JPH0654686A - 微生物固定化用担体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 大きな気孔径と内部に大きな気孔容積がある
にもかかわらず、優れた強度を有する微生物固定化用担
体を得る。 【構成】 低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解し、該
溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多孔質キ
トサンを酸処理した後、Ｎ−アシル化し、有機ジイソシ
アネート化合物を反応させて微生物固定化用担体とす
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、担体内部に極めて大き
な気孔を有するにもかかわらず、担体としての充分な強
度を具備した微生物固定化用担体の製造法に関するもの
である。本方法で得られた担体は大きな気孔をもつ事か
ら、酵母，糸状菌，放線菌といった比較的大きな微生物
を固定化して、好気条件下で酵素，ペプチドといった生
理活性物質，有機酸等の各種物質を微生物変換により大
規模レベルで生産する際に好適である。

【０００２】

【従来の技術】キチン，キトサンを用いて微生物を固定
化させることは特開昭５３−１３６５８４号，特開昭５
９−７４９８４号，特開平１−１１７７８７号等に開示
されている。しかし、これらはいずれも微生物を固定化
担体に包括固定しようとするものであり、基質やガスの
物質透過に劣り、特に好気性微生物の固定化には適さな
いものであった。

【０００３】一方、本出願人が先に出願した特開平２−
２２５５３９号に開示した粒状多孔質キトサンは、表面
から内部に１５μｍ程度の気孔を有しており、細菌等の
比較的小さな微生物の固定化用担体として優れた性能を
発揮するものである。

【０００４】しかし、酵母，糸状菌，放線菌といった比
較的大きな微生物を固定化する担体では、固定化性能を
向上させるために、更に大きな気孔径を具備させる事が
望ましいが、担体内部の気孔容積を大きくすると、担体
の強度が低くなり、実用性に欠けるものであった。

【０００５】担体の強度は多官能性試薬を用いた架橋に
より改善することができ、粒状多孔質キトサンの架橋方
法として、本出願人は先に、特公昭６３−５４２８５
号，特開昭６３−２０５１４４号，特開昭６３−２８４
５３号等の方法を開示した。

【０００６】しかし、気孔容積の大きい担体を上述の架
橋方法で処理した場合、担体が脆く強度的に不十分であ
り、流動層培養で激しい攪拌を必要とする場合や、充填
層で培養する場合に、充分な強度を与えるものではない
欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、酵母，糸状
菌，放線菌の様な微生物の固定化用担体として、充分に
大きな気孔径と内部に大きな気孔容積があるにもかかわ
らず優れた強度を有し、実用性の高い微生物固定化用担
体を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、低分子量キト
サンを酸性水溶液に溶解し、該溶解液を塩基性溶液中に
落下せしめて得た粒状多孔質キトサンを、酸処理した
後、極性溶媒中でＮ−アシル化し、極性溶媒中で有機ジ
イソシアネート化合物を反応させる微生物固定化用担体
の製造法である。

【０００９】酵母，糸状菌，放線菌の様な微生物の固定
化用担体として、充分に大きな気孔径と内部に大きな気
孔容積を有する粒状多孔質キトサンは、特開平２−２２
５５３９号で開示された方法によって得ることができ
る。

【００１０】即ち、平均分子量が１０，０００〜２３
０，０００の範囲である低分子量キトサンを、酸性水溶
液に溶解する。この際、キトサン酸性水溶液中に細孔調
節剤として水溶性高分子物質であるポリエチレングリコ
ール等を添加することができる。この溶解液を水酸化ナ
トリウムもしくはアンモニア等の塩基性溶液中に落下さ
せて粒状多孔質キトサンを凝固折出させる。これを酢
酸、蟻酸等の有機酸、又は塩酸、硝酸等の鉱酸の酸水溶
液で短時間処理し、表面及びその近傍にある、内部より
直径の小さい細孔径気孔部分を除去し、粒状物内部の大
きな気孔を露出させた後、充分に水洗する。

【００１１】次に、極性溶媒で水を置換した後、酸無水
物でキトサンのアミノ基をＮ−アシル化する。反応時の
溶媒としてはジオキサン，メタノール，エタノール，イ
ソプロピルアルコール，ジメチルホルムアミド，ジメチ
ルスルホキシド，ピリジン等の酸無水物に対して不活性
の溶媒が選択使用される。

【００１２】アシル化剤としては無水酢酸，無水プロピ
オン酸，無水酪酸等の脂肪酸の酸無水物が使用される。
アシル化の反応条件はアシル化剤濃度は０．３〜２モル
／Ｌ、液量は担体容積の２倍量、反応温度は１０〜６０
℃、反応時間は１〜２４時間が好ましい。反応終了後、
未反応のアシル化剤と生成した脂肪酸を溶剤で充分に洗
浄して除去する。

【００１３】次いで、Ｎ−アシル化キトサンの水酸基に
反応したアシル化剤を、担体と等容積の１規定水酸化ナ
トリウムで４０℃、２時間、ケン化処理を行ない、水洗
し、脱離したアシル化剤を充分に除去する。

【００１４】次に大きな気孔容積を有し、Ｎ−アシル化
されたキトサンを極性溶媒中で有機ジイソシアネート化
合物と反応させる。Ｎ−アシル化した粒状多孔質キトサ
ンの水を極性溶媒で充分に除去する。極性溶媒としはジ
オキサン、メタノール、エタノール、イソプロピルアル
コール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシ
ド、ジメチルアセトアミド、ピリジン等の反応溶媒から
選択され使用される。

【００１５】有機ジイソシアネート化合物としては、
４，４´−ジフェニルメタンジイソシアネート、１，４
−フェニレンジイソシアネート、２，４−トリレンジイ
ソシアネート、ナフタレンジイソシアネート、１，４−
シクロヘキサンジイソシアネート、４，４´−ジシクロ
ヘキシルメタンジイソシアネート、キシリレンジイソシ
アネート、ヘキサメチレンジイソシアネート等が用いら
れる。

【００１６】有機ジイソシアネート化合物を導入する反
応は、有機ジイソシアネートの濃度は０．０３〜１．０
ｍｏｌ／Ｌ、液量は担体容積の２倍量、反応温度は２０
〜６０℃、反応時間は０．５〜１２時間で行うことが好
ましい。反応終了後、充分に水洗して未反応の有機ジイ
ソシアネート化合物を除去し、微生物固定化用担体を得
る。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこの範囲に限定されるものではない。

【００１８】本発明の方法で得られた微生物固定化用担
体の物性値は次の方法で測定した。 気孔径 試料５ｍｌを固体と液体の共存する窒素中で急冷し凍結
した後、−５０℃，１０−７トールの真空度で乾燥後、
走査電子顕微鏡で測定し、１００個の気孔の平均値を計
算した。気孔容積 試料を凍結乾燥後、水銀圧入式ポアサイザ９３１０型
（島津製作所（株）製）によって乾燥試料１ｇ当りの気
孔容積を測定した。非破損率 担体５０ｍｌとイオン交換水７５０ｍｌをジャーファー
メンタ Ｍ−１００（東京理化器械製）に入れ、室温
中、７００ｒｐｍで３時間攪拌する。攪拌処理後、担体
を１２メッシュの金網上に移し、破損した担体を流水で
除去した。メッシュ上に残った担体容積をメスシリンダ
ーで測定し、非破損率を次式により計算した。

【００１９】

【数１】

【００２０】《実施例１》脱アセチル化度８０％，平均
分子量３５，０００のキトサン３５０ｇを、ポリエチレ
ングリコール（分子量２０，０００、三洋化成工業
（株）製）５００ｇを含む、３．５％酢酸水溶液５，０
００ｍｌに溶解した。該溶液を１％アンモニア水２０％
エタノール，７９％水からなる混合溶液中に一定量づつ
滴下させて凝固再生させた後、中性になるまで充分に水
洗し、平均粒径１．２ｍｍの粒状多孔質キトサン５，０
００ｍｌ（湿潤）を得た。粒状多孔質キトサンの付着水
を除去後、０．５％酢酸水溶液５，０００ｍｌ中に２５
℃で３０秒間浸漬処理した後、直ちに中性になるまで水
洗を行った。水洗後の粒状多孔質キトサンの容積は３，
０００ｍｌであった。

【００２１】１，０００ｍｌの粒状多孔質キトサンに含
まれる水をエタノールで充分に置換した後、無水酢酸１
モルを含むエタノール２，０００ｍｌ中で２５℃，１２
時間攪拌し、アミノ基をＮ−アシル化した。

【００２２】次に、Ｎ−アシル化キトサンの水酸基に反
応したアシル化剤を除くために、担体と等容積の１Ｎ−
水酸化ナトリウムで４０℃、２時間、ケン化処理を行っ
た後、水洗し、脱離したアシル化剤を充分に除去した。

【００２３】次にＮ−アシル化粒状多孔質キトサンの水
をジメチルホルムアミドで充分に除去、置換した。０．
１モルの４，４´−ジフェニルメタンジイソシアネート
をジメチルホルムアミドで希釈し２，０００ｍｌを準備
し、Ｎ−アシル化粒状多孔質キトサンに加え、２５℃で
１時間、攪拌し反応させた。その後、未反応の４，４´
−ジフェニルメタンジイソシアネートをジメチルホルミ
アミドで洗浄し、充分に除去した。ジメチルホルムアミ
ドを水洗、除去し８５０ｍｌの微生物固定化用担体を得
た。本担体の気孔径、気孔容積、非破損率の測定結果を
表１に示した。

【００２４】

【表１】

【００２５】表１から明らかな如く、従来の気孔径、約
１５μｍより大気孔径となり、しかも非破損率も高い、
強度にも優れた担体である。

【００２６】《実施例２》実施例１と同様の方法で得ら
れたＮ−アシル粒状多孔質キトサン１，０００ｍｌの水
をジメチルホルムアミドで置換、除去した。０．１モル
のヘキサメチレンジイソシアネートをジメチルホルムア
ミドで希釈し２，０００ｍｌを準備し、Ｎ−アシル化粒
状多孔質キトサンに加え、２５℃で１時間、攪拌し反応
させた。

【００２７】その後、未反応のヘキサメチレンジイソシ
アネートをジメチルホムアミドで洗浄し、充分に除去し
た。ジメチルホルムアミドを水洗、除去し８５０ｍｌの
微生物固定化用担体を得た。本担体の気孔径、気孔容
積、非破損率の測定結果を表２に示した。

【００２８】

【表２】

【００２９】表２から明らかな如く、有機ジイソシアネ
ート化合物の種類を変更しても優れた担体が得られた。
従来の気孔径約１５μｍに対し、大孔径になり、しかも
非破損率が高い。即ち担体強度も優れていた。

【００３０】《比較例１》実施例１と同様の方法で得ら
れた粒状多孔質キトサン１，０００ｍｌの水をジメチル
ホルムアミドで除去置換した。成形物中に含まれる水を
充分に除去した。０．１モルの４，４´−ジフェニルメ
タンジイソシアネートをジメチルホルムアミドで希釈し
２，０００ｍｌを準備し、粒状多孔質キトサンに加え、
２５℃で１時間、攪拌し反応させた。その後、未反応の
４，４´−ジフェニルメタンジイソシアネートをジメチ
ルホルムアミドで洗浄し、充分に除去した。ジメチルホ
ルムアミドを水洗、除去し８５０ｍｌの微生物固定化用
担体を得た。本担体の気孔径、気孔容積、非破損率の測
定結果を表３に示した。

【００３１】

【表３】

【００３２】表３から明らかな如く、Ｎ−アシル化しな
い場合は、実施例１と比較して非破損率が悪い担体で、
強度が低かった。

【００３３】《比較例２》実施例１と同様にして得られ
た粒状多孔質キトサン１，０００ｍｌの水をジメチルホ
ルムアミドで充分に除去置換した。０．１モルのヘキサ
メチレンジイソシアネートをジメチルホルムアミドで希
釈し２，０００ｍｌを準備し、粒状多孔質キトサンに加
え、２５℃で１時間、攪拌し反応させた。その後、未反
応のヘキサメチレンジイソシアネートをジメチルホルム
アミドで洗浄し、充分に除去した。ジメチルホルムアミ
ドを水洗、除去し８５０ｍｌの微生物固定化用担体を得
た。それぞれの担体の気孔径、気孔容積、非破損率の測
定結果を表４に示した。

【００３４】

【表４】

【００３５】表４から明らかな如く、Ｎ−アシル化しな
い場合は実施例２と比較して非破損率が悪い担体で、強
度が低かった。

【００３６】

【発明の効果】低分子量キトサンを酸性水溶液で溶解
し、該溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多
孔質キトサンを酸処理した後、極性溶媒中でＮ−アシル
化し、極性溶媒中で有機ジイソシアネート化合物と反応
させて得られた本微生物固定化用担体は、担体内部に極
めて大きな気孔を有するにもかかわらず、担体としての
強度にも優れ、ジャーファーメンタ中での激しい攪拌に
も耐え得るものである。本方法で得られた微生物固定化
用担体は比較的大きな酵母，糸状菌，放線菌等の微生物
の固定化に適した大きさの気孔を有しており、酵素，ペ
プチドといった生理活性物質，有機酸等の各種物質を微
生物変換により大規模レベルで生産する担体として好適
である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年９月１１日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】本発明の方法で得られた微生物固定化用担
体の物性値は次の方法で測定した。 気孔径 試料５ｍｌを固体と液体の共存する窒素中で急冷し凍結
した後、−５０℃，１０^-7トールの真空度で乾燥後、走
査電子顕微鏡で測定し、１００個の気孔の平均値を計算
した。気孔容積 試料を凍結乾燥後、水銀圧入式ポアサイザ９３１０型
（島津製作所（株）製）によって乾燥試料１ｇ当りの気
孔容積を測定した。非破損率 担体５０ｍｌとイオン交換水７５０ｍｌをジャーファー
メンタ Ｍ−１００（東京理化器械製）に入れ、室温
中、７００ｒｐｍで３時間攪拌する。攪拌処理後、担体
を１２メッシュの金網上に移し、破損した担体を流水で
除去した。メッシュ上に残った担体容積をメスシリンダ
ーで測定し、非破損率を次式により計算した。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】《実施例２》実施例１と同様の方法で得ら
れたＮ−アシル化粒状多孔質キトサン１，０００ｍｌの
水をジメチルホルムアミドで置換、除去した。０．１モ
ルのヘキサメチレンジイソシアネートをジメチルホルム
アミドで希釈し２，０００ｍｌを準備し、Ｎ−アシル化
粒状多孔質キトサンに加え、２５℃で１時間、攪拌し反
応させた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 低分子量キトサンを酸性水溶液に溶解
   し、該溶解液を塩基性溶液中に落下せしめて得た粒状多
   孔質キトサンを酸処理した後、Ｎ−アシル化し、極性溶
   媒中で有機ジイソシアネート化合物を反応させることを
   特徴とする、微生物固定化用担体の製造法。