JPH0653673B2 - Ｍ―ｃｓｆの医薬用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、炎症性疾患及びアレルギーの治療剤に関す
る。

より詳しくは、本発明は新規な抗炎症剤及び抗アレルギ
ー剤を提供するものであり、特に、Ｍ−ＣＳＦを有効成
分とする抗炎症剤及び抗アレルギー剤に関する。

背景技術 炎症は、バクテリア、外傷、化学物質又は熱のような様
々な因子により起こされる損傷に対する反応としての生
体組織内での一連の複雑な変化である。炎症反応は、前
記因子の存在下での生体による抵抗のメカニズムではあ
るが、炎症反応はリウマチ性関節炎や痛風のような炎症
性疾患に苦しむ多くの患者の多大な痛みの原因ともなっ
ている。

炎症反応は、関与する組織、原因となる因子等により様
々であるが、該反応を特徴づけるいくつかの特色があ
る。これら特色には、微小血管の開窓(fenetration)、
血液成分の細胞間隙(interstitial space)への漏出、白
血球の炎症組織への遊走を含む。これには通常、紅斑(e
rythema)、浮腫(edema)、圧痛(tenderness)（痛覚過敏
(hyperalgesia)と呼ばれる）、及び痛み等の臨床症状が
伴なわれる。この複雑な反応には、ヒスタミン、５−ヒ
ドロキシトリプタミン(5-hydroxytryptamine)（５−Ｈ
Ｔ）、アナフィラキシ−遅延反応性物質(slow reacting
substance of anaphylaxis)（ＳＲＳ−Ａ）、種々の化
学走化性因子(chemotactic factor)、ブラジキニン及び
プロスタグランジンのような化学的伝達物質(chemical
mediator)の放出及び作用も含まれる。さらに、食細胞
が炎症領域(area)へ遊走し、細胞性リソソーム膜の破裂
及び溶解酵素の放出を引き起こす。これらの出来事すべ
てが炎症反応に寄与し得る。

炎症反応の作用機構は、医学の初期からの興味の焦点で
あった。ヤナギや他の植物の樹皮が何世紀もの間多くの
文化で医薬として用いられた。１８世紀中頃に、エドム
ント ストーン(Edmund Stone)師が熱のようなおこり(a
gue)の治療におけるヤナギの樹皮の成功例を記載したこ
とが報告されている。１８２７年にラルー(Laroux)は、
ヤナギの樹皮中の活性成分が結局サリチル酸の生産に導
かれるサリン(salin)であることを発見した。

サリチル酸及びアスピリン様薬物が炎症反応の症状の多
くを軽減することに成功したのはよく知られている。し
かしながらこれらの薬物は、重篤な副作用及び障害がな
いわけではない。例えば、アスピリン様薬物は種々の他
の酵素及び細胞システムを阻害又は損なうことがある。
さらに、リウマチ様関節炎(rheumatoid arthritis)、変
形性関節炎(osteoarthritis)及び強直脊髄炎(ankylosin
e spondilitis)のような筋骨格疾患を含む炎症性疾患の
治療については、アスピリン様薬物は、ただ疾患に関連
する痛みや炎症の症状の軽減を与えるに過ぎず、組織に
対する病理学的損傷の進行を阻止しない。一部の開業医
は、該薬物が本来可能でない関節炎の関節の動きを可能
にすることにより損傷を進行させ疾患を悪化させるかも
しれないと考えている。

アスピリン様薬物は、血液損失の結果による２次的貧血
を時々伴なう胃又は腸の潰瘍を誘発する傾向がある。

炎症性疾患の治療に以前に使用された他の薬物は、同様
の重篤な副作用を有する。例えば、ピラゾロン誘導体で
あるフェニルブタゾン(phenylbutazone)は、リウマチ様
関節炎及び関連する疾患の治療のため１９４９年に導入
された。それは、効果のある抗炎症薬ではあるけれど
も、長期間の使用により重篤な毒性の問題を現わす。フ
ェニルブタゾンは、悪心、嘔吐、上腹部の不快感及び皮
膚の発疹をしばしば訴える多くの患者にとって耐え難い
ものであった。下痢、めまい、不眠、多幸感、神経過
敏、血尿及び視朦(blurred vision)も報告された。より
重篤な作用としては、出血又は穿孔(perforation)を伴
なう消化性潰瘍、過敏反応、潰瘍性口内炎(ulceration
stomatitis)、肝炎、腎炎、再生不良性貧血(apiastican
emia)、白血球減少症(leukopenia)及び顆粒球減少症(ag
ranulocytosis)が含まれる。加えて、多くの死亡が特に
再生不良性貧血及び顆粒球減少症の場合に発生した。最
後に、該薬物の毒作用は年配の人々には激しすぎるの
で、この薬物で年配の人々を治療するのは適切ではな
い。

インドメタシンは、抗炎症作用薬の実験的探索の産物で
あり、リウマチ様関節炎や、急性痛風のような関連する
疾患の治療のために１９６３年に導入された。インドメ
タシンは、著効があり広く使用されているが、毒性によ
りその使用はしばしば制限される。高率の患者（３５−
５０％）が不都合な症状を経験し、薬２０％の患者は使
用を中止せざるを得なかったとの報告がある。胃腸症状
としては、食欲不振(anorexia)、悪心(nausea)、腹痛が
含まれる。中枢神経系の作用としては、激しい前頭部の
頭痛、めまい(dizziness)、眩暈(vertigo)、頭のふらつ
き(light-headedness)及び精神錯乱が含まれる。

上記アスピリン様薬物は、通常休養及び物理療法と共に
リウマチ様関節炎のような炎症性疾患の治療に用いられ
る。もし該疾患がこの治療にも拘らず進行する場合に
は、患者は通常次に金又はグルココルチコイド(glucoco
rticoids)で治療される。

金の毒作用は、患者の２５−５０％の範囲でみられ、薬
１０％の患者では重篤な毒性であり、最初は皮膚又は粘
膜に現れる。粘膜の障害は、口内炎(stomatitis)、胃
炎、大腸炎(colitis)及び膣炎(vaginitis)が含まれる。
重篤な血液疾患は自家治療の結果かもしれない。血小板
減少症(Thrombocytopenia)が時々発生し、多くの死亡事
故の原因となっている。白血球減少症、顆粒球減少症、
再生不良性貧血が起こることもある。

グルココルチコイド(glucocorticoids)、コルチゾル(co
rtisol)及びコルチゾルの合成アナログも、炎症を認識
させる局所熱、発赤、腫張及び圧痛の進行を抑制し又は
妨げる能力があるために、リウマチ様関節炎のような炎
症性疾患の治療に使用される。その上、コルチコステロ
イド(corticosteroids)は、刺激因子が放射的(radian
t)、機械的、化学的、伝染性又は免疫性のものである炎
症反応を阻止する。しかしながら、コルチコステロイド
は、単に炎症反応を抑え、該薬物が疾患の進行をマスク
するような方法でそうするに過ぎない。まさに重要なこ
とは、コルチコステロイド治療は、一度始めれば何年間
か又は一生涯継続しなければならないかもしれないこと
である。

腫瘍性疾患(neoplastic disease)の化学療法剤の探索で
発展した免疫抑制剤は、全身性エリテマトーデス(syste
mic lupus erythematosus)、壊死性脈管炎(necrotizing
vasculitis)、強皮症(scleroderma)及びリウマチ様関
節炎(rheumatoid arthritis)のような炎症性疾患への用
途が探査されてきた。そのような薬剤の一つであるサイ
クロホスファミド(cyclophospamide)は数多くの研究対
象とされたが、注意をして始めて使用されるべきであ
る。ナイトロジェンマスタード(nitrogen mustard)のよ
うな急性毒性作用に加えて、サイクロホスファミドは、
不妊症(sterility)、催奇形作用(teratogenic effec
t)、突然変異及びガンを誘導する高い危険性を有してい
る。

上記抗炎症薬の利用にも拘らず、科学者は炎症性疾患の
補助的な及びより良い治療薬を見出そうとして炎症性疾
患の病因の研究を続けた。１つの大変重要な最近の発見
は、傷害及び感染に対する宿主の反応がインターロイキ
ン１(interleukin 1)（以下ＩＬ−１と略す）の産生を
含むことである。ＩＬ−１は、体内で十分な作用を有す
る単核食細胞(mononuclear phagocyte)により主として
産生されるポリペプチド免疫調節性サイトカイン(cytok
ine)である。ＩＬ−１は、内皮細胞(endothelial cel
l)、顆粒球(granulocyte)、破骨細胞(osteoclast)、軟
骨細胞(chondrocyte)、繊維芽細胞(fibroblast)、造血
細胞(hematopoietic cell)、神経細胞及びリンパ細胞(l
ymphoid cell)のような細胞の活動を調和させるのを助
けることで組織の改造、修復及び炎症を媒介する。ジェ
イ，ダブリュー，ラリック(J.W.Larrick)、ネイティブ
インターロイキン１インヒビター(Native interleuki
n 1 inhibitors)、イムノロジー トゥデイ(Immunology
Today)１０，６１−６６（１９８９）の総説参照。Ｉ
Ｌ−１の生物活性には、ヘルパーＴ細胞(T helper cel
l)の活性化、熱の誘導、プロスタグランジン(prostagla
ndin)又はコラゲナーゼ(collagenase)産生の刺激、好中
球化学走性(neutrophil chemotaxis)、急性期蛋白質(ac
ute phase protein)の誘導及び血漿鉄レベルの抑制が含
まれる。ベンダー，アール，イー，(Bender,R.E.)らに
対して１９８８年１２月２７日に発行された米国特許第
４，７９４，１１４号，単球及び／又はマクロファージ
によるインターロイキン１産生の阻害(Inhibition of i
nterleukin-1 production by monocytes and/or macrop
hages)参照。

最近の研究は、リウマチ様関節炎、変形性関節炎(osteo
arthritis)、トキシックショックシンドローム(toxic s
hock syndrome)、ライテル症候群(Reiter’s syndrom
e)、痛風、急性滑膜炎(acute synovitis)、及びエンド
トキシン(endotoxin)により誘導される炎症反応のよう
な他の急性又は慢性の炎症性疾患のような疾患を悪化さ
せ及び／又は引き起こす過剰の又は未調節のＩＬ−１産
生に関係している。ベンダー，アール，イー，(Bender,
R.E.)らに対し１９８８年１２月２７日に発行された米
国特許第４，７９４，１１４号，単球及び／又はマイク
ロファージによるインターロイキン１産生阻害(Inhibit
ion of interleukin-1 production by monocytes and/o
r macrophage)参照。

従って、当該分野の研究者は、ＩＬ−１のインヒビター
で炎症性疾患の治療をすることを考えた。ＩＬ−１阻害
の機構は様々であり、ＩＬ−１転写を制限すること、イ
ンターロイキン１レセプターと直接に結合することでＩ
Ｌ−１の結合を妨げること及びＩＬ−１レセプターの活
性を制限する他の部位に作用することが含まれる。

ジェイ．ダブリュー．ラリック(J.W.Larrick)によるイ
ムノロジー トゥディ(Immunology Today)１０：６１−
６６（１９８９）中の、ネイティブ インターロイキン
１インヒビター(Native interleukin 1 lnhibitors)と
いう表題の最近の総説は、尿由来インヒビター（１９８
９年３月９日に公開されたデイエル(Dayer)らの、ＰＣ
Ｔ特許出願Ｗ０８９／０１９４６、ＰＣＴ第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ８８／０２８１９号参照）、ウロモジュリン(uromodu
lin)単球−マイクロファージ由来のインヒビター（ハン
ナム，シー．エイチ．(Hannum,C.H.)ら、ヒトインター
ロイキン−１インヒービターのインターロイキン−１ア
ンタゴニスト活性(Interleukin-1 receptor antagonist
activity of a human interleukin-1-inhibitor)、ネ
イチャー(Nature)３４３：３３６−３３４０（１９９０
年１月２５日）；アイゼンバーグ，エス．ピイ．(Eisen
berg,S.P.)ら、ヒトインターロイキン−１レセプターア
ンタゴニストの相補ＤＮＡ由来の一次構造及び機能発現
(Primary structure and functional expression from
complementary DNA of a human interleukin-1 recepto
r antagonist)、ネイチャー(Nature)３４３：３４１−
３４６（１９９０年１月２５日）も参照）、及びウイル
スに感染したマクロファージを含むＩＬ−１インヒビタ
ーについて論じている。

より最近の記事は、これらインヒビターはいずれも精製
及び特定されていないことを示唆している。ハンナム、
シー．エイチ．(Hannum,C.H.)ら、ヒトインターロイキ
ン−１インヒビターのインターロイキン−１レセプター
アンタゴニスト活性(interleukin-1 receptor antagoni
st activity of a human interleukin-1-inhibitor)、
ネイチャー(Nature)３４３：３３６−３３４０（１９９
０年１月２５日）。

ＩＬ−１の非天然インヒビター(nonnative inhibitor)
も論じられている。例えば１９８９年９月２６日にジ
ー．ク(G.Ku)に発行された、インターロイキン−１の放
出を阻止する方法(Method of inhibiting interleukin-
1 release)と題した米国特許第４，８７０，１０１号
（抗酸化特性を持つ化合物を提供する）、１９８８年１
０月２５日にベンダー(Bender)らに発行された、単球及
び／又はマクロファージによるインターロイキン−１の
阻害(Inhibition of interleukin-1 by monocytes and/
or macrophage)と題した米国特許第４，７８０，４７０
号（４，５−ジアリール−２（置換−イミダゾール）の
用途に関する。）、１９８８年１０月１８日にベンダー
(Bender)らに発行された、単球及び／又はマクロファー
ジによるインターロイキン１産生阻害(Inhibition of i
nterleukin-1 production by monocytes and/or macrop
hage)と題した米国特許第４，７７８，８０６号（２−
２′［１，３−プロパン−２−オンジイル−ビス（チ
オ）］ビス−１Ｈ−イミダゾールの用途に関する。）、
１９８８年１２月２７日にベンダー(Bender)らに発行さ
れた、単球及び／又はマクロファージによるインターロ
イキン−１産生阻害(Inhibition of interleukin-1 pro
duction by monocytes and/or macrophages)と題した米
国特許第４，７９４，１１４号（チアゾールピロリジ
ン，チアジド(thiazide)又はピペリジン環に融合したジ
アリール基で置換されたイミダゾールの用途に関す
る。）参照。

入手できるＩＬ−１インヒビターの数にも拘らず、グル
ココルチコイドだけが転写時及び転写後のレベルでＩＬ
−１を阻害するものと信じられている。上述のようにグ
ルココチコイドは、特に長期間の治療に関係すると重篤
な副作用を現わす。

従って、当該技術分野では炎症性疾患の治療に使用でき
るＩＬ−１インヒビターへの必要性が存在する。該必要
性は、他の疾患の治療に有益な効果があるために研究さ
れてきたＩＬ−１インヒビターにより最もよく満たされ
るように思われる。耐性レベルだけでなく副作用及びあ
らゆる可能性のある毒性がそのようなインヒビターでは
知られているからである。

最近興味を集めている薬剤の一つは、造血成長因子(hem
atopoietic growth factor)として機能するコロニー刺
激因子(colony stimulating factor)の一つであるマク
ロフアージコロニー刺激因子(macrophage colony stimu
lating factor)である。この薬剤は、種々の疾患の治療
に有益であることが発見されていているため有望なもの
である。例えば、Ｍ−ＣＳＦは、白血球の機能を促進す
ることができ、それゆえ種々の感染症を予防及び治療す
る薬物として効果的である（ロペツ，エイ．エフ．(Lop
ez,A.F.)ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２９８３
（１９８３）；ハンダム，イー．(Handam,E.)ら、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２２，：１１３４（１９７９）；
及びバダス，エム．エイ．(Vadas,M.A.)ら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．，１３０：７９５（１９８３）。加えて、Ｍ
−ＣＳＦは、その分化誘導活性のため骨髄性白血病の治
癒に効果があることが見出されている（メトカルフ，デ
ィー．(Metcalf,D.)ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３
０：７７３（１９８２））。Ｍ−ＣＳＦはまた、ガンの
化学療法及び放射線療法の結果として生じた白血球減少
(Ieukopenia)を軽減すると考えられている（ヨーロッパ
特許第２６１５９２号公報）。

しかしながら、炎症性疾患の治療におけるＭ−ＣＳＦの
使用は、以前の報告が成長因子Ｍ−ＣＳＦがＩＬ−１産
生を阻害するというよりむしろＩＬ−１産生を促進する
ことを示唆していたために驚くべきことであろう。例え
ば、ムーア，アール．エヌ．(Moore,R.N.)ら、コロニー
刺激因子で活性化されたマクロファージによるリンパ球
活性化因子［インターロイキン１］の進行(Procedure o
f Lymphocyte Activating Factor[Interleukin1]by Mac
rophages activated with colony stimulating factor
s)、ジャーナル・オブ・イムノロジー(Journal of Immu
nology)，１２５：１３０２（１９８０）及びクーラン
ド，ジェイ．アイ．(Kurland,J.I.)ら、正常及び腫瘍性
マクロファージのプロスタグランジンＥ合成の誘導(Ind
uction of Prostaglandin E Synthesis in Normal and
Neoplastic Macrophages)；骨髄前駆細胞(Myeloid Prog
enitor Cell)の増殖に関する効果とは区別されるコロニ
ー刺激因子の役割(Role of Colony Stimulating Factor
s Distinct from Effects on Myeloid Progenitor Cell
s)、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシーズ(Proceedings of the Na
tional Academy of Sciences)７６：２３２６（１９７
９）は、ネズミ(murine)腹膜の(peritoneal)マクロファ
ージによるＩＬ−１及びプロスタグランジンＥ_２（以下
ＰＧＥ_２と略す）の産生を論じており、Ｍ−ＣＳＦが炎
症のメディエイタ(mediator)であるＩＬ−１及びＰＧＥ
_２の産生に関与し、これにより炎症反応の進展に関与す
ることを示唆している。

発明の開示 本発明は、従来技術の問題点及び不利益を克服するもの
であり、インターロイキン１（以下ＩＬ−１と略す）の
生物活性を阻害するのに効果のある量のマクロファージ
コロニー刺激因子(macrophage-colony stimulating fac
tor)（以下Ｍ−ＣＳＦと略す）を投与することにより炎
症性疾患を治療するものであり、従来技術の観点から見
ると驚くべき効果を現わすものである。本発明はまた、
ＩＬ−１のインヒビターの産生を引き起こすのに有効な
量のＭ−ＣＳＦを投与することにより炎症性疾患を治療
するものである。

本発明はまた、薬学的に効果のある量のＭ−ＣＳＦを投
与することによりアレルギー性疾患を治療するものであ
る。

即ち、本発明は、Ｍ−ＣＳＦの有する優れた抗炎症作用
及び抗アレルギー作用に基づき、該Ｍ−ＣＳＦを有効成
分とする抗炎症剤及び抗アレルギー剤を提供するもので
ある。

添付図面は、一体となって本明細書の一部を構成し、本
発明の好適ないくつかの実施例を説明し、明細書ととも
に本発明の本質を説明するものである。

第１図はＩＬ−１，ＩＬ−６及びＴＧＦ−βの発現を説
明するマクロファージのｍＲＮＡのノザンブロット分析
の結果を示す。

第２図は、ＬＰＳ，Ｍ−ＣＳＦ及びＬＰＳとＭ−ＣＳＦ
とを組合せたもので処理したマクロファージから得たＩ
Ｌ−１α及びＩＬ−６のｍＲＮＡの発現を示すラジオオ
ートグラフである。

第３図は、Ｍ−ＣＳＦ，ＬＰＳ及びＬＰＳとＭ−ＣＳＦ
とを組合せたものの存在下でマクロファージにより産生
されたＩＬ−１のバイオアベイラビリティーを示すグラ
フである。

第４図は、ＬＰＳ、Ｍ−ＣＳＦ及びＬＰＳとＭ−ＣＳＦ
とを組合せたものの存在下でのＩＬ−１インヒビターの
産生を示すグラフである。

第５図は、ＬＰＳ，Ｍ−ＣＳＦ及びＬＰＳとＭ−ＣＳＦ
とを組合せたものの存在下でのＩＬ−６インヒビターの
産生欠損を示すグラフである。

第６図は、ＱＡＥ−５２カラム内でＩＬ−１からのＩＬ
−１インヒビターの分離を示すグラフである。

第７図は、ＩＬ−１及びＩＬ−１インヒビターのＩＬ−
１レセプターに結合する能力を示すグラフである。

第８図は、ＴＮＦの作用に関するＩＬ−１インヒビター
の効果を示すグラフである。

第９図は、Ｔ−細胞のＩＬ−２に対する反応についての
ＩＬ−１及びＩＬ−１インヒビターの効果を示すグラフ
である。

第１０図は、ＩＬ−１セレプターとの結合及び生物活性
ＩＬ−１の阻害についてのバイオアッセイによるＩＬ−
１インヒビターの活性及び逆相ＨＰＬＣ Ｃ−４カラム
でのＩＬ−１インヒビターの精製を示すグラフである。

以下、添附図面にての実施例が示されている本発明の現
在の好適な実施態様について説明する。

本発明において使用される「炎症性疾患」という表現
は、これらに限定されるものではないが、痛風、リウマ
チ様関節炎(rheumatoid arthritis)、強直性脊椎炎(ank
ylosine spondilitis)全身性エリテマトーデス(systemi
c lupus erythematosus)強皮症(scleroderma)、シェー
グレン症候群(Sjogren’s syndrome)、混合型結合組織
病(mixed connective tissue disease)(MCTD)、ライテ
ル症候群(Reiter syndrome)、全身性壊死性脈管炎(syst
emic necrotizing vasculitis)、過敏性脈管炎(hyperse
nsitivity vasculitis)、側頭動脈炎(temporal arterit
is)、ウエグナー肉芽腫症(Wegner’s granulomatsus)、
サルコイドーシス(sarcoidosis)、川崎病(Kawasaki’s
disease)、閉塞性血栓性血管炎(Buerger’s disease)、
正中線肉芽腫(midline granuloma)、乾癬性関節炎(psor
iatic arthritis)、関節の炎症性疾患、インシュリン耐
圧糖尿病(insulin resistant diabetes)、橋本甲状腺炎
(Hashimoto thyroiditis)、若年性自己免疫性糖尿病(ju
venile autommune diabetes)、重症筋無力症(myastheni
a gravis)、潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)、硬変
(cirrhosis)及び自己免疫性ブドウ膜炎(autoimmune uve
itis)を含む。

従って、本発明の抗炎症剤によって処置される炎症は、
これらに限定されるものではないが、上記アレルギー疾
患を包含し例示された炎症性疾患を代表とする各種の疾
患に起因する炎症が包含される。

また、本発明において、Ｍ−ＣＳＦという用語はマクロ
ファージコロニー刺激因子(macrophage colony stimula
ting factor)を指す。本発明において、炎症性疾患の治
療に使用できるＭ−ＣＳＦは、造血成長因子(hematopoi
etic growth factor)、コロニー刺激因子(colony stimu
lating factor)のファミリーの一つである。コロニー刺
激因子(Colony-stimulating factor)（以下ＣＳＦと略
す）は、骨髄、胎児の肝臓及び他の造血器官の前駆細胞
から生じる造血細胞のコロニーの成長を促進する。既述
のように、特に興味あるＣＳＦは、マクロファージコロ
ニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ，ＣＳＦ−１としても知られ
ている）である。Ｍ−ＣＳＦは、マクロファージとして
も知られている単核食細胞の系統の細胞の増殖及び分化
を促進する。炎症の後にのみ存在する顆粒球マクロファ
ージ−ＣＳＦのような他のＣＳＦと異なり、Ｍ−ＣＳＦ
は、線維芽細胞産生の結果として体液中に非炎症条件下
でさえ存在する。

Ｍ−ＣＳＦは、天然のＭ−ＣＳＦ又は組換えＭ−ＣＳＦ
及びその誘導体（例えばヨーロッパ特許公報第２６１５
９２号及び第３２８０６１号；及び米国特許第４，８６
８，１１９号及び第４，８７９，２２７号に記載されて
いるもの）の両方を指す。該Ｍ−ＣＳＦは、ヒト又は他
の哺乳動物起源のもののいずれでもよいが、ヒト起源の
ものが好ましい。天然のＭ−ＣＳＦの特に好適な起源
は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(America
n Type Culture Collection)（以下、ＡＴＣＣと略す）
から得られるＬ９２９線維芽細胞(fibroblast cell)で
ある。

組換えＭ−ＣＳＦ及びその誘導体については、更に後記
に詳述するが、ここでＭ−ＣＳＦ誘導体は、便宜上、下
式（１）で表わされるアミノ酸一次配列を参照すること
により呼称される。

式（１）： ［式中ＸはTyr又はAspを示す。］ 即ち、式（１）の１位Gluから５２２位Valまでのアミノ
酸配列を基準とし、該配列に従って、例えば置換、欠
失、付加等により修飾された各種誘導体が示される。場
合により、これらは慣用に従い略記され、例えば、Ｍ−
ＣＳＦ−（３−１５３）、又はＭ−ＣＳＦ−（４−１５
３）は順次、式（１）の３位Val又は４位Serから１５３
位thrまでのアミノ酸配列のポリペプチドからなる活性
体を示す。

組換Ｍ−ＣＳＦ及びその誘導体としては、それらがＭ−
ＣＳＦ本来の生理活性を有する限りにおいていずれも本
発明に好適に採用されるが、式（１）の全アミノ酸一次
配列を有するか、または、式（１）の１位Gluから５位G
luの領域のいずれかにＮ末端を有し、１５３位Thrから
５２２位Valの領域のいずれかにＣ末端を有し、且つＮ
末端にMetを付加されることのあるアミノ酸一次配列を
有するＭ−ＣＳＦが好ましい。とくに好適な例は、例え
ば、Ｎ末端にMetを付加されることのある、式（１）の
３位Val又は４位Serから１５３位Thr又は２１４位Proま
でのアミノ酸一次配列を有する生物活性なＭ−ＣＳＦ誘
導体及び組換Ｍ−ＣＳＦ等が挙げられる。

ＬＰＳで処理したマクロファージのＩＬ−１及びＩＬ−
６の発現を測定するためのインビトロ(in vitro)試験で
述べたように、既述の従来技術とは対照的に本発明のＭ
−ＣＳＦはＩＬ−１又はＩＬ−６の遺伝子の発現を促進
しない。加えて、インビトロ(in-vitro)試験で測定され
たように、本発明のＭ−ＣＳＦは、ＬＰＳで処理された
マクロファージからＩＬ−１，ＩＬ−６又はＰＧＥ_２の
産生を促進しない。

それどころか、本発明のＭ−ＣＳＦは、ＩＬ−１の生物
活性を阻害するのに効果のある量を投与することにより
炎症性疾患と診断された患者の治療に用いることができ
る。例えば、後記実施例に示すように、Ｍ−ＣＳＦを用
いた前処理又は共処理(cotreatment)により、インビト
ロ(in vitro)でマクロファージの機能を強力に刺激する
ものとして知られている細菌性エンドトキシン(bacteri
al endotoxin)であるリポポリサッカライド(lipopolysa
ccharide)（以下ＬＰＳと略す）に対する応答で産生さ
れた生物活性ＩＬ−１の産生を阻害することができる。
同様に、後記の実施例で示されるように、Ｍ−ＣＳＦの
前処理により、インビボ(in vivo)でＬＰＳに対する応
答で産生された生物活性ＩＬ−１の産生を阻害すること
ができる。

本発明のＭ−ＣＳＦはまた、ＩＬ−１のインヒビターの
産生を引き起こすのに効果のある量のＭ−ＣＳＦを投与
することにより炎症性疾患と診断された患者の治療にも
使用できる。以下の実施例を示すように、Ｍ−ＣＳＦの
投与は、インビトロ(in vitro)でＬＰＳの処理に反応し
たＩＬ−１の生物活性を減少させるＩＬ−１のインヒビ
ターの産生を刺激するらしい。本明細書において、イン
ターロイキン−１（以下ＩＬ−１と略す）は、特に免疫
複合体、細菌生産物又はＴ−細胞と相互作用をした後で
マクロファージにより産生される因子である。ＩＬ−１
は、胸腺細胞(thymocyte)の増殖及びＴ−細胞の成熟を
促進し、それら自身の成長を促進する分子を放出させ
る。ＩＬ−１はまた熱を誘発する。熱は、高度のＴ−細
胞活性の結果として生ずる抗原に対する急性反応である
と考えられる。

既述のように、ＩＬ−１は炎症の蛋白質メディエイタ(m
ediator)である。ラリック，ジェイ．ダブリュー．(Lar
rick,J.W.)ら、炎症反応における腫瘍壊死因子(tumor n
ecrosis factor)及びインターロイキン−１の役割(The
role of tumor necrosis factor and interleukin-1 in
the inflammation response)ファーマンシューティカ
ルリサーチ(Pharmaceutical Research)５（３）：１２
９−１３９（１９８８）の総説に述べられているよう
に、ＩＬ−１は、内皮細胞、白血球及び線維芽細胞の炎
症機能を調節し、炎症部位における顆粒球の集積を促進
するのであろう。シー，ピー．ジェイ．マウリー(C.P.
J.Maury)インターロイキン１及び炎症性疾患の病因(Int
erleukin 1 and Pathogenesis of Inflammatory Diseas
es)Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｓｃａｎｄ ２２０：２９１−
４（１９８６）も参照。

ＩＬ−１は天然に存在するＩＬ−１α、天然に存在する
ＩＬ−１β、組換え(recombinant)ＩＬ−１α、組換え
ＩＬ−１β及びヨーロッパ特許公報第２３７０７３号、
ヨッロッパ特許公報第２３７９６７号、ＰＣＴ公報第８
９／０１９４６号（オッペンハイム，ジェイ．ジェイ．
(Oppenheim,J.J.)ら、イムノロジートゥディ(Immunol.T
oday)７：４５（１９８６）も参照）に記載されている
ようなＩＬ−１α及びＩＬ−１βの誘導体を意味する。
ＩＬ−１とヒト又は他の哺乳類起源のものでもよいが、
ヒト起源のものが好ましい。

本明細書において使用される用語の“ＩＬ−１インヒビ
ター”は、炎症を媒介し又は進行させるようなＩＬ−１
の生物活性を阻害することができる因子を指す。生物活
性の阻害は、トガワ，エイ．(Togawa,A.)ら、ヒト単核
細胞により産生される白血球活性化因子の特性づけ(Cha
racterzation of Lymphocyte Activating Factor Produ
ced by Human Mononouclear Cells)：ＬＡＦの高及び低
分子量型の生化学的関係(Biochemical Relationship of
High and Low Molecular Weight Forms of LAF)、Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：２１１２（１９７９）に記載
されたＩＬ−１バイオアッセイのような当業者に周知の
数多くのＩＬ−１活性のための試験を用いて評価でき
る。

加えて，本発明のＩＬ−１インヒビターは、ＩＬ−１レ
セプターに結合できる因子(agent)を指している。その
ような特徴は、例えばキリアン，ティー．エル．(Kilia
n,T.L.)ら、インターロイキン１アルファ及びインター
ロイキン１ベータのＴ−細胞上の同一レセプターへの結
合(Interleukin1 Alpha and Interleukin1 Beta Bind t
o the Same Receptor on T Cells)、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３６：４５０９（１９８６）に記載されたような
技術を用いて当業者により容易に測定される。

本発明のＩＬ−１インヒビターの産生は、Ｍ−ＣＳＦに
より影響を受ける。好適な実施態様において、ＩＬ−１
インヒビターは、Ｍ−ＣＳＦにより調節される結果Ｍ−
ＣＳＦの投与量を増加させるとＩＬ−１生物活性のより
大きな阻害を引き起こす。

他の好適な実施例において、該インヒビターはＩＬ−１
に特異的でありＩＬ−２，ＩＬ６又はＴＮＦ（腫瘍壊死
因子(tumor necrosis factor)）の活性を調節しない。

本発明は、薬学的に効果のある量のＭ−ＣＳＦの投与に
よるＩＬ−１の生物活性の阻害に関する。ここで使用さ
れるように、薬学的に効果のあるというのは既述の炎症
性疾患の何らかの症状を軽減できる薬剤の量を指す。当
業者には知られているが、炎症性疾患の症状には、紅斑
(erythema)、浮腫(edema)、圧痛(tenderness)、痛覚過
敏(hyperalgesia)及び痛みが含まれる。これらの症状を
軽減するＭ−ＣＳＦの投与量は、１μｇ／ｋｇ〜１００
mg／ｋｇの範囲にあり、特に好適な投与量は１mg／ｋｇ
〜３５mgｋｇの範囲である。

当業者であれば、当該分野で知られている技術を用いて
本発明のＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−１インヒビターの投与量
を最適化することができるであろう。それらの技術は、
例えばグッドマン(Goodman)及びギルマン(Gilman)の治
療の薬理学的基礎(The Pharmacological Basis of Ther
apeutics)、第５巻１９−２８頁、（１９７５）に記述
されている。投与量は確立された試験及び一般的な用量
−反応研究(dose-response studies)により確認され、
最適化され得る。治療のための適当な投与量を決定する
ために必要な推定を更に改善することは、当業者により
機械的に(routinely)なされ、過度の実験作業なしに当
業者により機械的になされる仕事の工程に含まれる。加
えて、本発明の方法により投与されるＭ−ＣＳＦ又はＩ
Ｌ−１インヒビターの投与量は、例えば治療を受けるべ
き炎症性疾患、投与方法、年令、投与される者の体重及
び性別により変化するであろう。

本発明は、Ｍ−ＣＳＦ又はＩＬ−１インヒビターを投与
するいかなる方法をも想定している。そのような投与方
法の例としては、静脈内、筋肉内、局所、経皮、注射、
経口及び非経口が含まれる。好適な投与は当該部位への
局所投与である。

本発明のＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−Ｌインヒビターは、単独
で又は既述の一般的な抗炎症薬と組合せて投与できる。

適当な薬学的に許容された担体、賦形剤及びアジュバン
ド(adjuvant)が患者の治療に使用するために望ましい組
成物を調整するために本明細書で記載された化合物とと
もに使用できる。本発明の薬剤上の(pharmacentical)組
成物は、固体又は液体の薬学的に許容された毒性のない
担体とともにＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−１インヒビター化合
物を含むものであろう。そのような薬剤上の担体は、ピ
ーナッツ油、大豆油、鉱油、セサミ油のような石油、動
物又は植物又は合成起源のものを含む水及び油のような
無菌の液体であってもよい。水は、薬剤上の組成物が静
脈から投与されるときに好適な担体である。生理食塩水
溶液、デキストロース及びグリセロールの水溶液もま
た、特に注射可能な溶液用の液体担体として使用でき
る。加えて、本発明の化合物は、ギデオン ストラスマ
ン(Gideon Strassmann)により１９９０年４月６日に出
願された同時係属米国出願第０７／５０５，５８４号に
記載されているように、リポソームと会合させることが
できる。該米国出願の内容は、ここに引出し本明細書の
一部をなす。好適な薬剤上の賦形剤はデンプン、グルコ
ース、ラクトース、シュクロース、ゼラチン、モルト(m
alt)、ライス、小麦粉、胡粉(chalk)、シリカゲル、炭
酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリ
ン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タル
ク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロー
ル、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれ
る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤(pil
ls)、カプセル、粉末、除放性処方等の形態をとること
ができる。好適な薬剤上の担体は、イー．ダブリュー．
マッチン(E.W.Martin)によりレミントン薬剤学(Remingt
on’s Pharmaceutical Sciences)に記載されている。そ
のような組成物は、患者への適切な投与のための形態で
提供するために好適な量の担体とともに治療上の効果的
な量の活性化合物を含む。本発明の化合物は、患者の治
療に使用できる。患者は、動物、例えば犬、猫、モルモ
ット、マウス及びラットと同様にヒトを含む哺乳類を意
味する最も広い意味で用いられる。

また、既述のように、本発明は、前記Ｎ末端にＭｅｔを
付加されることのある、前記式（１）の３位Val又は４
位Serから１５３位Thr又は２１４位Proまでのアミノ酸
一次配列を有する生物活性な組換え型ヒトＭ−ＣＳＦ誘
導体等をはじめとするＭ−ＣＳＦ誘導体を包含する、本
明細書で特定するＭ−ＣＳＦを有効成分とする抗アレル
ギー剤の用途にも関するものである。

以下、本発明において有効成分として利用するＭ−ＣＳ
Ｆ誘導体の製造方法につき詳述すれば、該誘導体は例え
ばこれをコードする遺伝子を利用して、該遺伝子が宿主
細胞中で発現されるような組換えＤＮＡを作成し、これ
を宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換株を培養
することにより製造することができる。

上記Ｍ−ＣＳＦ誘導体の製造に用いられる遺伝子は、Ｍ
−ＣＳＦ産生能を有する各種のヒト細胞、より具体的且
つ有利にはＡＧＲ−ＯＮ［特開昭５９−１６９４８９号
公報記載の特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト培
養株化細胞、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ＡＴＣＣ）に「ＡＴＣＣ受託No.ＣＲＬ−８１
９９」として受託］より分離されたｍＲＮＡから調製で
きる。該ＡＧＲ−ＯＮからのｍＲＮＡの分離のための抽
出操作は、例えばグアニジウム／熱フェノール法〔Guan
idinium／Hot Phenol method，T.Maniatis，E.F.Fritsc
h and J.Sambrook，Molecular Cloning，p194-195(Cold
Spring Harbor Laboratory)，1982〕やグアニジウム／
塩化セシウム法〔Guanidinium／Cesium Chloride metho
d，T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambrook，Molecul
ar Cloning，p196(Cold Spring Harbor Laboratory)，1
982〕等に従い実施でき、精製されたｍＲＮＡのｃＤＮ
Ａへの変換、即ち目的遺伝子の合成は例えばオカヤマ−
バーク法〔H.Okayama and P.Berg，Molecular and Cell
ular Biology，vol.3，p280(1983)〕やブラーホフマン
法〔V.Gubler and B.J.Hoffman，Gene，vol.25，p263-2
69(1983)〕等に従い実施でき、かくして得られるＤＮＡ
の宿主細胞への導入による形質転換法及び形質転換体か
らの目的のＭ−ＣＳＦｃＤＮＡを有する株の選出は、い
ずれも通常の方法に従い行なうことができる。之等の詳
細は特開平１−１０４１７６号公報に示される通りであ
る。また上記で用いられるＭ−ＣＳＦ遺伝子としても該
公報記載のものを有利に利用できる。

尚、上記遺伝子は例えばホスファイト トリエステル法
〔Nature，31，105(1984)〕等の常法に従い核酸の化学
合成等により製造することもできる。之等の方法におい
て一部ＤＮＡの化学合成やＤＮＡ鎖の切断、削除、付加
乃至は結合を目的とする酵素処理やＤＮＡの単離、精製
乃至複製、選別等の各種操作乃至手段は、いずれも常法
に従うことができる。例えば上記ＤＮＡの単離精製は、
アガロースゲル電気泳動法等に従うことができ、核配列
のコドンの一部の改変は、サイトースペシフィック ミ
ュータジェネシス(Site-Specific Mutagenesis)〔Proc.
Natl.Acad.Sci.，81，5662-5666(1984)〕等に従うこと
ができる。尚、上記において所望のアミノ酸に対応する
遺伝暗号の選択は、特に限定されるものではなく、利用
する宿主細胞のコドン使用頻度等を考慮して、常法に従
い決定することができる。また、上記方法に従い得られ
る目的遺伝子のＤＮＡ配列の決定及び確認は、例えばマ
キサム、ギルバート(Maxam-Gilbert)の化学修飾法〔Met
h.Enzym.，65，499-560(1980)〕やＭ１３ファージを用
いるジテオキシヌクレオチド鎖終結法〔Messing，J.and
Vieira，J.，Gene，19，269-276(1982)〕等により行な
い得る。

本発明に利用するＭ−ＣＳＦ誘導体は、上記で得られる
遺伝子を利用して、遺伝子組換え技術により容易に且つ
大量に製造、収得できる。該方法は、上記特定の遺伝子
（ＤＮＡ）の利用を必須として、基本的には一般的な遺
伝子組換え技術に従い行ない得る〔Molecular Clonin
g，T.Maniatis et al.，Cold Spring Harbor Laborator
y(1982)等参照〕。

より詳細には、Ｍ−ＣＳＦ遺伝子が宿主細胞中で発現で
きるような組換えＤＮＡを作成し、これを宿主細胞に導
入して形質転換し、該形質転換株を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいず
れをも使用でき、原核生物の宿主としては大腸菌や枯草
菌が一般によく用いられる。本発明では、例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中にＭ−ＣＳＦ遺伝子が発現できるように、該遺伝
子の上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・
ダルガーノ）配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コド
ン（例えばATG）を付与した発現プラスミドを使用する
ことができる。上記宿主菌としての大腸菌としては、エ
シエリヒアコリ(Escherichia coli)Ｋ１２株等がよく用
いられ、ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２がよく用
いられるが、之等に限定されず公知の各種の菌株及びベ
クターをいずれも利用できる。プロモーターとしては例
えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモータ
ー、lacプロモーター、P_Lプロモーター等を利用でき、
いずれも目的遺伝子を発現させ得る。

上記遺伝子を利用してＭ−ＣＳＦ誘導体を製造するため
の一つの好ましい方法としては、宿主細胞として大腸菌
等の原核生物を用い、２・シストロン法により目的蛋白
を発現させる方法を例示できる。この方法は連続する二
つのシストロンよりなる遺伝子発現システムであり、こ
れによれば目的とするヒトＭ−ＣＳＦ誘導体を宿主細胞
内に安定して且つ多量に生産蓄積させることができる。

該２・シストロン法に従うＭ−ＣＳＦ誘導体の製造につ
き詳述すれば、まずファーストシストロン(first cistr
on)としての適当なポリペプチドをコードする遺伝子と
セカンドシストロン(second cistron)としてのＭ−ＣＳ
Ｆ遺伝子との、二つのシストロンを含む発現プラスミド
を作成する。該プラスミドはまたファーストシストロン
の上流に該遺伝子の発現のためのプロモーター及びＳＤ
配列が配置されていると共に、その下流であって且つセ
カンドシストロンの上流に、セカンドシストロンの発現
のためのＳＤ配列とファーストシストロンの終止コドン
とセカンドシストロンの開始コドンとを、この順序で含
む合成リンカーが配置されていることが重要である。

上記におけるファーストシストロンとしての遺伝子とし
ては、宿主によりこれが発現され得るものである限り、
合成遺伝子でも天然物由来のものでもよく、その発現に
よりＭ−ＣＳＦ誘導体とは異なるポリペプチドが同一系
内に生産され、引続き該ポリペプチドの分離が必要とな
ることを考慮すれば、該ポリペプチドは疎水性であり且
つＭ−ＣＳＦ誘導体とは充分に離れた分子量を有するも
のであるのがよい。上記ファーストシストロンは、かか
るポリペプチドをコードするものであるのが望ましい。
その具体例としては、例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−α、−
β、−γ等をコードする遺伝子及びそれらの断片であ
り、約５０〜１００のアミノ酸残基をコードするものを
例示できる。

上記ファーストシストロンの上流に配置させるプロモー
ター及びＳＤ配列としては、それぞれ従来公知の各種の
ものを使用でき、プロモーターとしては、例えばtrpプ
ロモーター、tacプロモーター、P_Lプロモーター、P_Rプ
ロモーター、lppプロモーター、OmpAプロモーター、lac
プロモーター等を、特に好ましくはtrpプロモーター、P
_Lプロモーター、P_Rプロモーター等を例示できる。また
ＳＤ配列としては原核細胞の１６ＳｒＲＮＡの３′末端
と水素結合を形成できる３〜９塩基対の配列、例えばGG
AG、AGGA等を例示できる。

また上記ファーストシストロンとセカンドシストロンと
の間に介在させる合成リンカーにおける開始コドン及び
終止コドンは、天然界に存在するすべてのものでよい。
之等はそれぞれ完全な形、例えばTGA及びATG等として利
用される必要はなく、両者の一部オーバーラップした
形、例えばTGATG、TAATG等として利用することもでき
る。上記２・シストロン法に利用される発現プラスミド
の構築は、通常の方法に従い実施できる。

特に好ましい一つの方法によれば、まずＭ−ＣＳＦ遺伝
子を含むプラスミドを適当な制限酵素で切断し、Ｍ−Ｃ
ＳＦ遺伝子を含む断片を常法に従い単離精製する一方、
上記合成リンカーを常法に従い例えばＤＮＡシンセサイ
ザー等を用いて合成し、これを上記で得られた断片のＭ
−ＣＳＦ遺伝子の上流側に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用
いて連結させ、次いで得られるＤＮＡ断片を、ファース
トシストロンを含みこれを発現可能なプサスミドの所定
位置に組込む方法を例示できる。また上記方法により得
られるセカンドシストロンと合成リンカーとを連結され
たＤＮＡ断片の上流に、予めファーストシストロンを連
結後、該ＤＮＡ断片を適当な蛋白質発現系を有するプサ
スミドに組込む方法によっても、所望の２・シストロン
法に好適な発現プラスミドを得ることができる。

上記で得られるプラスミドを適当な宿主細胞に導入して
これを形質転換させることにより、２・シストロン法に
よる所望の形質転換体を収得でき、該形質転換体の利用
によれば、ファーストシストロンに係わる蛋白質とセカ
ンドシストロンに係わる所望のＭ−ＣＳＦ誘導体とを、
それぞれ別個に発現させ得る。之等は通常の方法、例え
ばＳＤＳ−ＰＡＧＥやウエスタンブロッティング法等に
より解析、確認でき、また後記する各種の方法によりそ
れぞれ分離、精製できる。

かくして得られる所望の形質転換体は、常法に従い培養
でき、該培養によりＭ−ＣＳＦ誘導体が生産、蓄積され
る。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細
胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択使用するこ
とができる。宿主細胞として大腸菌等を利用した形質転
換体の培養には、例えばＬＢ培地、Ｅ培地、Ｍ９培地、
Ｍ６３培地等を使用でき、之等培地には更に必要に応じ
て通常知られている各種の炭素源、窒素源、無機塩、ビ
タミン類、天然物抽出物、生理活性物質等を添加するこ
ともできる。

上記形質転換体の培養条件としては、宿主細胞の生育に
適した条件を採用でき、大腸菌の場合は例えばpH約５〜
８、好ましくは７又はその付近、温度約２０〜４３℃、
好ましくは３７℃又はその付近を採用できる。

上記により、形質転換体の細胞内に目的とするＭ−ＣＳ
Ｆ誘導体が生産、蓄積される。これはその物理学的性
質、化学的性質等を利用した各種の分離操作により分離
精製できる。該方法としては、具体的には通常の再構成
処理、蛋白沈澱剤による処理、遠心分離、浸透圧ショッ
ク法、超音波破砕、限外過、分子篩クロマトグラフィ
ー（ゲル過法）、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティククロマトグラフ
ィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各
種液体クロマトグラフィー透析法、之等の組合せ等を例
示でき、かかる分離精製操作の採用により、容易に高収
率、高純度で、所望のＭ−ＣＳＦ誘導体を工業的規模で
製造できる。

かくして得られるＭ−ＣＳＦ誘導体は、その製造のため
に利用される遺伝子や該遺伝子の発現のための発現系の
種類等に応じて、そのＮ−末端アミキ酸配列や分子量等
を若干異にし、殊に該誘導体の発現の過程で開始コドン
に対応するMet残基がＮ末端に付加されることがあり得
るが、いずれもＣＳＦ活性を有する点については共通し
ている。

本発明の抗アレルギー剤の有効成分としては、上記式
（１）のアミノ酸配列の１位Gluから５位Gluの領域のい
ずれかにＮ末端（該Ｎ末端にはMetが付加されることが
ある）を有し、１５３位Thrから５２２位Valの領域のい
ずれかにＣ末端を有しているＭ−ＣＳＦ誘導体が好まし
い。

これらのうちでも、前記の如く、Ｎ末端にMetを付加さ
れることのある、式（１）の３位Val又は４位Serから１
５３位Thr又は２１４位Proまでのアミノ酸一次配列を有
するＭ−ＣＳＦ誘導体が特に好ましい。

尚、前記式（１）の−３２位Metから５２２位Valまでの
全アミノ酸配列を有するＭ−ＣＳＦも使用できる。

本発明の抗アレルギー剤は、通常上記のごとくして得ら
れるＭ−ＣＳＦ誘導体を包含するＭ−ＣＳＦの有効量を
薬理的に許容される通常の無毒性担体と共に含有する薬
理組成物の形態に調製され、該形態に応じた各種投与経
路で投与される。製剤形態としては、液状形態例えば溶
液、懸濁液、乳濁液等が通常採用され、之等は一般に経
口、静脈内、皮下、皮内、筋肉内投与されるが、特に之
等の形態及び投与経路に限定されず、本発明誘導体は、
他の通常採用される経口、非経口投与等に適した各種の
製剤形態に調製することもでき、また使用前に適当な担
体の添加により液状となし得る乾燥品とすることもでき
る。上記製剤の投与量は、所望の薬理効果、疾病の種
類、患者の年齢、性別、疾患の程度等に応じて適宜決定
され、特に限定はないが、通常有効成分が蛋白量として
約０．００１〜１mg／kg／日となる量で１日に１回乃至
数回に分けて投与すればよい。

殊に本発明において有効成分とするＭ−ＣＳＦとして、
Ｎ末端にMetを付加されることのある、式（１）の３位V
al又は４位Serから１５３位Thrまでのアミノ酸一次配列
を有する生物活性なＭ−ＣＳＦ誘導体を採用した場合に
は、それ特有の抗炎症及び抗アレルギー作用を有する他
に、他のＭ−ＣＳＦと比べて生物学的利用率が高いとい
う特徴を有しており、この点からもかかる抗炎症及び抗
アレルギー剤は、非常に有効なものである。

本発明は、以下の実施例により更に明らかにされるが、
該実施例は、本発明を純粋に例示するものであることを
意図したものである。

尚、以下の実施例及び参考例に記載されるＭ−ＣＳＦ誘
導体において、前記式（１）のアミノ酸配列を参照して
呼称されるものは、いずれも、該式中のＸがAspを示す
ものである。

実施例１ Ｍ−ＣＳＦは炎症のメディエイタ(mediator)であるＩＬ
−１，ＩＬ−６及びＰＧＥ_２の産生を刺激しない。

第１図、第２図及び第１表に示されているように、Ｍ−
ＣＳＦは、マクロファージによる炎症のメディエイタ(m
ediator)であるＩＬ−１α，ＰＧＥ_２及びＩＬ−６の産
生を促進しない。

Ａ．Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１又はＩＬ−６の発現を促進し
ない。

１．実験的モデル バクテリア細胞由来のエンドトキシンの活性成分である
リポ多糖(Lipopolysaccharide)（以下ＬＰＳと略す）
を、炎症性マクロファージにおける炎症のメディエイタ
(mediator)の産生についてＭ−ＣＳＦの効果を示すため
のモデルシステムとして使用した。

炎症性マクロファージを得るために、マクロファージ
は、マウスに無菌のブレワーのチオグリコレート(Brewe
r’s thioglycolate(TG))１．０mを注入後３日間同系
繁殖雌性の病原菌のない（pathogen-free)Ｃ５７Ｂ１／
６マウス（チャールズ リバー ブリーディング ラボ
ラトリーズ，ウィルミントン，マサチューセッツ(Charl
es River Breeding Laboratories，Wilmington，MA)）
から採取した。該細胞は、ヘパリン１０Ｕ／mを追加
した氷冷ＨＢＳＳ（ハンクの平衡塩溶液(Hank’s Balan
ced Salt Solution)）１０mでの腹膜洗浄により得ら
れ、２５０Ｘｇで５分間４℃で遠心分離された。

得られた細胞ペレット(pellet)は、１０％(V/V)の熱不
活性化された低エンドトキシン(low endotoxin)(0.008
ｎｇ／m）、ウシ胎児血清（ハイクロン，ローガン，
バーモント(Hyclone，Logan，VT)），２．０Ｍグルタミ
ン，１００Ｕ／mのペニシリン及び１００μｇ／mの
ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地
（ギブコ，グランドアイランド，ニューヨーク(GIBCO，
Grand Island，NY)）（以下、完全培地と略す）中に再
懸濁された。

マクロファージを０．５×１０^６個含む１．０mのア
リコート(aliguot)を組織培養皿(tissue culture dishe
s)（コスター，ケンブリッジ，マサチューセッツ(Costa
r，Cambridge，MA)）中の１６mmのウェル(well)（１cm²
あたり２．５×１０⁵個のマクロファージ）ごとに接種
した。該皿を３７℃で２時間６％のＣＯ_２下でインキュ
ベートし、次に非付着細胞を除去するために暖かい完全
培地（３７℃）で３回洗浄した。単一層の細胞(The cel
l monolayers)は、非特異的エステラーゼ染色(non-spec
ific esterase staining)による測定で約９５％のマク
ロファージを含んでいた。

細胞は、以下の第２節及び第３節において示されるよう
に３７℃でＬＰＳ及びＭ−ＣＳＦにさらされた。

得られた調製培地(conditioned medium)は、４℃で１５
分間５７０ｘｇでの遠心分離により集められ、１００倍
量のＲＰＭＩ１６４０培地で透析され、滅菌過され、
次の分析のために−３５℃で保存された。

２．Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１又はＩＬ−６の発現を促進し
ない。

炎症性マクロファージは、以下のような種々の時間、コ
ントロール；ＬＰＳ（大腸菌(E.coli)０．５５：Ｂ５
（ディフコ，デトロイト，ミシガン(Difco，Detroit，M
l)）から得られたもの０．５μｇ／m）；及びＭ−Ｃ
ＳＦ［タカハシ，エム．(Takahashi，M.)ら、バイオケ
ミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーションズ(Biochemical and Biophysical Reserch
Communications)１６１（２）：８９２−９０１（１９
８９年６月１５日）に記載のようにして製造され、後記
する参考例４のようにして精製された２．７×１０^７Ｕ
／ｍｇ（バッチ(Batch)０５８−２）の比活性を有する
組換えＭ−ＣＳＦ−（３−１５３）の０．５μｇ／m
）］にさらした。ここで、Ｍ−ＣＳＦの１．０ユニッ
トは、Ｍ−ＣＳＦ依存性ヒト細胞系ＮＦＳ−６０，ナコ
インツ(Nakoinz)Ｉ．等，(Exp.Hemotol 17:669(1989))
の成長の刺激の最大値の半分の量として定義される。

各チューブは、マイクロファージのｍＲＮＡのノザン分
析(Northern Analysis)を用いてＩＬ−１，ＩＬ−６及
びＴＧＦ−βの発現を分析した。そのような分析は、当
業者のルーチン(routine)技術に属するものであり、例
えばヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション
(Nucleic Acid Hybridization)セクションＸＬ：遺伝子
相同性の測定(Determination of Genetic Homology)，
組換えＤＮＡ方法論(Recombinant DNA Methodology)，
ディロン ジェイ．アール．(Dillon J.R.)，エイ．ナ
シム(A.Nasim)，イー．アール．ネストマン(Nestmann)
（編）ジョン ウイリー・アンド・サンズ(John Wiley&
Sons(1985)に記載されている。

第１図のＩＬ−１α及びＩＬ−６として示されるセクシ
ョンは、ＬＰＳがＩＬ−１α及びＩＬ−６の両方の発現
を促進できることを示す。コントロール（レーン１）と
ＬＰＳだけを投与したサンプル（レーン２−５）を比較
せよ。ＩＬ−１αとＩＬ−６の両方の発現は、３時間で
ピークになるまで時間とともに増加する。

これに対し、Ｍ−ＣＳＦ（レーン７−１０）の存在はＩ
Ｌ−１α又はＩＬ−６の発現を促進しなかった。それら
のレーンは両方ともブランク(blank)であった。

ＴＧＦ−βとして指定したセクションにおいて見られる
ように、ＴＧＦ−βはＭ−ＣＳＦと同様にＬＰＳにより
発現され、このことは、すべての蛋白質が活性であるこ
とを示している。

この実験は、２度繰り返したが同一の結果が得られた。
このように、炎症メディエイタ(mediator)の産生を促進
するＬＰＳと異なり、Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１又はＩＬ−
６の産生を刺激しない。この発見は、Ｍ−ＣＳＦがＩＬ
−１の産生を刺激することを示す以前の報告に鑑み驚く
べきことである。

３．Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１α遺伝子の発現を刺激しない Ｍ−ＣＳＦの異なる標品を用いた実験により、Ｍ−ＣＳ
ＦがＩＬ−１の遺伝子の発現を誘導する能力のないこと
が確認された。第２図において、Ｍ−ＣＳＦの異なる標
品がテストされ、ＩＬ−１αの発現を刺激しないことが
見出された。

炎症性マクロファージが、コントロール（レーン１）、
既述のようにして得られたＬＰＳ１μｇ／m（レーン
２）、３．０×１０^７Ｕ／ｍｇの比活性をもった異なる
バッチ(batch)であることを除いて既述のようにして得
たＭ−ＣＳＦ−（３−１５３）１μｇ／m（レーン
３）及びＬＰＳとＭ−ＣＳＦの組合せたもの（レーン
４）にさらされた。細胞は分子クローニング(Molecular
Clonig)：実験マニュアル(A Laboratory Manual)、テ
ィー．マニアティス(T.Manitis)、イー．エフ．．フリ
ッチュ(E.F.Fritsch)、ジェイ．サンブルック(Samnroo
k)（編）コールド・スプリング・ハーバー・プレス(Col
dSpring Hsrbor Press)（１９８２）に記載のようにし
てＩＬ−１αの発現について分析された。

コントロールレーン（１）と比較して、レーン２のＬＰ
Ｓは、ＩＬ−１α遺伝子の発現を確かに刺激するが、レ
ーン３のＭ−ＣＳＦはＩＬ−１αの発現を刺激しない。
又、レーン４における、ＬＰＳに対するＭ−ＣＳＦの添
加はＩＬ−１αの発現に影響しなかった。このように、
既述の第１節で記されたように、Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１
αの発現を誘導も減少もしなかった。

Ｂ．Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１，ＩＬ−６又はＰＧＥ_２の活
性を促進しない １．実験モデル ａ．調整培地(conditioned medium) 炎症性マクロファージは、既述のようにして得られ、以
下のような調整培地(conditioned medium)を与える２つ
の起源(source)からのＭ−ＣＳＦで処理された： ３．０×１０^７Ｕ／ｍｇの比活性を有し、既述のように
して生産される組換えＭ−ＣＳＦ−（３−１５３）（バ
ッチ(Batch)ＥＣ−８０−Ｉ）；及び １．５×１０¹⁰Ｕ／ｍｇの比活性を有しＬ９２９線維芽
細胞由来の天然のＭ−ＣＳＦ［イー．アール．スタンレ
イ(E.R.Stanley)（アルベルト・アインシュタイン・カ
レッジ・オブ・メディスン，ニューヨーク(Albert Eins
tein College Medicine，NY)）から得た］ 該細胞は、最大用量の１μｇ／mまで用量を増加させ
ながら両方の起源のＭ−ＣＳＦにさらされた。２４時間
インキュベートした後、調整培地は以下に記すようにＩ
Ｌ−１，ＩＬ−６及びＰＧＥ_２の活性について分析され
た。

ｂ．ＩＬ−１胸線細胞試験 生物活性ＩＬ−１の産生に対する調整培地の効果を評価
するために、細胞はトガワ，エイ．(Tgawa，A.)ら、ヒ
ト単核細胞により産生さたリンパ球活性因子の特定(Cha
racterization of Lymphocyte Activating Factor Prod
uced by Human Mononucslear Cells)；ＬＡＦの高及び
低分子量型の生化学的関係(Biochemical Relationship
of High and Low Molecular Weight Forms of LAF)，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２：２１１２（１９７９）に
記載されたように胸線細胞試験(thymocyte assay)に供
された。この試験では、６−１０週齢の雌性Ｃ３Ｈ／Ｈ
ｅマウス（バンチン−キングマン(Bantin-Kingman)(C
A)）から得られた胸線細胞の単細胞懸濁液は、穏やかな
細分割化(mincing)により調製された。大きな凝集合体
は、単位重力(unit gravity)で１０分間氷上でのインキ
ュベーションにより除去された。細胞は、完全培地で２
度洗浄され、完全培地中に１．０×１０^２細胞／mの
密度で再懸濁された。細胞は、その後１μｇ／mのコ
ンカナバリンＡ(Concanavalin A)（以下ＣｏｎＡとい
う）（シグマ ケミカル カンパニー (Sigma Chemica
l Co.)）の存在下又は非存在下１．０×１０^６細胞／ウ
エルの密度の平底マイクロ敵定プレート(flat-bottomed
microtiter plates)に接種された。

調整培地(conditioned medium)又は組換えヒトＩＬ−１
βが、最終容量が０．２mになるよう連続希釈で加え
られた。胸線細胞は、７２時間培養され、１．０μＣｉ
の［メチル］−^３Ｈ−ＴｄＲ（6.7Ci／Mmol，ニューイ
ングランドヌクレアー，ボストン，マサチュー セッツ(New England Nuclear,Boston,MA)にてパルスさ
れた。^３Ｈ−ＴｄＲの取込みは、半自動式細胞ハーベス
タ(semiautomatic cell harvester(Skatron,Sterling,V
A))を用いたグラスファイバーペーパー(glass fiber pa
per)上での細胞の収穫(harvest)後、標準液体シンチレ
ーション計測(standard liquid scintillation countin
g)操作により測定された。

以下の第１表に記されるように、天然Ｍ−ＣＳＦ(M-CSF
タイプL929と呼ばれる）も組換えＭ−ＣＳＦ−（３−１
５３）{E coli[3-153]M-CSF又はrh-M-CSF(3-153)と呼ば
れる｝も試験において陽性の結果を示さなかった。この
ことは、両方の起源のＭ−ＣＳＦはともに、炎症性マク
ロファージにＩＬ−１を産生させることができないこと
を示している。

Ｃ．ＩＬ−１ラジオレセプター(radioreceptor)試験ヒ
トＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方が、ネズミ(murine)
のＥＬ−４．６．１標的細胞上の同一のネズミ(murine)
ＩＬ−１のレセプターに結合するという観察から、キリ
アン、ティ．エル(Kilian,T.L.）ら、Ｔ細胞上の同一レ
セプターに対するインターロイキン１アルファ及びイン
ターロイキン１ベータの結合(Interleukin 1Alpha and
lnterleukin 1 Beta Bind to the Same Receptor on T
Cells)，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ１１３６：４５０９（１９８
６）に記載されるＩＬ−１レセプター試験が開発され
た。該試験では、完全培地中に保持されたＡＴＣＣから
のネズミ(murine)ＥＬ−４．６．１細胞は、遠心分離さ
れ、ウシ血清アルブミン０．１mg／ｍ及び２５ｎＭの
ＨＥＰＥＳ（pH７．２）が添加されたＲＰＭＩ１６４０
培地を含有するバインディングバッファー(binding buf
fer)中に再懸濁された。細胞密度は８．０×１０^６細胞
／ｍに調整され、０．０５ｍのアリコート(aliquo
t)が氷上に置かれたチューブへ分配された。

２７５ｐｇの¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１α(75000cpm)（比活性，2
000Ci／mmol；アメルスハム，アーリントン ハイツ，
イリノイ(Amersham,Arlington Heights,IL)）が各チュ
ーブに加えられた。該チューブは、次に１μｇ／ｍま
での２つの起源のＭ−ＣＳＦで処理されたマクロファー
ジからの希釈された調整培地(conditioned medium)とと
もに４℃で３時間インキュベートされた。

非特異的な結合は、５．８ｐＭの組換えヒトＩＬ−１β
（比活性，４．０×１０^７Ｕ／ｍｇ；平井(Dr.Hirai)
（大塚製薬，徳島，日本(Otsuka Pharmaceutical,Tokus
hima,Japan)）から得た。）の添加により測定された。
遊離の¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１αから細胞に結合した¹²⁵Ｉ−Ｉ
Ｌ−１αを分離するために、ジブチルフタレート及びジ
オクチルフタレート(10：1(V.V))のオイル混合物０．２
ｍを各試験チューブに注入し、各チューブをマクロフ
ュージ(macrofuge)中４℃で２分間遠心分離した。流体
は、次に吸入器で吸い出され、チューブチップは切断さ
れ、細胞に結合した放射活性をガンマカウンター(gamma
counter)で測定した。

以下の第１表に記載されるように、両方のタイプのＭ−
ＣＳＦともにＩＬ−１を置換できず、このことは、両方
のタイプのＭ−ＣＳＦともにマクロファージのＩＬ−１
産生を刺激しないことを示している。

ｄ．ＩＬ−１ ｍＲＮＡ試験 ＩＬ−１のｍＲＮＡの発現は、前記のようにして測定さ
れた。第１図と同様に、第１表は組換えＭ−ＣＳＦも天
然のＭ−ＣＳＦもマクロファージからのＩＬ−１の発現
を促進できないことを示し、両タイプともにマクロファ
ージにおけるＩＬ−１の産生を刺激しないことが確認さ
れた。

ｅ．ＩＬ−６ Ｂ−９試験 使用されたＩＬ−６試験は、以下のようにアーデン(Aar
den)ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７：１４１
１−１４１６（１９８７）に記載されたものである。Ｉ
Ｌ−６依存性ハイブリドーマ(hybridoma)細胞系Ｂ１
３．２９クローンＢ９は、ＩＬ−６の起源としてのＡＴ
ＣＣ調整培地からのＭＧ６３骨肉腫 (osteocosarcoma)２．０％(V/V)を添加したイズコフ(Is
cove′s)修飾ダルベッコ(Dulbecco′s)培地中で維持さ
れた。これらの細胞に対し５．０％(V/V)の胎児ウシ血
清、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１００Ｕ／
ｍのペニシリン及び１００mg／ｍのストレプトマイ
シンが加えられた。

５．０×１０^４／ｍのクローンＢ９細胞が平底９６ウ
エルプレート（ファルコン(Falcon)）の上記培地０．２
ｍ中で培養された。調整培地(conditioned medium)が
該細胞に加えられ、プレートは空気中３７℃で５％のＣ
Ｏ_２雰囲気下で７２時間インキュベートされた。該プレ
ートは、培養期間の最後の４時間１．０μＣｉの
［^３Ｈ］−チミジン存在下でインキュベートされた。細
胞は、次に細胞ハーベスタ(cell harvester)（スカット
ロン，スターリング，バージニア(Skatron,Sterling,V
A)），を用いて集められたＤＮＡ中に取り込まれた［^３
Ｈ］−チミジンが液体シンチレーションカウンター(liq
uid scintillation counter)（ＬＫＢロックベータ(Roc
kbeta)）により定量された。サンプルは一対でテストさ
れ、３倍希釈液で滴定された。全ての試験は１．０×１
０^７Ｕ／ｍｇの組換えヒトＩＬ−６（アムジェン，サウ
ザンドオークス，カリフォルニア(Amgen,Thousand Oak
s,CA)）を用いた標準曲線と比較された。

第１表に示されるように、組換えＭ−ＣＳＦも天然のＭ
−ＣＳＦもＩＬ−６の産生を刺激することができず、い
ずれの型もマクロファージ中のＩＬ−１の産生を刺激で
きないことを示している。

ｆ．ＩＬ−６のｍＲＮＡ試験 ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現は上記のようにして測定さ
れ、Ｂ−９試験で得られた結果が確認された。第１表に
示すように、Ｍ−ＣＳＦのいずれの型もＩＬ−６の発現
を刺激することができなかった。

ｇ．ＰＧＥ_２試験 Ｍ−ＣＳＦのＰＧＥ_２産生を刺激する能力を測定するた
めに、ＰＧＥ_２の存在を以下のようにして測定した。
１．０μｇ／ｍまでの組換え及び天然の両方のＭ−Ｃ
ＳＦで処理されたマクロファージからの調整培地をリン
酸緩衝食塩水(phosphate buffered saline)(PBS)で希釈
し、約pH２まで酸性にし、等量のクロロホルム：メタノ
ール(1:1(V/V))で抽出した。有機層を窒素気流下乾燥
し、ＰＧＥ_２の定量をニューイングランドヌクレアー，
ボストン，マサチューセッツ(New Englnd Nuclear,Bost
on,MA)から購入した標準ラジオイムノアッセイキットに
より行った。

以下の第１表に示すように、ＩＬ−１及びＩＬ−６と同
様にいずれの型のＭ−ＣＳＦもＰＧＥ_２の産生を刺激で
きなかった。

上記実験により示されるように、Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−
１，ＩＬ−６又はＰＧＥ_２のような炎症性メディエイタ
の産生を刺激しない。

実施例２ Ｍ−ＣＳＦはＬＰＳ処理に反応し産生される炎症性メデ
ィエイタの産生を調節する。

第２−１０図、第２，３表及び以下に詳細に記載される
ように、Ｍ−ＣＳＦは、ＬＰＳに反応して産生される炎
症性メディエータ、ＩＬ−１及びＰＧＥ_２の活性を減少
させることができる。

Ａ．Ｍ−ＣＳＦはＰＧＥ_２の産生を調節する １．Ｍ−ＣＳＦの前処理はＰＧＥ_２の産生を減少させる マクロファージは実施例１のようにして得られ、４つの
セットに分割された。２セットのマクロファージは培養
培地で前処理され、２つは実施例１のようにして得られ
た組換えＭ−ＣＳＦで前処理された。処理の段階におい
て、１セットの細胞は培地で前処理し、１セットの細胞
は以下の第２表で示されるように１μｇ／ｍのＬＰＳ
を含むＭ−ＣＳＦで前処理した。他のセットは培地を加
えた。ＰＧＥ_２の存在は、実施例１で記載したようにし
て測定され、ｎｇ／ｍｇ（細胞蛋白）／２４時間又はｎ
ｇ／ｍ／２４時間で表わした。

第２ａ表に記載したように、培地又はＭ−ＣＳＦで前処
理されたときのＰＧＥ_２のコントロールレベルは０．１
１−０．１２である。培地で前処理した細胞のＬＰＳ処
理により約１０．００のレベルのＰＧＥ_２を生じ、コン
トロールのレベルより約１００倍増加する。しかしなが
ら、ＬＰＳがＭ−ＣＳＦで前処理された細胞に加えられ
たときには、ＰＧＥ_２のレベルの増加は約３．６にとど
まり６５％は阻害される。

このように、Ｍ−ＣＳＦの前処理は、ＰＧＥ_２レベルを
刺激するＬＰＳの能力をブロックするものと思われる。

２．Ｍ−ＣＳＦの前処理又は共処理はＰＧＥ_２の産生を
減少させる。

実施例１のようにして得られたマクロファージは以下の
第２表に記載されるように培養培地又はＭ−ＣＳＦのい
ずれかで前処理された。上記実施例１で述べられたよう
にして得られた組換えＭ−ＣＳＦ−（３−１５３）（以
下ｒｈと称する）及び天然Ｍ−ＣＳＦ（以下Ｌ９２９と
称する）の両者が細胞の前処理に使用された。

細胞は、次に培地（ＰＧＥ_２のコントロールレベルを得
るため）、両方の起源のＭ−ＣＳＦ（異なるＭ−ＣＳＦ
サンプルによる処理の効果を明らかにするため）、１μ
ｇ／ｍの濃度のＬＰＳ単独及びＬＰＳと両方の起源の
Ｍ−ＣＳＦとの組合せたものにより、以下の第２表で説
明されるようにして処理される。細胞は、産生されたＰ
ＧＥ_２（ｎｇ／ｍ／２４時間）の存在について分析さ
れた。この実験は５回繰り返した。

第２表で示されるように、産生されるＰＧＥ_２のレベル
は、コントロール細胞で０．０７、Ｍ−ＣＳＦで前処理
されただけの細胞では０．１９及び０．０７、及びＭＫ
−ＣＳＦで処理されただけの細胞では０．０６及び０．
１であった。培地だけで前処理された細胞においてＬＰ
Ｓの処理により１．２７及び１．１０のレベルまで増加
した。これに対し、ＬＰＳで処理され、Ｍ−ＣＳＦで前
処理又は共処理された細胞におけるＰＧＥ_２の産生は、
４８％、８７−８９％又は１００％阻害された。このよ
うに、Ｍ−ＣＳＦの前処理又は共処理のいずれかによ
り、ＬＰＳにより刺激されるＰＧＥ_２の産生は減弱す
る。

Ｂ．Ｍ−ＣＳＦはＩＬ−１インヒビターの産生を調節す
る 上記実施例１で説明したようにして得たマクロファージ
は、培養培地又は０．０１，０．０３，０．１，０．３
及び１．０μｇ／ｍの濃度のｒｈ−Ｍ−ＣＳＦ−（３
−１５３）、即ち、組み換えＭ−ＣＳＦ｛Ｅｃｏｌｉ
［３−１５３］Ｍ−ＣＳＦ｝で２４時間前処理された。
培地で前処理された細胞は、次に培地（コントロールを
得るため）、１．０μｇ／ｍのＬＰＳ単独、１．０，
０．３，０．０１，０．０３μｇ／ｍの濃度のｒｈ−
Ｍ−ＣＳＦ−（３−１５３）単独又は前記４つの濃度の
ｒｈ−Ｍ−ＣＳＦ−（３−１５３）に１．０μｇ／ｍ
のＬＰＳを添加したもので処理された。ｒｈ−Ｍ−ＣＳ
Ｆ−（３−１５３）で前処理された細胞は、培地又は
１．０μｇ／ｍのＬＰＳで処理された。

生物活性ＩＬ−１の産生についての効果を評価するた
め、培養上清(rulture supernatant)は、結果が刺激指
数(stimulation index)として示されたことを除いて既
述の実施例１のようにして胸線細胞試験に供された。刺
激指数は、ＣｏｎＡ単独の存在での与えられた希釈／ｃ
ｐｍにおけるＣｏｎＡ及びマクロファージ調整培地の存
在下でのｃｐｍを指す。

第３表に示すように、コントロールサンプルの刺激指数
値は、２．５（培地による前処理及び物理）及び１．１
９−１．６７（種々の濃度のＭ−ＣＳＦによる前処理及
び培地による処理）であった。ＬＰＳ処理からの刺激指
数値は、約１０倍大きな２０．３であった。これに対
し、Ｍ−ＣＳＦで前処理されたＬＰＳで刺激されたサン
プルにおける刺激指数値は、６．０２−１０．０９だけ
の範囲にあり、５１−７０％のＩＬ−１の生物活性の阻
害を示している。

同様に、種々の濃度のＭ−ＣＳＦで共処理されたサンプ
ルでは、刺激指数値は５．６５−１１．８％の範囲にあ
り、ＩＬ−１の生物活性が７２−４２％が阻害されたこ
とを示している。阻害は、最大の阻害が１．０μｇ／ｍ
／のＭ−ＣＳＦで、最小の阻害が０．０３μｇ／ｍ
のＭ−ＣＳＦで観察されたことから、濃度依存性である
ようにみえる。ｒｈ−Ｍ−ＣＳＦ−（３−１５３）のＥ
Ｃ₅₀（５０％阻害をもたらす効果のある濃度）は約１．
１ｎＭであると測定された。

同様な実験が、Ｌ９２９細胞から精製された種々の濃度
の天然Ｍ−ＣＳＦを用いて行われた。第３ａ表に示すよ
うに、Ｍ−ＣＳＦの前処理は、ＬＰＳに反応してマクロ
ファージから産生されるＩＬ−１の生物活性を３９−９
３％阻害する。上記のようにＭ−ＣＳＦの最大の濃度で
最大の阻害が観察された。Ｌ−９２９Ｍ−ＣＳＦのＥＣ
₅₀は、約０．６ｎＭであることが見出された。

これら２つの実験は、Ｍ−ＣＳＦの種々の調製物(prepa
ration)を用いて１２回以上繰り返し、各実験で同様の
結果を得た。このように、これらの実験は、Ｍ−ＣＳＦ
の前処理又は共処理が、ＬＰＳに反応するＩＬ−１の生
物活性を減弱することを示す。加えて、その効果は濃度
依存性であるように思われる。

これらの結果は第３図にグラフとして示される。ＩＬ−
１の生物活性(CPM/1000)が、前処理及び共処理の方向(r
egimen)に対してプロットされると、ＩＬ−１の生物活
性の最大の増加が、培地での前処理及び処理（Ｃ−Ｃ）
の場合と比較として、培地での前処理及びＬＰＳでの処
理（Ｃ−Ｌ）の場合に見られる。ＩＬ−１の生物活性の
より緩やかな増加が、培地の前処理及びＬＰＳとＭ−Ｃ
ＳＦとの組合せでの処理（Ｃ−ＬＭ）の場合に見られ
る。ＩＬ−１の生物活性の低下がＭ−ＣＳＦで前処理さ
れＬＰＳで処理されたサンプル（Ｍ−Ｌ）で見られる。
このように、Ｍ−ＣＳＦは、ＬＰＳにより刺激されたマ
クロファージのＩＬ−１産生を調節するようにみえる。

Ｃ．ＩＬ−１の生物活性についてのＭ−ＣＳＦの作用の
可能なメカニズム 上記第１及び２図に示されるように、ＬＰＳはＩＬ−１
（主にマクロファージのＩＬ−１α）の発現を誘導し、
上記第３図及び第３及び３ａ表に示されるように、ＬＰ
Ｓはまた生物活性ＩＬ−１の産生をも増加させる。細胞
がＬＰＳで処理されＭ−ＣＳＦで前処理又は共処理され
たとき、生物活性なＩＬ−１のレベルは減少する。しか
しながら、ＩＬ−１の発現は、ＬＰＳ及びＭ−ＣＳＦの
共処理により影響されないように見える。第２図に示し
たように、Ｍ−ＣＳＦとＬＰＳとの組合せは、ＬＰＳ単
独の場合に観察されるパターンと非常に似たＩＬ−１発
現のオートラジオグラフのパターンを示す。これらの観
察は、ＩＬ−１の生物活性の減少につながるＩＬ−１イ
ンヒビターのＭ−ＣＳＦ依存性の刺激により説明でき
る。ＩＬ−１インヒビターの産生は、ＣｏｎＡとＩＬ−
１の両方を加えることにより補足されるＩＬ−１胸線細
胞試験を行うことにより調べられる。これら２つの成分
の添加により、ＩＬ−１のレベルのいかなる減少をも測
定できるように検出可能なレベルの生物活性ＩＬ−１を
提供し、ＩＬ−１インヒビターの作用の評価が可能とな
る。

６セットの調整培地が第４図に示すようにＩＬ−１胸線
細胞(thymocyte)試験に加えられた。培地で前処理及び
処理されたセット（Ｃ−Ｃ）における生物活性ＩＬ−１
のレベルは同一のままである。これに対し、生物活性Ｉ
Ｌ−１の幾分の減少が、培地又はＭ−ＣＳＦで前処理さ
れＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ又はＭ−ＣＳＦとＬＰＳとの組合
せで処理したセットで見られるけれども、ＩＬ−１の生
物活性の真の減少は、Ｍ−ＣＳＦで前処理されＬＰＳで
処理されたセット（Ｍ−Ｌ）で見られるだけである。こ
のように、この研究はＩＬ−１のインヒビターを産生さ
せるＭ−ＣＳＦに関する。

インヒビターが、ＩＬ−１に特異的であるかどうかを決
定するために、同様の実験がＩＬ−６について行われ
た。６セットのマクロファージが、第５図に示すように
培地（Ｃ）又はＭ−ＣＳＦ（Ｍ）で前処理され、培地、
Ｍ−ＣＳＦ、ＬＰＳ又はＭ−ＣＳＦとＬＰＳとの組合せ
により処理された。ＩＬ−６の活性は、既述のＩＬ−６
Ｂ−９試験を用いて評価された。

第５図に示すように、ＩＬ−６の生物活性と同様のパタ
ーンが、培地で前処理されＬＰＳで処理された細胞、培
地で前処理されＬＰＳ及びＭ−ＣＳＦの組合せで処理さ
れた細胞及びＭ−ＣＳＦで前処理されＬＰＳで処理され
た細胞で観察された。Ｍ−ＣＳＦにより刺激されたイン
ヒビターは、ＩＬ−６の活性には効果がないようにみえ
る。このパターンは、Ｍ−ＣＳＦで前処理されＬＰＳで
処理された細胞からの培養上清(culture supernatant)
において劇的なＩＬ−１の減少がみられる、第４図のＩ
Ｌ−１産生で観察されるパターンとは全く異なるもので
ある。このように、本研究は、ＩＬ−１インヒビターは
ＩＬ−１に特異的であり、Ｍ−ＣＳＦは同一条件下でＩ
Ｌ−６に特異的なインヒビターの産生を調節しないこと
を示す。

実施例３ インビボ(in vivo)におけるＭ−ＣＳＦの注射はＬＰＳ
に反応して産生されるＩＬ−１の生物活性の減少をもた
らす。

８匹の同系繁殖体の雌性の病原体のないＣ５７Ｂ１／６
マウス（チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラ
トリーズ，ウィルミントン，マサチューセッツ (Charles River Breeding Laboratories,Wilmington,M
A)）に対して、腹腔内に１．０ｍの無菌ブレワー(Bre
wer′s)チオグリコート(TG)が０時間に注射され、４つ
のグループに分けられた。以下の第４表に示すように、
７２時間後に、グループ１（コントロールグループ）及
びグループ２のマウスは、リン酸緩衝食塩水（以下ＰＢ
Ｓと略す）０．２ｍで前処理され、グループ３及び４
のマウスは４μｇ／マウスのＭ−ＣＳＦ−（３−１５３
を含むＰＢＳで前処理された。９０時間後に、コントロ
ールのグループ１は、ＰＢＳで処理され、グループ２
は、５０μｇ／マウスのＬＰＳを含むＰＢＳで処理され
（ＬＰＳ処理の効果を示すため）、グループ３はＰＢＳ
で処理され、（Ｍ−ＣＳＦの前処理だけの効果を示すた
め）及びグループ４は、ＬＰＳを５０μｇ／マウス含む
ＰＢＳで処理された（ＬＰＳ処理についてのＭ−ＣＳＦ
前処理の効果を示すため）。

８時間後、マウスを犠牲にして上記実施例１で示したよ
うに腹膜(peritoneal)細胞を集めた。１×１０^６細胞／
ウエルの細胞をコスター(Coster)プレートに接種(plate
d)し、調整培地で処理した。

２０時間後、該調整培地が集められ、既述のＩＬ−１バ
イオアッセイ（ＣｏｎＡでパルスした胸線細胞）で滴定
された。結果は、３つのウエル(well)の平均ｃｐｍとし
て表わされる。

ＩＬ−１の生物活性のパーセント阻害は、以下のように
して測定された。

（グル−プ２のＣＰＭ−グル−プ１のＣＰＭ）−（グル
−プ４のＣＰＭ−グル−プ１のＣＰＭ）／グループ２の
ＣＰＭ−グループ１のＣＰＭ×１００ 以下の第４表に示されるように、調整培地の１／４希釈
において、ＬＰＳの処理（グループ２）は、１３１０３
ＣＰＭの生物活性ＩＬ−１を生ずる一方Ｍ−ＣＳＦの前
処理（グループ４）は５０５０ＣＰＭを生ずる。

１／１２希釈において、２５９２ＣＰＭがＭ−ＣＳＦの
前処理（グループ４）で得られるのと比較してＬＰＳの
処理（グループ２）は５３８５ＣＰＭを生ずる。このよ
うに、調整培地の１／１２及び１／４希釈の両者におい
て、Ｍ−ＣＳＦの前処理は、ＬＰＳに反応して産生され
るＩＬ−１の生物活性を６９．９％阻害し、Ｍ−ＣＳＦ
は、インビトロ(in vitro)及びインビボ(in vivo)の両
方でＩＬ−１の生物活性を阻害することが示された。

実施例４ ＩＬ−１インヒビターの分離及び評価 Ａ．ＩＬ−１インヒビターの分離及び特定 ＩＬ−１インヒビターを更に評価するために、Ｍ−ＣＳ
Ｆ及びＬＰＳで処置された調整培地は、ＩＬ−１インヒ
ビターからＩＬ−１を分離するためＱＡＥ−５２カラム
にかけられた。アニオン交換体として、pH７．４でＱＡ
Ｅ−５２は、５．５のｐＩを有するＩＬ−１αをＩＬ−
１インヒビターから分離する能力がある。

ＩＬ−１インヒビターを分離するために、３．０×１０
^８個の腹膜侵出液細胞(peritoneal exudate cells)が、
完全培地中２．３×１０^５／cm²の細胞密度（約１．８
×１０^７細胞／プレート）において１００mmの組織培養
皿中で培養された。インキュベーションの２時間後、プ
レートは完全培地で２度洗浄され、１プレート当たり
５．０ｍのＭ−ＣＳＦ−（３−１５３）（１．０μｇ
／ｍ）が加えられ、２０時間インキュベートされた。
この前処置段階に続き、流体(fluid)は吸い出され、プ
レートは２度洗浄され、１プレート当たり０．５mg／ｍ
のウシ血清アルブミン及び１．０ｐｇ／ｍのＬＰＳ
を含むＲＰＭＩ１６４０を５．０ｍ加えた。該プレー
トは４０時間培養され、調整培地が集められ、１０００
ｘｇ，４℃で１５時間遠心分離された。得られたペレッ
ト(pellet)は、氷冷された等量の２０ｍＭＨＥＰＥＳバ
ッファー（pH７．４）で希釈された。該物質は次に４級
アンモニウムセルロース（ＱＡＥ−５２，ワットマン(W
atmann)）でパックされた１．５×１０cm²のカラムに載
せられた。

ＱＡＥ−５２に吸着しないサンプルは、カラムを通って
流出し、集められ、通過後(flow thru)と名付けられ
た。ＱＡＥ−５２に吸着するサンプルは、ＩＭＮａＣｌ
の存在下で遊離され、集められ、溶出液(eluate)と名付
けられた。通過液と溶出液の両方のフラクションは、透
析過(diafiltered)され、１０ｋｄカット−オフポイ
ント(cut-off point)を備えたメンブレン上アミコンチ
ャンバー(Amicon chamber)中で等量まで濃縮された。

通過液及び溶出液のサンプルは、ＩＬ−１胸線細胞試
験、ＩＬ−１ラジオレセプター試験、ＴＮＦバイオアッ
セイ及びＩＬ−２増殖試験に供された。

１．ＩＬ−１胸線細胞試験 通過液及び溶出液のサンプルは、前記試験で導入された
ＩＬ−１のサンプルの活性と比較して、生物活性のＩＬ
−１のレベルを測定するために既述のＩＬ−１胸線細胞
試験でテストされた。結果は第６図に示される。

溶出液(eluate)は、胸線細胞がＩＬ−１の最大に近い用
量で補足されているので、ＩＬ−１サンプルよりもはる
かに大きなＩＬ−１活性を示した。これに対し、通過液
(flow thru)は、ＩＬ−１活性において劇的な減少を示
した。これは、ＩＬ−１活性を示す溶出液は、ＩＬ−１
及びたぶんＩＬ−６を含有し、ＩＬ−１活性の減少した
通過液は、ＩＬ−１インヒビターを含有することを示し
た。

２．ＩＬ−１ラジオセレプター試験 通過液と溶出液のサンプルは両方ともに、実施例１で示
したＩＬ−１ラジオレセプター(redioreceptor)試験を
行った。第７図に示すように、両フラクションはＥＬ−
４．６細胞に結合した¹²⁵ＩＬ−１αを置換することが
できるけれども、通過液は、溶出液よりも多くの置換を
示した。このことは、ＩＬ−１及びＩＬ−１インヒビタ
ーの両方ともがＩＬ−１レセプターに結合することを示
唆した。

３．ＴＮＦ試験 ＱＡＥ−５２の通過液中に存在するＩＬ−１インヒビタ
ーの特異性を測定するために、通過液サンプルは、ネド
ウィン、ジー．イー．(Nedwin,G.E.)ら、腫瘍懐死因子
(tumor necrosis factor)α及びβの産生についてのイ
ンターロイキン２，インターフェロンガンマ及びマイト
ージェン(mitogen)の効果(Effect of interleukin 2,in
terferon gamma,and mitogens on the production of t
umor necrosis factorsαandβ）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３５：２４９２（１９８５）に
記載されているＴＮＦバイオアッセイでテストされた。

この試験で、１ウェル(well)あたり５．０×１０^４個の
Ｌ９２９繊維芽細胞が、１．０Ｕ／ｍのアクチノマイ
シンＤの存在下平底微小滴定プレート(flat-bottomed m
icrotiter plates)に接種された。ＱＡＥ−５２の通過
液からの希釈サンプルが、最終量が、０．２ｍになる
ようにＴＨＦ−α（アムジェン(Amgen)から得た）の連
続希釈液とともに又はＴＮＦ−αの連続希釈液を伴なわ
ずに加えられた。６．０％ＣＯ_２下３７℃で２４時間イ
ンキュベートした後に、単層(monolayer)が洗浄され
た。細胞の溶解(lysis)が、メタノールと水(1:4(V/V))
の混合溶媒中のクリスタルバイトレット(crystal viole
t)０．５％(W/V)溶液を加えることにより測定され、タ
イターテックマルチｓｕキャンＥＬＩＳＡリーダー (Titertek multiscan ELISA reader)で５７０nmの吸光
度を測定することにより定量された。

第８図に示すように、培地と１２．５％通過液に対応す
る曲線は事実上同一のパターンを示し、これは、ＱＡＥ
−５２通過液は、Ｌ９２９指標細胞を破壊するＴＨＦ−
αの活性は阻害も刺激もしないことを示している。この
ように、本研究は、ＩＬ−１インヒビターがＩＬ−１に
特異的であり、ＴＨＦ活性に関し何ら効果を有しないこ
とを示している。

４．ＩＬ−２バイオアッセイ ＱＡＥ通過液(flow thru)中のＩＬ−１インヒビターの
特異性を測定するために、ＱＡＥ通過液とＱＡＥ溶出液
の両者をギリス，エス．(Gillis,S.）ら、Ｔ細胞成長因
子の産生のパラメータ及び活性の定量微小試験(Tcell g
rowth factor parameters of production and a quanti
tative microassay for activity)，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１２０：２０２７（１９７８）に記載されたＩＬ−
２のバイオアッセイでテストされた。第９図に示すよう
に、通過液も溶出液もＩＬ−２の活性は生じなかった。
両サンプルは、ほとんどまっすぐな水平線を示し、これ
は、ＩＬ−２の増殖も促進も阻害もしないことを示して
いる。

Ｂ．ＩＬ−１インヒビターの精製 ＩＬ−１インヒビターが、酸及び熱には抵抗性であるが
トリプシン処理には抵抗性でないことを決定した後で、
ＩＬ−１インヒビターをＣ−４カラムの溶離液としてア
セトニトリルを用いた逆相−ＨＰＬＣで更に精製した。

この精製において、通過液の集合中の物質は凍結乾燥さ
れ、１０％(V/V)アセトニトリル／０．１％(V/V)トリフ
ルオロ酢酸／水に再懸濁され、逆相ＨＰＬＣに接続され
たＣ−４カラム（ネストグループ(The Nest Group))へ
注入された。アセトニトリルのグラジェント (gradient)（６０分間で２５％−５０％(V/V)、流速は
１．０ｍ／minである）を適用し、フラクションを集
め、凍結乾燥し、対応するバッファー中に再懸濁させ
た。サンプルは、既述のＩＬ−１胸線細胞試験、実施例
１で記載されたＩＬ−１レセプター試験及び実施例２で
記載された胸線細胞試験でテストされた。

第１０図に示すように、ＩＬ−１バイオアッセイ（直
線）で測定されたＩＬ−１阻害のピーク活性は、フラク
ション３３〜３８で見出された。それらのフラクション
は約３７％のアセトニトリルに対応する。追加のＩＬ−
１ラジオレセプター結合試験は、これらのフラクション
（★線）だけがＩＬ−１を置換できることを示した。同
様に、既述のＣｏｎＡ及びＩＬ−１で刺激されたＩＬ−
１胸線細胞(thymocyte)試験において、これらのフラク
ションだけが胸線細胞の増殖（三角形の線）を阻害でき
た。このように、Ｍ−ＣＳＦにより刺激されたＩＬ−１
インヒビターは逆相ＨＰＬＣで分離できる。

以下、本発明で使用するＭ−ＣＳＦ誘導体の製造例を示
す参考例及びそれらの抗アレルギー作用を示す実施例を
挙げて、本発明の抗アレルギー剤について更に詳細に説
明する。

ここで得られるＭ−ＣＳＦ誘導体は次のように定義す
る。即ち、該Ｍ−ＣＳＦ誘導体はエシュリヒア コリ
（E.coli）をホストとして前記式（１）の３位Valから
１５３位Thrまでのアミノ酸を含む発現ベクターによっ
て産生されたものであり、これを′E.cole [3-153]M-CS
F′と呼び、同様に３位Valから２１３位Proまでのアミ
ノ酸配列を含む発現ベクターにて産生されたものを“E.
coli[3-214]M-CSF′と呼ぶ。

更に、エシュリヒア コリ（Ｅ．coli）をホストとして
式（１）の４位Serから１５３位Thrまでのアミノ酸配列
を含む発現ベクターにて産生されたものを“E.coli[4-2
14]M-CSF′と呼ぶ。

また、参考例１で得られる、ＣＨＯ細胞をホストとし
て、３２個のアミノ酸配列よりなるシグナルペプチド及
び５２２個のアミノ酸配列よりなるヒト成熟Ｍ−ＣＳＦ
誘導体は“ＣＨＯ〔−３２−５２２〕Ｍ−ＣＳＦ”と呼
ぶ。

尚、下記例で得られる試料のＣＳＦ活性は以下の方法に
より測定されるものとする。

＜ＣＳＦの活性測定法＞ 牛胎児血清（ＦＣＳ）２０ｍ、α−培地３０ｍ及び
２倍濃度α−培地２０ｍを混和して得られる溶液を３
７℃にて保温し、その２３．３ｍを予め５０℃に保温
した１％寒天（ディフコ社製）溶液１０ｍと混合して
３７℃に保温する。

一方ＢＡＬＢ／ｃ系マウス大腿骨より採取した骨髄細胞
（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、α−培地にて
細胞濃度が１０^７個／ｍとなるように調製し、その１
ｍを上記３７℃に保温してある寒天培地に加え、よく
混和後、３７℃に保温し、次にその０．５ｍを、予め
５０μの供試試料を入れたウェル（ティッシュカルチ
ャークラスター１２、コスター製）に加えて手早く混和
して室温に放置する。各ウェルの寒天が固化するのを待
って炭酸ガスインキュベーターに移し、更に３７℃で７
日間培養する。

かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測
し、ＣＳＦ活性の指標とする。またＣＳＦ活性の単位
（Ｕ／ｍ）は、上記コロニー数より、次式(a)に従っ
て算出した値を用いた。

ＣＳＦ活性単位（Ｕ／ｍ）＝ （コロニー数）×（希釈倍率）÷１．５(a) 尚、上記で生じるコロニーは、形態学的及び酵素化学的
観察の結果、殆んどすべてがマクロファージコロニーで
あった。

参考例１ ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの製造 １％ＦＣＳ含有ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ギブコ社製）中にて
マイクロキャリー培養したＣＨＯ細胞クローンNo.２，
３−８〔特開平１−１０４１７６号公報参照〕の培養上
清液を用いて、以下の精製工程により目的の均質なＣＨ
Ｏ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦを得た。尚、以下の工
程において目的蛋白はウエスタンブロッティング法に従
い検出した。該ウエスタンブロッティングは、バイオラ
ッド社のトランスブロットセルを用いて行ない、トウン
スファーされたニトロセルロース膜を１％スキンミルク
含有ＰＢＳ⁻にてブロッキング後、Ｍ−ＣＳＦに対する
ウサギ抗血清と反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗ウサギ抗体（バイオラッド社製）を反応させた。Ｍ
−ＣＳＦのバンドの検出は、かくして得られたニトロセ
ルロース膜と発色基質である４−クロロ−１−ナフトー
ル液とを反応させることにより行なった。

(1)ConA−セファロースクロマトグラフィー 上記ＣＨＯ細胞培養上清液６９．３を限外過濃縮し
て得られた濃縮液８４２ｍ中の６５０ｍを出発物質
として、硫安分画法にて３５％〜６５％飽和硫安沈殿画
分を得た後、蒸留水にて溶解し（１１２０ｍ）サンプ
ルとした。

一方、約５００ｍのConA−セファロースゲルを充填し
たカラム（５×２５cm)を０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．４）にて平衡化
した後、上記サンプル溶液をアプライし、同緩衝液にて
充分に洗浄後、０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを
含む同緩衝液にて溶出を行なった。全溶出液をＹＭ−１
０膜を用いた限外過により濃縮後、２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH７．４）に緩衝液を交換した後、以
下の条件で７回に分けて陰イオン交換高速液体クロマト
グラフィーに供した。

(2)陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ （２１．５mmID×１５cm、トーソー社製） 溶出液Ａ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
４） 溶出液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（pH７．４） 流 速：３．０ｍ／分 フラクション容積：６ｍ／チューブ／２分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ １０ ０ ２０ １０ ９５ ３０ １００ １００ １１０ １００ １１５ ０ １３０ ０ 上記溶出の結果、目的のＭ−ＣＳＦはフラクションNo.
２６〜３８（０．１８〜０．２５ＭＮａＣｌ）に溶出さ
れた。該活性画分をプールした後、限外過にて濃縮
（ＹＭ−１０膜使用）し、以下の精製を行なった。

(3)ゲル過高速液体クロマトグラフィー 上記(2)で得た濃縮サンプルを５回に分けて以下の条件
でゲル過高速液体クロマトグラフィーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＧ （２１．５mmID×６０cm、トーソー社製） 溶離液：０．３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH７．４） 流 速：３．０ｍ／分 フラクション容積：６ｍ／チューブ／２分 上記ゲル過高速液体クロマトグラフィーの結果、Ｍ−
ＣＳＦはフラクションNo.２０〜２７にかけて検出され
たが、その中のフラクションNo.２４〜２７をプールし
た後、限外過濃縮し、以下の精製に供した。

(4)ＴＳＫゲルEther−５ＰＷ高速液体クロマトグラフィ
ー 上記(3)で得た濃縮サンプル１２ｍを８回に分けて以
下の条件で精製した。

尚、上記濃縮液はカラム注入前に等量の８０％飽和硫安
含有２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．４）と混
合した後、クロマトグラフィーに供した。

カラム：ＴＳＫゲルEther−５ＰＷ （７．５mmID×７５mm、トーソー社製） 溶離液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
４） 溶離液Ｂ：４０％飽和硫安含有２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH７．４） 流 速：１．０ｍ／分 フラクション容積：２ｍ／チューブ／２分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ １００ ５ １００ ６５ ０ ８０ ０ ８５ １００ １００ １００ 上記クロマトグラフィーの結果、Ｍ−ＣＳＦはフラクシ
ョンNo.１５〜１８（２２％〜１７％飽和硫安濃度）に
検出されたが、之等のフラクションについてフラクショ
ン毎にプールした後、それぞれのプールについて３〜４
回に分けて逆相高速液体クロマトグラフィーを行なっ
た。

(5)ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷＲＰ逆相高速液体クロ
マトグラフィー カラム：ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷＲＰ （７．５mmID×７５mm、トーソー社製） 溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ 溶離液Ｂ：ｎ−プロパノール：１％ＴＦＡ（９：１） 流 速：０．８ｍ／分 フラクション容積：１．６ｍ／チューブ／２分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ５ ０ １０ ２５ ５０ ４５ ６０ １００ ７０ １００ ７５ ０ ９５ ０ 上記クロマトグラフィーの結果、Ｍ−ＣＳＦは用いるサ
ンプルの相違により、また実験により多少変動したが、
フラクションNo.５〜８（３２％〜３４％ｎ−プロパノ
ール）の間の連続する２本のフラクションに検出され
た。

尚、分画は予めチューブ当り２００ｍの０．８Ｍリン
酸二ナトリウムをいれたチューブにて行なった。Ｍ−Ｃ
ＳＦ画分はコンセントレーター（トミー精工社製）にて
各チューブ毎に遠心濃縮乾固した後、チューブ当り５０
０μの蒸留水を用いて溶解し実験に供した。

(6)ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ レムリの方法〔Laemmli,U.K.,Nature,277680(1970)〕に
従い、上記(5)で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ
−ＣＳＦを、レムリのサンプルバッファー［２−メルカ
プトエタノールを含むもの（２−ＭＥ^＋及び含まないも
の（２−ＭＥ^＋）の両者］のそれぞれと混合した後、９
５℃で１０分間加熱処理後、ミニスラブゲル（ゲル濃度
１２％）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。分子量
マーカーとしてはプレステインドマーカー（バイオラッ
ド社製）を用い、染色はシルバーステイン（和光純薬社
製）にて行なった。

その結果、非還元条件下（２−ＭＥ⁻状態）での分子量
は約８５０００を主成分として、６２０００〜１１５０
００にかけて、また還元条件（２−ＭＥ^＋状態）では４
３０００を主成分として３９０００〜４６０００にかけ
て、それぞれスメアーしたバンドとして検出された。

(7)ＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦのＮ末端域ア
ミノ酸配列 (5)で得られたＣＨＯ［−３２−５２２］Ｍ−ＣＳＦの
Ｎ末端域アミノ酸配列を、気相シークエンサー（アプラ
イドバイオシステムズ社製）を用いて決定した。

その結果、Ｎ端１０個のアミノ酸配列として次の配列が
確認された。尚、サイクル７におけるアミノ酸（Ｘ′）
は同定し得ず、遺伝子構造からＣｙｓであると推定し
た。

Glu-Glu-Val-Ser-Glu-Tyr-X′-Ser-His Met- 参考例２ プラスミドp trp IL-2X M-CSF101の作製 プラスミドpcDM-CSF11-185［Ｍ−ＣＳＦ遺伝子（λｃＭ
１１ｃＤＮＡ、約２．５kb）を保有するプラスミドpcDM
-CSF11から作製した（特開平１−１０４１７６号公報参
照）］を、制限酵素Scal及びBamHlで消化してScal−Bam
HlＤＮＡ断片（約４５０bp）をアガロースゲル電気泳動
にて単離精製した。次いで得られたＤＮＡ断片のScal切
断端に、下記合成リンカー（Ａ）をＴ４ＤＮＡリガーゼ
により連結させ、Scal切断端側に制限酵素Xbalの切断端
を有するXbal-BamHlＤＮＡ断片（約４８０bp）を得た。

合成リンカー（Ａ）： かくして得られたＤＮＡ断片を、ヒトＩＬ−２発現プラ
スミドp trp IL-2DB△（特開昭６３−１２９５８号公報
参照）のXbal、BamHI切断部位に挿入して、所望のプラ
スミドp trp IL-2X-M-CSF101を得た。

該プラスミドをエシェリヒア・コリHB101株にトランス
フォームさせた形質転換体は、「Escherichia coli HB1
01/ptrp IL-2X-CSF101」なる名称で、１９８８年１２月
２６日に工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄
第２２２６号(E.coli[3-153]ＦＥＲＭＢＰ−２２２６）
として寄託された。

E.coli [3-153]−Ｍ−ＣＳＦの分離、精製 （１）大腸菌からのＭ−ＣＳＦ画分の調製 上記で得たプラスミドPtrp IL-2X-M-CSF101を保持す
る大腸菌ＳＧ２１０５８株１．５ｇ（湿重量）に０．５
ショ糖を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．０）５
０ｍを加え、充分に攪拌した。次にリゾチーム２mg／
ｍを６ｍ、続けて０．１４Ｍ ＥＤＴＡ４ｍを加
え、４℃で１５分間攪拌処理し、次に１００００回転／
分で２０分間遠心分離を行なった。

上清はすて、沈渣を同緩衝液（０．５Ｍショ糖を含む５
０ｍＭトリス塩酸、pH７．０）にて洗浄し、同じく１０
０００回転／分で２０分間遠心操作を行なって、沈渣と
してスフェロプラストを得た。次いでこれに５０ｍＭト
リス塩酸（pH７．０）５０ｍを加えて懸濁させ、超音
波処理を２０ＫHz、１０分間行ない、その後１００００
回転／分で２０分間遠心分離し、同緩衝液（５０ｍＭト
リス塩酸、pH７．０）にて洗浄後、同条件で再度遠心分
離を行なって、沈渣としてＭ−ＣＳＦ画分を得た。

（２）Ｍ−ＣＳＦ画分からＭ−ＣＳＦの再構成 上記（１）の操作により得られたＭ−ＣＳＦ画分に７．
０Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭトリス塩酸（pH７．
０）１００ｍを加え、４℃で１時間スターラーにて攪
拌して溶解させた。この溶解液を、予め１０ｍＭトリス
塩酸（pH８．５）３００ｍに入ったビーカー（スター
ラーにて攪拌）中に徐々に滴下し、滴下終了後、１０ｍ
Ｍトリス塩酸（pH８．５）に対して４℃で充分に透析を
行ない、その後、１００００回転／分で２０分間遠心分
離を行ない、沈澱を除去して上清を得た。

かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳＦが
存在している。

（３）Ｍ−ＣＳＦの精製 上記（２）で得たＭ−ＣＳＦの精製を以下の通り行なっ
た。

(3−1)ゲル過高速液体クロマトグラフィー 上記（２）で得た遠心上清を限外過器（アミコン社
製、メンブラン：ＹＭ−１０膜、アミコン社製）を用い
て濃縮し、濃縮後を０．４５μｍミリポア−フィルター
に通した後、以下の条件で、ゲル過高速液体クロマト
グラフィーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（６０cm×２１．５
mmI.D.、トーソー社 製） 溶出液：０．３Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH６．８） 流 速：３．０ｍ／分 フラクション容積：６ｍ／チューブ／分 上記において、ゲル過ＨＰＬＣ用標準蛋白（オリエン
タル酵母社製）の各溶出位置、即ちグルタメート・デハ
イドロゲナーゼ（分子量２９００００）、ラクテート・
デハイドロゲナーゼ（分子量１４２０００）、エノラー
ゼ（分子量６７０００）及びアデニレート・キナーゼ
（分子量３２０００）から判断してＭ−ＣＳＦの分子量
３２０００と推定された。

上記活性部分を分取し、上記限外過器にて４０ｍＭホ
ウ酸ナトリウム（pH８．０）に対して溶媒交換を行なっ
た。

(3−2)ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体
クロマトグラフィー 上記(3−1)で得た活性溶出画分を、以下の条件でＴＳＫ
ゲルＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーにかけた。

カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ （７．５mmI.D.×７５mm、トーソー社製） 溶離液Ａ：５％メタノール含有４０ｍＭホウ酸ナトリウ
ム緩衝液（pH８．０） 溶離液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ及び５％メタノール含有
４０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（pH８．０） 流 速：１．０ｍ／分 フラクション容積：１．０ｍ／チューブ／分 濃度勾配： 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ７ ０ ４２ ３０ ４７ １００ ５２ １００ ５７ ０ ６２ ０ 上記ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体ク
ロマトグラフィーの結果（溶出パターン）より、フラク
ションNo.４２〜４３（０．２３〜０．２５ＭＮａＣｌ
濃度）に認められるピークがＭ−ＣＳＦに相当し、該ピ
ークを集めることにより、大腸菌から精製Ｍ−ＣＳＦ
（E.coli[3-153]M-CSF）を得た。

参考例３ ＣＨＯ〔−３２−５２２〕Ｍ−ＣＳＦの製造 参考例１と同様にＣＨＯ細胞を培養することにより得ら
れた培養上清液の濃縮液９３０ｍを硫安分画して２５
〜６５％の飽和硫安沈殿画分を得た後、蒸留水にて溶解
し（１１８０ｍ）、以下の方法により精製を行った。
尚、Ｍ−ＣＳＦの検出は参考例１と同様、ウエスタンブ
ロッティングにより行った。

（１）Ｃon−Ａセファロースクロマトグラフィー 約５００ｍのConA−セファロースゲルを充填したカラ
ム（５×２５cm）を０．１５ＭＮａＣｌ含有２０mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH７．４）にて平衡化した後、上
記溶解後をアプライし、同緩衝液にて充分に洗浄後、
０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドを含む同緩衝液に
て溶出を行った。全溶出液をＹＭ−１０膜を用いた限外
過により濃縮後、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
７．４）に緩衝液を交換した後（４０ｍ）、５回に分
けて陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーに供し
た。

（２）陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ （２１．５mmＩＤ×１５cm、トーソー社製） 溶出液Ａ：４０mMリン酸ナトリウム緩衝液 （pH７．４） 溶出液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH７．４） 流 速：３．０ｍ／分 フラクション容積：６ｍ／チューブ／２分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ １０ ０ ２０ １０ ９５ ３０ １００ １００ １１０ １００ １１５ ０ １３０ ０ Ｍ−ＣＳＦは溶出フラクションのNo.２６〜４３にかけ
て検出されたが、主たるＭ−ＣＳＦ画分であるフラクシ
ョンNo.３０〜３９をプールし限外過濃縮（ＹＭ−１
０膜使用）した後（１５ｍ）、４回に分けて以下の精
製を行った。

（３）ＴＳＫゲル フェニル−５ＰＷＲＰ逆相高速流体
クロマトグラフィー カラム：ＴＳＫゲルフェニル−５ＰＷＲＰ （２１．５mmＩＤ×１５cm、トーソー社製） 溶出液Ａ：０．１％ ＴＦＡ 溶出液Ｂ：ｎ−プロパノール：１．０％ ＴＦＡ （９：１） 流 速：３ｍ／分 フラクション容器：１．５ｍ／チューブ／０．５分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ １０ ０ ２０ ２０ １００ ４５ １２０ １００ １３０ １００ １４０ ０ １８０ ０ 上記溶出フラクション中のＭ−ＣＳＦ画分をプールした
後、限外過にて濃縮（ＹＭ−１０膜使用）し、更にセ
ントリコン３０（アミコン社製）にて濃縮した後（１ｍ
）、３回に分けてゲル過高速液体クロマトグラフィ
ーを行った。

（４）ゲル過高速液体クロマトグラフィー カラム：スーパーローズ１２ ＨＲ １０／３０ １０mmＩＤ×３０cm、PharmaciaＬＫＢ社製） 溶出液：０．３Ｍ ＮａＣｌ含有２０mMリン酸 ナトリウム緩衝液（pH７．４） 流 速：０．８ｍ／チューブ／分 上記クロマトグラフィーの結果、Ｍ−ＣＳＦはフラクシ
ョンNo.１５〜１７にかけて溶出されたが、その中のフ
ラクションNo.１６をプールして実験に供した。（５．
６mg，比活性：３．８×１０^７単位／mg蛋白）。

参考例４ Ｍ−ＣＳＦ誘導体(E.coli[3-153]-M-CSF）の改良分離、
精製 （１）大腸菌からのＭ−ＣＳＦ画分の調製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF101を保持する大腸菌ＳＧ
２１０５８株７．５ｇ（湿重量）に、５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（pH７．０）１．０ｍを加えて充分に攪拌し
た。次にリゾチーム４mg／ｍをｂｍ及びＥＤＴＡを
最終濃度が１０ｍＭとなるように加え、４℃で１５分間
攪拌処理し、超音波処理（２０ＫHz、１０分間、２００
Ｗ）を行ない、更に１００００×ｇ／分で２０分間遠心
分離を行ない沈渣を得た。これを更に洗浄用緩衝液（２
％トリトンＸ１００を含む５０ｍＭトリス塩酸、pH７．
０）にて洗浄後、同条件で再度遠心分離を行ない、この
操作を２回繰返して、Ｍ−ＣＳＦ画分（沈渣）を得た。

（２）Ｍ−ＣＳＦ画分からＭ−ＣＳＦの再構成 上記（１）で得たＭ−ＣＳＦ画分に、７Ｍ塩酸グアニジ
ン及び２５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH７．０）２０ｍを加え、室温
で４時間以上攪拌して溶解させた。この溶解液を予め
０．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸化型グル
タチオン及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（pH８．５）２０００ｍの入ったビーカー（スターラ
ーにて攪拌）中に徐々に滴下し、その後、４℃にて２日
間以上放置した。次に溶液を１００００×ｇ／分で３０
分間遠心分離を行ない、沈澱を除去して上清を得た。

かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳＦが
存在している。

（３）Ｍ−ＣＳＦの精製 上記（２）で得た遠心上清を以下の通り精製した。

(3−1)イオン交換クロマトグラフィーによる濃縮 予め５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．５）で平衡化し
ておいたＱＡＥ−ゼータ・プレップ１００（ファルマシ
ア−ＬＢＫ社製）に上記（２）で得た再構成液をかけ、
次に上記緩衝液で充分洗浄後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含
む上記緩衝液にてＭ−ＣＳＦ画分の溶出を行なった。

(3−2)疎水性高速流体クロマトグラフィー 上記で得られた画分に硫酸アンモニウムを３０％飽和溶
液となるように加え、１００００×ｇ／分で２０分間遠
心分離し、沈殿を除去して上清を得た。この上清を０．
４５μｍミリポアーフィルターに通した後、以下の条件
で疎水性高速液体クロマトグラフィーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルフェニル５ＰＷ（２１．５mmID×１
５０mm、トーソー社製） 溶出液Ａ：３０％飽和硫安含有４０mMリン酸ナトリウム
緩衝液（pH７．４） 溶出液Ｂ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
４） 流 速：３．０ｍ／分 フラクション容積：３．０ｍ／チューブ／分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ７ ０ ４７ １００ ５２ １００ ５７ ０ 上記の結果、Ｍ−ＣＳＦ活性は硫安濃度６〜３％の画分
に溶出された。該活性部分を分取し、限外過器にて４
０ｍＭリン酸ナトリウム（pH７．４）に対して溶媒交換
を行なった。

(3−3)陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー 上記(3−2)で得た画分を、以下の条件で陰イオン交換高
速液体クロマトグラフィーにかけた。

カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５mmID×
１５０mm、トーソー社製） 溶離液Ａ：４０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．４） 溶離液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有４０ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH７．４） 流 速：３．０ｍ／分 フラクション容積：３．０ｍ／チューブ／分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ５ ０ ４３ ３０ ４８ １００ ５３ １００ ５８ ０ 上記陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーの結果
（溶出パターン）より、フラクションNo.３５及び３６
（０．２８〜０．２９Ｍ ＮａＣｌ濃度）に認められる
ピークがＭ−ＣＳＦに相当し、該ピークを集めて、精製
された本発明ヒトＭ−ＣＳＦ誘導体(E.coli[3-153]-M-C
SF）を得た。

参考例５ p trp IL-2X-M-CSF 201の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 101を制限酵素BstEllとS
alIで切断し、ＩＬ−２及びＭ−ＣＳＦＤＮＡ部分を含
む４．７kbのＤＮＡ断片（Ｉ）を得た。

一方、プラスミドpcDM-CSF11を制限酵素EcoRIで切断
後、切断部分をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を
用いて平滑末端とした後、SalIリンカー(5′−pGGTCGAC
COH^３′）（ニューイングランドバイオラボ社製）を連
結させた。これを制限酵素SalI及びBstEIIで切断して、
約１．１KbのBstEII-SallＤＮＡ断片（II）を得た。

上記ＤＮＡ断片（Ｉ）と（II）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結し、これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形
質転換して、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201
を有する大腸菌HB101を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201は、大腸菌
トリプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内
に、２種のポリプペチドがコードされている。その一つ
は翻訳開始のメチオニン、ヒトＩＬ−２アミノ末端側６
０アミノ酸及び合成ＤＮＡリンカーにコードされる４−
アミノ酸からなる６５アミノ酸のポリペプチドであり、
他の一つは翻訳開始のMetと式（１）で表わされるアミ
ノ酸配列の３位アミノ酸(Val)から５２２位アミノ酸(Va
l)までの５２０アミノ酸とのヒトＭ・ＣＳＦ誘導体から
なるポリペプチドである。

かかる２・シストロン(two-cistron)発現システムにお
いて、セカンドシストロン(2nd cistron)の翻訳は、合
成ＤＮＡリンカーに置かれた第２のＳＤ配列にリボソー
ムが結合することにより開始される。

(2) p trp IL-2X-M-CSF 202の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201を制限酵素NcolとSal
Iで切断して、約４．８kbのNcol-SalIＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片の両端を合成オリゴデキシヌクレオ
チド［５′−CATGGCCTGATAAG-3′と５′−TCGACTTATCAG
GC-3′］を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、こ
れを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換し、所
望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 202を有する大腸菌H
B101を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 202は、大腸菌
トリプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内の
セカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式（１）のア
ミノ酸配列の３位アミノ酸(Val)から１８４位アミノ酸
(Ala)までの１８２アミノ酸とのヒトＭ・ＣＳＦ誘導体
からなるポリペプチドをコードしている。

(3) p trp IL-2X-M-CSF 203の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201を制限酵素BamHIとSa
lIで切断して、約４．９kbのBamHI-SalIＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片の両端を合成オリゴデキシヌクレオ
チド［５′−GATCCATGATAAG-3′と５′−TCGACTTATCATG
-3′］を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、これ
を大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換して、所
望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 203を有する大腸菌H
B101を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 203は、大腸菌
トリプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内の
セカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式（１）のア
ミノ酸配列の３位アミノ酸(Val)から２１４位アミノ酸
(Pro)までの２１２アミノ酸とのヒトＭ・ＣＳＦ誘導体
からなるポリペプチドをコードしている。

上記プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 203を保有する大腸
菌HB101株は「Escherichia coli HB 101/ptrplL-2X-M-C
SF203」なる表示で、平成１年１０月１８日に工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１０５３号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０５３）として寄託され、その後
平成３年５月７日に国際寄託に移管されされ、微工研条
寄第３３８３号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３８３）として寄
託された。

(4) p trp IL-2X-M-CSF 204の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201を制限酵素SmaIとSal
Iで切断して、約５．０kbのSmaI-SalIＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片の両端を合成オリゴデオキシヌクレ
オチド［５′−GGGTGATAAG-3′と５′-TCGACTTATCACCC-
3′］を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、これ
を大腸菌HB101のコンピセントセルに形質転換して、所
望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 204を有する大腸菌H
B101を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 204は、大腸菌
トリプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内の
セカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式（１）のア
ミノ酸配列の３位アミノ酸(Val)から２５８位アミノ酸
(Gly)までの２５６アミノ酸とのＭ・ＣＳＦ誘導体から
なるポリペプチドをコードしている。

(5)p trp IL-2X-M-CSF 205の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201を制限酵素SphIとSal
Iで切断して、約５．１kbのSPhI-SalIＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片の両端を合成オリゴデオキシヌクレ
オチド［５′−CAGTGATAAG-3′と５′-TCGACTTATCACTGC
ATG-3′］を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、
これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換し
て、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 205を有する
大腸菌HB101を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 205は、大腸菌
トリプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内の
セカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式（１）のア
ミノ酸配列の３位アミノ酸(Val)から３０２位アミノ酸
(Gln)までの３００アミノ酸とのＭ・ＣＳＦ誘導体から
なるポリペプチドをコードしている。

(6)p trp IL-2X-M-CSF 206の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 201を制限酵素kpnIとSal
Iで切断して、約５．２kbのKpnI-SalIＤＮＡ断片を得
た。このＤＮＡ断片の両端を合成オリゴデオキシヌクレ
オチド［５′−CGCCTGATAAG-3′と５′-TCGACTTATCAGGC
GGTAC-3′］を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結
し、これを大腸菌HB101のコンピセントセルに形質転換
して、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 206を有す
る大腸菌HB101を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 206は、大腸菌
トリプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内の
セカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式（１）のア
ミノ酸配列の３位アミノ酸(Val)から３３４位アミノ酸
(Ala)までの３３２アミノ酸とのＭ・ＣＳＦ誘導体から
なるポリペプチドをコードしている。

(7) Ｍ−ＣＳＦ誘導体の発現 上記(1)〜(6)で得た各プラスミドを、大腸菌ＳＧ２１０
５８株〔J.Bacteriol.,164,1124-1135(1985)〕に形質転
換法により導入して、形質転換体［夫々E.COLI SG21058
/p trp IL-2X-M-CSF 201、E.coli SG21058/p trp-IL-2X
-M-CSF 202、E.coli SG21058/p trp-IL-2X-M-CSF 203、
E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 204、E.coli SG210
58/p trp-IL-2X-M-CSF 205及びE.coli SG21058/p trp-I
L-2X-M-CSF 206と命名する］を得た。

之等の形質転換体を、５０μｇ／ｍのアンピシリンを
含むＬＢ培地（T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambro
ok，Molecular Cloning，A Laboratiry Manual,P440 (1
982),Cold Spring Harbor Laboratory)中で、３７℃で
一晩培養後、その培養液０．５ｍを、１％カザミノ
酸、５μｇ／ｍ塩酸チアミン、２０μｇ／ｍＬ−シ
ステイン及び５０μｇ／ｍアンピシリンを加え、グル
コース濃度を０．４％に調整したＭ９培地（同上文献参
照）５０ｍに添加し、３７℃で８時間振盪培養後、遠
心（５０００rpm）して菌体を回収し、生産された蛋白
質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
法により解析した。

ウエスタンブロッティングは、バイオラッド社のトラナ
スブロットセルを用いて行ない、トランスファーされた
ニトロセルロース膜を１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳ
−にてブロッキング後、Ｍ−ＣＳＦに対するウサギ抗血
清と反応させ、更にパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ
抗体（バイオラッド社製）を反応させた。Ｍ−ＣＳＦの
バンドの検出は、かくして得られたニトロセルロース膜
と発色基質である４−クロロ−１−ナフトール液とを反
応させることにより行なった。

その結果、セカンドシストロンにコードされているＭ−
ＣＳＦは、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 202、E.c
oli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 203、E.coli SG21058/p
trp IL-2X-M-CSF 204、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-
CSF 205及びE.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 206に
おいて、夫々予想される分子量の位置に検出された。

(8)Ｍ−ＣＳＦ誘導体（E.coli[3-214]-M-CSF）の分離、
精製 上記(3)で得たプラスミドP trp IL-2X-M-CSF 203を保持
する大腸菌ＳＧ２１０５８株１０ｇ（湿重量）に、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え全量を１０
０ｍとし、充分に攪拌した。次にリゾチーム６mg／ｍ
を４ｍ、続けて０．１４Ｍ ＥＤＴＡ８ｍを加
え、４℃で１５分間攪拌処理後、超音波処理（２００Ｋ
Ｈｚ、２分間、２００Ｗ）を行ない、更に１００００回
転／分で２０分間遠心分離を行なった。得られた沈渣を
２％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．０）にて充分洗浄後、同条件で再度遠心分
離を行なって、沈渣としてＭ−ＣＳＦ画分を得た。

かくして得られたＭ−ＣＳＦ画分に、７．０Ｍ塩酸グア
ニジン及び５０ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．０）２０ｍを加え、室温で４
時間攪拌して蛋白質を還元、変性及び溶解させた。この
溶解液０．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸化
型グルタチオン及び２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．５）２０００ｍの入ったビーカ−（スター
ラーにて攪拌）中に徐々に滴下して１００倍に希釈し
た。滴下終了後、４℃にて２日間以上放置し、その後、
３０００回転／分で３０分間遠心分離を行ない、沈澱を
除去して上清２を得た。

かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳＦが
存在している。

上記で得た遠心上清の内の１を、限外過器（アルミ
コン社製、ＹＭ−１０膜（アミコン社製）使用）を用い
て濃縮し、濃縮液を１００００回転／分で２０分間遠心
分離し、沈澱を除去して上清を得た。この上清に更に硫
酸アンモニウム（硫安）を３０％飽和となる量で加え、
再度同様に遠心分離し、以下の条件で疏水性相互作用ク
ロマトグラフィーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルフェニル５ＰＷ（７．５mmID×７５
mm、トーソー社製） 溶出液Ａ：３０％飽和硫安含有５０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４） 溶出液Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 流速：１．０ｍ／分 フラクション容積：１ｍ／チューブ／分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ７ ０ ４０ １００ ４５ １００ ５０ ０ ６０ ０ 上記の結果、Ｍ−ＣＳＦ活性はフラクションNo.４０〜
４２（８〜６％飽和硫安濃度）の画分に溶出された。該
活性部分を分取し、上記限外過器にて５０ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して溶媒交換を行ない、
以下の条件でＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体クロ
マトグラフィーを行なった。

カラム：ＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５mmI.D.×７５mm、ト
ーソー社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 溶離液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：１．０ｍ／分 フラクション容積：１．０ｍ／チューブ／分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ７ ０ ４２ ３０ ４７ １００ ５２ １００ ５７ ０ ６２ ０ 上記ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーの結果（溶出パターン）より、フラクションNo.
３１及び３２（０．１８〜０．２０Ｍ ＮａＣｌ濃度）
に認められるピークがＭ−ＣＳＦに相当し、該ピークを
集めて、本発明ヒトＭ−ＣＳＦ誘導体を得た。

上記各精製工程での本発明ヒトＭ−ＣＳＦ誘導体の活
性、蛋白質、比活性及び精製度を求めた結果を下記第５
表に示す。

(9)Ｍ−ＣＳＦ誘導体（E.coli[3-214]-M-CSF）のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ レムリの方法〔Laemmli，U.K.，Nature，277，680(197
0)〕に従い、上記精製サンプルをレムリのサンプルバッ
ファー［２−ＭＥ^＋及び２−ＭＥ⁻］の夫々に溶解し、
９５℃で５分間加熱処理後、マイクロスラブゲルを用い
て電気泳動を行なった［装置：マリソル産業社製又は第
一化学薬品社製］。尚、分子量マーカーとしては、プレ
ステインドマーカー（バイオラッド社製）を用い、染色
はクマシーブリリアントブルーＲ−２５０によった。

その結果、E.coli[3-214]-M-CSFの分子量は、２−ＭＥ
⁻状態で約５２５００であり、２−ＭＥ^＋状態で約２６
９００であり、この位置に単一バンドとして泳動され
た。

参考例６ (1)プラスミドp trp IL-2X-M-CSF109の作製 プラスミドpcDM-CSF11-185［Ｍ−ＣＳＦ遺伝子（λｃＭ
１１ｃＤＮＡ、約２．５kb）を保有するプラスミドpcDM
-CSF11から作製した（特開平１−１０４１７６号公報参
照）］を、制限酵素Scal及びBamHIで消化してScal−Bam
HI ＤＮＡ断片（約４５０bp）をアガロースゲル電気泳
動にて単離精製した。

次いで得られたＤＮＡ断片のScal切断端に下記合成リン
カー（Ｂ）をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連絡させ、Scal
切断端側に制限酵素Xbalの切断端を有するXbal−BamHI
ＤＮＡ断片（約４８０bp）を得た。

合成リンカー（Ｂ）： かくして得られたＤＮＡ断片を、ヒトＩＬ−２発現プラ
スミドp trp IL-2D8Δ（特開昭６３−１２９５８号公報
参照）のXbal、BamHl切断部位に挿入して、所望のプラ
スミドp trp IL-2X-M-CSF109を得た。

得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF109は、大腸菌ト
リプトファンプロモーター支配下の転写ユニット内に、
２種のポリペプチドがコードされている。その一つは翻
訳開始のMet、ヒトＩＬ−２アミノ末端側６０アミノ酸
及び合成リンカーＤＮＡ配列により生じる４アミノ酸か
らなる６５アミノ酸のポリペプチドであり、他の一つは
翻訳開始のMetと式（１）で表わされるアミノ酸配列の
４位アミノ酸（Ser）から１５３位アミノ酸（Thr）まで
の１５０アミノ酸とからなるポリペプチドである。

(2)p trp IL-2X-M-CSF 402の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 109を制限酵素BstEIIとS
caIで切断して、約１．５kbのＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 202を同様に制限
酵素BatEII及びScaIで切断して、約３．３kbのＤＮＡ断
片を得た。

上記両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換
して、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 402を有す
る大腸菌HB101を得た。

かくして得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 402
は、大腸菌トリプトファンプロモーター支配下の転写ユ
ニット内のセカンドシストロンに、翻訳開始のMetの式
（１）のアミノ酸配列の４位アミノ酸（Ser）から１８
４位アミノ酸（Ala）までの１８１アミノ酸とのヒトＭ
・ＣＳＦ誘導体からなるポリペプチをコードしている。

(3)p trp IL-2X-M-CSF 403の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 109を制限酵素BstEIIとS
caIで切断して、約１．５kbのＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 203を同様に制限
酵素BstEIIとScaIで切断して、約３．４kbのＤＮＡ断片
を得た。

上記両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換
して、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 403を有す
る大腸菌HB101を得た。

かくして得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 403
は、大腸菌トリプトファンプロモーター支配下の転写ユ
ニット内のセカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式
（１）のアミノ酸配列の４位アミノ酸（Ser）から２１
４位アミノ酸（Pro）までの２１１アミノ酸とのヒトＭ
・ＣＳＦ誘導体からなるポリペプチドをコードしてい
る。

(4)p trp IL-2X-M-CSF 404の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 109を制限酵素BstEIIとS
caIで切断して、約１．５kbのＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 204を同様に制限
酵素BstEII及びScaIで切断して、約３．５kbのＤＮＡ断
片を得た。

上記両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換
して、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 404を有す
る大腸菌HB101を得た。

かくして得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 404
は、大腸菌トリプトファンプロモーター支配下の転写ユ
ニット内のセカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式
（１）のアミノ酸配列の４位アミノ酸（Ser）から２５
８位アミノ酸（Gly）までの２５５アミノ酸とのヒトＭ
・ＣＳＦ誘導体からなるポリペプチドをコードしてい
る。

(5)プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 405の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 109を制限酵素BstEIIとS
caIで切断して、約１．５kbのＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 205を同様に制限
酵素BstEII及びScaIで切断して、約３．６kbのＤＮＡ断
片を得た。

上記両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
し、これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換
して、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 405を有す
る大腸菌HB101を得た。

かくして得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 405
は、大腸菌トリプトファンプロモーター支配下の転写ユ
ニット内のセカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式
（１）のアミノ酸配列の４位アミノ酸（Ser）から３０
２位アミノ酸（Glm）までの２９９アミノ酸とのヒトＭ
・ＣＳＦ誘導体からなるポリペプチドをコードしてい
る。

(6)プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 406の作製 プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 109を制限酵素BstEIIとS
caIで切断して、約１．５kbのＤＮＡ断片を得た。

一方、プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 206を同様に制限
酵素BstEII及びScaIで切断して、約３．６kbのＤＮＡ断
片を得た。

一方、プラスミドp trp IL-2X-M-CSF 206を同様に制限
酵素BstEII及びScaIで切断して、約３．７kbのＤＮＡ断
片を得た。

上記両ＤＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、
これを大腸菌HB101のコンピテントセルに形質転換し
て、所望のプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 406を有する
大腸菌HB101を得た。

かくして得られたプラスミドp trp IL-2X-M-CSF 406
は、大腸菌トリプトファンプロモーター支配下の転写ユ
ニット内のセカンドシストロンに、翻訳開始のMetと式
（１）のアミノ酸配列の４位アミノ酸（Ser）から３３
４位アミノ酸（Ala）までの３１１アミノ酸とのヒトＭ
・ＣＳＦ誘導体からなるポリペプチドをコードしてい
る。

(7)Ｍ−ＣＳＦ誘導体の発現 上記(1)〜(6)で得た各プラスミドを、大腸菌ＳＧ２１０
５８株〔J.Bacteriol.，164，1124-1135（1985）〕に形
質転換法により導入して、形質転換体［夫々E.coli SG2
1058/p trp IL-2X-M-CSF 109、E.coli SG21058/p trp I
L-2X-M-CSF 402、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 4
03、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 404、E.coli S
G21058/p trp IL-2X-M-CSF 405及びE.coli SG21058/p t
rp IL-2X-M-CSF 406と命名する］を得た。

之等の形質転換体を、５０μｇ／ｍのアンピシリンを
含むＬＢ培地（T.Maniatis，E.F.Fritsch and J.Sambro
ok，Molecular Cloning，A Laboratiry Manual,P440 (1
982),Cold Spring Harbor Laboratory)中で、３７℃で
一晩培養後、その培養液０．５ｍを、１％カザミノ
酸、５μｇ／ｍ塩酸チアミン、２０μｇ／ｍＬ−シ
ステイン及び５０μｇ／ｍアンピシリンを加え、グル
コース濃度を０．４％に調整したＭ９培地（同上文献参
照）５０ｍに添加し、３７℃で８時間振盪培養後、遠
心（５０００rpm）して菌体を回収し、生産された蛋白
質を参考例５の(7)と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びウエスタンブロッティング法により解析した。

その結果、セカンドシストロンにコードされていＭ−Ｃ
ＳＦは、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 109、E.co
li SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 402、E.coli SG21058/p
trp IL-2X-M-CSF 403、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M
-CSF 404、E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 405及び
E.coli SG21058/p trp IL-2X-M-CSF 406において、夫々
予想される分子量の位置に検出された。

(8)Ｍ−ＣＳＦ誘導体（E.coli[4-153]-M-CSF）の分離、
精製 （１）大腸菌からのＭ−ＣＳＦ画分の調製 上記(1)で得たプラスミドP trp IL-2X-M-CSF 109を保持
する大腸菌ＳＧ２１０５８株７．５ｇ（湿重量）に、５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え全量を１
００ｍとし、充分に攪拌した。次にリゾチーム２mg／
ｍを６ｍ、続けて０．１４Ｍ ＥＤＴＡ４ｍを加
え、４℃で１５分間攪拌処理し、超音波処理（２０ＫＨ
ｚ、１０分間、２００Ｗ）を行ない、更に１００００回
転／分で２０分間遠心分離を行ない沈渣を得た。これを
更に洗浄用緩衝液（２％トリトンＸ１００を含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０）にて洗浄後、同条件で
再度遠心分離を行ない、この操作を２回繰返して、Ｍ−
ＣＳＦ画分（沈渣）を得た。

（２）Ｍ−ＣＳＦ画分からＭ−ＣＳＦの再構成 上記（１）で得たＭ−ＣＳＦ画分に、７Ｍ塩酸グアニジ
ン及び２５ｍＭ２−メルカプトエタノールを含む５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍを加え、室
温で４時間以上攪拌して蛋白質を還元、変性及び溶解さ
せた。この溶解液を予め０．５ｍＭ還元型グルタチオ
ン、０．１ｍＭ酸化型グルタチオン及び２Ｍ尿素を含む
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０００ｍ
の入ったビーカ−（スターラーにて攪拌）中に徐々に滴
下し、その後、４℃にて２日間以上放置した。次に溶液
を３５００回転／分で３０分間遠心分離を行ない、沈澱
を除去して上清を得た。

かくして得られた上清中には、再構成したＭ−ＣＳＦが
存在している。

（３）Ｍ−ＣＳＦの精製 上記（２）で得た遠心上清を以下の通り精製した。

(3-1)疏水性高速液体クロマトグラフィー 上記遠心上清を限外過器（アミコン社製、メンブラ
ン：ＹＭ−１０膜（アミコン社製）使用）を用いて濃縮
し、濃縮液に硫酸アンモニウムを３０％飽和溶液となよ
うに加え、１００００回転／分で２０分間遠心分離し、
沈澱を除去して上清を得た。この上清を０．４５μｍミ
リポアーフィルターに通した後、２回に分けて以下の条
件で疏水性相互作用クロマトグラフィーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルフェニル５ＰＷ（７．５mmID×７５
mm、トーソー社製） 溶出液Ａ：３０％飽和硫安含有４０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４） 溶出液Ｂ：４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 流速：１．０ｍ／分 フラクション容積：１．０ｍ／チューブ／分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ７ ０ ４０ １００ ４５ １００ ５０ ０ 上記の結果、Ｍ−ＣＳＦ活性は硫安濃度１１〜６％の画
分に溶出された。該活性部分を分取し、上記限外過器
にて４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して
溶媒交換を行なった。

(3-2)陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー 以下(3-1)で得た画分を４回に分けて、以下の条件でＤ
ＥＡＥ−５ＰＷ陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ
ーを行なった。

カラム：ＴＳＫゲルＤＥＡＥ−５ＰＷ（７．５mmI.D.×
７５mm、トーソー社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４） 溶離液Ｂ：１．０Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７．４） 流速：１．０ｍ／分 フラクション容積：１．０ｍ／チューブ／分 濃度勾配 時間（分） Ｂ％ ０ ０ ５ ０ ５５ ３０ ６０ １００ ６５ １００ ７０ ０ 上記ＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーの結果（溶出パターン）より、フラクションNo.
４１及び４２（０．２１〜０．２２Ｍ ＮａＣｌ濃度）
に認められるピークがＭ−ＣＳＦに相当し、該ピークを
集めて、精製された本発明ヒトＭ−ＣＳＦ誘導体（E.co
li[4-153]-M-CSF）を得た。

(9)Ｍ−ＣＳＦ誘導体（E.coli[4-153]-M-CSF）のＮ−末
端アミノ酸配列の決定 上記(8)の(3-2)で得られたＭ−ＣＳＦ誘導体（E.coli[4
-153]-M-CSF）のＮ−末端アミノ酸配列を、気相シーク
エンサー（アプライド・バイオシステムズ社製）を用い
て決定した。

その結果、Ser-Glu-Tyr-X′-Serの配列とMet-Ser-Glu-T
yr-X′-Serの配列とが、約７〜８対１の割合で認められ
た。

尚、上記配列中、アミノ酸（Ｘ′）は同定し得ず、遺伝
子構造からCysであると推定した。

〈生物学的利用率〉 生物学的利用率は、投与された薬剤が有効に生体内で利
用されるか否かの指標となる。

ここで、生物学的利用率は静注による血中半減期と皮下
注による血中半減期の積分値の比をもって表わす。

血中半減期はＲＩＡにより測定した。血中半減期の積分
値は、台形法によって求め、生物学的利用率は次式によ
り算出した。

生物学的利用率（％）＝ＡＵＣ_sc／ＡＵＣ_iv×１００ (1)血中半減期の測定 本発明にかかわるＭ−ＣＳＦ誘導体（E.coli[3-153]-M-
CSF）及び参考例１で得たCHO[-32-522]-M-CSFのそれぞ
れをＭＳＡ（マウス血清アルブミン）含有生理食塩水
（３０μｇ／ｍ）にて２０μｇ／ｍの濃度となるよ
うに希釈調整し、之等を１群４匹からなる各群マウス
（ＢＡＬＢ／ｃ雄性、７週齢）にて１匹当り０．２５ｍ
（２００μｇ／kg）の量で静脈内（I.V.）投与した。
投与後、経時的に血中のＭ−ＣＳＦ量をＲＩＡにより求
めた。

該ＲＩＡによる血中半減期の測定は、次の方法により実
施した。即ち検体サンプル（血清）又は標準Ｍ−ＣＳＦ
（参考例２で得た本発明に係わるＭ−ＣＳＦ誘導体（E.
coli[3-153]-M-CSF）溶液１００μ、Ｎａ¹²⁵Ｉで標識
したＭ−ＣＳＦ（上記標準Ｍ−ＣＳＦをヨードゲン法に
より¹²⁵Ｉにて標識したもの）を１００μ中に１００
００cpm含む溶液、及び抗Ｍ−ＣＳＦウサギ血清（後記
する方法により得られるポリクローナル抗体ＯＣＴ５１
１を、０．１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％チメロザ
ールで４００００倍希釈したもの）２００μの混合液
を、室温で２０時間又は４℃で４８時間放置して、抗原
抗体反応を行なわせ、反応終了後、標識Ｍ−ＣＳＦの結
合物と非結合物を２抗体法にて分離する。該分離はまず
０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％チメロザールで４
００倍に希釈した正常ウサギ血清１００μと、同様に
４０倍に希釈した抗ウサギ１ｇＧ血清１００μ、及び
２００μのＰＢＳに溶かした１２．５％ポリエチレン
グリコールを加え、３０分間４℃で反応させ、１５分間
３０００rpmで遠心分離し、デカンテーションして標識
Ｍ−ＣＳＦと抗体との結合物である沈渣を得る。沈渣は
ガンマーカウンターで１分間カウントして標準溶液から
スタンダードカーブを作成し、本発明に係わるＭ−ＣＳ
Ｆ誘導体を含有する検体サンプルにつき、上記操作を繰
り返して同様にして測定したカウント数を、上記スタン
ダードカーブ上にプロットして、該検体中のＭ−ＣＳＦ
濃度を求める。

かくして得られた結果を下記第６表に示す。

上記第６表の結果より、CHO[-32-522]-M-CSF及びE.coli
[3-153]-M-CSFの生物学的利用率を求めと、以下の通り
となる。

CHO[-32-522]-M-CSF： (5876.6/85087.5)×100＝6.63％ E.coli[3-153]-M-CSF： (24519.9/20966.5)×100＝116.95％ E.coli[3-214]-M-CSF： (44602.0/267107.0)×100＝16.70％ 上記の通り、本発明に係わるＭ−ＣＳＦ誘導体E.coli[3
-153]-M-CSFは、皮下投与による血中移行率が良好であ
り、皮下投与した際の生物学的利用率がCHO[-32-522]-M
-CSFより優れていることが示唆され、注射剤として皮下
投与されることが通常である抗アレルギー剤として特に
適していることが示唆されるものである。

尚上記ＲＩＡにおいて用いたＭ−ＣＳＦに対するポリク
ローナル抗体は次のような性質を有する。

１）上記で用いられるポリクローナ抗体は以下の方法に
より作製された。

ポリクローナル抗体の作製は、２．５kgから３．０kgの
雌のニュージランドホワイト種のウサギに、CHO[-32-52
2]-M-CSFの精製品（ＰＢＳに溶解）を一羽当り２０μｇ
を等量のフロイントの完全アジュバンドと共にウサギの
皮内に多点免疫し、それ以降は同２０μｇをフロイント
の不完全フジュバントと共に１ケ月おきに免疫し、最初
の免疫に合わせて合計７回免疫した。免疫終了後、１週
間後にウサギより全採血して抗血清を得た。

得られた３種の抗体の内の一つを、「ＯＣＴ５１１」と
命名し、−８０℃で保存した。

２）Ｍ−ＣＳＦ誘導体の血中半減期の測定に用いるポリ
クローナル抗体ＯＣＴ５１１は以下の性質を有する。

抗体力価 CHO[-32-522]-M-CSFを、ヨードゲン法にて¹²⁵Ｉを標識
してこの¹²⁵Ｉ標識CHO[-32-522]-M-CSF１０kcpmのうち
５０％と結合できる抗血清の希釈倍率を抗体価とした。

その結果、ＯＣＴ５１１の抗体力価は８００００であっ
た。

中和活性 マウスの骨髄細胞を使用したコロニーアッセイ法で中和
活性を求めたところ、ＯＣＴ５１１の中和活性は、ＯＣ
Ｔ５１１ １ｍ当りでCHO[-32-522]-M-CSFを１〜２×
１０^６単位が中和できた。

交差反応性 このＯＣＴ５１１はマウスのＣＳＦ（L-Cellの培養上
清）及びヒトのＧＭ−ＣＳＦ（アマシャム社）と全く交
差せず、更にヒトＩＬ−１ａ（特開昭６３−１６４８９
９号公報参照）、ＩＬ−１β（特開昭６３−１５２３９
８号公報参照）、ＩＬ−２（アマシャム社）、ＴＮＦ−
α（アマシャム社）にも全く交差しなかった。

実施例５ 細胞免疫能の検査法として広く用いられているマウスの
塩化ピクリル誘発遅延型過敏皮膚反応（ＰＣ−ＤＴＨ）
に対するＥ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦの効果につ
いて検討した。

材料としては以下のものを使用した。

マウス：マウスは８週齢雄性のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｓ
Ｌ Ｃ）を１群５匹として使用した。

抗原溶液：感作用抗原は、塩化ピクリル（ＰＣ）（半井
化学薬品）を０．５％（W/V）となるようにエタノール
に溶解し、チャレンジ用抗原は、塩化ピクリルを１％
（W/V）となるようにオリーブ油に溶解したものを用い
た。

計測用機器：Dial thickness gauge（尾崎製作所）を使
用した。

感作方法 感作はマウスの耳への塗布により行なった。塗布方法は
田島らの方法〔田島滋、今井英子、伊東敬三、能瀬尚
志：マウスの塩化ピクリル誘発遅延型皮膚反応における
抗原の簡易な感作方法、医学のあゆみ、第１２２巻、第
４号、第２４０−２４２頁、１９８２年〕に従って行な
った。

即ち、マイクロピペットにて右耳の表裏に感作用抗原１
０μずつを塗布して感作した。感作後４日目に左耳の
厚さを測定し、これを反応前値とした。その後、上記チ
ャレンジ用抗原液を左耳の表裏に５μずつ塗布し、２
４時間後、左耳の厚さを測定して、反応前値との差（Δ
Ｔ）を耳の厚さの増加量とした。

また、対照群に対する抑制率は次式によって求めること
ができる。

抑制率（％）＝〔1-(M-CSF投与群ΔT/対照群ΔT）×10
0） Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦの投与方法は以下の
ようにして行なった。

Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦは、マウス１匹当り
１０、１００μｇ／kgとなるようにマウス血清フルブミ
ン（ＭＳＡ）含有生理食塩水で調製し、皮下投与した。
その投与群は以下の通りである。

また溶媒投与群（ＭＳＡ３０μｇ／ｍ含有生理食塩
水）を対照群とした。該群は次の投与群No.１と同様と
した。

〈投与群〉 No.１：感作後投薬し、以後３日間連日投与し４日目に
チャレンジを行なった群。

No.２：感作後投薬し、以後３日間連日投与し４日目に
チャレンジを行ない、その後１回投与した群。

No.３：感作前３日間連日投与し、感作後投薬、更に３
日間連日投与し、４日目にチャレンジを行なった群。

No.４：感作前３日間連日投与して感作後投薬、更に３
日間連日投与し、４日目にチャレンジを行ない、その後
１回投与した群 結果を下記第７表に示す。

本実施例の結果、どの投与群においてもＤＴＨの誘導が
対照群により抑制された。

投与群１ではＭ−ＣＳＦを１０、１００μｇ／kg投与し
たものは、ともに同程度の抑制が見られ、投与群２及び
投与群３においてはむしろ１０μｇ／kgにおいて１００
μｇ／kgより強い抑制が認められた。投与群４において
は１０、１００μｇ／kg、ともに５０％程度の抑制が認
められた。

以下の結果より、Ｍ−ＣＳＦでのＤＴＨの誘導は、前投
与後感作し、更に連投与を行ない、チャレンジし、その
後も一度投与した系において強い抑制があることが示唆
された。

実施例６ マウスのＰＣ−ＤＴＨに対するＥ．cole〔３−１５３〕
Ｍ−ＣＳＦの作用について、実施例５の方法を用い、そ
の投与タイミングを検討した。

Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦは、ＭＳＡ含有生理
食塩水（３０μｇＭＳＡ／ｍ）にて希釈後、１、１
０、１００μｇ／kgとなるように、また溶媒投与群（Ｍ
ＳＡ含有生理食塩水）を対照群として、以下に示す投与
タイミングにて皮下投与した（ＳＣ）。

〈投与群〉 Ｉ感作後投薬し、４日目にチャレンジを行なった群 II感作後投薬し、以後２日間連続投与後、４日目にチャ
レンジを行なった群 III感作後投薬し、以後３日間連続投与し、４日目にチ
ャレンジ及び投与を行なった群 IV投与群IIIと同様であるが、投与を１日２回とした群 Ｖチャレンジ前無投与、チャレンジ時にのみチャレンジ
４時間前、チャレンジ時、チャレンジ４時間後の計３回
投与を行なった群 結果を第８表に示す。

その結果、１次感作から２次感作までの４日間のうち、
３回もしくは５回、あるいは１日２回、５回投与したII
〜IV群において、１０μｇ／kg以上の投与量において、
有意な抑制効果が認められた。また、ＤＴＨ成立後投与
したＶ群においても有意の抑制効果が認められた。

実施例７ ３種類のＭ−ＣＳＦ、Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳ
Ｆ、Ｅ．coli〔３−２１４〕Ｍ−ＣＳＦ、ＣＨＯ〔−３
２−５２２〕について、マウスのＰＣ−ＤＴＨ抑制作用
を検討した。

各Ｍ−ＣＳＦをＭＳＡ含有生理食塩水（３０μｇ／ｍ
）にて希釈調製後、１、１０、１００μｇ／kgで、皮
下（ＳＣ）及び静脈内（ＩＶ）投与した。

投与タイミングは実施例６中の投与群IIIと同様、即
ち、感作後投薬し以後３日間連続投与後、４日間にチャ
レンジ及び投与することにより行なった。その他の方法
は実施例５、６と同様である。

結果を第９表及び第１０表に示す。

静脈内投与においては、ＣＨＯ（−３２−５２２）Ｍ−
ＣＳＦ、Ｅ．coli〔３−２１４〕Ｍ−ＣＳＦでは、濃度
依存的な抑制傾向が認められ、１００μｇ／kgで明らか
な抑制が認められた。Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳ
Ｆでは低用量側（１μｇ／kg、１０μｇ／kg）で抑制作
用が認められたものの、その程度は弱いものであった。

皮下投与においては、３種のＭ−ＣＳＦとも抑制傾向が
認められたが、Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦにの
み強い抑制が認められた。これらのことから、ＤＴＨ抑
制反応はＭ−ＣＳＦに共通の作用であり、皮下投与にお
いてはＥ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦが優れている
ことが明らかになった。この結果は皮下投与した際の生
物学的利用率の結果（第６表）と一致するものであり、
Ｅ．coli〔３−１５３〕Ｍ−ＣＳＦが特に皮下注射用Ｍ
−ＣＳＦとして優れた性質を有する誘導体であることが
強く示唆された。

本発明の他の実施例は、本明細書を考慮し、この中に開
示された発明を実施することから当業者には明らかであ
ろう。本明細書及び実施例は単なる例示として、特許請
求の範囲により示される本発明の真の範囲及び精神とと
もに考慮されるべきである。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Ｍ−ＣＳＦを有効成分として含有すること
   を特徴とする炎症性疾患およびアレルギーの治療剤。
2. 【請求項２】前記Ｍ−ＣＳＦが組換えＭ−ＣＳＦである
   請求の範囲第１項に記載の治療剤。
3. 【請求項３】前記Ｍ−ＣＳＦが天然のＭ−ＣＳＦである
   請求の範囲第１項に記載の治療剤。
4. 【請求項４】前記Ｍ−ＣＳＦが、Ｌ９２９繊維芽細胞系
   由来のものである請求の範囲第１項に記載の治療剤。
5. 【請求項５】前記Ｍ−ＣＳＦが、下記式（１）の全アミ
   ノ酸一次配列を有するか、または、下記式（１）の１位
   Gluから５位Gluの領域のいずれかにＮ末端を有し、１５
   ３位Thrから５２２位Valの領域のいずれかにＣ末端を有
   し、且つＮ末端にMetを付加されることのあるアミノ酸
   一次配列を有するＭ−ＣＳＦである請求の範囲第１項に
   記載の治療剤： 式（１） 〔式中、ＸはTyr又はAspを示す。〕。
6. 【請求項６】請求の範囲第５項に記載の式（１）の３位
   Valまたは４位Serから１５３位Thrまでのアミノ酸一次
   配列又は３位Valまたは４位Serから２１４位Proまでの
   アミノ酸一次配列を有するＭ−ＣＳＦを有効成分とする
   請求の範囲第１項に記載の治療剤。
7. 【請求項７】請求の範囲第５項に記載の式（１）の３位
   Valまたは４位Serから１５３位Thrまでのアミノ酸一次
   配列を有するＭ−ＣＳＦを有効成分とする請求の範囲第
   １項に記載の治療剤。
8. 【請求項８】請求の範囲第５項に記載の式（１）の３位
   Valまたは４位Serから２１４位Proまでのアミノ酸一次
   配列を有するＭ−ＣＳＦを有効成分とする請求の範囲第
   １項に記載の治療剤。