerte Insulinwirkung aufweist. Die verlängerte Wirkung ist aber zu wenig, als daß sie von klinischem Nutzen sein könnte. Lösungen unmodifizierter Insuline erfordern große Mengen an Zinkionen, um verlängert wirksam zu sein. Die Injektion solch großer Dosen ist jedoch sehr schmerzhaft, so daß in der Therapie von solchen Lösungen kein Gebrauch gemacht worden ist.
Zu 3) Das erfindungsgemäße Verfahren wird angewandt in der pharmazeutischen Industrie auf dem Gebiet der Arzneimittelsynthese.
Zu 4) Erfindungsgemäß werden neue Insulin-Derivate zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäß hergestellten Insulin-Derivate sind geeignet für die Herstellung von injizierbaren Insulin-Lösungen mit verlängerter Wirkungsdauer. Die auf diese Weise erhaltenen Insulin-Lösungen sind hervorragend geeignet für die Behandlung von Diabetes. Sie weisen die Nachteile der bekannten Insulin-Lösungen nicht auf.
Zu 5) Versuchsergebnisse sind auf den Seiten 22 bis 24 der Anmeldungsunterlagen angegeben.
AfEP
RHZ-A-3
ENDE
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung neuer Insulinderivate der allgemeinen Formel (I)
A(l-3)-E1-A(5-6)-Cy9-A(8-16)-E2-A(18-19)-Cye-W#A „ .
ι . (A-Kette)
S S
s s (l)
ι 3 ι
B(l-6)-Cye-B(8-12 )-E0-B( 14-18)-Cys (B-Kette)
R-Zn-Ym-Lys-Pro-X-f3(26-22)-E4-Gly
worin die Buchstaben A und B mit Ziffern in Klammern die Poptidfragmente der A- und B-Ketten, die durch dieZiffern in den Klammern benannt werden, darstellen, E1, E2, E3 und E4, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils einen Glutaminsäi/rerest oder den Rest einer neutralen Aminosäure, der durch Nucleotidsequenzen kodiert werden kann, bedeuten, X einen L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysinrest darstellt, Y und Z, die gleich oder verschieden voneinander sein können, einen Aminosäurerest bedeuten, in dem jede Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und worin jede Seitenkettenhydroxylgruppe alkyliert sein kann, m und n, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils 0 oder 1 bedeuten und R einen Hydroxyl-, Amid- oder Esterrest bedeutet, der die Carboxylgruppe am C-Terminal der B-Kette blockiert, und W einen Aminosäurerest bedeutet, mit der Einschränkung, daß, wenn W Asparagin bedeutet, R eine Hydroxylgruppe ist und, wenn W ein Asparaginrest ist, sowohl X als auch -Y1n-Zn-R einen Threoninrest und E3 einen Glutaminrest bedeuten und nicht alle drei E1, E2 und E4 Glutaminsäurereste sind; mit der weiteren Einschränkung, daß wenigstens einer der sechs Aminosäurereste E1, E2, E3, E4, W und X von den Aminosäureresten, die an den entsprechenden Positionen im Humaninsulin stehen, verschieden ist, und daß wenigstens einer der acht Aminosäurereste E1, E2, E3, E4, W, X und Z und die Gruppe R so ausgewählt werden, daß die Verbindung der Formel (I) wenigstens eine Ladung mehr als das Humaninsulin bei einem pH-Wert von 7 aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Insulinvorstufe der allgemeinen Formel (II):
X-B(2&-22)-E4-B(20-14)-E3-B(12-1) (II),
B(28-29)-(Qq-T)-A(1-3)-E1-A(5-16)-E2-A(18-20)-W
worin A und B die Fragmente der A- und der B-Kette bezeichnen, die durch die Ziffern in Klammern definiert werden, Q eine Peptidkette mit q Aminosäuren darstellt, q eine ganze Zahl zwischen 0 und 33 bedeutet, T Lys oder Arg ist und r 0 oder 1 darstellt und E1, E2, E3, E4, W und X jeweils wie in Anspruch 12 definiert sind, mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (III)
H-Y01-Zn-R (III),
worin Y, Z, R, m und η jeweils wie weiter oben definiert sind und worin die Seitenkettenaminogruppen und die Hydroxylgruppen von Y und Z gegebenenfalls mit Schutzgruppen für Amino- und Hydroxylgruppen blockiert sind, unter Verwendung von Trypsin odereinemtrypsinähnlichen Enzym als Katalysator einerTranspeptidierungsreaktion unterworfen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel IX ein Lysin- oder Argininrest ist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I E2 und E3 jeweils einen Glutaminrest darstellen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel IY und/oder Z ein basischer Aminosäurerest ist, worin die Seitenkettenaminogruppe gegebenenfalls acyliert ist (m = 1).
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I η gleich 0 und Y ein basischer Aminosäurerest sind (m = 1).
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel IY und Z beides basische Aminosäurereste sind (m = 1, η = 1).
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß in den Verbindungen der Formel I R eine Gruppe der allgemeinen Formel -NR1R2 ist, worin R1 und R2, die gleich oder verschieden voneinander sein können, jeweils Wasserstoff oder eine niedere Alkylgruppe bedeuten und worin R vorzugsweise eine -NH2-Gruppe ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I R eine niedere Alkoxygruppe, vorzugsweise eine tert.-Butyloxygruppe, ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel I R einen Rest eines Lactams darstelt, das vorzugsweise weniger als acht Atome im Lactamring enthält.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Verbindungen der Formel IW von Asparagin verschieden ist und vorzugsweise GIy, Ser, Thr, AIa, His, Asp oder hSer bedeutet.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen der Formel I ausgewählt sind unter den folgenden: GlyA21,LysB27,ThrB30-NH2-Humaninsulin, Ser^VLys^Jhr^-NrVHumaninsulin, ThrA21,LysB27 lThrB30-NH2-Humaninsulinf AlaA21,Lys827,ThrB30-NH2-Humaninsulin, HisA21,LysB27,ThrB30-NH2-Humaninsulin, AspA2\LysB27,ThrB30-NH2-Humaninsulin, GlnA17,AspA21,ArgB27-Humaninsulin, GlnA1/,GlyA21,ArgB27-Humaninsulin, GlnA17,AsnA21,GlnB13-Hurnaninsulin, GlnA17,SerA21,GlnB13-Humaninsulin, GlnA17,ThrA21,GlnB13-Humaninsulin, GlnA17,AlaA21,GlnB13-Hurnaninsulin, GlnA17,HisA21,GlnB13-Hurnaninsulin, G!nA17,AspA2l,GinB13-Hurnaninsulin, GlnA17,GlyA21,GlnB13-Humaninsu!in.
ArgB27,AsnA2\GlnB13-Humaninsulin, ArgB27,SerA21,GlnB13-Humaninsul.n, ArgB27,ThrA21,GlnB13-Humaninsulin, ArgB27,AlaA21,GlnB13-Humaninsulin, ArgB27,HisA21,GlnB13-Hurnaninsulin, ArgB27,AspA21,GlnBl3-Hurnaninsulin, Arg^Gl/^GIn^-Humaninsulin, GlnA17,AsnA2\LysB27-Humaninsulin, GlnA17,SerA21,LysB27-Humaninsulin, GlnA17,ThrA21,LysB27-Hurnaninsulin, GlnA17,Ala21,LysB27-Humaninsulin, GlnA17,HisA'1,LysB27-Humaninsulin, GlnA17,AspA21,Lys827-Humaninsulin, GlnA17,GlyA21,LysB27-Humaninsulin, GlnB13,AsnA21,LysB27-Hurnaninsulin, GlnB13,SerA2l,LysB27-Humaninsulin, GlnB13,ThrA21,LysB27-Humaninsulin, GlnB13,AlaA21,LysB27-Humaninsulin( GlnB13,HisA21,LysB27-Hurnaninsulin, GlnB13,AspA21,LysB27-Humaninsulin, GlnB13,GlyA2',LysB27-Humaninsulin, hSerA21,ArgB27,ThrB30-NHrHumaninsulin,
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