JPH0655746B2

JPH0655746B2 - 重合性ホスファチジン酸

Info

Publication number: JPH0655746B2
Application number: JP11068189A
Authority: JP
Inventors: 悦雄長谷川; 英一庄司; 英俊土田
Original assignee: 財団法人生産開発科学研究所; 日本油脂株式会社
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1989-04-27
Publication date: 1994-07-27
Anticipated expiration: 2009-07-27
Also published as: JPH03128387A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規な重合性ホスファチジン酸に関するもので
ある。本発明は、更に詳しくは、膜の表面電荷が負であ
る高分子リポソームを形成し得る重合性（α−又はβ
−）ホスファチジン酸に関するものである。

〔従来の技術と発明が解決しようとする課題〕

有用物質、例えば酵素や各種の医薬品を微小なカプセル
（マイクロカプセル）に封入して、それらの活性，持
続，放出を制御しようとする試みはよく知られている。
初期の試みでは膜材料として、ポリスチレン，ナイロ
ン，酢酸セルロースなどの高分子化合物を用い、乳化法
や界面重合法を応用してカプセル化を行い、目的とする
マイクロカプセルを製造したが、これらの膜厚は数μｍ
と厚く、粒径は数十から数千μｍと大きく、特に、医薬
品の担体として使用し血管内に投与する場合には、血栓
を形成し易い点や、膜材料自体の毒性の点で問題があり
実用性に欠けていた。

最近、これらの膜材料として天然あるいは合成リン脂質
を用い、それらが形成するリポソームをマイクロカプセ
ルとして利用する試みが行われている。即ち、膜厚５ｎ
ｍ，粒径0.02から数十μｍの単層あるいは多重層膜から
なるマイクロカプセルで、内水相には水溶性の物質を、
膜内には脂溶性物質を担持出来る。天然リン脂質である
ので生分解性も高く、安全性も高いと予想される。しか
も、適度に粒径を制御できるので血栓の形成が起こらな
い。しかし、これらのリポソームは生体内で物理的およ
び化学的に不安定であり、容易に分解し、特に血中での
持続性がない。この為、リポソームを安定化する試みが
鋭意行われている。その一つとして、重合性の脂質を用
いて二分子膜を重合し、膜を安定化する方法が知られて
いる（Ｈ．リングスドルフら、アンゲバンテヘミイイン
ターナショナルエヂションインイングリッシュ，２０
巻，３０５頁（１９８１）ほか）。従来、これらの重合
性脂質の殆どが、生体膜成分の一つであるホスファチジ
ルコリン型誘導体であった。ホスファチジルコリンは両
性イオンであり、膜中では中性電荷脂質として働く。従
って、得られる高分子リポソーム（マイクロカプセル）
の表面電荷は中性である。

しかし、特に、医薬品として利用する場合、生体成分
（細胞成分，血漿蛋白質，細胞膜など）との相互作用を
減じて、カプセルの安定性を保つ工夫が必要であった。
一般に、pH7.4という生理条件下で、生体成分の殆どは
負に荷電しており、マイクロカプセルの表面電荷を負に
保ち、適切なゼータ電位に維持すれば生体成分との相互
作用を著しく低下することが出来る。しかし、このよう
な試みは、負電荷を持つ重合性脂質の例が少ないため高
分子化リポソームでは行われていなかった。

本発明はこの様な現況に鑑み、高分子リポソーム（マイ
クロカプセル）の表面電荷を負に保つための材料、即
ち、負電荷を有する新規な重合性リン脂質を提供せんと
研究の結果到達したものである。

〔課題を解決するための手段と作用〕

即ち本発明は、（１）一般式（但し、式中R,R¹は（ｎは6,8,10,12）で表されるアシル基，Ｙは水素またはアルカリ金属イオン（Na⁺,K⁺），Ｘはを表す。以下同符号は同じ意味を有する。）で表される重合性（α−およびβ−）ホスファチジン酸
に係るものである。

一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、重合性β−ホス
ファチジン酸誘導体（一般式（III））は、例えば、つ
ぎのようにして合成される。

即ち、一般式（IV）で表される1,3−ジアシルグリセロ
ールを適当な無水の非プロトン性媒体（塩化メチレン，
クロロホルムなど）中、適当な脱塩酸剤（トリエチルア
ミン，トリメチルアミンなど）存在下、オキシ塩化リン
と縮合させた後、炭酸水素ナトリウム／エチレンジアミ
ン四酢酸水溶液で処理して目的とするβ−ホスファチジ
ン酸（Ｙはナトリウムイオン）を得る。

ここで、脱塩酸剤の量は1,3−ジアシルグリセロールの
1.0〜1.5倍モル、オキシ塩化リンの量は1.0〜1.5倍モ
ル、反応温度は０〜３０℃（好ましくは０〜１０℃）、
反応時間は３〜２４時間（好ましくは５〜１２時間）で
ある。

また、中間原料である化合物（IV）は、飽和脂肪酸鎖を
持つ1,3−ジアシルグリセロールの合成法（Ｗ．Ｇ．ロ
ーズ，ジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアテ
ー，６９巻，１３８４頁（１９７４年）など）に従い、
適当な脱塩酸剤（キノリンなど）の存在下、グリセロー
ルと相当する脂肪酸塩化物（Ｖ）との縮合により合成で
きる。

一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、重合性α−ホス
ファチジン酸誘導体（式（VI））は、二つの方法で合成
される。

第一の方法は、一般式（II）で表される重合性ホスファ
チジルコリン誘導体を常法（日本生化学会編，生化学実験講座３，「脂質の
化学」，２８９頁（１９７４年）ほか）に従い酵素（ホ
スホリパーゼＤ）を用い加水分解し合成する方法であ
る。

第二の方法は、一般式（VII）で表される1,2−ジアシルグリセロールを、一般式（II
I）の化合物の合成の場合と同様にしてオキシ塩化リン
と縮合させ、その後炭酸水素ナトリウム／エチレンジア
ミン四酢酸水溶液で処理して合成する方法である。ま
た、中間原料である一般式（VII）で表される化合物
は、飽和脂肪酸鎖を持つ1,2−ジアシルグリセロール合
成の一般法（Ｈ．アイブル，「リポソームズ：フロムフ
ィジカルストラクチャーツーセラポイテックアプリケー
ションズ」，エルセビアー（１９８１年），２４頁ほ
か）を用いて合成できる。

以上により得られる重合性ホスファチジン酸を用いての
リポソームの製造は、常法（Ｇ．グレゴリアヂス，「リ
ポソームテクノロジー」，１巻，シーアールシープレス
（１９８３年）ほか）にしたがい可能である。例えば、
一般式（Ｉ）で表される重合性ホスファチジン酸，一般
式（II）で表される重合性ホスファチジルコリンおよび
コレステロール（リン脂質／コレステロールモル比は
１：２ないし２：１）を乾燥ベンゼン（必要に応じ、少
量の無水メタノールあるいはエタノールを添加）に溶解
後、これを凍結乾燥して得られる粉末に水または緩衝水
を加え、不活性ガス（窒素，アルゴンほか）下で室温な
いし６０℃に加温、ボルテックスミキサー処理（１０な
いし６０分）することで、多重層リポソーム（径：〜数
μｍ）を得る。更に、これを超音波処理（プローブ型ま
たはバス型超音波発信機）することにより単層リポソー
ム（径：２０〜６０ｎｍ）が得られる。また、前記の凍
結乾燥して得た粉末に水または緩衝水を加え、不活性ガ
ス（窒素，アルゴンほか）下、室温で直接超音波処理す
ることによっても単層リポソームを得ることができる。
このリポソームは各種の医薬品，有用物質，酵素，蛋白
質，金属蛋白質などを担持できる。

このようにして得られたリポソームを重合して高分子リ
ポソームを製造するには、不活性ガスで、紫外線あるい
はガンマ線を照射するか、適当な開始剤（アゾビスイソ
ブチロニトリル，アゾビス（２−ジアミノプロパン）二
塩酸塩，NaHSO₃／K₂S₂O₈他）を用いて重合することで可
能となる。重合の進行は、ジエン基に基づく紫外吸収帯
の吸収強度の減少により確認できる。粒径は重合前後で
変化しない。

本発明の重合性ホスファチジン酸は、以上のほか、高分
子材料に適切な医用適正を付与する為にこれを高分子材
料の表面で重合させ、薄膜を形成するためにも用いるこ
とができる。

〔実施例〕

次に、本発明の重合性ホスファチジン酸の合成法を具体
的に説明した実施例と共に、この重合性ホスファチジン
酸からの高分子リポソームの製造法を具体的に説明した
参考例を掲げ、本発明を更に説明する。

実施例１ 1,3−ビス（オクタデカ−trans，２−trans，４−ジエ
ノイル）グリセロール（一般式（IV）のｎ＝12の化合
物）の合成；キノリン９ml（７８mmol）とグリセロール1.7ｇ（18.5m
mol）を乾燥クロロホルム２０mlに溶解し、１０℃に冷
却した。これに、オクタデカジエノイルクロライド（3
6.25mmol）を乾燥クロロホルム１０mlに溶解した溶液を
ゆっくり滴下した（１時間）。室温下で一夜攪拌後、乾
燥エーテル1.5を加え、生成する沈澱を濾別した。濾
液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマト（溶出
溶媒：クロロホルム）で精製し、目的部を集めた（薄層
クロマトグラフィ（シリカゲル，ヘキサン／エーテル＝
１／１）：Ｒｆ値＝0.3）。溶媒を留去後、ヘキサンよ
り再結晶し、目的物2.3ｇ（収率２０％）を得た。

IR(KBr)：1710cm^-1（ν ｃ＝o),1650,1610cm^-1（ν
ｃ＝c)；¹H-NMR(CDCl³,TMS)δ(ppm)：4.25(4H,-CH₂-O
-),2.60 5.80(2H,-CO-CH＝),7.30(2H,-COC＝CH-),6.16(4H,-C＝C
H-CH＝C-)；¹³C-NMR(CDCl₃,TMS)δ(ppm)：167.3（エス
テルカルボニル炭素）；EIms：616(M⁺)；融点６９〜７
０℃；元素分析値（重量％）：Ｃ 76.07(75.92),H 11.
33(11.11)（但し、括弧内の値は、C₃₉H₆₈O₅の計算
値）。

1,3−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロ−２−ホスホリックアシッド（一般式(II
I)のｎ＝12の化合物）の合成；乾燥塩化メチレン１０mlにオキシ塩化リン0.24ml(2.35m
mol)を溶解し氷冷した。これとは別に、上記のグリセロ
ール誘導体1.0g(1.6mmol)を塩化メチレン１０mlに溶解
した溶液と、トリエチルアミン0.36ml(1.65mmol)を塩化
メチレン１０mlに溶解した溶液を別々に、かつ同時に上
記グリセロール誘導体溶液にゆっくり滴下した。室温で
１２時間攪拌後、乾燥ベンゼン100mlを加え、生成した
沈澱を濾別した。濾液を減圧下で濃縮後、テトラヒドロ
フラン７０mlを加え、更に、0.5M炭酸水素ナトリウム５
０mlと0.25M(pH10.8)エチレンジアミン四酢酸２５mlを
加え１２時間攪拌した。更に、飽和食塩水５０mlを加
え、有機層を集め、減圧下で乾固した。残渣にクロロホ
ルム／メタノール／水＝５０ml／５０ml／５０mlを加え
攪拌後、有機層を集めた。減圧下で溶媒を留去した後、
残渣にクロロホルム３０mlを加え不溶部を除去した。ク
ロロホルム溶液を乾固後、乾燥ベンゼンと共沸処理し
た。残渣をクロロホルム８mlに溶解後、乾燥アセトン10
0mlを加え遠心分離処理し、沈澱を集めアセトンで洗浄
後五酸化リン上で真空乾燥し、目的物0.5ｇ（収率４１
％）を得た。

IR(KBr)：1720cm^-1（ν ｃ＝o),1650,1610cm^-1（ν
ｃ＝c),3400,1260,1160,1100cm^-1（ホスフェート）；¹H
-NMR(CDCl³,TMS)δ(ppm)：4.25(4H,-CH₂-O-),2.60 5.80,7.30,6.16(2H,2H,4H,-CH＝CH-CH＝CH-)；¹³C-NMR
(CDCl₃,TMS)δ(ppm)：167.3（エステルカルボニル炭
素）；FABms：763(M+Na)⁺,741(M+H)⁺(C₃₉H₆₇O₈P₁Na₂の
分子量740）；紫外吸収スペクトル(CHCl₃)λmax261nm,
εmax52500(/mol・cm)；薄層クロマトグラフィ（CHCl₃
/MeOH／水＝65/25/4)Ｒｆ値＝0.3；元素分析値（重量
％）：Ｃ61.7(61.72),Ｈ9.01(9.17)（但し、括弧内の値
は、C₃₉H₆₇O₈P₁Na₂・H₂Oの計算値）。

実施例２〜４実施例１と同様にして、一般式(III)のｎ＝10,8,6の化
合物を合成した。分析結果を表１にまとめた。

実施例５ 1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロール（一般式(VII)のｎ＝12の化合物）の
合成；３−トリチルグリセロール10.0g(11.6mmol)を乾燥塩化
メチレン200mlに溶解後、０℃に冷却。これにBF₃メタノ
ール9.7mlを加え、1.2時間攪拌した。これに、エーテル
300mlを加えた後、氷冷、飽和食塩水で洗浄後、無水硫
酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下で留去した。残渣
にヘキサン100mlを加え５℃で３時間冷却後、沈澱を集
め、冷ヘキサンで洗浄後、五酸化リン上で真空乾燥し、
目的物5.7ｇ（収率８０％）を得た。

薄層クロマトグラフィ（シリカゲル，エーテル／ヘキサ
ン＝１／１）Ｒｆ値＝0.35;EIms:617(M+H)⁺;¹³C-NMR(CD
Cl₃,TMS):167.3,166.8（エステルカルボニル炭素）、14
6.3,145.7,128.2,118.3(-C＝C-C＝C-),72.4,62.1,61.5
（グリセロール骨格），14.1（メチル），22.7,28.7,2
9.2〜29.7,31.9（メチレンCH₂ _n）；元素分析値：Ｃ
75.87(75.92),H 11.21(11.11)（但し、括弧内の値は、
C₃₉H₆₈O₅の計算値）。

1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロ−３−ホスホリックアシッド（一般式(VI)
のｎ＝12の化合物）の合成； 1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロール1.2g(1.94mmol)を用い、実施例１と同
様な方法で1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-
ジエノイル）グリセロ−３−ホスホリックアシッドを合
成した。収率４８％。

薄層クロマトグラフィ（シリカゲル，CuCl₃/MeOH/水＝6
5/25/4）Ｒｆ値＝0.22;FABms:741(M+H)⁺(C₃₉H₆₇O₈PiNa₂
の分子量は740);IR(KBr):1705cm^-1(ν c＝o),3350,126
0,1135,1100cm^-1（ホスフェート）；¹³C-NMR(CDCl₃/CD₃
OD,TMS)δ(ppm):167.8,167.6（エステルカルボニル炭
素）、146.5,146.0,128.4,118.5(-C＝C-C＝C-),70.6,6
3.0,63.7（グリセロール骨格），14.2（メチル），23.
0,29.0〜29.9,32.2,33.5（メチレンCH₂ _n）；元素分
析値（重量％）：Ｃ 61.9(61.72),H 9.20(9.17)（但
し、括弧内の値は、C₃₉H₆₇O₈P₁Na₂・H₂Oの計算値）。

実施例６ 1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロ−３−ホスホリックアシッド（一般式(VI)
のｎ＝12の化合物）の合成（酵素法）； 1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロ−３−ホスファチジルコリン（一般式(II)
のｎ＝12の化合物）1.0ｇをエーテル１５mlに溶解後、1
MCaCl₂3.75ml,0.2M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.8）およ
びキャベツより抽出したホスホリパーゼＤ溶液（Ｆ．
Ｍ．デビドソン，バイオケミカルジャーナル，６９巻，
４５８頁（１９５８年））を加え、３７℃浴上で２４時
間激しく攪拌した。0.5Mエチレンジアミン四酢酸（pH8.
0）溶液5mlを加えた後、クロロホルム／メタノール（２
／１）５０ml，ついでクロロホルム５０mlで２回抽出し
た。有機層を合わせ氷冷後遠心し、有機層を集めた。減
圧下で溶媒を留去後、残渣にクロロホルム／メタノール
／３％アンモニア水（６／５／１）３０mlを加え中和し
た。減圧下で溶媒を留去後、残渣にクロロホルム／メタ
ノール（１／１）を加え、不溶部を除く。溶媒を留去
後、五酸化リン上で真空乾燥し、目的物（収率４５％）
を得た。分析値は実施例５の化合物と一致した。

参考例１ 1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロ−３−ホスファチジルコリン（一般式(II)
のｎ＝12の化合物）0.20g(0.26mmol),1,3−ビス（オク
タデカ−trans,2-trans,4-ジエノイル）グリセロ−２−
ホスホリックアシッド（一般式(III)のｎ＝12の化合
物）0.095g(0.13mmol),コレステロール0.20g(0.52mmol)
をベンゼン／メタノール＝１５ml／２mlに溶解後、凍結
乾燥した。アルゴンガス雰囲気下で２５mMTris緩衝液
（pH7.4）３０mlを加え、超音波処理した（プローブ
型，８０ｗ，３０分）。８℃水浴中、100w低圧水銀ラン
プで石英セル中アルゴンガス下で上記リポソーム溶液
（４ml）に１０時間照射した。ジエン基に基づく特性吸
収帯（255ｎｍ）の吸収の消失により、重合を確認し
た。平均粒径３０ｎｍの高分子リポソームを得た。

参考例２ 1,2−ビス（オクタデカ−trans,2-trans,4-ジエノイ
ル）グリセロ−３−ホスファチジルコリン（一般式(II)
のｎ＝12の化合物）0.20g(0.26mmol),1,2−ビス（オク
タデカ−trans,2-trans,4-ジエノイル）グリセロ−２−
ホスホリックアシッド（一般式(VI)のｎ＝12の化合物）
0.19g(0.26mmol),コレステロール0.10g(0.26mmol)を用
い参考例１と同様にして高分子リポソームを得た。（平
均粒径３５ｎｍ）。

〔発明の効果〕

本発明の重合性ホスファチジン酸は負電荷であるため、
これを高分子化リポソームとして利用したり、医用高分
子の表面処理薄膜として利用したりする場合に、生体成
分との間の相互作用を著しく低下させることが可能であ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（但し、式中R,R¹は（ｎは6,8,10,12）で表されるアシル基，Ｙは水素またはアルカリ金属イオン（Na⁺,K⁺），Ｘはを表す）で表される重合性（α−又はβ−）ホスファチジン酸
【請求項２】R,R¹が、（オクタデカ−trans,２−trans,４−ジエン酸）である
請求項１記載の重合性（α−又はβ−）ホスファチジン
酸