JPH0655145B2 - ヒトウロキナーゼ - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトウロキナーゼ、その新規な形態の生成物
および組成物、ならびに特にヒトウロキナーゼの機能的
な蛋白質種（functional protein species）のin vitro
（インビトロ）における製造手段および方法に係る。
および組成物、ならびに特にヒトウロキナーゼの機能的
な蛋白質種（functional protein species）のin vitro
（インビトロ）における製造手段および方法に係る。
本発明は、部分的には、天然ウロキナーゼのＤＮＡ配列
および推定アミノ酸配列ならびに機能的生物活性部（fu
nctional bioactive moieties）であることが判明した
ウロキナーゼ分子の関連部分を知見したことに基づいて
いる。この知見により、組換ＤＮＡ技術を適用して種々
の形態でウロキナーゼを生産することが可能になり、さ
らに分子の生物学的に機能するしたがつて有用な部分を
同定するための必須の生物学的試験を行なうのに充分な
質および量の物質を生産することが可能になつた。従つ
て、遺伝子操作およびin vitro処理により、機能性種の
（functional species）ウロキナーゼを製造し、従来得
られなかつた産業上有効量の活性物質を効果的に得るこ
とができたのである。本発明は、全ての面でこれらの関
連する具体例に向けられる。
および推定アミノ酸配列ならびに機能的生物活性部（fu
nctional bioactive moieties）であることが判明した
ウロキナーゼ分子の関連部分を知見したことに基づいて
いる。この知見により、組換ＤＮＡ技術を適用して種々
の形態でウロキナーゼを生産することが可能になり、さ
らに分子の生物学的に機能するしたがつて有用な部分を
同定するための必須の生物学的試験を行なうのに充分な
質および量の物質を生産することが可能になつた。従つ
て、遺伝子操作およびin vitro処理により、機能性種の
（functional species）ウロキナーゼを製造し、従来得
られなかつた産業上有効量の活性物質を効果的に得るこ
とができたのである。本発明は、全ての面でこれらの関
連する具体例に向けられる。
本発明の背景を説明し、かつ特にその実施に関し附加的
に詳細を示すために使用する分献およびその他の資料を
本明細書中に番号を附して引用し、さらに便宜のため明
細書末尾に列挙する。
に詳細を示すために使用する分献およびその他の資料を
本明細書中に番号を附して引用し、さらに便宜のため明
細書末尾に列挙する。
Ａ．ヒトウロキナーゼ 繊維素溶解系は凝集系との動的平衡状態にあり、完全か
つ独特な血管床を維持する。凝集系は繊維素をマトリツ
クスとして沈着させ、止血状態を回復するのに役立つ。
繊維素溶解系は、止血状態が達成された後、繊維素ネツ
トワークを除去する。この繊維素溶解過程は、血漿蛋白
質である先駆体プラスミノーゲンから生ずる蛋白質分解
酵素、プラスミンによつてもたらされる。プラスミノー
ゲンは活性化剤による活性化を介してプラスミンに変換
される。
つ独特な血管床を維持する。凝集系は繊維素をマトリツ
クスとして沈着させ、止血状態を回復するのに役立つ。
繊維素溶解系は、止血状態が達成された後、繊維素ネツ
トワークを除去する。この繊維素溶解過程は、血漿蛋白
質である先駆体プラスミノーゲンから生ずる蛋白質分解
酵素、プラスミンによつてもたらされる。プラスミノー
ゲンは活性化剤による活性化を介してプラスミンに変換
される。
ウロキナーゼは、この種の活性化剤の１種である。この
活性化剤およびその他の活性化剤、たとえばストレプト
キナーゼは現在市販されている。この両者は、たとえば
心筋梗塞、卒中、肺動脈塞栓症、深静脈血栓症、末梢血
管閉塞症およびその他の静脈血栓症のような急性血管病
の治療に必要とされている。総合して、これらの病気は
重大な健康上の危険をもたらす。
活性化剤およびその他の活性化剤、たとえばストレプト
キナーゼは現在市販されている。この両者は、たとえば
心筋梗塞、卒中、肺動脈塞栓症、深静脈血栓症、末梢血
管閉塞症およびその他の静脈血栓症のような急性血管病
の治療に必要とされている。総合して、これらの病気は
重大な健康上の危険をもたらす。
これら病気に対する基本的原因は、血餅（血栓または血
栓塞栓）による血管の部分的または重度の場合には全体
的閉塞にある。たとえばヘパリンおよびクマリンを用い
るような従来の凝固防止治療は、血栓もしくは塞栓物質
の溶解を何ら直接には改善しない。ストレプトキナーゼ
およびウロキナーゼは、血栓崩壊剤として実用的かつ有
効に使用されている。しかしながら今日まで、これらに
は厳しい制限があつた。さらに、繊維素に対する高度の
親和性も示されていない。したがつて、両者は、循環し
ている繊維素に結合したプラスミノーゲンを比較的無差
別に活性化させる。循環血液中で形成されたプラスミン
は、比較的急速に中和されて有効な血栓崩壊能を失な
う。残留するプラスミンは、数種の凝血因子蛋白質、た
とえばフイプリノーゲン、因子Ｖおよび因子VIIIを減成
して出血能力をもたらす。さらに、ストレプトキナーゼ
は強度に抗原性であり、高度の抗体力価を有する患者は
治療に対し効果を示さず、継続処置を続けることができ
ない。ウロキナーゼ治療法は人間の尿または組織培養物
から単離することを含むため高価であり、したがつて臨
床的には一般に許容されない。ウロキナーゼは多くの研
究の主題であつた。たとえば文献１〜９参照。上記した
ように、現在入手しうるウロキナーゼは人間の尿または
組織培養物、たとえば腎臓細胞（９Ａ，９Ｂ）から単離
される。
栓塞栓）による血管の部分的または重度の場合には全体
的閉塞にある。たとえばヘパリンおよびクマリンを用い
るような従来の凝固防止治療は、血栓もしくは塞栓物質
の溶解を何ら直接には改善しない。ストレプトキナーゼ
およびウロキナーゼは、血栓崩壊剤として実用的かつ有
効に使用されている。しかしながら今日まで、これらに
は厳しい制限があつた。さらに、繊維素に対する高度の
親和性も示されていない。したがつて、両者は、循環し
ている繊維素に結合したプラスミノーゲンを比較的無差
別に活性化させる。循環血液中で形成されたプラスミン
は、比較的急速に中和されて有効な血栓崩壊能を失な
う。残留するプラスミンは、数種の凝血因子蛋白質、た
とえばフイプリノーゲン、因子Ｖおよび因子VIIIを減成
して出血能力をもたらす。さらに、ストレプトキナーゼ
は強度に抗原性であり、高度の抗体力価を有する患者は
治療に対し効果を示さず、継続処置を続けることができ
ない。ウロキナーゼ治療法は人間の尿または組織培養物
から単離することを含むため高価であり、したがつて臨
床的には一般に許容されない。ウロキナーゼは多くの研
究の主題であつた。たとえば文献１〜９参照。上記した
ように、現在入手しうるウロキナーゼは人間の尿または
組織培養物、たとえば腎臓細胞（９Ａ，９Ｂ）から単離
される。
ウロキナーゼ分子は幾つかの生物学上活性な形態で存在
し、高分子量（約５４０００ダルトン）および低分子量
（約３３０００ダルトン）のものがあり、それぞれ単一
鎖もしくは二本鎖物質（two chain material）で構成さ
れている。低分子量型は、酵素開裂によつて高分子量型
から誘導される。生物学上活性な物質はいわゆるセリン
プロテアーゼ部分（serine protease portion）を含有
し、この部分は活性型においてジスルフイド結合を介し
第二鎖（second chain）に結合されている。高分子量物
質に起因する活性は、いずれもこれら２つの結合した鎖
が同じ様に存在していることによるものと思われ、配列
中の有効なジスルフイド結合および中断（interruptio
n）は疑いもなく全分子のセリンプロテアーゼ部分に存
在する（第１図参照）。いずれにせよ、本発明までは、
約２１０００ダルトン残基の本質従つてその機能は未知
であり、ウロキナーゼの公知部分のいずれかにその活性
を結びつけることは必らずしも可能でなかつた。
し、高分子量（約５４０００ダルトン）および低分子量
（約３３０００ダルトン）のものがあり、それぞれ単一
鎖もしくは二本鎖物質（two chain material）で構成さ
れている。低分子量型は、酵素開裂によつて高分子量型
から誘導される。生物学上活性な物質はいわゆるセリン
プロテアーゼ部分（serine protease portion）を含有
し、この部分は活性型においてジスルフイド結合を介し
第二鎖（second chain）に結合されている。高分子量物
質に起因する活性は、いずれもこれら２つの結合した鎖
が同じ様に存在していることによるものと思われ、配列
中の有効なジスルフイド結合および中断（interruptio
n）は疑いもなく全分子のセリンプロテアーゼ部分に存
在する（第１図参照）。いずれにせよ、本発明までは、
約２１０００ダルトン残基の本質従つてその機能は未知
であり、ウロキナーゼの公知部分のいずれかにその活性
を結びつけることは必らずしも可能でなかつた。
最近、低活性ではあるが特異的活性を有する他の型のウ
ロキナーゼペプチドが報告された（１０，１０Ａ）。こ
の物質は天然ウロキナーゼに対応し、恐らく単一鎖より
なる従来単離された上記の活性物質の先駆型（prefor
m）であると推定された。
ロキナーゼペプチドが報告された（１０，１０Ａ）。こ
の物質は天然ウロキナーゼに対応し、恐らく単一鎖より
なる従来単離された上記の活性物質の先駆型（prefor
m）であると推定された。
微生物宿主において発現を達成するという希望をもつて
ウロキナーゼに必須の遺伝子をクローン化するという従
来の試みは成功しなかつたと信じられる（１１，１１
Ａ）。(6)をも参照。
ウロキナーゼに必須の遺伝子をクローン化するという従
来の試みは成功しなかつたと信じられる（１１，１１
Ａ）。(6)をも参照。
結局、組換ＤＮＡ技術およびその関連技術を使用するこ
とが、高品質かつ高生物活性のヒトウロキナーゼを他の
ヒト蛋白質を実質的に含有せずに多量に提供し、さらに
機能的生物活性を保持するその誘導体を提供し、かくし
てこれら物質を種々の血管状態（vascular condition
s）もしくは病気（diseases）の治療に臨床的に使用し
うる最も有効な方法であると思われた。
とが、高品質かつ高生物活性のヒトウロキナーゼを他の
ヒト蛋白質を実質的に含有せずに多量に提供し、さらに
機能的生物活性を保持するその誘導体を提供し、かくし
てこれら物質を種々の血管状態（vascular condition
s）もしくは病気（diseases）の治療に臨床的に使用し
うる最も有効な方法であると思われた。
Ｂ．組換ＤＮＡ／蛋白質生化学技術 組換ＤＮＡ技術は、複雑な段階に達している。分子生物
学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に組換え、著量
の外来蛋白質生産物をトランスフオームされた微生物も
しくはセルカルチヤー（細胞培養物）中で産生しうる新
たなＤＮＡ物質を生成させることができる。一般的手段
および方法は、種々の平滑末端もしくは「付着性」末端
のＤＮＡ断片をin vitroで結合させ、特定生物をトラン
スフオームするのに有用な強力な発現ベヒクルを生成さ
せ、かくして所望の外来生産物の効率的な合成を行なう
ことである。しかしながら、個々の生産物について見る
と、その経路は若干繁雑であり、科学は成効を常に予測
しうる段階にまで進歩していない。事実、基礎的実験を
伴なわずに成功結果を予告する者もいるが、このような
者は実施不能という著しい危険を伴なう。
学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容易に組換え、著量
の外来蛋白質生産物をトランスフオームされた微生物も
しくはセルカルチヤー（細胞培養物）中で産生しうる新
たなＤＮＡ物質を生成させることができる。一般的手段
および方法は、種々の平滑末端もしくは「付着性」末端
のＤＮＡ断片をin vitroで結合させ、特定生物をトラン
スフオームするのに有用な強力な発現ベヒクルを生成さ
せ、かくして所望の外来生産物の効率的な合成を行なう
ことである。しかしながら、個々の生産物について見る
と、その経路は若干繁雑であり、科学は成効を常に予測
しうる段階にまで進歩していない。事実、基礎的実験を
伴なわずに成功結果を予告する者もいるが、このような
者は実施不能という著しい危険を伴なう。
必須要素、すなわち複製のオリジン、１種もしくはそれ
以上の表現型選択特性、発現プロモータ、異種遺伝子挿
入物および残余のベクターのＤＮＡ組換は、一般に宿主
細胞の外部で行なわれる。得られた複製しうる組換発現
ベヒクルすなわちプラスミドをトランスフオーメーシヨ
ンにより細胞中へ導入し、トランスフオーマントを増殖
させることにより多量の組換ベヒクルを得る。コードＤ
ＮＡメツセージの転写および翻訳を支配する部分に関し
遺伝子が適切に挿入されていると、得られる発現ベヒク
ルを使用して挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列
を実際に産生することができる（この過程を発現と呼
ぶ）。得られる産生物は、必要に応じ、微生物系で宿主
細胞を溶菌し、かつ適当な精製により他の蛋白質から産
生物を回収することにより得られる。
以上の表現型選択特性、発現プロモータ、異種遺伝子挿
入物および残余のベクターのＤＮＡ組換は、一般に宿主
細胞の外部で行なわれる。得られた複製しうる組換発現
ベヒクルすなわちプラスミドをトランスフオーメーシヨ
ンにより細胞中へ導入し、トランスフオーマントを増殖
させることにより多量の組換ベヒクルを得る。コードＤ
ＮＡメツセージの転写および翻訳を支配する部分に関し
遺伝子が適切に挿入されていると、得られる発現ベヒク
ルを使用して挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列
を実際に産生することができる（この過程を発現と呼
ぶ）。得られる産生物は、必要に応じ、微生物系で宿主
細胞を溶菌し、かつ適当な精製により他の蛋白質から産
生物を回収することにより得られる。
実際上、組換ＤＮＡ技術を用いれば全体が異種のポリペ
プチドを発現することができ（いわゆる直接発現）、或
いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に融合した
異種ポリペプチドを発現することもできる。後者の場
合、目的とする生物活性産生物は、しばしば、細胞外環
境で開裂されるまで融合した同種／異種ポリペプチドと
して生物不活性にされている。文献(12)および(13)参
照。
プチドを発現することができ（いわゆる直接発現）、或
いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部に融合した
異種ポリペプチドを発現することもできる。後者の場
合、目的とする生物活性産生物は、しばしば、細胞外環
境で開裂されるまで融合した同種／異種ポリペプチドと
して生物不活性にされている。文献(12)および(13)参
照。
同様に、遺伝学および細胞生理学を研究するための細胞
培養（cell culture）または組織培養の技術は充分に確
立されている。単離された正常細胞から一連の継続した
トランスフアー処理により調製された永久セルライン
（細胞系）を維持する手段および方法は公知である。研
究に使用するため、これらのセルラインは液体培地中の
固体支持体上に維持され、或いは支持栄養源を含有する
懸濁物中で増殖させることにより維持される。大量生産
のための規模拡大は、機械的問題のみを提起すると思わ
れる。その他の背景については、文献(14)および(15)を
参照することができる。
培養（cell culture）または組織培養の技術は充分に確
立されている。単離された正常細胞から一連の継続した
トランスフアー処理により調製された永久セルライン
（細胞系）を維持する手段および方法は公知である。研
究に使用するため、これらのセルラインは液体培地中の
固体支持体上に維持され、或いは支持栄養源を含有する
懸濁物中で増殖させることにより維持される。大量生産
のための規模拡大は、機械的問題のみを提起すると思わ
れる。その他の背景については、文献(14)および(15)を
参照することができる。
同様に、生物工学においては蛋白質生化学が有用かつ実
際上必要な手段である。所望の蛋白質を産生する細胞
は、さらに多数の他の蛋白質、すなわち細胞固有の代謝
産生物をも生成する。これらの夾雑蛋白質ならびにその
他の化合物は、所望蛋白質から除去されないと、所望蛋
白質による治療処置の過程で動物もしくはヒトに投与し
た場合、有毒となるであろう。蛋白質生化学の技術は、
目的とする特定のシステムに適する分離方法の設計を可
能にし、かつ目的用途に対し安全な均質生産物を提供す
ることができる。さらに、蛋白質生化学により、所望生
産物を特性化する本質が明らかにされ、細胞が何らの交
代もしくは突然変異を生ずることなく忠実に所望生産物
を生成したことを証明する。この科学分野も、臨床的研
究および市場開発を成功裡に行ないうるために必要とさ
れる生物分析（バイオアツセイ）、安定性の検討および
その他の過程の設計に含まれる。
際上必要な手段である。所望の蛋白質を産生する細胞
は、さらに多数の他の蛋白質、すなわち細胞固有の代謝
産生物をも生成する。これらの夾雑蛋白質ならびにその
他の化合物は、所望蛋白質から除去されないと、所望蛋
白質による治療処置の過程で動物もしくはヒトに投与し
た場合、有毒となるであろう。蛋白質生化学の技術は、
目的とする特定のシステムに適する分離方法の設計を可
能にし、かつ目的用途に対し安全な均質生産物を提供す
ることができる。さらに、蛋白質生化学により、所望生
産物を特性化する本質が明らかにされ、細胞が何らの交
代もしくは突然変異を生ずることなく忠実に所望生産物
を生成したことを証明する。この科学分野も、臨床的研
究および市場開発を成功裡に行ないうるために必要とさ
れる生物分析（バイオアツセイ）、安定性の検討および
その他の過程の設計に含まれる。
本発明は、組換ＤＮＡ／蛋白質生化学的技術を使用し
て、生物学的に機能する調製種の形態でヒトウロキナー
ゼを成功裡に生産しうるという知見に基づいている。本
発明は、全ゆる形態において多種の血管状態もしくは病
気に対し人間の予防処置もしくは治療に使用するのに適
した活性ウロキナーゼ蛋白質を提供する。各形態は、生
物活性部分すなわちセリンプロテアーゼ部分からなる２
本鎖領域に存在すると思われる天然物質の酵素部分（en
zymatic portion）を包含する。本発明によれば、一連
のウロキナーゼ活性生産物を生物活性型において直接
に、或いは特に生物活性生産物を生成させるようにin v
itroで処理しうる形態で製造することができる。さら
に、本発明は、特に生物活性型もしくは生物活性化しう
る型において全長（full length）の天然ウロキナーゼ
分子を生産し、天然原料から単離されたいかなるウロキ
ナーゼ生産物についても現在まで示されていないような
繊維素に対する特異的親和性という有力な附加的利点を
有するウロキナーゼ分子を生産する手段および方法を提
供する。かくして、触知しうる現存の血栓に対し特異的
活性を示すような有力な新らしい性質を有するヒトウロ
キナーゼ生産物が提供される。この生産物は各生産物の
本質をコードする組換ＤＮＡを備えたセルカルチヤーに
より生産されるが、従来可能であつたよりもずつと効率
的な方法で、かつ生物学的に向上された顕著な性質を示
す形態でヒトウロキナーゼを生産する手段が現在可能で
ある。さらに、宿主細胞に応じて、そのウロキナーゼ活
性化剤は天然物質と比較して多かれ少なかれ関連グリコ
シレーシヨン（associated glycosylation）を有するこ
とができる。
て、生物学的に機能する調製種の形態でヒトウロキナー
ゼを成功裡に生産しうるという知見に基づいている。本
発明は、全ゆる形態において多種の血管状態もしくは病
気に対し人間の予防処置もしくは治療に使用するのに適
した活性ウロキナーゼ蛋白質を提供する。各形態は、生
物活性部分すなわちセリンプロテアーゼ部分からなる２
本鎖領域に存在すると思われる天然物質の酵素部分（en
zymatic portion）を包含する。本発明によれば、一連
のウロキナーゼ活性生産物を生物活性型において直接
に、或いは特に生物活性生産物を生成させるようにin v
itroで処理しうる形態で製造することができる。さら
に、本発明は、特に生物活性型もしくは生物活性化しう
る型において全長（full length）の天然ウロキナーゼ
分子を生産し、天然原料から単離されたいかなるウロキ
ナーゼ生産物についても現在まで示されていないような
繊維素に対する特異的親和性という有力な附加的利点を
有するウロキナーゼ分子を生産する手段および方法を提
供する。かくして、触知しうる現存の血栓に対し特異的
活性を示すような有力な新らしい性質を有するヒトウロ
キナーゼ生産物が提供される。この生産物は各生産物の
本質をコードする組換ＤＮＡを備えたセルカルチヤーに
より生産されるが、従来可能であつたよりもずつと効率
的な方法で、かつ生物学的に向上された顕著な性質を示
す形態でヒトウロキナーゼを生産する手段が現在可能で
ある。さらに、宿主細胞に応じて、そのウロキナーゼ活
性化剤は天然物質と比較して多かれ少なかれ関連グリコ
シレーシヨン（associated glycosylation）を有するこ
とができる。
本発明は、このように生産されたヒトウロキナーゼ生産
物およびその製造手段および方法を包含する。さらに、
本発明はヒトウロキナーゼの酵素部分を発現可能な形態
でコードする遺伝子配列を備えた複製可能なＤＮＡ発現
ベヒクルに向けられる。さらに、本発明は上記の発現ベ
ヒクルでトランスフオームされた微生物菌株もしくはセ
ルカルチヤーに向けられ、さらにヒトウロキナーゼ生産
物の生成を指示しうるこの種のトランスフオームされた
菌株もしくはカルチヤー（培養物）の微生物カルチヤー
もしくはセルカルチヤーに向けられる。さらに他の面に
おいて、本発明は前記ウロキナーゼ遺伝子配列、ＤＮＡ
発現ベヒクル、微生物菌株およびセルカルチヤーを製造
するのに有用な種々の方法ならびにその特定具体例に向
けられる。さらに、本発明は前記微生物およびセルカル
チヤーの発酵カルチヤーの製造に向けられる。
物およびその製造手段および方法を包含する。さらに、
本発明はヒトウロキナーゼの酵素部分を発現可能な形態
でコードする遺伝子配列を備えた複製可能なＤＮＡ発現
ベヒクルに向けられる。さらに、本発明は上記の発現ベ
ヒクルでトランスフオームされた微生物菌株もしくはセ
ルカルチヤーに向けられ、さらにヒトウロキナーゼ生産
物の生成を指示しうるこの種のトランスフオームされた
菌株もしくはカルチヤー（培養物）の微生物カルチヤー
もしくはセルカルチヤーに向けられる。さらに他の面に
おいて、本発明は前記ウロキナーゼ遺伝子配列、ＤＮＡ
発現ベヒクル、微生物菌株およびセルカルチヤーを製造
するのに有用な種々の方法ならびにその特定具体例に向
けられる。さらに、本発明は前記微生物およびセルカル
チヤーの発酵カルチヤーの製造に向けられる。
ここで「ヒトウロキナーゼ」という用語は、微生物カル
チヤーもしくはセルカルチヤーにより生産される或いは
適宜in vitroでの処理により生産される生物活性型のポ
リペプチドを意味し、天然物質に対応する酵素部分を含
む。したがつて、本発明によるヒトウロキナーゼは、
(1)従来天然材料から単離された物質と対照して全長
で、または(2)プラスミノーゲン活性化に必須と思われ
る酵素部分の部位を有するその他の生物活性型におい
て、または(3)酵素部分のＮ末端に、第１アミノ酸であ
るメチオニン、または融合したシグナルポリペプチドも
しくはこのシグナルポリペプチドとは異なる共役ポリペ
プチドを有する形態で提供され、ここでメチオニン、シ
グナルポリペプチドまたは共役ポリペプチドは細胞内も
しくは細胞外の環境で特異的に開裂することができる
（文献１２参照）。いずれにせよ、このように生産され
るヒトウロキナーゼポリペプチドを回収し、かつ種々の
心臓血管状態もしくは病気の治療に使用するのに適する
レベルまで精製する。
チヤーもしくはセルカルチヤーにより生産される或いは
適宜in vitroでの処理により生産される生物活性型のポ
リペプチドを意味し、天然物質に対応する酵素部分を含
む。したがつて、本発明によるヒトウロキナーゼは、
(1)従来天然材料から単離された物質と対照して全長
で、または(2)プラスミノーゲン活性化に必須と思われ
る酵素部分の部位を有するその他の生物活性型におい
て、または(3)酵素部分のＮ末端に、第１アミノ酸であ
るメチオニン、または融合したシグナルポリペプチドも
しくはこのシグナルポリペプチドとは異なる共役ポリペ
プチドを有する形態で提供され、ここでメチオニン、シ
グナルポリペプチドまたは共役ポリペプチドは細胞内も
しくは細胞外の環境で特異的に開裂することができる
（文献１２参照）。いずれにせよ、このように生産され
るヒトウロキナーゼポリペプチドを回収し、かつ種々の
心臓血管状態もしくは病気の治療に使用するのに適する
レベルまで精製する。
Ａ．微生物／セルカルチヤー １．細菌菌株／プロモータ 本明細書中に記載した研究は、特に１９８２年４月９日
付でアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に寄託した微生
物E.coliＫ−１２菌株ＧＭ４８（thr-,leu-,B1 -,lacY1,
galK12,galT22,ara14,tonA31,tsx78,Sup E44,dam3、dcm
6)(ATCC No.39099)および１９７８年１０月２８日付でA
merican Type Culture Collectionに寄託しかつ文献(1
6)中に記載したE.coliＫ−１２菌株２９４（endA、thi-,
hsr-,khsm＋）（ATCC No.31446）を用いて行なつた。し
かしながら、たとえばE.coliＢ、E.coli×1776(ATCCNo.
31537,1979年７月３日付で寄託）およびE.coliＷ3110
（F-，λ-，プロトロフイツク，protrophic)(ATCC No.2
7325，１９７２年２月１０日付で寄託）のような公知の
E.coli菌株、或いはたとえばAmerican Type Culture Co
llection(ATCC)のような承認された微生物寄託機関に寄
託されかつそこから入手しうる（ATCCカタログ参照）そ
の他の微生物菌株を含め、種々のその他の微生物菌株も
使用できる。文献(17)参照。これらのその他微生物は、
たとえば枯草菌（Bacillus subtillis）のようなBacill
i属細菌類を包含し，さらにその他の腸内細菌科（enter
obacteriaceae）の菌株を包含し、そのうちたとえばサ
ルモネラ・チフイムリウム（Salmonella typhimuriu
m）、セラチア・マルセサンス（Serratia marcesans）
およびシユードモナス（Pseudomonas）を挙げることが
できる。さらに、異種遺伝子配列を複製し、かつ発現し
うるプラスミドを使用することができる。
付でアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に寄託した微生
物E.coliＫ−１２菌株ＧＭ４８（thr-,leu-,B1 -,lacY1,
galK12,galT22,ara14,tonA31,tsx78,Sup E44,dam3、dcm
6)(ATCC No.39099)および１９７８年１０月２８日付でA
merican Type Culture Collectionに寄託しかつ文献(1
6)中に記載したE.coliＫ−１２菌株２９４（endA、thi-,
hsr-,khsm＋）（ATCC No.31446）を用いて行なつた。し
かしながら、たとえばE.coliＢ、E.coli×1776(ATCCNo.
31537,1979年７月３日付で寄託）およびE.coliＷ3110
（F-，λ-，プロトロフイツク，protrophic)(ATCC No.2
7325，１９７２年２月１０日付で寄託）のような公知の
E.coli菌株、或いはたとえばAmerican Type Culture Co
llection(ATCC)のような承認された微生物寄託機関に寄
託されかつそこから入手しうる（ATCCカタログ参照）そ
の他の微生物菌株を含め、種々のその他の微生物菌株も
使用できる。文献(17)参照。これらのその他微生物は、
たとえば枯草菌（Bacillus subtillis）のようなBacill
i属細菌類を包含し，さらにその他の腸内細菌科（enter
obacteriaceae）の菌株を包含し、そのうちたとえばサ
ルモネラ・チフイムリウム（Salmonella typhimuriu
m）、セラチア・マルセサンス（Serratia marcesans）
およびシユードモナス（Pseudomonas）を挙げることが
できる。さらに、異種遺伝子配列を複製し、かつ発現し
うるプラスミドを使用することができる。
たとえば、異種ポリペプチドの微生物学的生産を開始さ
せかつ保持するには、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロ
モータ系が有利に使用されている。これらプロモータ系
の構成および作成に関する詳細は、文献(18)および(19)
を参照することができる。極く最近、トリプトフアン経
路に基づく系、いわゆるtrpプロモータ系が開発され
た。この系の構成および作成に関する詳細は文献(20)お
よび(21)を参照することができる。その他の多くの微生
物プロモータが見出されかつ使用されており、当業者が
プラスミドベクター中に機能的に結合させうるそれらの
ヌクレオチド配列に関する詳細は文献(22)に公開されて
いる。
せかつ保持するには、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロ
モータ系が有利に使用されている。これらプロモータ系
の構成および作成に関する詳細は、文献(18)および(19)
を参照することができる。極く最近、トリプトフアン経
路に基づく系、いわゆるtrpプロモータ系が開発され
た。この系の構成および作成に関する詳細は文献(20)お
よび(21)を参照することができる。その他の多くの微生
物プロモータが見出されかつ使用されており、当業者が
プラスミドベクター中に機能的に結合させうるそれらの
ヌクレオチド配列に関する詳細は文献(22)に公開されて
いる。
2.酵母菌株／酵母プロモータ 本発明発現系には、さらにE.coliおよび／または酵母、
サツカロミセス・セレビシー（Saccharomyces cerevisi
ae）のいずれかまたは両者において選択および複製しう
るプラスミドを使用することもできる。酵母中で選択す
る場合、プラスミドはTRP1遺伝子を含有することができ
（２３，２４，２５）、これは酵母の染色体IVに見られ
るこの遺伝子における突然変異を含む酵母を補完する
（トリプトフアンの不存在において増殖を可能にする）
(26)。有用な菌株は１９８０年１２月８日付で制約なし
にAmerican Type Culture Collectionに寄託された菌株
RH218(ATCC No.44076)である(27)。しかしながら、細胞
をtrp１にする突然変異を含む任意のSaccharomyces cer
evisiaeの菌株が、発現系を含むプラスミドの発現に関
し有効であり、たとえば菌株pep4-1(28)があることも理
解されるであろう。このトリプトフアン栄養要求性菌株
も、ＴＲＰ１遺伝子に点突然変異を有する。
サツカロミセス・セレビシー（Saccharomyces cerevisi
ae）のいずれかまたは両者において選択および複製しう
るプラスミドを使用することもできる。酵母中で選択す
る場合、プラスミドはTRP1遺伝子を含有することができ
（２３，２４，２５）、これは酵母の染色体IVに見られ
るこの遺伝子における突然変異を含む酵母を補完する
（トリプトフアンの不存在において増殖を可能にする）
(26)。有用な菌株は１９８０年１２月８日付で制約なし
にAmerican Type Culture Collectionに寄託された菌株
RH218(ATCC No.44076)である(27)。しかしながら、細胞
をtrp１にする突然変異を含む任意のSaccharomyces cer
evisiaeの菌株が、発現系を含むプラスミドの発現に関
し有効であり、たとえば菌株pep4-1(28)があることも理
解されるであろう。このトリプトフアン栄養要求性菌株
も、ＴＲＰ１遺伝子に点突然変異を有する。
非酵母遺伝子の５′側に位置する場合、酵母遺伝子（ア
ルコールデヒドロゲナーゼ１）からの５′−フランキン
グＤＮＡ配列（プロモータ）は、酵母をトランスフオー
ムするために使用されるプラスミド中に入れた場合酵母
における外来遺伝子の発現をプロモートすることができ
る。プロモータの他に、酵母における非酵母遺伝子の適
切な発現は、酵母における適切な転写終了とポリアデニ
ル化とを可能にするように、プラスミドにおける非酵母
遺伝子の３′末端に位置した第２酵母配列を必要とす
る。好適具体例において、酵母３−ホスホグリセレート
キナーゼ遺伝子(29)の５′−フランキング配列は構造遺
伝子の上流に位置し、この構造遺伝子には、次いで終了
信号−ポリアデニル化信号を含むＤＮＡたとえばTRP1(2
3-25)遺伝子もしくはＰＧＫ(29)遺伝子が続く。
ルコールデヒドロゲナーゼ１）からの５′−フランキン
グＤＮＡ配列（プロモータ）は、酵母をトランスフオー
ムするために使用されるプラスミド中に入れた場合酵母
における外来遺伝子の発現をプロモートすることができ
る。プロモータの他に、酵母における非酵母遺伝子の適
切な発現は、酵母における適切な転写終了とポリアデニ
ル化とを可能にするように、プラスミドにおける非酵母
遺伝子の３′末端に位置した第２酵母配列を必要とす
る。好適具体例において、酵母３−ホスホグリセレート
キナーゼ遺伝子(29)の５′−フランキング配列は構造遺
伝子の上流に位置し、この構造遺伝子には、次いで終了
信号−ポリアデニル化信号を含むＤＮＡたとえばTRP1(2
3-25)遺伝子もしくはＰＧＫ(29)遺伝子が続く。
酵母の５′−フランキング配列は（酵母の３′−停止Ｄ
ＮＡと組合せて、下記参照）、酵母における外来遺伝子
の発現をプロモートするよう機能しうるので、任意の酵
母遺伝子の５′−フランキング配列は、重要な遺伝子生
産物、たとえばグリコール分解遺伝子（glycolytic gen
es）、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフエートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ
ースホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼおよびグルコキナーゼの発現に使用しうると思
われる。これら遺伝子の３′−フランキング配列のいず
れを使用しても、この種の発現系における適切な終了と
mRNAポリアデニル化とを行なうことができる。
ＮＡと組合せて、下記参照）、酵母における外来遺伝子
の発現をプロモートするよう機能しうるので、任意の酵
母遺伝子の５′−フランキング配列は、重要な遺伝子生
産物、たとえばグリコール分解遺伝子（glycolytic gen
es）、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−
ホスフエートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピル
ビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、
グルコース−６−ホスフエートイソメラーゼ、３−ホス
ホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオ
ースホスフエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソ
メラーゼおよびグルコキナーゼの発現に使用しうると思
われる。これら遺伝子の３′−フランキング配列のいず
れを使用しても、この種の発現系における適切な終了と
mRNAポリアデニル化とを行なうことができる。
最後に、多くの酵母プロモータはさらに転写制御部を含
むので、増殖条件における変化によつてオン・オフする
ことができる。この種の酵母プロモータの幾つかの例は
次の蛋白質を生産する遺伝子である：アルコールデヒド
ロゲナーゼII、酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する
分解酵素（degradative enzymes）、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼならびにマルト
ースおよびガラクトースの利用に必要な酵素(30)。この
種の制御領域は、蛋白質生産物の発現を制御する際、特
にその生産が酵母に対し有毒である場合、極めて有用で
ある。さらに、１個の５′−フランキング配列の制御領
域を、高度に発現された遺伝子からのプロモータを含む
５′−フランキング配列と組合せることも可能であろ
う。これはハイブリツドプロモータをもたらしかつ可能
であろう。何故なら、制御領域およびプロモータは物理
的に異なるＤＮＡ配列であると思われるからである。
むので、増殖条件における変化によつてオン・オフする
ことができる。この種の酵母プロモータの幾つかの例は
次の蛋白質を生産する遺伝子である：アルコールデヒド
ロゲナーゼII、酸ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する
分解酵素（degradative enzymes）、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼならびにマルト
ースおよびガラクトースの利用に必要な酵素(30)。この
種の制御領域は、蛋白質生産物の発現を制御する際、特
にその生産が酵母に対し有毒である場合、極めて有用で
ある。さらに、１個の５′−フランキング配列の制御領
域を、高度に発現された遺伝子からのプロモータを含む
５′−フランキング配列と組合せることも可能であろ
う。これはハイブリツドプロモータをもたらしかつ可能
であろう。何故なら、制御領域およびプロモータは物理
的に異なるＤＮＡ配列であると思われるからである。
3.セルカルチヤー／セルカルチヤーベクター 培養（組織培養）において脊椎動物細胞を増殖させるこ
とが、近年慣用の方法となつた（３１参照）。異種蛋白
質を生産するための有用な宿主は、猿の腎臓繊維芽細胞
のＣＯＳ−７ラインである(32)。しかしながら、本発明
は適合性ベクターを複製かつ発現しうる任意のセルライ
ン、たとえばWI38、BHK、3T3、CHO、VEROおよびHeLaセルラ
インにおいて実施することもできる。さらに、発現ベク
ターに必要とされるものは、発現すべき遺伝子の前方に
位置する複製のオリジンおよびプロモータであつて、こ
れらとともに、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮ
Ａスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了
配列を含む。本発明は、好適具体例に関して記載する
が、これら配列のみに限定されないと理解すべきであ
る。たとえば、他のウイルス性（たとえばポリオーマ、
アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど）ベクターの複製のオリジ
ン、ならびに一体化されてない状態で機能しうるＤＮＡ
複製の細胞性オリジンも使用することができる。
とが、近年慣用の方法となつた（３１参照）。異種蛋白
質を生産するための有用な宿主は、猿の腎臓繊維芽細胞
のＣＯＳ−７ラインである(32)。しかしながら、本発明
は適合性ベクターを複製かつ発現しうる任意のセルライ
ン、たとえばWI38、BHK、3T3、CHO、VEROおよびHeLaセルラ
インにおいて実施することもできる。さらに、発現ベク
ターに必要とされるものは、発現すべき遺伝子の前方に
位置する複製のオリジンおよびプロモータであつて、こ
れらとともに、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮ
Ａスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了
配列を含む。本発明は、好適具体例に関して記載する
が、これら配列のみに限定されないと理解すべきであ
る。たとえば、他のウイルス性（たとえばポリオーマ、
アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど）ベクターの複製のオリジ
ン、ならびに一体化されてない状態で機能しうるＤＮＡ
複製の細胞性オリジンも使用することができる。
この種の脊椎動物細胞宿主において、ウロキナーゼ生産
物ポリペプチドに対する遺伝的発現ベクターは、さらに
同じプロモータの制御下で第２の遺伝子コード化配列を
含むこともできる。第２の配列は、一般のトランスフオ
ーマントおよび第１の配列に対する高度の発現レベルを
示すトランスフオーマントの両者に対し有利なスクリー
ニングマーカーを附与し、かつ所望のウロキナーゼポリ
ペプチドの発現を調節し、特にしばしば向上させうる制
御手段としても作用する。
物ポリペプチドに対する遺伝的発現ベクターは、さらに
同じプロモータの制御下で第２の遺伝子コード化配列を
含むこともできる。第２の配列は、一般のトランスフオ
ーマントおよび第１の配列に対する高度の発現レベルを
示すトランスフオーマントの両者に対し有利なスクリー
ニングマーカーを附与し、かつ所望のウロキナーゼポリ
ペプチドの発現を調節し、特にしばしば向上させうる制
御手段としても作用する。
これは二種の蛋白質が成熟型で別々に生産されるので特
に重要である。両方のＤＮＡコード化配列は、融合メツ
セージ（ｍＲＮＡ）が形成されるように同じ転写プロモ
ータによつて制御され、これらは第一のものの翻訳停止
信号と第二のものの開始信号によつて分離されているた
め、二種の独立した蛋白質が生ずる。
に重要である。両方のＤＮＡコード化配列は、融合メツ
セージ（ｍＲＮＡ）が形成されるように同じ転写プロモ
ータによつて制御され、これらは第一のものの翻訳停止
信号と第二のものの開始信号によつて分離されているた
め、二種の独立した蛋白質が生ずる。
或る種の増殖条件下で細胞により生産される特定酵素の
量を制御するには、しばしば環境条件が有効であると認
められる。好適具体例においては、ジヒドロフオレート
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の阻害剤であるメソトレキセ
ート（ＭＴＸ）に対する或る種の細胞の感受性を利用す
る。ＤＨＦＲは、１個の炭素単位のトランスフアーを含
む合成反応に間接的に必要とされる酵素である。ＤＨＦ
Ｒ活性が欠如すると、これら化合物が存在しない限り、
細胞の増殖が不可能となる。他の場合には、これらの化
合物の合成には１つの炭素単位のトランスフアーが必要
である。しかしながら、ＤＨＦＲを欠く細胞は、グリシ
ンとチミジンとヒポキサンチンとの組合せの存在下で増
殖するであろう。
量を制御するには、しばしば環境条件が有効であると認
められる。好適具体例においては、ジヒドロフオレート
レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の阻害剤であるメソトレキセ
ート（ＭＴＸ）に対する或る種の細胞の感受性を利用す
る。ＤＨＦＲは、１個の炭素単位のトランスフアーを含
む合成反応に間接的に必要とされる酵素である。ＤＨＦ
Ｒ活性が欠如すると、これら化合物が存在しない限り、
細胞の増殖が不可能となる。他の場合には、これらの化
合物の合成には１つの炭素単位のトランスフアーが必要
である。しかしながら、ＤＨＦＲを欠く細胞は、グリシ
ンとチミジンとヒポキサンチンとの組合せの存在下で増
殖するであろう。
通常ＤＨＦＲを生産する細胞は、メソトレキセートによ
り阻害されることが知られている。大抵の場合、正常細
胞に対するメソトレキセートの適当量の添加は、細胞の
死滅をもたらす。しかしながら、或る種の細胞はＤＨＦ
Ｒ量を増加させることによりメソトレキセート処理に耐
えると思われ、したがつてメソトレキセートがこの酵素
を阻害する能力を上まわる。この種の細胞には、ＤＨＦ
Ｒ配列をコードするメツセンジヤＲＮＡの量が増加して
いることが従来示されている。このことは、このメツセ
ンジヤＲＮＡをコードする遺伝物質におけるＤＮＡ量の
増加を考えることにより説明される。効果上、明らかに
メソトレキセートの添加はＤＨＦＲ遺伝子の遺伝子増幅
をもたらす。ＤＨＦＲ配列と物理的に結合された遺伝子
配列は、同じプロモータにより調節されないがやはり増
幅される。したがつて、メソトレキセート処理の結果生
ずるＤＨＦＲ遺伝子の増幅を使用して、同時に他の蛋白
質、すなわちこの場合は所望のウロキナーゼポリペプチ
ドに対する遺伝子を増幅することができる。
り阻害されることが知られている。大抵の場合、正常細
胞に対するメソトレキセートの適当量の添加は、細胞の
死滅をもたらす。しかしながら、或る種の細胞はＤＨＦ
Ｒ量を増加させることによりメソトレキセート処理に耐
えると思われ、したがつてメソトレキセートがこの酵素
を阻害する能力を上まわる。この種の細胞には、ＤＨＦ
Ｒ配列をコードするメツセンジヤＲＮＡの量が増加して
いることが従来示されている。このことは、このメツセ
ンジヤＲＮＡをコードする遺伝物質におけるＤＮＡ量の
増加を考えることにより説明される。効果上、明らかに
メソトレキセートの添加はＤＨＦＲ遺伝子の遺伝子増幅
をもたらす。ＤＨＦＲ配列と物理的に結合された遺伝子
配列は、同じプロモータにより調節されないがやはり増
幅される。したがつて、メソトレキセート処理の結果生
ずるＤＨＦＲ遺伝子の増幅を使用して、同時に他の蛋白
質、すなわちこの場合は所望のウロキナーゼポリペプチ
ドに対する遺伝子を増幅することができる。
さらに、ＤＨＦＲ用の第二の配列が導入される宿主細胞
自身がＤＨＦＲを欠如している場合、ＤＨＦＲは成功裡
にトランスフエクトされる細胞の選択のための便利なマ
ーカーとしても作用する。ＤＨＦＲ配列が所望ペプチド
のための配列に効果的に結合されると、この能力は所望
の配列による有効なトランスフエクシヨンに対するマー
カーとしても作用する。
自身がＤＨＦＲを欠如している場合、ＤＨＦＲは成功裡
にトランスフエクトされる細胞の選択のための便利なマ
ーカーとしても作用する。ＤＨＦＲ配列が所望ペプチド
のための配列に効果的に結合されると、この能力は所望
の配列による有効なトランスフエクシヨンに対するマー
カーとしても作用する。
B.ベクター系 1.細菌系における発現 細菌使用の場合、たとえばE.coliに対する発現プラスミ
ドは、一般にベクターとしてpBR322(37)を使用しかつ異
種遺伝子配列、翻訳開始および停止信号を機能的プロモ
ータと共に有効に解読されるように挿入し、これは一般
的なまたは合成的に生成しうる制限部位を利用すること
により達成される。このベクターは１個もしくはそれ以
上の表現型選択特性遺伝子を有し、さらに宿主内での増
幅を確保する複製のオリジンをも有する。さらに、異種
挿入物を整列させて、たとえばtrp系遺伝子から誘導し
うる融合予備配列（プレシーケンス）と共に発現させる
こともできる。
ドは、一般にベクターとしてpBR322(37)を使用しかつ異
種遺伝子配列、翻訳開始および停止信号を機能的プロモ
ータと共に有効に解読されるように挿入し、これは一般
的なまたは合成的に生成しうる制限部位を利用すること
により達成される。このベクターは１個もしくはそれ以
上の表現型選択特性遺伝子を有し、さらに宿主内での増
幅を確保する複製のオリジンをも有する。さらに、異種
挿入物を整列させて、たとえばtrp系遺伝子から誘導し
うる融合予備配列（プレシーケンス）と共に発現させる
こともできる。
2.酵母における発現 たとえばヒトウロキナーゼに対するｃＤＮＡのような異
種遺伝子を酵母中で発現するには、４つの成分を含有す
るプラスミドベクターを作成する必要がある。１つの成
分は、E.coliおよび酵母の両者をトランスフオームさせ
うる部分であり、したがつて各微生物からの選択しうる
遺伝子を含まねばならない。これはE.coli由来のアンピ
シリン耐性に関する遺伝子および酵母由来の遺伝子ＴＲ
Ｐ１とすることができる。この成分は、さらに両微生物
においてプラスミドＤＮＡとして維持すべき両微生物由
来の複製のオリジンをも必要とする。これはpBR322由来
のE.coliオリジンおよび酵母の染色体IIIからのars１オ
リジンとすることができる。
種遺伝子を酵母中で発現するには、４つの成分を含有す
るプラスミドベクターを作成する必要がある。１つの成
分は、E.coliおよび酵母の両者をトランスフオームさせ
うる部分であり、したがつて各微生物からの選択しうる
遺伝子を含まねばならない。これはE.coli由来のアンピ
シリン耐性に関する遺伝子および酵母由来の遺伝子ＴＲ
Ｐ１とすることができる。この成分は、さらに両微生物
においてプラスミドＤＮＡとして維持すべき両微生物由
来の複製のオリジンをも必要とする。これはpBR322由来
のE.coliオリジンおよび酵母の染色体IIIからのars１オ
リジンとすることができる。
プラスミドの第二の成分は酵母遺伝子由来の５′−フラ
ンキング配列であつて、下流に位置する構造遺伝子の転
写をプロモートする。この５′−フランキング配列は酵
母３−ホスホ−グリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子
由来のものとすることができる。この断片はＰＧＫ構造
配列のＡＴＧを除去するような方法で作成され、このＡ
ＴＧは、５′−フランキング配列を構造遺伝子へ有利に
結合させるため、たとえばXbaＩおよびEcoＲＩ制限部位
のような代替制限部位を含む配列で置換することもでき
る。
ンキング配列であつて、下流に位置する構造遺伝子の転
写をプロモートする。この５′−フランキング配列は酵
母３−ホスホ−グリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子
由来のものとすることができる。この断片はＰＧＫ構造
配列のＡＴＧを除去するような方法で作成され、このＡ
ＴＧは、５′−フランキング配列を構造遺伝子へ有利に
結合させるため、たとえばXbaＩおよびEcoＲＩ制限部位
のような代替制限部位を含む配列で置換することもでき
る。
この系の第三の成分は、ＡＴＧ翻訳開始信号と翻訳停止
信号との両者を含有するように作成された構造遺伝子で
ある。
信号との両者を含有するように作成された構造遺伝子で
ある。
第四の成分は酵母遺伝子の３′−フランキング配列を含
む酵母ＤＮＡ配列であつて、転写終了とポリアデニル化
とに対する適切な信号を含む。
む酵母ＤＮＡ配列であつて、転写終了とポリアデニル化
とに対する適切な信号を含む。
３．哺乳動物セルカルチヤーにおける発現 哺乳動物セルカルチヤーにおける異種ペプチドの合成方
法は、異種転写単位の制御下で外来遺伝子の自律複製と
発現との両者を行ないうるベクターの開発に依存する。
組織培養におけるこのベクターの複製は、ＤＮＡ複製オ
リジン（たとえばＳＶ40ウイルス由来のもの）を与え、
かつ抗原（Ｔ抗原）を外生的に発現するセルライン中へ
ベクターを導入することによりヘルパー機能（Ｔ抗原）
を与えることによつて達成される(33,34)。ＳＶ40ウイ
ルスの後期プロモータ（late promoter）は、構造遺伝
子の前に位置し、遺伝子の転写を確保する。
法は、異種転写単位の制御下で外来遺伝子の自律複製と
発現との両者を行ないうるベクターの開発に依存する。
組織培養におけるこのベクターの複製は、ＤＮＡ複製オ
リジン（たとえばＳＶ40ウイルス由来のもの）を与え、
かつ抗原（Ｔ抗原）を外生的に発現するセルライン中へ
ベクターを導入することによりヘルパー機能（Ｔ抗原）
を与えることによつて達成される(33,34)。ＳＶ40ウイ
ルスの後期プロモータ（late promoter）は、構造遺伝
子の前に位置し、遺伝子の転写を確保する。
発現を得るのに有用なベクターはpBR322配列より成つて
おり、E. coliにおける選択のための選択可能なマーカー
（アンピシリン耐性）ならびにＤＮＡ複製のE.coliオリ
ジンを附与する。これらの配列はプラスミドpML-1から
誘導することができる。ＳＶ40オリジンは、この領域を
包含する342塩基対ＰvuII−Hind III断片から誘導する
ことができる(35,36)（両末端はEcoＲＩ末端に変換する
ことができる）。これらの配列は、ＤＮＡ複製のウイル
ス性オリジンからなる他、早期および後期転写単位の両
者に対するプロモータをコードする。ＳＶ40オリジン領
域の配向は、後期転写単位に対するプロモータがウロキ
ナーゼをコードする遺伝子の近くに位置するようなもの
である。
おり、E. coliにおける選択のための選択可能なマーカー
（アンピシリン耐性）ならびにＤＮＡ複製のE.coliオリ
ジンを附与する。これらの配列はプラスミドpML-1から
誘導することができる。ＳＶ40オリジンは、この領域を
包含する342塩基対ＰvuII−Hind III断片から誘導する
ことができる(35,36)（両末端はEcoＲＩ末端に変換する
ことができる）。これらの配列は、ＤＮＡ複製のウイル
ス性オリジンからなる他、早期および後期転写単位の両
者に対するプロモータをコードする。ＳＶ40オリジン領
域の配向は、後期転写単位に対するプロモータがウロキ
ナーゼをコードする遺伝子の近くに位置するようなもの
である。
Ａ．ウロキナーゼmRNAの起源 デトロイト５６２（Detroit 562，ヒト咽頭癌）細胞(3
8)(ATCC No.CCL 135)を、３％の重炭酸ナトリウム（pH
7.5）と１％のＬ−グルタミン（アービン，Irvine）と
１０％の牛胎児血清と１％のピルビン酸ナトリウム（ア
ービン）と１％の非必須アミノ酸（アービン）と2.4％
のHEPES(pH7.5)、50μｇ／ｍのガラマイシン(Garamyci
n)とを含有するように補充したイーグルの最小基本培地
(39)で合一するまで培養し、そして５％CO2雰囲気中で3
7℃にてインキユベートした。0.25％のトリプシンによ
り３７℃で１５分間処理した後、合一細胞(confluentce
lls)を遠心分離により採取した。
8)(ATCC No.CCL 135)を、３％の重炭酸ナトリウム（pH
7.5）と１％のＬ−グルタミン（アービン，Irvine）と
１０％の牛胎児血清と１％のピルビン酸ナトリウム（ア
ービン）と１％の非必須アミノ酸（アービン）と2.4％
のHEPES(pH7.5)、50μｇ／ｍのガラマイシン(Garamyci
n)とを含有するように補充したイーグルの最小基本培地
(39)で合一するまで培養し、そして５％CO2雰囲気中で3
7℃にてインキユベートした。0.25％のトリプシンによ
り３７℃で１５分間処理した後、合一細胞(confluentce
lls)を遠心分離により採取した。
Ｂ．メツセンジヤRNAの単離 Lynchet al.(40)により実質的に記載されたように全Ｒ
ＮＡをデトロイト562細胞から抽出した。これら細胞を
遠心分離によりペレツトにし、次いで約１ｇの細胞を10
mMのNaClと10mMのトリスHCl(pH7.4)と1.5mMのMgCl2との
１０ｍ中に再懸濁させた。非イオン系洗剤NP-40を１
％の最終濃液となるまで添加して、細胞を溶解させた。
遠心分離により核を除去し、さらにRNAをフエノール
（再蒸留）／クロロホルムとイソアミルアルコールとの
２回の４℃における順次の抽出によつて精製した。水相
を0.2ＭのNaClとなし、２倍容量の１００％エタノール
を添加しかつ−２０℃にて１晩貯蔵することにより全RN
Aを沈澱させた。遠心分離の後、ポリＡｍRNAをオリゴ−
dTセルロースクロマトグラフイー(41)により全RNAから
精製した。細胞１ｇからの収量は典型的には１０〜１５
mgの全RNAであり、その約２％がポリＡmRNAであつた。
ＮＡをデトロイト562細胞から抽出した。これら細胞を
遠心分離によりペレツトにし、次いで約１ｇの細胞を10
mMのNaClと10mMのトリスHCl(pH7.4)と1.5mMのMgCl2との
１０ｍ中に再懸濁させた。非イオン系洗剤NP-40を１
％の最終濃液となるまで添加して、細胞を溶解させた。
遠心分離により核を除去し、さらにRNAをフエノール
（再蒸留）／クロロホルムとイソアミルアルコールとの
２回の４℃における順次の抽出によつて精製した。水相
を0.2ＭのNaClとなし、２倍容量の１００％エタノール
を添加しかつ−２０℃にて１晩貯蔵することにより全RN
Aを沈澱させた。遠心分離の後、ポリＡｍRNAをオリゴ−
dTセルロースクロマトグラフイー(41)により全RNAから
精製した。細胞１ｇからの収量は典型的には１０〜１５
mgの全RNAであり、その約２％がポリＡmRNAであつた。
Ｃ．ポリＡ ｍＲＮＡのサイズ分画 ２００μｇのポリＡ ｍＲＮＡのサイズ分画は、1.75％
のアガロースと２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（pH3.
8）と６Ｍの尿素とより構成された酸−尿素ゲルを通す
電気泳動により行なつた（40,42）。電気泳動は２５ｍ
Ａかつ４℃にて７時間行なつた。次いで、ゲルを剃刀の
刃により手で分割した。このゲルの個々の切片を７０℃
で溶融させ、１０ｍＭのNaClと１０ｍＭのトリスＨＣｌ
（pH7.4）と1.5mMのMgCl2と0.1％のSDSとの１２ｍ中
へ希釈し、水飽和された再蒸留フエノールで２回および
クロロホルムで１回抽出した。次いで、これらフラクシ
ヨンをエタノールで沈澱させ、次いでin vitroで翻訳し
て(43)、ポリＡ mRNAの得られたサイズ分画と完全性と
を決定した。
のアガロースと２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（pH3.
8）と６Ｍの尿素とより構成された酸−尿素ゲルを通す
電気泳動により行なつた（40,42）。電気泳動は２５ｍ
Ａかつ４℃にて７時間行なつた。次いで、ゲルを剃刀の
刃により手で分割した。このゲルの個々の切片を７０℃
で溶融させ、１０ｍＭのNaClと１０ｍＭのトリスＨＣｌ
（pH7.4）と1.5mMのMgCl2と0.1％のSDSとの１２ｍ中
へ希釈し、水飽和された再蒸留フエノールで２回および
クロロホルムで１回抽出した。次いで、これらフラクシ
ヨンをエタノールで沈澱させ、次いでin vitroで翻訳し
て(43)、ポリＡ mRNAの得られたサイズ分画と完全性と
を決定した。
Ｄ．ウロキナーゼＤＮＡ配列を含有するオリゴーdTでプ
ライム処理したコロニーライブラリの調製 ポリＡ mRNAを酸−尿素ゲル上でサイズ分画した。１２
Ｓより大きいmRNAフラクシヨンをプールし、そしてこれ
らを標準法による二重鎖cDNAのオリゴーdTプライム処理
調製の雛型として使用した（44,45）。cDNAを６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動でサイズ分画し、長さが35
0塩基対より大きいds cDNA 132ngを電気溶出によつて得
た。３０ngのds cDNAを、末端デオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ(46)を用いてデオキシＣ残基によつ
て延長させ、PstＩ部位(46)においてデオキシＧ残基に
より同様に末端処理されたプラスミドpBR322(37)200ng
とともにアニールした。次いで、各アニールされた混合
物をE.coliＫ１２菌株294(ATCC No.31446)にトランスフ
オームした。アンピシリン感受性かつテトラサイクリン
耐性の約10000個のトランスフオーマントが得られた。
ライム処理したコロニーライブラリの調製 ポリＡ mRNAを酸−尿素ゲル上でサイズ分画した。１２
Ｓより大きいmRNAフラクシヨンをプールし、そしてこれ
らを標準法による二重鎖cDNAのオリゴーdTプライム処理
調製の雛型として使用した（44,45）。cDNAを６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動でサイズ分画し、長さが35
0塩基対より大きいds cDNA 132ngを電気溶出によつて得
た。３０ngのds cDNAを、末端デオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ(46)を用いてデオキシＣ残基によつ
て延長させ、PstＩ部位(46)においてデオキシＧ残基に
より同様に末端処理されたプラスミドpBR322(37)200ng
とともにアニールした。次いで、各アニールされた混合
物をE.coliＫ１２菌株294(ATCC No.31446)にトランスフ
オームした。アンピシリン感受性かつテトラサイクリン
耐性の約10000個のトランスフオーマントが得られた。
Ｅ．ウロキナーゼスクリーニングプローブとして使用す
るための合成DNAオリゴマーの調製 長さ１４塩基の８種の合成DNAオリゴマーを、CB6と呼ば
れるウロキナーゼシアノゲンブロマイドポリペプチド断
片のMet-Tyr-Asn-Asp-Proアミノ酸配列に基づきmRNAに
対し相補的となるよう設計した。これら８種のデオキシ
オリゴヌクレオチドを次の２種のオリゴマーからなるプ
ールすなわち（ＣＢ６Ａ）５′GGGTCGTTA/GTACAT３′、
（ＣＢ６Ｂ）５′GGATCGTTA/GTACAT３′、（ＣＢ６Ｃ）
５′GGGTCATTA/GTACAT３′、（ＣＢ６Ｄ）５′GGATCATT
A/GTACAT３′においてホスホトリエステル法(17)によつ
て合成した。次いで、２種のオリゴマーのそれぞれのプ
ールを次のようにして放射活性となるように燐酸化し
た：250ngのデオキシオリゴヌクレオチドを６０mMのト
リスHCl(pH８）と１０mMのMgCl2と１５mMのβ−メルカ
プトエタノールと１００μCi（γ−32P)ATP（アメルシ
ヤム社Amersham、5000Ci/mM）との２５μ中で混合し
た。
るための合成DNAオリゴマーの調製 長さ１４塩基の８種の合成DNAオリゴマーを、CB6と呼ば
れるウロキナーゼシアノゲンブロマイドポリペプチド断
片のMet-Tyr-Asn-Asp-Proアミノ酸配列に基づきmRNAに
対し相補的となるよう設計した。これら８種のデオキシ
オリゴヌクレオチドを次の２種のオリゴマーからなるプ
ールすなわち（ＣＢ６Ａ）５′GGGTCGTTA/GTACAT３′、
（ＣＢ６Ｂ）５′GGATCGTTA/GTACAT３′、（ＣＢ６Ｃ）
５′GGGTCATTA/GTACAT３′、（ＣＢ６Ｄ）５′GGATCATT
A/GTACAT３′においてホスホトリエステル法(17)によつ
て合成した。次いで、２種のオリゴマーのそれぞれのプ
ールを次のようにして放射活性となるように燐酸化し
た：250ngのデオキシオリゴヌクレオチドを６０mMのト
リスHCl(pH８）と１０mMのMgCl2と１５mMのβ−メルカ
プトエタノールと１００μCi（γ−32P)ATP（アメルシ
ヤム社Amersham、5000Ci/mM）との２５μ中で混合し
た。
５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、反応を
３７℃で３０分間進行させ、そして２０mMまでのEDTAの
添加によつて停止させた。
３７℃で３０分間進行させ、そして２０mMまでのEDTAの
添加によつて停止させた。
Ｆ．ウロキナーゼ配列に対するオリゴーdTプライム処理
されたコロニーライブラリのスクリーニング 約10000個のコロニーを、LB(48)＋５μｇ／ｍのテト
ラサイクリンを含有するマイクロタイター培養皿のウエ
ルに個々に接種し、そして７％までDMSOを添加した後−
２０℃で貯蔵した。このライブラリからの個々のコロニ
ーをシユライヒヤー（Schleicher）およびシユエル（Sc
huell）のＢＡ８５／２０ニトロセルロースフイルタに
トランスフアーし、そしてLB＋５μｇ／ｍのテトラサ
イクリンを含有する寒天板上で増殖させた。３７℃にて
約１０時間の増殖の後、これらコロニーフイルタをLB＋
５μｇ／ｍのテトラサイクリンと12.5μｇ／ｍのク
ロラムフエニルコールとを含有する寒天プレートにトラ
ンスフアーし、そして３７℃にて１晩再インキユベート
した。次いで、各コロニーからのDNAを変性させ、グル
ンシユタイン−ホグネス（Grunstein-Hogness）法(49)
の変法によつてフイルタへ固定した。各フイルタを0.5
ＮのNaOHと1.5ＭのNaClとの上に３分間浮遊させてコロ
ニーを溶菌させかつDNAを変性させ、次いで３ＭのNaCl
と0.5ＭのトリスHCl(pH7.5）との上に１５分間浮遊させ
て中和した。次いで、これらフイルタを２ＸＳＳＣ上で
さらに１５分間浮遊させ、次いで８０℃の真空オーブン
内で２時間焼成した。これらフイルタを0.9ＭのNaClと
１Ｘのデンハルツ（Denhardts）と１００mMのトリスHCl
(pH7.5)と5mMのNa-EDTAと1mMのATPと1Mの燐酸ナトリウ
ム（二塩基）と1mMのピロ燐酸ナトリウムと0.5％のNP-4
0と200μｇ／ｍのE.coli ｔ−ＲＮＡ中、室温で約２
時間にわたり予備ハイブリダイズさせ、次いで同じ溶液
中でWallace et al.(50)により実質的に記載された方法
により１晩ハイブリダイズさせた。この場合約４０×１
０6cpmの各キナーゼ処理された２のＣＢ６デオキシオリ
ゴヌクレオチドプールを用いた。6XSSCと0.1％のSDS中
で37℃で激く洗浄した後、これらフイルタをコダツク
（Kodak)XR-5のＸ線フイルムにデユポン露光強化スクリ
ーン（Dupont Lightning-Plus intensitying screens）
を用いて−８０℃にて１６〜２４時間露出させた。２種
のコロニーすなわち：UK513dT69D2(pD2)およびUK513dT7
3D12(pD12)は、８種のプローブの混合物とのハイブリダ
イゼーシヨンを示した。
されたコロニーライブラリのスクリーニング 約10000個のコロニーを、LB(48)＋５μｇ／ｍのテト
ラサイクリンを含有するマイクロタイター培養皿のウエ
ルに個々に接種し、そして７％までDMSOを添加した後−
２０℃で貯蔵した。このライブラリからの個々のコロニ
ーをシユライヒヤー（Schleicher）およびシユエル（Sc
huell）のＢＡ８５／２０ニトロセルロースフイルタに
トランスフアーし、そしてLB＋５μｇ／ｍのテトラサ
イクリンを含有する寒天板上で増殖させた。３７℃にて
約１０時間の増殖の後、これらコロニーフイルタをLB＋
５μｇ／ｍのテトラサイクリンと12.5μｇ／ｍのク
ロラムフエニルコールとを含有する寒天プレートにトラ
ンスフアーし、そして３７℃にて１晩再インキユベート
した。次いで、各コロニーからのDNAを変性させ、グル
ンシユタイン−ホグネス（Grunstein-Hogness）法(49)
の変法によつてフイルタへ固定した。各フイルタを0.5
ＮのNaOHと1.5ＭのNaClとの上に３分間浮遊させてコロ
ニーを溶菌させかつDNAを変性させ、次いで３ＭのNaCl
と0.5ＭのトリスHCl(pH7.5）との上に１５分間浮遊させ
て中和した。次いで、これらフイルタを２ＸＳＳＣ上で
さらに１５分間浮遊させ、次いで８０℃の真空オーブン
内で２時間焼成した。これらフイルタを0.9ＭのNaClと
１Ｘのデンハルツ（Denhardts）と１００mMのトリスHCl
(pH7.5)と5mMのNa-EDTAと1mMのATPと1Mの燐酸ナトリウ
ム（二塩基）と1mMのピロ燐酸ナトリウムと0.5％のNP-4
0と200μｇ／ｍのE.coli ｔ−ＲＮＡ中、室温で約２
時間にわたり予備ハイブリダイズさせ、次いで同じ溶液
中でWallace et al.(50)により実質的に記載された方法
により１晩ハイブリダイズさせた。この場合約４０×１
０6cpmの各キナーゼ処理された２のＣＢ６デオキシオリ
ゴヌクレオチドプールを用いた。6XSSCと0.1％のSDS中
で37℃で激く洗浄した後、これらフイルタをコダツク
（Kodak)XR-5のＸ線フイルムにデユポン露光強化スクリ
ーン（Dupont Lightning-Plus intensitying screens）
を用いて−８０℃にて１６〜２４時間露出させた。２種
のコロニーすなわち：UK513dT69D2(pD2)およびUK513dT7
3D12(pD12)は、８種のプローブの混合物とのハイブリダ
イゼーシヨンを示した。
Ｇ．pD2およびpD12プラスミドDNAの特性 迅速ミニスクリーン法(51)によつてE.coliコロニーUK51
3dT69D2およびUK513dT73D12から単離したプラスミドDNA
を、PstＩ制限エンドヌクレアーゼ分析にかけた。この
分析は、pD2とpD12とが同一であること強く示唆した。
各プラスミドDNAは、６％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動させると、一緒に移動する３個のPstＩ制限断片を
有する。このプラスミドpD2cDNA挿入物の完全なヌクレ
オチド配列を、PstＩ制限断片をＭ１３ベクターmp７(5
3)中へサブクローン化した後、ジデオキシヌクレオチド
連鎖停止法(52)によつて決定した。第２図はヌクレオチ
ド配列を示し、第３図はpD2のcDNA挿入断片の翻訳され
たヌクレオチド配列（すなわちアミノ酸配列）を示して
いる。低分子量（３３Ｋ）のウロキナーゼの完全コード
化領域をこの大きい方のpD2断片から単離した。CB6B
（５′−GGATCGTTA/GTACAT）デオキシオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列は、この地図によればヌクレオチ
ド466〜479を包含する。典型的なセリンプロテアーゼ活
性部位（gly asp ser gly gly pro）は、アミノ酸222と
227との間に存在する。コード化領域は、838個の塩基対
もしくは高分子量（54Ｋ）ウロキナーゼのカルボキシ末
端部分の279個のアミノ酸よりなつている。
3dT69D2およびUK513dT73D12から単離したプラスミドDNA
を、PstＩ制限エンドヌクレアーゼ分析にかけた。この
分析は、pD2とpD12とが同一であること強く示唆した。
各プラスミドDNAは、６％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動させると、一緒に移動する３個のPstＩ制限断片を
有する。このプラスミドpD2cDNA挿入物の完全なヌクレ
オチド配列を、PstＩ制限断片をＭ１３ベクターmp７(5
3)中へサブクローン化した後、ジデオキシヌクレオチド
連鎖停止法(52)によつて決定した。第２図はヌクレオチ
ド配列を示し、第３図はpD2のcDNA挿入断片の翻訳され
たヌクレオチド配列（すなわちアミノ酸配列）を示して
いる。低分子量（３３Ｋ）のウロキナーゼの完全コード
化領域をこの大きい方のpD2断片から単離した。CB6B
（５′−GGATCGTTA/GTACAT）デオキシオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオチド配列は、この地図によればヌクレオチ
ド466〜479を包含する。典型的なセリンプロテアーゼ活
性部位（gly asp ser gly gly pro）は、アミノ酸222と
227との間に存在する。コード化領域は、838個の塩基対
もしくは高分子量（54Ｋ）ウロキナーゼのカルボキシ末
端部分の279個のアミノ酸よりなつている。
アミノ酸位置280における停止コドンUGAは、ポリＡ配列
に至るまでの３′−未翻訳配列の約935個のヌクレオチ
ドの始まりとなる。31413ダルトンの全長（full lengt
h）ウロキナーゼのみがpD2のcDNA挿入物によつてコード
されていたので、高分子量ウロキナーゼを同定するには
ウロキナーゼ配列を有する附加的なコロニーバンクを作
成する必要があつた。
に至るまでの３′−未翻訳配列の約935個のヌクレオチ
ドの始まりとなる。31413ダルトンの全長（full lengt
h）ウロキナーゼのみがpD2のcDNA挿入物によつてコード
されていたので、高分子量ウロキナーゼを同定するには
ウロキナーゼ配列を有する附加的なコロニーバンクを作
成する必要があつた。
Ｈ．現存するウロキナーゼクローンのアミノ末端延長の
ための２種の異なる特異的にプライム処理したコロニー
バンクの作成 第一の特異的にプライム処理したcDNAバンクは、位置22
5におけるHae IIで始まりかつ位置270におけるAccＩで
終る（第２図）45塩基対のウロキナーゼDNA制限エンド
ヌクレアーゼ断片をオリゴdT12−18の代わりにプライマ
ーとして使用した。この断片を20μｇの未分画デトロイ
ト562ポリＡ mRNAの存在下で加熱変性させ、そしてcDN
Aを上記Ｄに記載した方法にしたがつて調製した。200bp
より大きい二本鎖cDNA11.5ngを６％ポリアクリルアミド
ゲルから電気溶出させ、そしてこれを使用してE.coli29
4における約6000種のクローンを生成させた。
ための２種の異なる特異的にプライム処理したコロニー
バンクの作成 第一の特異的にプライム処理したcDNAバンクは、位置22
5におけるHae IIで始まりかつ位置270におけるAccＩで
終る（第２図）45塩基対のウロキナーゼDNA制限エンド
ヌクレアーゼ断片をオリゴdT12−18の代わりにプライマ
ーとして使用した。この断片を20μｇの未分画デトロイ
ト562ポリＡ mRNAの存在下で加熱変性させ、そしてcDN
Aを上記Ｄに記載した方法にしたがつて調製した。200bp
より大きい二本鎖cDNA11.5ngを６％ポリアクリルアミド
ゲルから電気溶出させ、そしてこれを使用してE.coli29
4における約6000種のクローンを生成させた。
UK89CB6と呼ばれる約4000個のコロニーよりなる第二の
特異的にプライム処理したcDNAバンクを作成し、この場
合４μｇのポリＡmRNA酸−尿素アガロースゲルフラクシ
ヨン８と、フラクシヨン９からの４μｇのポリＡmRNAと
のプールを使用した（上記Ｃ）。各CB6デオキシオリゴ
ーヌクレオチドプール（上記Ｅ）250ngをオリゴdT12-18
の代わりにプライマーとして使用した。
特異的にプライム処理したcDNAバンクを作成し、この場
合４μｇのポリＡmRNA酸−尿素アガロースゲルフラクシ
ヨン８と、フラクシヨン９からの４μｇのポリＡmRNAと
のプールを使用した（上記Ｃ）。各CB6デオキシオリゴ
ーヌクレオチドプール（上記Ｅ）250ngをオリゴdT12-18
の代わりにプライマーとして使用した。
Ｉ．全長コロニーバンクのスクリーニング 全長cDNAを含有するコロニーを、ニトロセルロースフイ
ルタへ直接トランスフアーし、次いで３７℃で増殖させ
た。これらコロニーを溶菌させ、そしてDNAを変性させ
かつ上記Ｆに記載したようにフイルタへ固定した(49)。
32Ｐ−標識したDNAプローブをpD2のcDNA挿入物からの14
3塩基対HinfＩ〜HaeII制限エンドヌクレアーゼ断片から
調製し(54)、そしてフイルタに固定された全長cDNAとハ
イブリダイズさせた(55)。８×106CPMのプローブを16時
間ハイブリダイズさせ、次いで上記したように洗浄し(5
5)、そしてＸ線フイルムに露出させた。２つのコロニー
は強いハイブリダイゼーシヨンを示した：Ａ３およびＥ
９。
ルタへ直接トランスフアーし、次いで３７℃で増殖させ
た。これらコロニーを溶菌させ、そしてDNAを変性させ
かつ上記Ｆに記載したようにフイルタへ固定した(49)。
32Ｐ−標識したDNAプローブをpD2のcDNA挿入物からの14
3塩基対HinfＩ〜HaeII制限エンドヌクレアーゼ断片から
調製し(54)、そしてフイルタに固定された全長cDNAとハ
イブリダイズさせた(55)。８×106CPMのプローブを16時
間ハイブリダイズさせ、次いで上記したように洗浄し(5
5)、そしてＸ線フイルムに露出させた。２つのコロニー
は強いハイブリダイゼーシヨンを示した：Ａ３およびＥ
９。
Ｊ．全長ウロキナーゼcDNA pA3およびpE9の特性 Ａ３プラスミドDNAのPstＩ制限分析は約360bpおよび約5
0bpのcDNA挿入断片を示し、かつＥ９プラスミドDNAのそ
れは約340bpの１つの断片を示した。各プラスミドDNAの
PstＩEcoＲＩ二重制限は予想したように約190bpの共通
のcDNA挿入断片を示し、この場合各プラスミドDNAはHae
IIAccＩプライマー断片に対するウロキナーゼ配列情報
５′をコードしていた。プラスミドpA3は185bpのPstＩE
coＲＩcDNA挿入断片をさらに有し、そしてＥ９のそれは
160bpの追加断片を有した。pA3のより大きい約360bpのP
stＩcDNA挿入断片をＭ１３ベクターmp７(53)中へサブク
ローン化させ、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止法(52)
によつて配列決定した。pA3のウロキナーゼコード配列
は、第４図に示したように全長ウロキナーゼ蛋白質に対
するcDNA配列におけるほぼ位置405から位置785までに存
在する。
0bpのcDNA挿入断片を示し、かつＥ９プラスミドDNAのそ
れは約340bpの１つの断片を示した。各プラスミドDNAの
PstＩEcoＲＩ二重制限は予想したように約190bpの共通
のcDNA挿入断片を示し、この場合各プラスミドDNAはHae
IIAccＩプライマー断片に対するウロキナーゼ配列情報
５′をコードしていた。プラスミドpA3は185bpのPstＩE
coＲＩcDNA挿入断片をさらに有し、そしてＥ９のそれは
160bpの追加断片を有した。pA3のより大きい約360bpのP
stＩcDNA挿入断片をＭ１３ベクターmp７(53)中へサブク
ローン化させ、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止法(52)
によつて配列決定した。pA3のウロキナーゼコード配列
は、第４図に示したように全長ウロキナーゼ蛋白質に対
するcDNA配列におけるほぼ位置405から位置785までに存
在する。
Ｋ．ウロキナーゼコロニーバンクUK89CB6のスクリーニ
ング 〜1900UK89CB6cDNA挿入物を含有するコロニーからのDNA
を変性させ、そして上記Ｆに記載したと同様にニトロセ
ルローズフイルタへ固定した。32Ｐ−標識したDNAプロ
ーブを、pA3のcDNA挿入断片の146bpPstIHinfＩ断片から
調製した(54)。このプローブ40×106CPmを次いでUK89CB
6コロニーのフイルタに結合したDNAへ１６時間ハイブリ
ダイズさせ、次いで上記(55)したように洗浄し、そして
Ｘ線フイルムに露出させた。陽性のハイブリダイゼーシ
ヨンを示す２つのコロニーは、UK89CB6F1(pF1)およびUK
89CB6H10(pH10)であつた。
ング 〜1900UK89CB6cDNA挿入物を含有するコロニーからのDNA
を変性させ、そして上記Ｆに記載したと同様にニトロセ
ルローズフイルタへ固定した。32Ｐ−標識したDNAプロ
ーブを、pA3のcDNA挿入断片の146bpPstIHinfＩ断片から
調製した(54)。このプローブ40×106CPmを次いでUK89CB
6コロニーのフイルタに結合したDNAへ１６時間ハイブリ
ダイズさせ、次いで上記(55)したように洗浄し、そして
Ｘ線フイルムに露出させた。陽性のハイブリダイゼーシ
ヨンを示す２つのコロニーは、UK89CB6F1(pF1)およびUK
89CB6H10(pH10)であつた。
Ｌ．pF1およびpH10ウロキナーゼcDNAの特性 pF1のPstＩ制限は〜450bpおよび〜125bpのcDNA挿入断片
を示し、pH10は〜500bpの１個のPstＩcDNA挿入断片を示
す。pF1のPstＩEcoＲＩ二重制限はEcoＲＩ制限部位を示
さず、PstＩ制限のみの断片と同一のcDNA挿入断片を有
する。pH10はEcoＲＩ制限部位を示し、〜375bpおよび〜
110bpのcDNA挿入断片を生産する。pH10のこのEcoＲＩ部
位は、恐らく位置627に示したと同じEcoＲＩ部位であろ
う（第４図）。pF1 cDNA挿入物は、このEcoＲＩ制限部
位を含有しない。
を示し、pH10は〜500bpの１個のPstＩcDNA挿入断片を示
す。pF1のPstＩEcoＲＩ二重制限はEcoＲＩ制限部位を示
さず、PstＩ制限のみの断片と同一のcDNA挿入断片を有
する。pH10はEcoＲＩ制限部位を示し、〜375bpおよび〜
110bpのcDNA挿入断片を生産する。pH10のこのEcoＲＩ部
位は、恐らく位置627に示したと同じEcoＲＩ部位であろ
う（第４図）。pF1 cDNA挿入物は、このEcoＲＩ制限部
位を含有しない。
pH10よりも長いcDNA挿入断片を有するpF1を配列決定（s
equencing）用に選択した。pF1cDNA挿入物の両PstＩ制
限断片をM13サブクローン化およびジデオキシ配列決定
により配列決定した。高分子量全長ウロキナーゼの全ア
ミノ酸配列をコードするpF1,pA3およびpD2からのUKcDNA
捜入物の複合ヌクレオチド配列を第４図に示す。pF1の
ウロキナーゼコード配列は位置１からほぼ位置570まで
示されている。pD2のウロキナーゼコード化配列は、第
４図において位置532から位置2304まで位置する。
equencing）用に選択した。pF1cDNA挿入物の両PstＩ制
限断片をM13サブクローン化およびジデオキシ配列決定
により配列決定した。高分子量全長ウロキナーゼの全ア
ミノ酸配列をコードするpF1,pA3およびpD2からのUKcDNA
捜入物の複合ヌクレオチド配列を第４図に示す。pF1の
ウロキナーゼコード配列は位置１からほぼ位置570まで
示されている。pD2のウロキナーゼコード化配列は、第
４図において位置532から位置2304まで位置する。
アミノ酸配列分析により決定したアミノ酸位置１におけ
るアミノ末端セリンを第１図および第５図に示す。メチ
オニンで始まりかつグリシンで終るアミノ末端における
先行の２０個のアミノ酸は、恐らく高分子量ウロキナー
ゼの残余の411個のアミノ酸を分泌するためのシグナル
配列として作用すると思われる。この推定シグナル配列
は、他の特性化シグナル配列と共通して、たとえばサイ
ズおよび疎水性のような特徴を有する（56,57）。
るアミノ末端セリンを第１図および第５図に示す。メチ
オニンで始まりかつグリシンで終るアミノ末端における
先行の２０個のアミノ酸は、恐らく高分子量ウロキナー
ゼの残余の411個のアミノ酸を分泌するためのシグナル
配列として作用すると思われる。この推定シグナル配列
は、他の特性化シグナル配列と共通して、たとえばサイ
ズおよび疎水性のような特徴を有する（56,57）。
高分子量ウロキナーゼから３３Ｋの二本鎖低分子量ウロ
キナーゼにするトリプシン開裂部位は次の通りである：
位置136におけるlysは短鎖のアミノ末端アミノ酸であ
り、位置159におけるileは長鎖のアミノ末端である（第
１図および第５図）。
キナーゼにするトリプシン開裂部位は次の通りである：
位置136におけるlysは短鎖のアミノ末端アミノ酸であ
り、位置159におけるileは長鎖のアミノ末端である（第
１図および第５図）。
Ｍ．Ｅ．coliにおけるウロキナーゼの低分子量誘導体の
発現 1.長trp LE融合（第６図） 次の性質を有するプラスミド（pNCV、58）を作成した：
(1)このプラスミドはpBR322の誘導体であつて、細胞１
個当り約２０個のコピーで存在する。(2)このプラスミ
ドは、そのE.coli宿主をテトラサイクリン耐性にする。
(3)このプラスミドは、trpリーダーペプチドとtrpＥ構
造遺伝子（LE融合遺伝子）との間に融合部を有する蛋白
質の合成を指示する誘発性トリプトフアンプロモータを
含有する。(4)独特のPstＩ制限部位がtrpＥ遺伝子に作
成され、これを使用してプラスミドpSOM7Δ１Δ４にお
けるLE遺伝子の遠位末端におけるEcoＲＩ部位を、合成
配列： AATTCTGCAG GACGTCTTAA を使用する２つのEcoＲＩ部位によりフランクされたPst
Ｉ部位へ変換することによつて、PstＩDNA断片をクロー
ン化することができる。次いで、trpプロモータとLE遺
伝子とを含有するDNA断片を、プラスミドpBR322中へ導
入してプラスミドpNCVを与えた（４７Ａ）。
発現 1.長trp LE融合（第６図） 次の性質を有するプラスミド（pNCV、58）を作成した：
(1)このプラスミドはpBR322の誘導体であつて、細胞１
個当り約２０個のコピーで存在する。(2)このプラスミ
ドは、そのE.coli宿主をテトラサイクリン耐性にする。
(3)このプラスミドは、trpリーダーペプチドとtrpＥ構
造遺伝子（LE融合遺伝子）との間に融合部を有する蛋白
質の合成を指示する誘発性トリプトフアンプロモータを
含有する。(4)独特のPstＩ制限部位がtrpＥ遺伝子に作
成され、これを使用してプラスミドpSOM7Δ１Δ４にお
けるLE遺伝子の遠位末端におけるEcoＲＩ部位を、合成
配列： AATTCTGCAG GACGTCTTAA を使用する２つのEcoＲＩ部位によりフランクされたPst
Ｉ部位へ変換することによつて、PstＩDNA断片をクロー
ン化することができる。次いで、trpプロモータとLE遺
伝子とを含有するDNA断片を、プラスミドpBR322中へ導
入してプラスミドpNCVを与えた（４７Ａ）。
ヌクレオチド位置５（PstI5′−開裂部位）からヌクレ
オチド位置1130（第２図）までのウロキナーゼPstＩ断
片を、融合蛋白質がtrpプロモータの誘発の際に作成さ
れるように、pNCVのPstＩ部位へクローン化させた。Ｎ
末端部はtrpＬＥであり、Ｃ末端部は低分子量ウロキナ
ーゼである。
オチド位置1130（第２図）までのウロキナーゼPstＩ断
片を、融合蛋白質がtrpプロモータの誘発の際に作成さ
れるように、pNCVのPstＩ部位へクローン化させた。Ｎ
末端部はtrpＬＥであり、Ｃ末端部は低分子量ウロキナ
ーゼである。
第６図を参照して、５μｇのプラスミドpUK513dT69D2(p
D2）を２０単位のPstＩによつて消化し、低分子量ウロ
キナーゼをコードする1125bpのcDNA挿入断片を６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により単離した。この挿入
物〜１μｇをゲルから電気溶出させ、フエノール／クロ
ロホルム抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。１μ
ｇのベクタープラスミドpNCV(58)を１０単位のPstＩで
消化し、そしてフエノール／クロロホルム抽出の後にエ
タノール沈澱させた。この1125bp断片〜100ngを20mMの
トリスHCl(pH7.5)と１０mMのMgCl2と１０mMのDTTと2.5m
MのATPと３０単位のＴ４DNAリガーゼとの20μ中で、P
stＩ消化したpNCVの〜100ngと混合した。１４℃にて一
晩結合させた後、混合物の半分をE.coliＫ１２菌株294
にトランスフオームした。１２種のトランスフオーマン
トからのDNAのBamＨＩ消化は適切な配向を有する３種を
示した。E.coliにおけるこのプラスミド（pUK33trp L
EL）（第６図）の発現は、33000ウロキナーゼを含む長
いtrpLE融合蛋白質を生成した。33000ウロキナーゼは、
トリプシン様活性酵素により位置３および４と位置２６
および２７との間で開裂させて活性化した（第３図参
照）。
D2）を２０単位のPstＩによつて消化し、低分子量ウロ
キナーゼをコードする1125bpのcDNA挿入断片を６％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により単離した。この挿入
物〜１μｇをゲルから電気溶出させ、フエノール／クロ
ロホルム抽出し、そしてエタノールで沈澱させた。１μ
ｇのベクタープラスミドpNCV(58)を１０単位のPstＩで
消化し、そしてフエノール／クロロホルム抽出の後にエ
タノール沈澱させた。この1125bp断片〜100ngを20mMの
トリスHCl(pH7.5)と１０mMのMgCl2と１０mMのDTTと2.5m
MのATPと３０単位のＴ４DNAリガーゼとの20μ中で、P
stＩ消化したpNCVの〜100ngと混合した。１４℃にて一
晩結合させた後、混合物の半分をE.coliＫ１２菌株294
にトランスフオームした。１２種のトランスフオーマン
トからのDNAのBamＨＩ消化は適切な配向を有する３種を
示した。E.coliにおけるこのプラスミド（pUK33trp L
EL）（第６図）の発現は、33000ウロキナーゼを含む長
いtrpLE融合蛋白質を生成した。33000ウロキナーゼは、
トリプシン様活性酵素により位置３および４と位置２６
および２７との間で開裂させて活性化した（第３図参
照）。
2.短trpLE融合（第７図） プラスミドpINCVを作成した。これは、trpＥ遺伝子の大
部分が欠失している以外は全ゆる点でpNCVと類似してい
る（上記参照）。このプラスミドにおいて、BglII部位
をPstＩ部位に変換し、そしてこの新しいPstＩ部位と元
のPstＩ部位との間の領域を欠失させた。pINCV〜100ng
をPstＩおよびHindIIIによつて消化し、次いでフエノー
ル／クロロホルムで抽出しそしてエタノール沈澱させ
た。pUK33trpLEL（第７図）〜３μｇをHindIIIにより完
全にかつPstＩにより部分的に消化して1150bpのPstＩ・
Hind III DNA断片を生成させ、これを６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動後の電気溶出によつて精製した。構
造ＵＫ遺伝子内のPstＩ部位は消化から免れた。PstＩ・
Hind III消化ｐINCVの全部をpUK33 trp LELの1150bp Hi
ndIII・部分PstＩ断片〜50ngと混合し、１４℃にて一晩
結合させた。次いで、この混合物でE.coliＫ１２菌株29
4をトランスフオームした。BamHI消化により、このプラ
スミド（pUK33 trp LES）の適性な作成を確認した（第
７図）。E.coliにおけるこのプラスミドの発現により融
合蛋白質が得られ、これから33000ウロキナーゼが活性
化された（上記）。
部分が欠失している以外は全ゆる点でpNCVと類似してい
る（上記参照）。このプラスミドにおいて、BglII部位
をPstＩ部位に変換し、そしてこの新しいPstＩ部位と元
のPstＩ部位との間の領域を欠失させた。pINCV〜100ng
をPstＩおよびHindIIIによつて消化し、次いでフエノー
ル／クロロホルムで抽出しそしてエタノール沈澱させ
た。pUK33trpLEL（第７図）〜３μｇをHindIIIにより完
全にかつPstＩにより部分的に消化して1150bpのPstＩ・
Hind III DNA断片を生成させ、これを６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動後の電気溶出によつて精製した。構
造ＵＫ遺伝子内のPstＩ部位は消化から免れた。PstＩ・
Hind III消化ｐINCVの全部をpUK33 trp LELの1150bp Hi
ndIII・部分PstＩ断片〜50ngと混合し、１４℃にて一晩
結合させた。次いで、この混合物でE.coliＫ１２菌株29
4をトランスフオームした。BamHI消化により、このプラ
スミド（pUK33 trp LES）の適性な作成を確認した（第
７図）。E.coliにおけるこのプラスミドの発現により融
合蛋白質が得られ、これから33000ウロキナーゼが活性
化された（上記）。
3.３３Ｋウロキナーゼの直接的発現（第８図および第９
図） ヌクレオチド１６で始まるウロキナーゼDNA断片（第２
図）をpBR322誘導体へクローン化させ、trpプロモータ
が、低分子量ウロキナーゼをコードしているこのウロキ
ナーゼ断片の直前に位置する構造を生成させた。プラス
ミドpLeIFAtrp 103（第８図）はプラスミドpLeIFA25(5
8)の誘導体であり、ここでLeIFA遺伝子末端のEcoＲＩ部
位は除去されている(59)。pLeIFAtrp103（第８図）の10
μｇを２０単位のEcoＲＩで消化し、フエノール／クロ
ロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。プラ
スミドDNA分子のEcoＲＩ付着末端を延長させて末端を平
滑化し、この場合60mMのNaClと7mMのMgCl2と7mMのトリ
スHCl(pH7.4)と1mMの各リボヌクレオチドトリホスフエ
ートとを含有する50μの反応物中で１２単位のDNAポ
リメラーゼＩを用いた。反応物を３７℃にて１時間イン
キユベートし、フエノール／クロロホルムで抽出し、そ
してエタノールで沈澱させた。次いで、DNAを10mMのト
リスHCl（pH８）と1mMのEDTAとの50μ中に再懸濁さ
せ、500単位の細菌性アルカリホスフアターゼ（Bacteri
al Alkaline Phosphatase）により６５℃にて３０分間
処理し、２回抽出し、そしてエタノール沈澱させた。Ps
tＩによつて消化した後、混合物を６％ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動にかけ、〜3900bpベクター断片を
電気溶出させた。
図） ヌクレオチド１６で始まるウロキナーゼDNA断片（第２
図）をpBR322誘導体へクローン化させ、trpプロモータ
が、低分子量ウロキナーゼをコードしているこのウロキ
ナーゼ断片の直前に位置する構造を生成させた。プラス
ミドpLeIFAtrp 103（第８図）はプラスミドpLeIFA25(5
8)の誘導体であり、ここでLeIFA遺伝子末端のEcoＲＩ部
位は除去されている(59)。pLeIFAtrp103（第８図）の10
μｇを２０単位のEcoＲＩで消化し、フエノール／クロ
ロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱させた。プラ
スミドDNA分子のEcoＲＩ付着末端を延長させて末端を平
滑化し、この場合60mMのNaClと7mMのMgCl2と7mMのトリ
スHCl(pH7.4)と1mMの各リボヌクレオチドトリホスフエ
ートとを含有する50μの反応物中で１２単位のDNAポ
リメラーゼＩを用いた。反応物を３７℃にて１時間イン
キユベートし、フエノール／クロロホルムで抽出し、そ
してエタノールで沈澱させた。次いで、DNAを10mMのト
リスHCl（pH８）と1mMのEDTAとの50μ中に再懸濁さ
せ、500単位の細菌性アルカリホスフアターゼ（Bacteri
al Alkaline Phosphatase）により６５℃にて３０分間
処理し、２回抽出し、そしてエタノール沈澱させた。Ps
tＩによつて消化した後、混合物を６％ポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動にかけ、〜3900bpベクター断片を
電気溶出させた。
プラスミドpUK33trpLELをE.coliＫ１２菌株GM48（デオ
キシアデノシンメチラーゼ）にトランスフオームさせ
て、このE.coli菌株から精製されたDNAを制限エンドヌ
クレアーゼBclＩによつて消化することができた（６
０）。このDNA４μｇを６単位のBclＩ（75mMのKCl、6mM
のトリスHCl(pH7.4)、10mMのMgCl2、1mMのDTT中におい
て）により５０℃にて１時間処理し、次いで50mMのNaCl
となし、そして１０単位のPstＩによつて消化した。６
％のゲル電気泳動を行ない、914bp断片を電気溶出させ
た。
キシアデノシンメチラーゼ）にトランスフオームさせ
て、このE.coli菌株から精製されたDNAを制限エンドヌ
クレアーゼBclＩによつて消化することができた（６
０）。このDNA４μｇを６単位のBclＩ（75mMのKCl、6mM
のトリスHCl(pH7.4)、10mMのMgCl2、1mMのDTT中におい
て）により５０℃にて１時間処理し、次いで50mMのNaCl
となし、そして１０単位のPstＩによつて消化した。６
％のゲル電気泳動を行ない、914bp断片を電気溶出させ
た。
met lys lys proのアミノ酸配列をコードする１４ヌク
レオチドDNAプライマーをホスホトリエステル法（４
７）によつて合成し、これは次の配列を有した： MetLysLysPro ５′CTATGAAAAAGCCC ３′ このプライマー500ngを、0.5mMのATPを含有する20μ
の反応物中で１０単位のＴ４ DNAキナーゼにより５′
末端で燐酸化させた。pUK33trpLEL(E.coli GM48におけ
る増殖）の264bpPstIAccI cDNA挿入断片を単離した。脱
イオン水10μ中に再懸濁したこの断片〜500ngを、燐
酸化プライマー20μと混合し、９５℃にて３分間加熱
し、ドライアイスエタノール浴中で急速に凍結させた。
この変性したDNA溶液を60mMのNaCl、7mMのMgCl2、7mMの
トリスHCl(pH7.4）、1mMの各デオキシリボヌクレオチド
トリホスフエートとなし、そして１２単位のDNAポリメ
ラーゼＩ大断片を加えた。３７℃にて２時間のインキユ
ベーシヨン後、このプライマー修復反応物をフエノール
／クロロホルム抽出しそしてエタノール沈澱させ、Bcl
Ｉによつて50℃で完全に消化させた。次いで、反応混合
物を６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、そしてBclＩ
に対する200bpのアミノ末端平滑末端断片〜50ngを電気
溶出させた。次いで、平滑末端−BclＩプライマー修復
断片〜50ngとBclＩPstＩカルボキシ−末端断片〜100ng
と〜3900bpベクター断片〜100ngとを14℃にて一晩結合
させ、E.coli 294中へトランスフオームさせた。多数の
トランスフオーマントのEcoＲＩ消化は適切な作成を示
し、DNA配列分析はこの新たなプラスミドpUK33trp 103
（第８図）の開始コドンを介している所望の配列を証明
した。この作成において、Ｎ末端メチオニンに続いて２
つのリジンが存在し、それに続いて第３Ａ図に示すよう
にアミノ酸配列５〜279が存在する。E.coliにおけるこ
のプラスミドの発現は、低分子量ウロキナーゼの合成を
もたらした。この蛋白質を上記したようにトリプシン様
活性酵素で活性化させ、この酵素はＮ−末端リジン対を
開裂させかつ位置２６におけるリジンと位置２７におけ
るイソロイシンとの間で開裂するよう作用する（第３Ａ
図）。
レオチドDNAプライマーをホスホトリエステル法（４
７）によつて合成し、これは次の配列を有した： MetLysLysPro ５′CTATGAAAAAGCCC ３′ このプライマー500ngを、0.5mMのATPを含有する20μ
の反応物中で１０単位のＴ４ DNAキナーゼにより５′
末端で燐酸化させた。pUK33trpLEL(E.coli GM48におけ
る増殖）の264bpPstIAccI cDNA挿入断片を単離した。脱
イオン水10μ中に再懸濁したこの断片〜500ngを、燐
酸化プライマー20μと混合し、９５℃にて３分間加熱
し、ドライアイスエタノール浴中で急速に凍結させた。
この変性したDNA溶液を60mMのNaCl、7mMのMgCl2、7mMの
トリスHCl(pH7.4）、1mMの各デオキシリボヌクレオチド
トリホスフエートとなし、そして１２単位のDNAポリメ
ラーゼＩ大断片を加えた。３７℃にて２時間のインキユ
ベーシヨン後、このプライマー修復反応物をフエノール
／クロロホルム抽出しそしてエタノール沈澱させ、Bcl
Ｉによつて50℃で完全に消化させた。次いで、反応混合
物を６％ポリアクリルアミドゲルにかけ、そしてBclＩ
に対する200bpのアミノ末端平滑末端断片〜50ngを電気
溶出させた。次いで、平滑末端−BclＩプライマー修復
断片〜50ngとBclＩPstＩカルボキシ−末端断片〜100ng
と〜3900bpベクター断片〜100ngとを14℃にて一晩結合
させ、E.coli 294中へトランスフオームさせた。多数の
トランスフオーマントのEcoＲＩ消化は適切な作成を示
し、DNA配列分析はこの新たなプラスミドpUK33trp 103
（第８図）の開始コドンを介している所望の配列を証明
した。この作成において、Ｎ末端メチオニンに続いて２
つのリジンが存在し、それに続いて第３Ａ図に示すよう
にアミノ酸配列５〜279が存在する。E.coliにおけるこ
のプラスミドの発現は、低分子量ウロキナーゼの合成を
もたらした。この蛋白質を上記したようにトリプシン様
活性酵素で活性化させ、この酵素はＮ−末端リジン対を
開裂させかつ位置２６におけるリジンと位置２７におけ
るイソロイシンとの間で開裂するよう作用する（第３Ａ
図）。
テトラサイクリン耐性（アンピシリン耐性）を宿主細胞
に付与するようなpUK33trp 103の誘導体プラスミドを作
成するのが望ましいと判明した。第９図はpUK33trp103A
pR-TcRの以下に述べる作成を示している。５μｇのpHGH
207-1（下記参照）をHpaＩおよびPvuIIで消化した。ベ
クター断片を単離しそして精製した。５μｇのpUK33trp
103をHpaＩおよびBamHIによつて消化し、６％ポリアク
リルアミドで電気泳動させ、そして836bpDNA断片を精製
した。別にpUK33trp103 5μｇをBamHIおよびPvuIIで消
化し、119bpDNA断片を単離かつ精製した。これら３種の
各DNA断片の等モル量を14℃にて一晩結合させ、これを
使用してE.coli294をトランスフオームさせた。数種の
アンピシリン耐性トランスフオーマントから得られるプ
ラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析はpUK33trp1
03ApRの適切な作成を証明し、かつtrpプロモータ／UK33
コード化DNAの配向における逆転を示した。
に付与するようなpUK33trp 103の誘導体プラスミドを作
成するのが望ましいと判明した。第９図はpUK33trp103A
pR-TcRの以下に述べる作成を示している。５μｇのpHGH
207-1（下記参照）をHpaＩおよびPvuIIで消化した。ベ
クター断片を単離しそして精製した。５μｇのpUK33trp
103をHpaＩおよびBamHIによつて消化し、６％ポリアク
リルアミドで電気泳動させ、そして836bpDNA断片を精製
した。別にpUK33trp103 5μｇをBamHIおよびPvuIIで消
化し、119bpDNA断片を単離かつ精製した。これら３種の
各DNA断片の等モル量を14℃にて一晩結合させ、これを
使用してE.coli294をトランスフオームさせた。数種の
アンピシリン耐性トランスフオーマントから得られるプ
ラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ分析はpUK33trp1
03ApRの適切な作成を証明し、かつtrpプロモータ／UK33
コード化DNAの配向における逆転を示した。
〜５μｇのpBR322DNAをEcoRIにて消化し、付着性末端を
クレノー(Klenow)Pol1で満たして平滑化した。PstＩ消
化の後、テトラサイクリン耐性をコードするDNAと複製
のオリジンとアンピシリン耐性遺伝子の一部とを有する
大型ベクター断片を単離しかつ精製した。〜５μｇのpU
K33trp103ApRをBamHIおよびPstＩによつて消化した。ア
ンピシリン耐性遺伝子の残部とtrpプロモータと殆どの
低分子量ウロキナーゼとをコードするDNA断片を精製し
た。ほぼ等モル量のこれら２種のDNA断片およびpUK33tr
p103ApRからの119bpBamHI-PvuIIDNA断片を14℃で一晩結
合させてpUK33trp103ApRTcRの作成を完結させた。この
プラスミドを、高分子量全長ウロキナーゼを発現するよ
う設計したプラスミドの作成に使用した（下記Ｎおよび
第10図参照）。
クレノー(Klenow)Pol1で満たして平滑化した。PstＩ消
化の後、テトラサイクリン耐性をコードするDNAと複製
のオリジンとアンピシリン耐性遺伝子の一部とを有する
大型ベクター断片を単離しかつ精製した。〜５μｇのpU
K33trp103ApRをBamHIおよびPstＩによつて消化した。ア
ンピシリン耐性遺伝子の残部とtrpプロモータと殆どの
低分子量ウロキナーゼとをコードするDNA断片を精製し
た。ほぼ等モル量のこれら２種のDNA断片およびpUK33tr
p103ApRからの119bpBamHI-PvuIIDNA断片を14℃で一晩結
合させてpUK33trp103ApRTcRの作成を完結させた。この
プラスミドを、高分子量全長ウロキナーゼを発現するよ
う設計したプラスミドの作成に使用した（下記Ｎおよび
第10図参照）。
N.ウロキナーゼの高分子量誘導体の発現 1.５４Ｋウロキナーゼの直接的発現 第１０図は全長ウロキナーゼの作成を示している。単一
trpプロモータを有するプラスミドpHGH207-1を、二重la
cプロモータとそれに続く単一のtrpプロモータとを有す
るpHGH207から二重lacプロモータを除去することによつ
て得た。これは次のように行なつた：trpプロモータ３
１０bpDNA断片をEcoＲＩ消化によりpFIFtrp69(20)から
得た。この断片を、予めEcoＲＩで開裂させたpHGH107(4
4)中へ挿入した。かくして、プラスミド（pHGH207）を
得、これはEcoＲＩ部位がフランクにされた二重lacプロ
モータとそれに続くtrpプロモータとを有する。このよ
うに得られたpHGH207をBamＨＩによつて消化し、これを
EcoＲＩによつて部分的に消化し、そして最も大きい断
片を単離した。この断片はしたがつて完全なtrpプロモ
ータを有する。pBR322から最も大きいEcoＲＩ−BamＨＩ
断片を単離した。両断片を結合させ、そして混合物を用
いてE. coli２９４をトランスフオームした。Tetr、Ampr
コロニーを単離し、それらの殆んどはpHGH207-1につき
示したような構造のプラスミドを有した。したがつて、
プラスミドpHGH207-1はプラスミドpHGH107(44)の誘導体
であり、次の性質を有する：(1)ヒト成長ホルモン遺伝
子がpHGH107によるようにlacプロモータの代わりにトリ
プトフアンプロモータによつてフランクされ、(2)この
プラスミドはE.coliで発現させた場合アンピシリン耐性
およびテトラサイクリン耐性を付与する（４７Ａ参
照）。
trpプロモータを有するプラスミドpHGH207-1を、二重la
cプロモータとそれに続く単一のtrpプロモータとを有す
るpHGH207から二重lacプロモータを除去することによつ
て得た。これは次のように行なつた：trpプロモータ３
１０bpDNA断片をEcoＲＩ消化によりpFIFtrp69(20)から
得た。この断片を、予めEcoＲＩで開裂させたpHGH107(4
4)中へ挿入した。かくして、プラスミド（pHGH207）を
得、これはEcoＲＩ部位がフランクにされた二重lacプロ
モータとそれに続くtrpプロモータとを有する。このよ
うに得られたpHGH207をBamＨＩによつて消化し、これを
EcoＲＩによつて部分的に消化し、そして最も大きい断
片を単離した。この断片はしたがつて完全なtrpプロモ
ータを有する。pBR322から最も大きいEcoＲＩ−BamＨＩ
断片を単離した。両断片を結合させ、そして混合物を用
いてE. coli２９４をトランスフオームした。Tetr、Ampr
コロニーを単離し、それらの殆んどはpHGH207-1につき
示したような構造のプラスミドを有した。したがつて、
プラスミドpHGH207-1はプラスミドpHGH107(44)の誘導体
であり、次の性質を有する：(1)ヒト成長ホルモン遺伝
子がpHGH107によるようにlacプロモータの代わりにトリ
プトフアンプロモータによつてフランクされ、(2)この
プラスミドはE.coliで発現させた場合アンピシリン耐性
およびテトラサイクリン耐性を付与する（４７Ａ参
照）。
２０μｇのpHGH207-1をEcoＲＩにより部分的にかつBglI
Iによつて完全に消化した。大ベクター断片の精製は、
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動と電気溶出とフエ
ノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱とによつて
達成した。
Iによつて完全に消化した。大ベクター断片の精製は、
５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動と電気溶出とフエ
ノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱とによつて
達成した。
１４μｇのｐＦ１をBglIIおよびTagＩによつて消化し、
２３６bpのDNA断片を単離し、そして６％ポリアクリル
アミドゲルによつて精製した。次の相補的DNA断片がホ
スホトリエステル法(47)によつて合成された： MetSerAsnGluLeuHis ５′AATTATGAGCAATGAATTACAT TACTCGTTACTTAATGTA GlnValPro CAAGTTCCAT GTTCAAGGTAGC ５′ 上記したように、アミノ酸配列Met Ser Asn Glu Leu Hi
s Gln Val Proは開始コドンすなわちATGと高分子量ウロ
キナーゼの８個のアミノ末端アミノ酸とをコードする。
５０ngの各合成DNA断片を燐酸化させ、そしてこれら断
片を混合し、６５℃にて１分間加熱し、そして室温にて
５分間放冷却した。燐酸化しかつ混合した合成DNA断片
の１０ngをEcoＲＩ（部分）、BglIIpHGH207-1ベクター
断片の〜200ngおよび２３６bpのBglIITagＩのDNA断片〜
５０ngと混合し、１４℃にて一晩結合させ、そしてE.co
li２９４にトランスフオームした。２４個のアンピシリ
ン耐性コロニーからの個々のプラスミドDNAをEcoＲＩお
よびBglIIによつて消化し、適切な構造を示す１個のプ
ラスミド（pInt 1）をDNA配列分析用に選択した。この
分析は、ATG開始コドンを介する正確なDNA配列と高分子
量ウロキナーゼのアミノ末端部分とを証明した。
２３６bpのDNA断片を単離し、そして６％ポリアクリル
アミドゲルによつて精製した。次の相補的DNA断片がホ
スホトリエステル法(47)によつて合成された： MetSerAsnGluLeuHis ５′AATTATGAGCAATGAATTACAT TACTCGTTACTTAATGTA GlnValPro CAAGTTCCAT GTTCAAGGTAGC ５′ 上記したように、アミノ酸配列Met Ser Asn Glu Leu Hi
s Gln Val Proは開始コドンすなわちATGと高分子量ウロ
キナーゼの８個のアミノ末端アミノ酸とをコードする。
５０ngの各合成DNA断片を燐酸化させ、そしてこれら断
片を混合し、６５℃にて１分間加熱し、そして室温にて
５分間放冷却した。燐酸化しかつ混合した合成DNA断片
の１０ngをEcoＲＩ（部分）、BglIIpHGH207-1ベクター
断片の〜200ngおよび２３６bpのBglIITagＩのDNA断片〜
５０ngと混合し、１４℃にて一晩結合させ、そしてE.co
li２９４にトランスフオームした。２４個のアンピシリ
ン耐性コロニーからの個々のプラスミドDNAをEcoＲＩお
よびBglIIによつて消化し、適切な構造を示す１個のプ
ラスミド（pInt 1）をDNA配列分析用に選択した。この
分析は、ATG開始コドンを介する正確なDNA配列と高分子
量ウロキナーゼのアミノ末端部分とを証明した。
４μｇのpNCV（上記Ｍ）をBglIIおよびClaＩによつて消
化し、大ベクター断片を単離し、そして５％ポリアクリ
ルアミドゲルにより精製した。３０μｇのpF1をPstＩお
よびBglIIによつて消化し、そして６％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動させた。４４bpのDNA断片を電気溶出
させ、フエノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノ
ール沈澱させた。４μｇのpA3DNAをPstＩおよびTagＩに
よつて消化し、１９２bpのDNA断片を６％ポリアクリル
アミドゲルから精製した。〜１００ngのBglIIClaＩベク
ターDNA断片と〜５０ngの１９２bp断片と〜５０ngの４
４bp断片とを混合し、１４℃にて一晩結合させ、次いで
E.coli２９４にトランスフオームさせた。数種のテトラ
サイクリン耐性トランスフオーマントからのプラスミド
DNAのBglIIClaＩ二重消化物は、pInt2と名付けるこの新
しいプラスミドの正確な作成を示した。E.coli GM48(ATCC No.39099、１９８２年４月９日寄託）
において増殖させたpUK33trp１０３ApRTcRの５μｇをBc
lＩおよびSalＩによつて消化し、1366bpのDNA断片を単
離かつ精製した。108bpのEcoＲＩ−BclI DNA断片を同じ
プラスミドから単離した。pUK33trp103ApRTcRからのEco
ＲＩ−SalＩ DNA断片と、同じくpUK33trp103ApRTcRか
らのEcoＲＩ−BclI DNA断片とのほぼ等モル量を１４℃
にて一晩結合させてpInt3を得た。
化し、大ベクター断片を単離し、そして５％ポリアクリ
ルアミドゲルにより精製した。３０μｇのpF1をPstＩお
よびBglIIによつて消化し、そして６％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動させた。４４bpのDNA断片を電気溶出
させ、フエノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノ
ール沈澱させた。４μｇのpA3DNAをPstＩおよびTagＩに
よつて消化し、１９２bpのDNA断片を６％ポリアクリル
アミドゲルから精製した。〜１００ngのBglIIClaＩベク
ターDNA断片と〜５０ngの１９２bp断片と〜５０ngの４
４bp断片とを混合し、１４℃にて一晩結合させ、次いで
E.coli２９４にトランスフオームさせた。数種のテトラ
サイクリン耐性トランスフオーマントからのプラスミド
DNAのBglIIClaＩ二重消化物は、pInt2と名付けるこの新
しいプラスミドの正確な作成を示した。E.coli GM48(ATCC No.39099、１９８２年４月９日寄託）
において増殖させたpUK33trp１０３ApRTcRの５μｇをBc
lＩおよびSalＩによつて消化し、1366bpのDNA断片を単
離かつ精製した。108bpのEcoＲＩ−BclI DNA断片を同じ
プラスミドから単離した。pUK33trp103ApRTcRからのEco
ＲＩ−SalＩ DNA断片と、同じくpUK33trp103ApRTcRか
らのEcoＲＩ−BclI DNA断片とのほぼ等モル量を１４℃
にて一晩結合させてpInt3を得た。
５μｇのpInt3 DNAをBglIIおよびSalＩで消化し、６％
ポリアクリルアミドによつて電気泳動させ、全長ウロキ
ナーゼのカルボキシ末端部分とテトラサイクリン耐性遺
伝子のアミノ末端部分とを有する１７０１bpの断片を精
製した。
ポリアクリルアミドによつて電気泳動させ、全長ウロキ
ナーゼのカルボキシ末端部分とテトラサイクリン耐性遺
伝子のアミノ末端部分とを有する１７０１bpの断片を精
製した。
〜５μｇのpInt1DNAをBglIIおよびSalＩによつて消化
し、６％ポリアクリルアミドによつて電気泳動させ、そ
してテトラサイクリン耐性遺伝子のカルボキシ末端部分
と複製のオリジンとアンピシリン耐性遺伝子とtrpプロ
モータと開始コドンATGと全長ウロキナーゼのアミノ末
端部分とを有する大ベクター断片を精製した。〜１００
ngのベクター断片と〜１００ng１７０１bp断片とを混合
し、１４℃にて一晩結合させ、そしてE.coli２９４にト
ランスフオームさせた。正確なPvuII制限エンドヌクレ
アーゼパターンを示すテトラサイクリン耐性およびアン
ピシリン耐性コロニーからのプラスミドが同定され、こ
れはtrpプロモータの下流の全長ウロキナーゼの作成を
確認した。これはプラスミドpUK５４trp 207-1である。
全長ウロキナーゼはE.coli２９４におけるこのプラスミ
ドの発現によつて生成される。
し、６％ポリアクリルアミドによつて電気泳動させ、そ
してテトラサイクリン耐性遺伝子のカルボキシ末端部分
と複製のオリジンとアンピシリン耐性遺伝子とtrpプロ
モータと開始コドンATGと全長ウロキナーゼのアミノ末
端部分とを有する大ベクター断片を精製した。〜１００
ngのベクター断片と〜１００ng１７０１bp断片とを混合
し、１４℃にて一晩結合させ、そしてE.coli２９４にト
ランスフオームさせた。正確なPvuII制限エンドヌクレ
アーゼパターンを示すテトラサイクリン耐性およびアン
ピシリン耐性コロニーからのプラスミドが同定され、こ
れはtrpプロモータの下流の全長ウロキナーゼの作成を
確認した。これはプラスミドpUK５４trp 207-1である。
全長ウロキナーゼはE.coli２９４におけるこのプラスミ
ドの発現によつて生成される。
2.E.coliにおけるpre-UK 54Kの直接的発現（第１１図） 次の方法を用いてpreUK 54の直接発現のためのプラスミ
ドを作成した。ホスホトリエステル法（47）により、ア
ミノ酸配列開始コドンATGとそれに続くウロキナーゼ予
備配列（プレシーケンス）Arg Ala Leuの最初の３個の
Ｎ−末端アミノ酸とをコードする２つの相補的DNA断片
を合成し、これを次に示す： EcoRIMetArgAlaLeu BglI ５′AATTATGCGTGCCCTGC TACGCACGGG5′Eco ＲＩおよびBglＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
は、予備配列のこの部分でフランクしている。５０ngの
各合成DNA断片を燐酸化した。燐酸化されたこれら断片
を混合し、６５℃にて１分間加熱し、そして室温まで冷
却させた。５μｇのpF1DNAをBglＩおよびBglIIによつて
消化し、３１０bpUK DNA断片を単離しかつ精製した。〜
５０ngの３１０bpUK DNA断片とpHGH２０７−１（上記
Ｎ）からの〜150ngの部分EcoＲＩ、BglIIベクターDNA断
片と１０ngの燐酸化されかつ混合された合成DNA断片と
を１４℃にて一晩結合し、そしてE.coli２９４にトラン
スフオームさせた。数種のアンピシリン耐性トランスフ
オーマントから単離された個々のプラスミドDNAを分析
して、高分子量ウロキナーゼの予備配列に関する適性な
作成とヌクレオチド配列とを確認した。
ドを作成した。ホスホトリエステル法（47）により、ア
ミノ酸配列開始コドンATGとそれに続くウロキナーゼ予
備配列（プレシーケンス）Arg Ala Leuの最初の３個の
Ｎ−末端アミノ酸とをコードする２つの相補的DNA断片
を合成し、これを次に示す： EcoRIMetArgAlaLeu BglI ５′AATTATGCGTGCCCTGC TACGCACGGG5′Eco ＲＩおよびBglＩ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位
は、予備配列のこの部分でフランクしている。５０ngの
各合成DNA断片を燐酸化した。燐酸化されたこれら断片
を混合し、６５℃にて１分間加熱し、そして室温まで冷
却させた。５μｇのpF1DNAをBglＩおよびBglIIによつて
消化し、３１０bpUK DNA断片を単離しかつ精製した。〜
５０ngの３１０bpUK DNA断片とpHGH２０７−１（上記
Ｎ）からの〜150ngの部分EcoＲＩ、BglIIベクターDNA断
片と１０ngの燐酸化されかつ混合された合成DNA断片と
を１４℃にて一晩結合し、そしてE.coli２９４にトラン
スフオームさせた。数種のアンピシリン耐性トランスフ
オーマントから単離された個々のプラスミドDNAを分析
して、高分子量ウロキナーゼの予備配列に関する適性な
作成とヌクレオチド配列とを確認した。
１種の正確なプラスミドをｐＩｎｔ４と名付けた。５μ
ｇのpInt4 DNAをBglIIおよびEcoＲＶによつて消化し、p
re-UK54のＮ−末端ヌクレオチドとtrpプロモータとアン
ピシリン耐性遺伝子と複製のオリジンとテトラサイクリ
ン耐性をコードするDNAの部分とを有するベクターDNA断
片を単離かつ精製した。５μｇのpUK５４trp207-1DNAを
BglIIおよびEcoＲＶによつて消化した。UK54の残部とテ
トラサイクリン耐性コード化DNAとをコードするBglIIEc
oRVDNA断片を単離し、精製しかつBglIIEcoＲＶベクター
DNA断片と結合させてプラスミドp-pre UK54trp207-1の
作成を完結した。
ｇのpInt4 DNAをBglIIおよびEcoＲＶによつて消化し、p
re-UK54のＮ−末端ヌクレオチドとtrpプロモータとアン
ピシリン耐性遺伝子と複製のオリジンとテトラサイクリ
ン耐性をコードするDNAの部分とを有するベクターDNA断
片を単離かつ精製した。５μｇのpUK５４trp207-1DNAを
BglIIおよびEcoＲＶによつて消化した。UK54の残部とテ
トラサイクリン耐性コード化DNAとをコードするBglIIEc
oRVDNA断片を単離し、精製しかつBglIIEcoＲＶベクター
DNA断片と結合させてプラスミドp-pre UK54trp207-1の
作成を完結した。
O.組織培養における（プレー）ウロキナーゼの直接的発
現 第１２図はプレウロキナーゼをコードする遺伝子を、許
容し得る猿細胞中で、プレウロキナーゼを複製および発
現しうる真核発現ベクターp342E（６２）中へ導入する
ことを示している。１０μｇのp342E DNAをXbaＩによつ
て消化し、〜１００塩基対をBal３１ヌクレアーゼによ
つて各方向に除去した（断片１）。ホスホトリエステル
法（４７）によつて合成されたHindIIIリンカー５′CTC
AAGCTTGAGの１００ngを燐酸化させ、６５℃まで１分間
加熱し、そして室温まで冷却させた。燐酸化されたリン
カーと断片１とを１４℃にて一晩結合させ、そしてE.co
li２９４にトランスフオームさせた。pEH3-Bal14と名付
けた１種のトランスフオーマントの制限エンドヌクレア
ーゼ分析は、HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位の導
入とXbaI部位の喪失とを示した。５μｇのpEH3-Bal14DN
AをHindIIIおよびHpaＩによつて消化した。クレノーPol
Iを用いて付着性末端を平滑末端部まで延長させた。DNA
をＢＡＰによつて処理し、ＳＶ−４０早期プロモータと
アンピシリン耐性遺伝子と複製のオリジンとを含有する
ベクター断片を単離しかつ精製した（断片２）。５μｇ
のｐ preUK54trp207-1をClaＩおよびXbaＩによつて消
化した。付着性末端をクレノーPolIによつて延長させ、
preUK54をコードするDNA断片を単離しかつ精製した（断
片３）。〜１００ngの断片２と〜１００ngの断片３とを
１４℃にて一晩結合させ、そしてE.coli２９４にトラン
スフオームさせた。１種のトランスフオーマントからの
pEH3-Bal14preUK ５４と名付けたプラスミドDNAの制限
エンドヌクレアーゼ分析は正確な作成を証明した。次い
で、pEH3-Bal14preUK54DNAを使用して、許容され得る猿
細胞（６２）にトランスフエクトしpreＵＫ５４を発現
させると共に全長高分子量ウロキナーゼを分泌させた。
現 第１２図はプレウロキナーゼをコードする遺伝子を、許
容し得る猿細胞中で、プレウロキナーゼを複製および発
現しうる真核発現ベクターp342E（６２）中へ導入する
ことを示している。１０μｇのp342E DNAをXbaＩによつ
て消化し、〜１００塩基対をBal３１ヌクレアーゼによ
つて各方向に除去した（断片１）。ホスホトリエステル
法（４７）によつて合成されたHindIIIリンカー５′CTC
AAGCTTGAGの１００ngを燐酸化させ、６５℃まで１分間
加熱し、そして室温まで冷却させた。燐酸化されたリン
カーと断片１とを１４℃にて一晩結合させ、そしてE.co
li２９４にトランスフオームさせた。pEH3-Bal14と名付
けた１種のトランスフオーマントの制限エンドヌクレア
ーゼ分析は、HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位の導
入とXbaI部位の喪失とを示した。５μｇのpEH3-Bal14DN
AをHindIIIおよびHpaＩによつて消化した。クレノーPol
Iを用いて付着性末端を平滑末端部まで延長させた。DNA
をＢＡＰによつて処理し、ＳＶ−４０早期プロモータと
アンピシリン耐性遺伝子と複製のオリジンとを含有する
ベクター断片を単離しかつ精製した（断片２）。５μｇ
のｐ preUK54trp207-1をClaＩおよびXbaＩによつて消
化した。付着性末端をクレノーPolIによつて延長させ、
preUK54をコードするDNA断片を単離しかつ精製した（断
片３）。〜１００ngの断片２と〜１００ngの断片３とを
１４℃にて一晩結合させ、そしてE.coli２９４にトラン
スフオームさせた。１種のトランスフオーマントからの
pEH3-Bal14preUK ５４と名付けたプラスミドDNAの制限
エンドヌクレアーゼ分析は正確な作成を証明した。次い
で、pEH3-Bal14preUK54DNAを使用して、許容され得る猿
細胞（６２）にトランスフエクトしpreＵＫ５４を発現
させると共に全長高分子量ウロキナーゼを分泌させた。
Ｐ．単離および特性化 ウロキナーゼ含有残部をE.coliから単離した。この残部
を、５０mMのトリス（pH8.0）を含有する５Ｍのグアニ
ジン塩酸塩中に溶解させた。この溶液を１Ｍのグアニジ
ンHClと５０mMのトリスHCl(pH9)まで１ng／ｍの蛋白
質濃度になるように希釈した。次いで、この溶液を２mM
の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と0.2mMの酸化型グル
タチオン（GSSG）とに入れ、そして室温にて一晩インキ
ユベートした。次いで、再折重ね蛋白質（refolded pro
tein）を含有する得られた溶液を水性媒体中で透析し
た。得られた溶液は１００PU／mgの活性を示すウロキナ
ーゼを含有した。
を、５０mMのトリス（pH8.0）を含有する５Ｍのグアニ
ジン塩酸塩中に溶解させた。この溶液を１Ｍのグアニジ
ンHClと５０mMのトリスHCl(pH9)まで１ng／ｍの蛋白
質濃度になるように希釈した。次いで、この溶液を２mM
の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）と0.2mMの酸化型グル
タチオン（GSSG）とに入れ、そして室温にて一晩インキ
ユベートした。次いで、再折重ね蛋白質（refolded pro
tein）を含有する得られた溶液を水性媒体中で透析し
た。得られた溶液は１００PU／mgの活性を示すウロキナ
ーゼを含有した。
慣用技術にしたがつて精製した際、蛋白質は低分子量の
生物活性物質の両連鎖に関する予想されたＮ−末端配列
を示すことが特性化された。さらに、Ｃ−末端分析は両
連鎖につき適性な配列を示した。蛋白質は〜30000ダル
トンの分子量にて移動する。これは〜170000PU／mg（92
25,000IU／mg）の比活性を有し、１mg／ｍが1.3のＯ
Ｄ280を有すると仮定する。
生物活性物質の両連鎖に関する予想されたＮ−末端配列
を示すことが特性化された。さらに、Ｃ−末端分析は両
連鎖につき適性な配列を示した。蛋白質は〜30000ダル
トンの分子量にて移動する。これは〜170000PU／mg（92
25,000IU／mg）の比活性を有し、１mg／ｍが1.3のＯ
Ｄ280を有すると仮定する。
Ｑ．ウロキナーゼの発現の検出分析 1.発色基質 ａ理論 この分析は、発色団からのトリペプチドの蛋白質分解開
裂に基づいている。開裂の割合は、特異性および試験さ
れるプロテアーゼの濃度に直接関係する。ウロキナーゼ
はクロモゲン基質（発色基質、chromogenic substrate)
S2444(Kabi Group Inc.Greenwich CTから購入）を開裂
する。発色団の生成をモニターすることにより、試料中
に存在する機能的ウロキナーゼの量を決定することがで
きる。ウロキナーゼは不活性前駆体型として合成され、
活性化は残基２６（リジン）と残基２７（イソロイシ
ン）（プロテアーゼクローンに基づいて番号を付する、
第３Ａ図）との間の開裂によつて生ずる。幾分かのウロ
キナーゼの生成が自己活性化されたことが判明しおよび
／またはE.coliプロテアーゼによつて活性化された。ウ
ロキナーゼの活性化を確保してこのクロモゲン技術によ
り検出を可能にするためには、少量のトリプシンによる
この試料の処理が必要である。トリプシンは、ウロキナ
ーゼ活性化に必要とされるリジン−イソロイシン結合を
開裂させうるプロテアーゼである。しかしながら、また
トリプシンはクロモゲン基質をも開裂させ、したがつて
分析から除去せねばならない。大豆トリプシンインヒビ
ター（ＳＴＩ）は、ウロキナーゼに作用を示さずにトリ
プシンを不活性化する蛋白質である。したがつて、この
分析はウロキナーゼのトリプシン活性化とトリプシンの
ＳＴＩ阻害と最後にクロモゲン基質の添加とからなつ
て、存在する機能的ウロキナーゼを測定する。
裂に基づいている。開裂の割合は、特異性および試験さ
れるプロテアーゼの濃度に直接関係する。ウロキナーゼ
はクロモゲン基質（発色基質、chromogenic substrate)
S2444(Kabi Group Inc.Greenwich CTから購入）を開裂
する。発色団の生成をモニターすることにより、試料中
に存在する機能的ウロキナーゼの量を決定することがで
きる。ウロキナーゼは不活性前駆体型として合成され、
活性化は残基２６（リジン）と残基２７（イソロイシ
ン）（プロテアーゼクローンに基づいて番号を付する、
第３Ａ図）との間の開裂によつて生ずる。幾分かのウロ
キナーゼの生成が自己活性化されたことが判明しおよび
／またはE.coliプロテアーゼによつて活性化された。ウ
ロキナーゼの活性化を確保してこのクロモゲン技術によ
り検出を可能にするためには、少量のトリプシンによる
この試料の処理が必要である。トリプシンは、ウロキナ
ーゼ活性化に必要とされるリジン−イソロイシン結合を
開裂させうるプロテアーゼである。しかしながら、また
トリプシンはクロモゲン基質をも開裂させ、したがつて
分析から除去せねばならない。大豆トリプシンインヒビ
ター（ＳＴＩ）は、ウロキナーゼに作用を示さずにトリ
プシンを不活性化する蛋白質である。したがつて、この
分析はウロキナーゼのトリプシン活性化とトリプシンの
ＳＴＩ阻害と最後にクロモゲン基質の添加とからなつ
て、存在する機能的ウロキナーゼを測定する。
ｂ手順 この分析は次のように行なわれる：0.2mLの0.1Ｍトリス
（pH8.0）と５０μＬの分析すべき試料と５μＬのトリ
プシン（0.1Ｍのトリス（pH8.0）と0.25ＭのCaCl2にお
ける0.1mg／mL）とを試験管に加え、この試料を３７℃
で１０分間インキユベート（培養）した。トリプシンを
２μＬの１０mg／mLSTI(0.1ＭのトリスpH8.0中）の添加
によつて失活させた。５０μＬのS2444の１mM溶液（水
中）を加えかつ反応物を３７℃にて１０分間インキユベ
ートすることにより、ウロキナーゼ活性を測定した。酢
酸（５０μＬ）を加えて反応を停止させ、溶液を遠心分
離して沈澱物を除去し、そして４０５nmにおける吸光度
を測定した。ウロキナーゼの実際量は、既知量のウロキ
ナーゼ（Calbiochem、San Diego CAから得られる）の標
準溶液の希釈物につき分析を行なつて得られる測定値を
試料の測定値と比較して計算することができる。
（pH8.0）と５０μＬの分析すべき試料と５μＬのトリ
プシン（0.1Ｍのトリス（pH8.0）と0.25ＭのCaCl2にお
ける0.1mg／mL）とを試験管に加え、この試料を３７℃
で１０分間インキユベート（培養）した。トリプシンを
２μＬの１０mg／mLSTI(0.1ＭのトリスpH8.0中）の添加
によつて失活させた。５０μＬのS2444の１mM溶液（水
中）を加えかつ反応物を３７℃にて１０分間インキユベ
ートすることにより、ウロキナーゼ活性を測定した。酢
酸（５０μＬ）を加えて反応を停止させ、溶液を遠心分
離して沈澱物を除去し、そして４０５nmにおける吸光度
を測定した。ウロキナーゼの実際量は、既知量のウロキ
ナーゼ（Calbiochem、San Diego CAから得られる）の標
準溶液の希釈物につき分析を行なつて得られる測定値を
試料の測定値と比較して計算することができる。
2.プラスミン形成の直接的分析 ａ理論 ウロキナーゼに対するさらに一層鋭敏な分析は、プラス
ミノーゲンからプラスミンへのウロキナーゼが触媒変換
をモニターすることにより得られる。プラスミンは、上
記１と同じ原理で基づいてクロモゲン基質分析を行なう
酵素である。この分析の基礎はウロキナーゼ含有溶液を
プラスミノーゲンの溶液と共にインキユベートした後に
形成されるプラスミンの量を測定することに基づいてい
る。ウロキナーゼの量が多い程、生成されるプラスミン
の量が多くなる。
ミノーゲンからプラスミンへのウロキナーゼが触媒変換
をモニターすることにより得られる。プラスミンは、上
記１と同じ原理で基づいてクロモゲン基質分析を行なう
酵素である。この分析の基礎はウロキナーゼ含有溶液を
プラスミノーゲンの溶液と共にインキユベートした後に
形成されるプラスミンの量を測定することに基づいてい
る。ウロキナーゼの量が多い程、生成されるプラスミン
の量が多くなる。
ｂ手順 試料の１部を0.7mg／ｍのプラスミノーゲン（0.012Ｍ
のNaClを含有する0.5ＭのトリスHCl、pH7.4)0.10ｍと
混合し、そして容量を0.15ｍに調整する。この混合物
を３７℃にて（上記したような）種々の時間にわたつて
インキユベートし、0.35ｍのS2251（上記緩衝液中の
1.0mM溶液）を加え、そして反応を３７℃にて５分間続
ける。酢酸（２５μＬ）を加えて反応を停止させ、４０
５nmにおける吸光度を測定する。活性の定量は、標準ウ
ロキナーゼ溶液の希釈物と比較して得られる。
のNaClを含有する0.5ＭのトリスHCl、pH7.4)0.10ｍと
混合し、そして容量を0.15ｍに調整する。この混合物
を３７℃にて（上記したような）種々の時間にわたつて
インキユベートし、0.35ｍのS2251（上記緩衝液中の
1.0mM溶液）を加え、そして反応を３７℃にて５分間続
ける。酢酸（２５μＬ）を加えて反応を停止させ、４０
５nmにおける吸光度を測定する。活性の定量は、標準ウ
ロキナーゼ溶液の希釈物と比較して得られる。
3.プラスミン生成の間接的分析 ａ理論 ウロキナーゼ活性に関する鋭敏な分析が開発されている
（６１）。この分析は、繊維素とプラスミノーゲンとを
含有する寒天プレートにおいて繊維素のプラスミン消化
の程度を測定することによるプラスミン生成の定量に基
づいている。プラスミンは、繊維素プレートにおいて透
明な溶菌領域を生成する。この溶菌領域の面積を、試料
におけるウロキナーゼの量と相関させることができる。
（６１）。この分析は、繊維素とプラスミノーゲンとを
含有する寒天プレートにおいて繊維素のプラスミン消化
の程度を測定することによるプラスミン生成の定量に基
づいている。プラスミンは、繊維素プレートにおいて透
明な溶菌領域を生成する。この溶菌領域の面積を、試料
におけるウロキナーゼの量と相関させることができる。
ｂ手順 Granelli-PipernoおよびReich（６１）の方法にしたが
い、プレートを３７℃にて１〜３時間インキユベートし
そして溶菌領域を測定した。定量は、標準ウロキナーゼ
溶液の希釈物につき分析を行なつて得られた。
い、プレートを３７℃にて１〜３時間インキユベートし
そして溶菌領域を測定した。定量は、標準ウロキナーゼ
溶液の希釈物につき分析を行なつて得られた。
Ｒ．ウロキナーゼ活性の検出 1.細菌増殖とウロキナーゼ試料の調製E.coli （Ｗ3110）の菌株を、ウロキナーゼ融合蛋白質含
有のプラスミド（pUK33trpLEs）を用いてトランスフオ
ームさせた。この発現ベヒクル（短trp LE融合体）は上
記した通りである。菌体を最小培地で５５０nmにて1.2
のO.Dとなるまで一晩増殖させた。２００ｍの培地を
追加した。インドールアクリル酸、すなわちトリプトフ
アンオペロン制御遺伝子の発現を促進すると思われる化
合物を１０μｇ／mLの濃度まで加えた。菌体を２時間イ
ンキユベートし、そして採取した。４００mLの培地から
得られた菌体を水中に懸濁させ、グアニジンを７Ｍ（最
終容量４０mL）の濃度まで加えた。この溶液を室温で９
０分間インキユベートした。不溶物質を遠心分離により
除去した。上澄液を、0.1ＭのNaClを含有する0.01Ｍの
トリスHCl(pH7.5）に対し４時間透析した。不溶物質を
遠心分離により除去し、試料を0.01ＭのトリスHCl(pH7.
5）に対して2.5時間透析した。
有のプラスミド（pUK33trpLEs）を用いてトランスフオ
ームさせた。この発現ベヒクル（短trp LE融合体）は上
記した通りである。菌体を最小培地で５５０nmにて1.2
のO.Dとなるまで一晩増殖させた。２００ｍの培地を
追加した。インドールアクリル酸、すなわちトリプトフ
アンオペロン制御遺伝子の発現を促進すると思われる化
合物を１０μｇ／mLの濃度まで加えた。菌体を２時間イ
ンキユベートし、そして採取した。４００mLの培地から
得られた菌体を水中に懸濁させ、グアニジンを７Ｍ（最
終容量４０mL）の濃度まで加えた。この溶液を室温で９
０分間インキユベートした。不溶物質を遠心分離により
除去した。上澄液を、0.1ＭのNaClを含有する0.01Ｍの
トリスHCl(pH7.5）に対し４時間透析した。不溶物質を
遠心分離により除去し、試料を0.01ＭのトリスHCl(pH7.
5）に対して2.5時間透析した。
この試料を0.01ＭのトリスHCl(pH7.5）で予め平衡化さ
せた3.9×９cmのＤＥ−５２カラムに施こし、このカラ
ムを同じ緩衝液で洗浄し、かつ0.15ＭのNaClを含有する
0.01ＭのトリスHCl(pH7.5）によつて溶出させた。活性
のピークをプールし、そしてこれを後の全ての試験に使
用した。
せた3.9×９cmのＤＥ−５２カラムに施こし、このカラ
ムを同じ緩衝液で洗浄し、かつ0.15ＭのNaClを含有する
0.01ＭのトリスHCl(pH7.5）によつて溶出させた。活性
のピークをプールし、そしてこれを後の全ての試験に使
用した。
2.活性の検出 第１３図は、上記Ｑ・２・に記載したと同様な条件下で
分析した場合の分画E.coli抽出物によるプラスミノーゲ
ンの直接的活性化の結果を示している。プラスミノーゲ
ンの存在に依存する活性が生成される。したがつて、モ
ニターされる活性はプラスミノーゲン依存性の活性であ
る。また測定される活性は時間と共に増加し、これはプ
ラスミンの時間依存性の触媒生成を示している。これら
の性質はウロキナーゼの性質、すなわちプラスミノーゲ
ンの触媒活性化と一致する。ウロキナーゼプラスミドを
含有しないE.coliについて行なつた同様な抽出条件は、
これらの条件下でプラスミノーゲンを活性化しない。
分析した場合の分画E.coli抽出物によるプラスミノーゲ
ンの直接的活性化の結果を示している。プラスミノーゲ
ンの存在に依存する活性が生成される。したがつて、モ
ニターされる活性はプラスミノーゲン依存性の活性であ
る。また測定される活性は時間と共に増加し、これはプ
ラスミンの時間依存性の触媒生成を示している。これら
の性質はウロキナーゼの性質、すなわちプラスミノーゲ
ンの触媒活性化と一致する。ウロキナーゼプラスミドを
含有しないE.coliについて行なつた同様な抽出条件は、
これらの条件下でプラスミノーゲンを活性化しない。
さらに、抽出物を上記したような分析で試験してウロキ
ナーゼ活性を検出すると共に定量した。第１４図は、上
記Ｑ・２・に記載した分析において１０分間の活性化で
得られる細菌性のフラクシヨンの種々な量の効果を示し
ている。取られた数値を、標準ウロキナーゼ溶液（プラ
フ・ユニテージ測定、Plough Unitage determination）
を用いて得られる数値と比較する。プラスミノーゲン活
性化の程度は、加えたクローン化ウロキナーゼの量に正
比例する。精製した天然ウロキナーゼに対して生じた抗
体は、天然ウロキナーゼの活性を低下させることが知ら
れている。時刻０の時点でこの分析に加えたこれら抗体
の効果をも第１４図に示す。E.coli由来の物質の顕著な
阻害が観察される。これは、E.coli由来の物質において
観察された活性が天然ウロキナーゼと同じ抗原部位を有
し、したがつて実際にウロキナーゼが微生物的に合成さ
れることを証明している。
ナーゼ活性を検出すると共に定量した。第１４図は、上
記Ｑ・２・に記載した分析において１０分間の活性化で
得られる細菌性のフラクシヨンの種々な量の効果を示し
ている。取られた数値を、標準ウロキナーゼ溶液（プラ
フ・ユニテージ測定、Plough Unitage determination）
を用いて得られる数値と比較する。プラスミノーゲン活
性化の程度は、加えたクローン化ウロキナーゼの量に正
比例する。精製した天然ウロキナーゼに対して生じた抗
体は、天然ウロキナーゼの活性を低下させることが知ら
れている。時刻０の時点でこの分析に加えたこれら抗体
の効果をも第１４図に示す。E.coli由来の物質の顕著な
阻害が観察される。これは、E.coli由来の物質において
観察された活性が天然ウロキナーゼと同じ抗原部位を有
し、したがつて実際にウロキナーゼが微生物的に合成さ
れることを証明している。
活性の検出および抗体の阻害に対する同様な結果が、繊
維素プレート分析を用いて観察される（上記Ｑ・３・に
記載）。これらの結果を下記第Ｉ表に要約する。
維素プレート分析を用いて観察される（上記Ｑ・３・に
記載）。これらの結果を下記第Ｉ表に要約する。
標準ウロキナーゼ活性は、この蛋白質に対して生ずるウ
ロキナーゼ抗体の添加により９６％もしくはそれ以上阻
害された。E.coli由来の抽出物の分析は、顕著なウロキ
ナーゼ活性を示した。この活性は、天然ウロキナーゼに
対する抗体を分析へ加えた際、殆んど完全に阻害され
た。
ロキナーゼ抗体の添加により９６％もしくはそれ以上阻
害された。E.coli由来の抽出物の分析は、顕著なウロキ
ナーゼ活性を示した。この活性は、天然ウロキナーゼに
対する抗体を分析へ加えた際、殆んど完全に阻害され
た。
さらに、第三の分析（クロモゲン基質分析）も、E.coli
抽出物においてウロキナーゼ様活性を検出した。これは
分析の最も低い感度であるため、抗体阻害試験は阻害を
観察するのに必要とされる多量の抗体のため行なうこと
ができなかつた。
抽出物においてウロキナーゼ様活性を検出した。これは
分析の最も低い感度であるため、抗体阻害試験は阻害を
観察するのに必要とされる多量の抗体のため行なうこと
ができなかつた。
Calbiochemから購入した標準ウロキナーゼを用いて、上
記３種の分析値を定量化した。得られた数値（プラウ・
単位／mL）は、全て同じ程度の大きさであつた：繊維素
プレートにつき６００；プラスミノーゲン活性化につき
１００；およびクロモゲン基質（S2444）につき３５
０。生じた変化は、疑いもなく試験時における物質の比
較的不純な性質によるものである。
記３種の分析値を定量化した。得られた数値（プラウ・
単位／mL）は、全て同じ程度の大きさであつた：繊維素
プレートにつき６００；プラスミノーゲン活性化につき
１００；およびクロモゲン基質（S2444）につき３５
０。生じた変化は、疑いもなく試験時における物質の比
較的不純な性質によるものである。
薬剤組成物 本発明の化合物は公知方法にしたがつて配合して薬剤上
有用な組成物を調製することができ、このヒトウロキナ
ーゼ生産物を薬剤上許容しうるキヤリヤベヒクルと混合
する。適するベヒクルおよびその配合はたとえばE.W.Ma
rtinによるRemington′s Pharmaceutical Sciencesに記
載されており、これを参考のためここに引用する。この
種の組成物は有効量の本発明の蛋白質を、宿主に有効投
与するのに適する薬剤上許容される組成物を調製するた
めの適する量のベヒクルと一緒に含有する。
有用な組成物を調製することができ、このヒトウロキナ
ーゼ生産物を薬剤上許容しうるキヤリヤベヒクルと混合
する。適するベヒクルおよびその配合はたとえばE.W.Ma
rtinによるRemington′s Pharmaceutical Sciencesに記
載されており、これを参考のためここに引用する。この
種の組成物は有効量の本発明の蛋白質を、宿主に有効投
与するのに適する薬剤上許容される組成物を調製するた
めの適する量のベヒクルと一緒に含有する。
Ａ非経口投与 本発明のヒトウロキナーゼは血栓閉塞症またはその状態
にかかつている患者に非経口投与することができる。投
与量および投与割合は、他の心臓血管の血栓崩壊剤の臨
床的投与に現在使用されているものと同等であり、たと
えば肺動脈塞栓症にかかつている患者の場合体重１kg当
り約4400ＩＵを静脈初期投与し、次いで１２時間にわた
り約４４００ＩＵ／kg／hr.の割合で連続的に静脈潅流
する。
にかかつている患者に非経口投与することができる。投
与量および投与割合は、他の心臓血管の血栓崩壊剤の臨
床的投与に現在使用されているものと同等であり、たと
えば肺動脈塞栓症にかかつている患者の場合体重１kg当
り約4400ＩＵを静脈初期投与し、次いで１２時間にわた
り約４４００ＩＵ／kg／hr.の割合で連続的に静脈潅流
する。
ここで使用しうる非経口型のほぼ均質なヒトウロキナー
ゼに対する適当な投与形態の１例として、２５００００
ＩＵウロキナーゼ活性を有する試料と２５mgのマンニト
ールと４５mgの塩化ナトリウムとを注射用の５ｍの無
菌水で再編成し、適量の0.9％塩化ナトリウム注射液も
しくは静脈投与用の５％デキストロース注射液と混合す
ることができる。
ゼに対する適当な投与形態の１例として、２５００００
ＩＵウロキナーゼ活性を有する試料と２５mgのマンニト
ールと４５mgの塩化ナトリウムとを注射用の５ｍの無
菌水で再編成し、適量の0.9％塩化ナトリウム注射液も
しくは静脈投与用の５％デキストロース注射液と混合す
ることができる。
本発明のヒトウロキナーゼ蛋白質は、決定されたDNA遺
伝子と推定アミノ酸配列とにより定義されている。対応
する天然の相同変異（allelicvariations）物も存在
し、かつ個々に生ずることが理解されよう。これらの変
異は全体的配列におけるアミノ酸の相違によつて、或い
は前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆転
もしくは付加によつて示すことができる。さらに、たと
えば基礎的DNAの部位に関連する世代交代による単一も
しくは多重のアミノ酸置換、欠失、付加もしくは置換に
よつて種々改変される各種のヒトウロキナーゼ誘導体を
調製するため、組換DNA技術を使用する可能性が存在す
る。ヒトウロキナーゼの誘導体をもたらす、これら全て
の改変および対応する変異は、本質的かつ特徴的なヒト
ウロキナーゼ活性が種類において影響を受けない限り、
本発明の範囲内に包含される。
伝子と推定アミノ酸配列とにより定義されている。対応
する天然の相同変異（allelicvariations）物も存在
し、かつ個々に生ずることが理解されよう。これらの変
異は全体的配列におけるアミノ酸の相違によつて、或い
は前記配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆転
もしくは付加によつて示すことができる。さらに、たと
えば基礎的DNAの部位に関連する世代交代による単一も
しくは多重のアミノ酸置換、欠失、付加もしくは置換に
よつて種々改変される各種のヒトウロキナーゼ誘導体を
調製するため、組換DNA技術を使用する可能性が存在す
る。ヒトウロキナーゼの誘導体をもたらす、これら全て
の改変および対応する変異は、本質的かつ特徴的なヒト
ウロキナーゼ活性が種類において影響を受けない限り、
本発明の範囲内に包含される。
特定の好適具体例につき説明したが、本発明はこれらの
みに限定されないことが了解されるであろう。
みに限定されないことが了解されるであろう。
文献 1.米国特許No.3355361 2.米国特許No.3926727 3.米国特許No.4029767 4.米国特許No.4258030 5.米国特許No.4271150 6.欧州特許出願公開No.0037687 7.米国特許No.3555000 8.Wallen,P.,Proc.Serono Symp.9,91(1977) 9.Thorsen,S.,et al.,Thrombos. Diathes.haemorrh.28 ,65(1972) 9A.Barnett and Baron,Proc.Soc. Exptl.Biol.102 ,308(1959) 9B.Banlow and Lazer,Thrombosis Res.1,201(1972) 10.Husain,S.S.,et al.,Thrombasis al Hemostasis46,1
1(1981) 10A.Wun et al.,J.Biol.Chem.256,3276(1982) 11.Ratzkin et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)78,3313
(1981) 11A.Bollen,A.et al．，Biochem.Biophys. Res.Commun.
103,391(1981) 12.英国特許出願公開No.2007676A. 13.Wetzel,American Scientist 68,664(1980) 14.Microbiology,2d Ed.,Harper and Row Publication
s,Inc.,Hagerstown,Maryland(1973),esp.pp.1122 et se
q 15.Scientific American 245,66 et seq(1981) 16.英国特許出願公開No.2055382A 17.西独特許出願公開2644432 18.Chang et al.,Nature 275,617(1978) 19.Itakura et al.,Science 198,1056(1977) 20.Goeddel et al.,Nucleic Acids Research 8,4057(19
80) 21.欧州特許出願公開No.0036776 22.Siebenlist et al.,Cell 20,269(1980) 23.Stinchcomb et al.,Nature 282,39(1979) 24.Kingsman et al.,Gene 7,141(1979) 25.Tschumper et al.,Gene 10,157(1980)
26.M
ortimer et al.,Microbiological Rcviews 44,519(198
) 27.Miozzari et al.,Journal of Bacteriology 134,48
(1978) 28.Jones,Genetics 85,23(1977) 29.Hitzeman,et al.,J.Biol.Chem. 255,12073(1980) 30.Holland et al.,Biochemistry 17,4900(1978) 31.Tissue Culture,Academic Press, Kruse and Patter
son eds,(1973) 32.Gluzman,Cell 23,175(1981) 33.Lusky et al.,Nature 293,79(1981) 34.Gluzman et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.44,293(1980) 35.Fiers et al.,Nature 273,113(1978) 36.Reddy et al.,Science 200 494(1978) 37.Bolivar et al.,Gene 2,95(1977) 38.Vetterlein et al.,J.Biol.Chem.255,3665(1980) 39.Eagle,H.,Science 130,432(1959) 40.Lynch et al,Virology 98,251(1979) 41.Aviv et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,1408(197
2) 42.Lehrach et al.,Biochemistry 16,4743(1977) 43.Jackson et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.(USA) 74,559
8(1977) 44.Goeddel et al.,Nature 281,544(1979) 45.Wickens et al.,J.Biol.Chem. 253,2483(1978) 46.Chang et al.,Nature 275,617(1978) 47.Crea et al.,Proc.Natl,Acad.Sci.(USA)75,5765(197
8) 47A.欧州特許出願公開No.0036776． 48.Miller,Experiments in Molecular Genetics,p.431-
3,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New Y
ork(1972) 49.Grunstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,39
61(1975) 50.Wallace et al.,Nucleic Acids Research9,879(198
1) 51.Birnboim et al.,Nucleic Acids Research7,1513(19
79) 52.Smith,Methods Enzymol.65,560(1980) 53.Messing et al.,Nucleic Acids.Res.9,309(1981) 54.Taylor et al.,Biochem.Biophys.Acta 442,324(197
6) 55.Fritsch et al.,Cell 19,959(1980) 56.Goeddel et al.,Nature 290,20(1981) 57.Blobel et al.,Biomembranes,Vol.2,ed.Manson,pp.1
93,Plenum 58.Goeddel et al.,Nature 287,411(1980) 59.Itakura et al.,Science 198,1056(1977) 60.Bingham et al.,Nucleic Acids Research 5,3457(19
78) 61.Granelli-Piperino and Reich,J.Exp.Med.148,223 62.Crowley et al.,Mol.and Cellular Biol.3,44(1983)
1(1981) 10A.Wun et al.,J.Biol.Chem.256,3276(1982) 11.Ratzkin et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)78,3313
(1981) 11A.Bollen,A.et al．，Biochem.Biophys. Res.Commun.
103,391(1981) 12.英国特許出願公開No.2007676A. 13.Wetzel,American Scientist 68,664(1980) 14.Microbiology,2d Ed.,Harper and Row Publication
s,Inc.,Hagerstown,Maryland(1973),esp.pp.1122 et se
q 15.Scientific American 245,66 et seq(1981) 16.英国特許出願公開No.2055382A 17.西独特許出願公開2644432 18.Chang et al.,Nature 275,617(1978) 19.Itakura et al.,Science 198,1056(1977) 20.Goeddel et al.,Nucleic Acids Research 8,4057(19
80) 21.欧州特許出願公開No.0036776 22.Siebenlist et al.,Cell 20,269(1980) 23.Stinchcomb et al.,Nature 282,39(1979) 24.Kingsman et al.,Gene 7,141(1979) 25.Tschumper et al.,Gene 10,157(1980)
26.M
ortimer et al.,Microbiological Rcviews 44,519(198
) 27.Miozzari et al.,Journal of Bacteriology 134,48
(1978) 28.Jones,Genetics 85,23(1977) 29.Hitzeman,et al.,J.Biol.Chem. 255,12073(1980) 30.Holland et al.,Biochemistry 17,4900(1978) 31.Tissue Culture,Academic Press, Kruse and Patter
son eds,(1973) 32.Gluzman,Cell 23,175(1981) 33.Lusky et al.,Nature 293,79(1981) 34.Gluzman et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Bi
ol.44,293(1980) 35.Fiers et al.,Nature 273,113(1978) 36.Reddy et al.,Science 200 494(1978) 37.Bolivar et al.,Gene 2,95(1977) 38.Vetterlein et al.,J.Biol.Chem.255,3665(1980) 39.Eagle,H.,Science 130,432(1959) 40.Lynch et al,Virology 98,251(1979) 41.Aviv et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,1408(197
2) 42.Lehrach et al.,Biochemistry 16,4743(1977) 43.Jackson et al.,Proc.Natl.Acad. Sci.(USA) 74,559
8(1977) 44.Goeddel et al.,Nature 281,544(1979) 45.Wickens et al.,J.Biol.Chem. 253,2483(1978) 46.Chang et al.,Nature 275,617(1978) 47.Crea et al.,Proc.Natl,Acad.Sci.(USA)75,5765(197
8) 47A.欧州特許出願公開No.0036776． 48.Miller,Experiments in Molecular Genetics,p.431-
3,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New Y
ork(1972) 49.Grunstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72,39
61(1975) 50.Wallace et al.,Nucleic Acids Research9,879(198
1) 51.Birnboim et al.,Nucleic Acids Research7,1513(19
79) 52.Smith,Methods Enzymol.65,560(1980) 53.Messing et al.,Nucleic Acids.Res.9,309(1981) 54.Taylor et al.,Biochem.Biophys.Acta 442,324(197
6) 55.Fritsch et al.,Cell 19,959(1980) 56.Goeddel et al.,Nature 290,20(1981) 57.Blobel et al.,Biomembranes,Vol.2,ed.Manson,pp.1
93,Plenum 58.Goeddel et al.,Nature 287,411(1980) 59.Itakura et al.,Science 198,1056(1977) 60.Bingham et al.,Nucleic Acids Research 5,3457(19
78) 61.Granelli-Piperino and Reich,J.Exp.Med.148,223 62.Crowley et al.,Mol.and Cellular Biol.3,44(1983)
第１図はウロキナーゼポリペプチドの略図である。低分
子量ウロキナーゼはアミノ酸１３６から開始し、アミノ
酸４１３で終る。高分子量ウロキナーゼはアミノ酸１か
ら開始し、アミノ酸４１３で終る。高分子量および低分
子量ウロキナーゼの両者の単一鎖型から生物活性の２本
鎖型への変換は、アミノ酸１５８と１５９との間の蛋白
質分解開裂によつて生ずる。プレウロキナーゼはアミノ
酸２０で始まる。図示したジスルフイド結合の立体配座
位置決定は、他のセリンプロテアーゼに対する類似性に
基づいている。 第２Ａ図〜第２Ｃ図は低分子量33000ダルトンのウロキ
ナーゼ生物活性蛋白質に対するプラスミドpD2 cDNA挿入
物のヌクレオチド配列および制限エンドヌクレアーゼ地
図を示す図である。合成デオキシオリゴヌクレオチドＣ
Ｂ６Ｂプローブのヌクレオチド部分に下線を施こす。 第３Ａ図および第３Ｂ図は第２図のcDNA配列の推定アミ
ノ酸配列を示す図であり、cDNA挿入部分のアミノ酸は１
〜２７９の番号を符する。 第４Ａ図〜第４Ｃ図は全長ヒトウロキナーゼ蛋白質に対
するcDNAのヌクレオチド配列および制限エンドヌクレア
ーゼ地図を示している。CB6Bプローブには同様に下線を
施こす。 第５Ａ図および第５Ｂ図は第４図のcDNA配列からの全長
ウロキナーゼに対する推定アミノ酸配列を示す図であ
る。 第６図は長い融合−33000ダルトン蛋白質の発現のため
のプラスミドpUK33trpLELの作成を示す図である。 第７図は短かい融合−33000ダルトン蛋白質の発現のた
めのプラスミドpUK33trp pLESの作成を示す図である。 第８図は33000ダルトンの蛋白質の直接的発現のための
プラスミドの作成を示す図である。 第９図は３３Ｋダルトンの蛋白質の直接的発現のための
プラスミドの他の作成を示す図である。 第１０図および第１１図は夫々５４Ｋのウロキナーゼお
よび５４Ｋのウロキナーゼの前駆体型を直接的に発現す
るためのプラスミドの作成を示す図である。 第１２図は５４Ｋのウロキナーゼを真核生物細胞中で発
現するためのプラスミド（p-pEH3-Bal14preUK54）の作
成を示す図である。 第１３図は本明細書中に記載したように生産されるウロ
キナーゼによるプラスミン分析におけるプラスミノーゲ
ンの経時的活性化およびその要件を示す図である。 第１４図はウロキナーゼ抽出物のプラスミノーゲン賦活
活性および天然ウロキナーゼに対して生じた抗体による
この活性の阻害を示している。
子量ウロキナーゼはアミノ酸１３６から開始し、アミノ
酸４１３で終る。高分子量ウロキナーゼはアミノ酸１か
ら開始し、アミノ酸４１３で終る。高分子量および低分
子量ウロキナーゼの両者の単一鎖型から生物活性の２本
鎖型への変換は、アミノ酸１５８と１５９との間の蛋白
質分解開裂によつて生ずる。プレウロキナーゼはアミノ
酸２０で始まる。図示したジスルフイド結合の立体配座
位置決定は、他のセリンプロテアーゼに対する類似性に
基づいている。 第２Ａ図〜第２Ｃ図は低分子量33000ダルトンのウロキ
ナーゼ生物活性蛋白質に対するプラスミドpD2 cDNA挿入
物のヌクレオチド配列および制限エンドヌクレアーゼ地
図を示す図である。合成デオキシオリゴヌクレオチドＣ
Ｂ６Ｂプローブのヌクレオチド部分に下線を施こす。 第３Ａ図および第３Ｂ図は第２図のcDNA配列の推定アミ
ノ酸配列を示す図であり、cDNA挿入部分のアミノ酸は１
〜２７９の番号を符する。 第４Ａ図〜第４Ｃ図は全長ヒトウロキナーゼ蛋白質に対
するcDNAのヌクレオチド配列および制限エンドヌクレア
ーゼ地図を示している。CB6Bプローブには同様に下線を
施こす。 第５Ａ図および第５Ｂ図は第４図のcDNA配列からの全長
ウロキナーゼに対する推定アミノ酸配列を示す図であ
る。 第６図は長い融合−33000ダルトン蛋白質の発現のため
のプラスミドpUK33trpLELの作成を示す図である。 第７図は短かい融合−33000ダルトン蛋白質の発現のた
めのプラスミドpUK33trp pLESの作成を示す図である。 第８図は33000ダルトンの蛋白質の直接的発現のための
プラスミドの作成を示す図である。 第９図は３３Ｋダルトンの蛋白質の直接的発現のための
プラスミドの他の作成を示す図である。 第１０図および第１１図は夫々５４Ｋのウロキナーゼお
よび５４Ｋのウロキナーゼの前駆体型を直接的に発現す
るためのプラスミドの作成を示す図である。 第１２図は５４Ｋのウロキナーゼを真核生物細胞中で発
現するためのプラスミド（p-pEH3-Bal14preUK54）の作
成を示す図である。 第１３図は本明細書中に記載したように生産されるウロ
キナーゼによるプラスミン分析におけるプラスミノーゲ
ンの経時的活性化およびその要件を示す図である。 第１４図はウロキナーゼ抽出物のプラスミノーゲン賦活
活性および天然ウロキナーゼに対して生じた抗体による
この活性の阻害を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴ−ドン・アラン・ヴイハ− アメリカ合衆国カリフオルニア94070サ ン・カ−ロス・メイプル・ウエイ14 (56)参考文献 特開 昭56−158799（ＪＰ，Ａ) Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．363, （1982）Ｐ．1043−1058，1155−1165
Claims (5)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナー
ゼをコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項２】下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナー
ゼをコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項３】下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナー
ゼをコードするＤＮＡ断片。 - 【請求項４】下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナー
ゼをコードするＤＮＡ断片を含有し、宿主細胞中で該Ｄ
ＮＡ断片を発現させる能力を有する組換え発現ベクタ
ー。 - 【請求項５】下記アミノ酸配列を有するヒトウロキナー
ゼをコードするＤＮＡ断片を含有し、宿主細胞中で該Ｄ
ＮＡ断片を発現させる能力を有する組換え発現ベクター
で形質転換された細胞。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US36877382A | 1982-04-15 | 1982-04-15 | |
| US47493083A | 1983-03-14 | 1983-03-14 | |
| US474930 | 1983-03-14 | ||
| US368773 | 1983-03-14 |
Related Child Applications (2)
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| JP4002252A Division JPH0824579B2 (ja) | 1982-04-15 | 1992-01-09 | ヒトウロキナーゼ |
| JP6014310A Division JP2584192B2 (ja) | 1982-04-15 | 1994-02-08 | ヒトウロキナーゼを発現する組換え発現ベクター及び形質転換細胞 |
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|---|---|
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| JP4002252A Expired - Lifetime JPH0824579B2 (ja) | 1982-04-15 | 1992-01-09 | ヒトウロキナーゼ |
| JP6014310A Expired - Lifetime JP2584192B2 (ja) | 1982-04-15 | 1994-02-08 | ヒトウロキナーゼを発現する組換え発現ベクター及び形質転換細胞 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4002252A Expired - Lifetime JPH0824579B2 (ja) | 1982-04-15 | 1992-01-09 | ヒトウロキナーゼ |
| JP6014310A Expired - Lifetime JP2584192B2 (ja) | 1982-04-15 | 1994-02-08 | ヒトウロキナーゼを発現する組換え発現ベクター及び形質転換細胞 |
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| JP (3) | JPH0655145B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| AU587960B2 (en) * | 1983-06-24 | 1989-09-07 | Genentech Inc. | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| NZ208612A (en) * | 1983-06-24 | 1991-09-25 | Genentech Inc | Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations |
| DE3486023T2 (de) * | 1983-09-13 | 1993-06-24 | Green Cross Corp | Verfahren zur herstellung von urokinase zymogen. |
| JPS60180591A (ja) * | 1984-02-27 | 1985-09-14 | Green Cross Corp:The | ヒトウロキナ−ゼのｄνａ配列，プラスミド，宿主 |
| DE3585097D1 (de) * | 1984-02-27 | 1992-02-20 | Green Cross Corp | Herstellung menschlicher urokinase. |
| JPS61177987A (ja) * | 1985-01-31 | 1986-08-09 | Green Cross Corp:The | ヒトウロキナ−ゼの製造方法 |
| AU5390286A (en) * | 1985-01-25 | 1986-08-13 | Sagami Chemical Research Center | Stabilized human prourokinase |
| JPS61181377A (ja) * | 1985-01-25 | 1986-08-14 | Sagami Chem Res Center | ヒトウロキナ−ゼ遺伝子 |
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