JPH0656774A

JPH0656774A - 光学活性（＋）−４，４，４−トリフルオロ −３−（インド−ル−３−）酪酸およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0656774A
Application number: JP23150092A
Authority: JP
Inventors: Katsuya Kato; 藤且也加; Hiroshi Kimoto; 本博木; Shozo Fujii; 井省造藤; Masato Katayama; 山正人片; Yoshihiko Hirose; 瀬芳彦広; Seiji Sasaki; 々木征治佐; Tamio Mase; 瀬民生間
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology; Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1992-08-07
Publication date: 1994-03-01
Anticipated expiration: 2016-02-05
Also published as: JP3131749B2

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は光学活性（＋）−４，４，４−トリ
フルオロ−３−（インドール−３−）酪酸（ＴＦＩＢ
Ａ）及びその製造方法に関する。【構成】ラセミ体ＴＦＩＢＡとエチルアルコールとを
反応させ、ラセミ体ＴＦＩＢＡのエチルエステルを合成
した後、エステラーゼ活性を有する酵素を作用させ、該
エステルを選択的に加水分解させることによって光学活
性（＋）−ＴＦＩＢＡを得る。光学活性（＋）−ＴＦＩ
ＢＡは、強力な発根促進作用及び根の伸長促進作用を有
している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は光学活性（＋）−４，
４，４−トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪酸
およびその製造方法に関する。更に詳細には、新規な光
学活性（＋）−４，４，４−トリフルオロ−３−（イン
ドール−３−）酪酸および該物質を、ラセミ体の４，
４，４−トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪酸
から酵素を用いた立体選択的加水分解によって製造する
方法に関する。

【０００２】光学活性（＋）−４，４，４−トリフルオ
ロ−３−（インドール−３−）酪酸（以下光学活性
（＋）−ＴＦＩＢＡという）は、含フッ素β−インドー
ル酪酸類の化合物の一つであり、植物の発根作用および
根の伸長促進作用を有している。

【０００３】このように、光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡ
は、植物ホルモンとしての作用を有する重要な物質であ
り、作物の増収、果樹栽培等の農業および園芸への幅広
い応用が可能である。

【０００４】

【従来の技術】植物の生育を促進する作用物質、いわゆ
るオーキシンとしては、インドール−３−酢酸（ＩＡ
Ａ）およびその誘導体（インドール−３−酢酸メチル、
インドール−３−アセトアミド等）が古くから知られて
いる。

【０００５】又最近になって、含フッ素β−インドール
酪酸類の化合物が開発され、それらの化合物、即ち４，
４，４−トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪酸
（以下「ＴＦＩＢＡ」という）、４，４，４−トリフル
オロ−２−ヒドロキシ−３−（インドール−３−）酪酸
（以下「ＴＦＩＨＢＡ」という）および４，４，４−ト
リフルオロ−３−（インドール−３−）ブチロニトリル
（以下「ＴＦＩＢＮ」という）にも強い植物の根の伸長
促進作用があることが知られている〔植物化学調節学
会、平成２年度大会、研究発表記録集第３１頁、農林水
産省発行〕。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来のオーキシン活性
を有する植物調節剤のＩＡＡおよびその誘導体は、植物
の根の伸長作用が不十分であり、作物の増収等の農業分
野に応用することが出来なかった。一方、最近になって
開発された含フッ素β−インドール酪酸類の化合物、即
ちＴＦＩＢＡ、ＴＦＩＨＢＡおよびＴＦＩＢＮ等は、Ｉ
ＡＡおよびその誘導体に比較すれば、かなり強い植物の
根の伸長作用を有している。しかしながら、作物の増収
等の実用的な用途に利用するためには、より強い植物の
根の伸長作用を有する物質が望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、よ
り強力な植物の発根促進ならびに根の伸長促進作用物質
を求めて鋭意検討した結果、光学活性体に着目するに至
り、数多くの各種の既知化合物の中からＴＦＩＢＡに着
目した。そしてＴＦＩＢＡについて、光学活性体の選択
的且つ高収率分離取得方法の新規開発及びその作用の確
認を試みた。その結果、光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡを
選択的にかつ高収率に分離取得することにはじめて成功
した。

【０００８】すなわち、先ずラセミ体のＴＦＩＢＡとエ
チルアルコールを作用させ、ラセミ体ＴＦＩＢＡのエチ
ルエステルを合成し、次いでそのものにエステラーゼ活
性を有する酵素を作用させ、該エステルを不斉加水分解
させたところ、光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡを選択的に
得ることが出来、かつ得られた光学活性体は、強力な発
根促進作用及び根の伸長促進作用を有していることを知
り本発明を完成した。

【０００９】本発明の光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡを酵
素により不斉加水分解して取得するにあたり、初発原料
のラセミ体ＴＦＩＢＡは、次のようにして合成される。

【００１０】先ず、トリフルオロアセトアルデヒドエチ
ルヘミアセタール（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｌｄ
ｅｈｙｄｅｅｔｈｙｌｈｅｍｉａｃｅｔａｌ、以下
ＴＦＡＥという）とインドールとをカップリング反応を
させてインドール−トリフルオロエタノール（ｉｎｄｏ
ｌｅｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｏｌ）を製造し
（Ｙ．Ｍａｋｅ，Ｈ．Ｋｉｍｏｔｏ，Ｓ．Ｆｕｊｉ
ｉ，Ｍ．ＳｅｎｇａａｎｄＬ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ，
Ｊ．ＦｌｕｏｒｉｎｅＣｈｅｍ．，３（９）４７
−５９（１９８８））、次いでインドールトリフルオロ
エタノールをマロン酸ジエチルのナトリウム塩と有機溶
媒中でカップリングし、さらにアルカリ加水分解してラ
セミ体ＴＦＩＢＡを得る〔植物化学調節学会、平成２年
度大会、研究発表記録集第３１頁、農林水産省発行〕。

【００１１】そして、ラセミ体ＴＦＩＢＡから光学活性
（＋）−ＴＦＩＢＡを得るには、次のように酵素による
不斉加水分解により行う。即ち、ラセミ体ＴＦＩＢＡと
エチルアルコール等のアルコールとを反応させてラセミ
体ＴＦＩＢＡのエチルエステル（ＴＦＥＥ）等のエステ
ルを合成した後、エステラーゼ活性を有する酵素を作用
させ、該エステルを選択的に加水分解させることによっ
て光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡを得る。

【００１２】上記したＴＦＥＥから光学活性（＋）−Ｔ
ＦＩＢＡを得るまでの化学反応を、下記する化４に示
す。

【００１３】

【化４】

【００１４】（なお、＊は不斉炭素を示す。）

【００１５】本発明に使用するエステラーゼ活性を有す
る酵素としてはリパーゼ及び／又はプロテアーゼが好ま
しく用いられ、リパーゼとしては、特にシュードモナス
（Pseudomonus）属の生産するリパーゼ、例えばリパー
ゼＰＳ（商品名：天野製薬製）、リパーゼＡＫ（商品
名：天野製薬製）やキャンディダ（Candida）属の生産
するリパーゼ、例えばリパーゼＡＹ（商品名：天野製薬
製）がより好ましく用いられ、プロテアーゼとしては、
アスペルギルス（Aspergillus）属の生産するプロテア
ーゼ、例えばプロテアーゼＭ（商品名：天野製薬製）が
より好ましく用いられる。用いる酵素は粗製品であって
も、精製されたものであってもよい。又、これらの酵素
を生産する菌体も利用できる。

【００１６】エステラーゼ活性を有する酵素を用いる不
斉加水分解反応は、適当な緩衝液及び／又は有機溶媒の
存在下で行うと有利である。この場合の緩衝液として
は、使用する酵素の作用ｐＨに適した緩衝液が用いら
れ、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、グリシン緩衝
液等が用いられる。

【００１７】又有機溶媒としては、酵素作用を阻害しな
ければ通常使用される有機溶媒を用いることが可能であ
り、特にｎ−ヘキサン、ｔ−ブチルアルコール、アセト
ン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＭＦ（ジメ
チルホルムアミド）等を好適に用いることが出来る。
尚、酵素反応において緩衝液と共存下で使用する有機溶
媒の濃度は、緩衝液に対して０．５〜５０％であり、好
ましくは、５〜３０％である。

【００１８】酵素反応の条件としては、反応温度は０〜
７０℃であり、好ましくは、４〜６０℃である。反応の
時間は１〜５００時間、好ましくは、２０〜２５０時間
である。

【００１９】こうして得られた光学活性（＋）−ＴＦＩ
ＢＡは、強力な根の伸長作用を有しており、このものを
植物生育調節剤として使用する場合、使用目的に応じて
そのまま使用するか、又はその効果を助長もしくは安定
化するために農薬で通常用いられる補助剤と混合して、
液剤、粉剤、粒剤、水和剤、フロアブル剤又は乳剤のよ
うな製剤形態にして使用する。

【００２０】これらの製剤は実際の使用においては直接
そのまま使用するか、又は水で所定の濃度に希釈して使
用することもできる。

【００２１】式（Ｉ）で示される化合物は通常１×１／
１０⁸〜１×１／１０²Ｍの濃度範囲で使用することが出
来るが、この範囲に限定されるものではない。

【００２２】以下、試験例、実施例により本発明をより
具体的に詳述するが、本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００２３】

【試験例】

【００２４】〔試験例１〕後記する実施例１の（２）で
調製されたラセミ体ＴＦＩＢＡエチルエステルを酢酸緩
衝液（ｐＨ４．５）とｔ−ブチルアルコール（緩衝液に
対して１０％濃度）の共存下、３０℃、４０又は１０８
時間の条件で各種酵素剤、即ち、リパーゼＰＳ、リパー
ゼＡＫ、リパーゼＡＹ、パンクレアチンＦ（商品名、天
野製薬製、豚膵臓由来）、ホスホリパーゼＡ（商品名、
天野製薬製）、プロテアーゼＭ、セルラーゼＡ（商品
名、天野製薬製、アスペルギルス由来）およびセルラー
ゼＴ（商品名、天野製薬製、トリコデルマ由来）の８種
類を作用させ、光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡの生成を調
べた。その結果は、下記の表１に示される。

【００２５】

【表１】

【００２６】上記結果から明らかなように、８種類の加
水分解酵素のうちでリパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ、リパ
ーゼＡＹおよびプロテアーゼＭの４種類が光学活性
（＋）−ＴＦＩＢＡを生成せしめることが判り、そして
４種類の酵素のうちでは、リパーゼＡＫを用いた場合、
光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡの収率が最も高いことが判
った。

【００２７】〔試験例２〕後記する実施例１の（２）で
調製されたラセミ体ＴＦＩＢＡエチルエステルにリパー
ゼＡＫをリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と各種溶媒（緩衝
液に対し１０％濃度使用）、即ちｎ−ヘキサン、ｔ−ブ
チルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯおよびＤＭＦの５
種類のそれぞれの存在下、３０℃、４０〜１３２時間、
作用させて光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡの生成を調べ
た。その結果は、下記の表２に示される。

【００２８】

【表２】

【００２９】上記結果から明らかなように、いずれの溶
媒を用いてもリパーゼＡＫは、光学活性（＋）−ＴＦＩ
ＢＡを収率良く生成するがｔ−ブチルアルコールを溶媒
として用いる場合、短時間で反応を終えることが出来る
ので有利である。

【００３０】〔試験例３〕後記する実施例１の（２）で
調製されたラセミ体ＴＦＩＢＡエチルエステルにリパー
ゼＡＫを各種緩衝液、即ち、酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５）、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）およびグリシン緩衝
液（ｐＨ８．０）と溶媒のｔ−ブチルアルコール（緩衝
液に対し１０％濃度使用）との組み合わせの存在下で、
４〜５５℃、３６〜２３０時間作用させて光学活性
（＋）−ＴＦＩＢＡの生成を調べた。その結果は、下記
の表３に示される。

【００３１】

【表３】

【００３２】上記結果から明らかなように、リパーゼＡ
Ｋによる不斉分解の場合、溶媒のｔ−ブチルアルコール
といずれの緩衝液を組み合わせても光学活性（＋）−Ｔ
ＦＩＢＡを収率良く生成することができる。しかし、酢
酸緩衝液と組み合わせた場合に比較的低温下でも反応時
間が短時間ですみ、しかも、ほぼ１００％のｅｅで光学
活性（＋）−ＴＦＩＢＡを得ることができるので有利で
あることが判る。

【００３３】〔試験例４〕ブラックマッペを用いた生物
試験

【００３４】ブラックマッペを水道水で充分洗った後蒸
留水ですすぎ、シャーレ中の蒸留水を充分湿らせた脱脂
綿上に播き、２５℃で約２４時間置く。少し根が出た状
態の種子１０個を直径６ｃｍのシャーレに、光学活性
（＋）−、光学活性（−）−およびラセミ体のそれぞれ
のＴＦＩＢＡの１／１０⁴（Ｍ）の濃度の薬液４ｍｌを
染め込ませたろ紙（直径５．５ｃｍ）上に置床し、暗黒
下３日間インキュベートした後、根長を測定した。その
結果は、下記の表４に示される。

【００３５】

【表４】

【００３６】上記結果から明らかなように、光学活性
（＋）−ＴＦＩＢＡは、ラセミ体ＴＦＩＢＡに比べ約
２．４倍の根の伸長作用があることが判る。そしてこの
ことは、光学活性体を植物調節剤として使用する場合、
ラセミ体の半分以下の使用で同等の効果を有することを
示すものである。それ故に、光学活性体は、環境汚染の
より少ない植物調節剤として期待でき得る。

【００３７】

【実施例】

【００３８】〔実施例１〕

【００３９】（１）ラセミ体ＴＦＩＢＡ（４，４，４−
トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪酸）の製造

【００４０】マロン酸ジエチル（１６．０ｇ，１００ｍ
ｍｏｌ）のトルエン５０ｍｌ溶液に金属ナトリウム
（２．３ｇ）を加え、１．５時間加熱還流した後、２，
２，２−トリフルオロ−１−インドール−３−）エタノ
ール（４．３ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加える。再び４時間
加熱還流した後注意深く水を加え、酢酸エチルで３回抽
出する。酢酸エチル層を水および飽和食塩水で洗い、無
水硫酸ナトリウムで乾燥した後減圧濃縮し、粗ジカルボ
ン酸ジエステルのトルエン溶液を得る。この溶液をヘキ
サン−アセトニトリルで分配した後、アセトニトリル層
を減圧濃縮する。得られた粗ジエステルをメタノール１
００ｍｌに溶解した後炭酸カリウム（２５．７ｇ）の水
溶液（８０ｍｌ）を加え、９０時間加熱還流する。

【００４１】塩酸で中和した後減圧濃縮してメタノール
を除去し、４Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液でアルカリ性
にした後酢酸エチルで抽出する。水層を塩酸で酸性にし
た後酢酸エチル抽出し、酢酸エチル層を水、飽和食塩水
で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。減圧濃縮後
得られた粗カルボン酸をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにより精製してラセミ体ＴＦＩＢＡ（４，４，４
−トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪酸）
（４．２ｇ，８２．０％）を得た。その理化学的性質を
下記の表５に示す。

【００４２】

【表５】

【００４３】（２）ラセミ体ＴＦＩＢＡエチルエステル
（４，４，４−トリフルオロ−３−（インドール−３
−）酪酸エチルエステル）の製造

【００４４】４，４，４−トリフルオロ−３−（インド
ール−３−）酪酸（５．１４ｇ，２０ｍｍｏｌ）のエタ
ノール（９９．８％，３００ｍｌ）溶液に、乾燥塩化水
素を飽和するまで、吹き込み吸収させた。１２時間加熱
還流させたのち、溶媒等を減圧下に留去することによ
り、全体量が３０ｍｌになるまで濃縮した。この液を氷
水（２００ｍｌ）中にそそぎ、冷時に５Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液で中和した。酢酸エチル（２００ｍｌ）で
２回抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧
下に除いた。残留物をｎ−ヘキサンから再結晶して、無
色柱状晶（ｍｐ．５７℃）のラセミ体ＴＦＩＢＡエチル
エステル（５．４７ｇ，収率９５．９％）を得た。その
理化学的性質を下記の表６に示す。

【００４５】

【表６】

【００４６】（３）光学活性（＋）−ＴＦＩＢＡ（４，
４，４−トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪
酸）の製造

【００４７】ジャーファーメンター（ＭＢＦ，東京理化
器械製）に、酢酸緩衝液（４５０ｍｌ）（０．２ＮＣ
Ｈ₃ＣＯＯＨ水溶液（２０５ｍｌ），０．２ＮＣＨ₃
ＣＯＯＮａ水溶液（４５ｍｌ）；ｐＨ４．０：使用時に
２倍希釈）、補助溶媒（ｔ−ＢｕＯＨ：５０ｍｌ）、リ
パーゼＡＫ（１５ｇ）を入れ、３０℃で２０分間攪拌し
た。この懸濁液に、ラセミ体ＴＦＩＢＡエチルエステル
（０．５ｇ）を加え３０℃で更に攪拌した。６０時間後
反応を停止し、１Ｎ塩酸水溶液でｐＨ２．０に調製の
ち、酢酸エチル（５００ｍｌ）で３回抽出した。抽出液
を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を留去した。残
留物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、光学活
性（＋）−ＴＦＩＢＡを収率９２％で得た。光学純度９
９％ｅｅ。又、同時に光学活性（−）−ＴＦＩＢＡエチ
ルエステル（４，４，４−トリフルオロ−３−（インド
ール−３−）酪酸エチルエステル）をも収率９３（％）
で得た。光学純度９９％ｅｅ。これらの理化学的性質を
下記の表７に示す。

【００４８】

【表７】

【００４９】（４）光学活性（−）−ＴＦＩＢＡ（４，
４，４−トリフルオロ−３−（インドール−３−）酪
酸）の製造：

【００５０】光学活性（−）−ＴＦＩＢＡエチルエステ
ル（２８．５ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）のメタノール（８
９．８％，３ｍｌ）溶液に炭酸カリウム（６８．９ｍ
ｇ，０．５ｍｍｏｌ）水溶液３ｍｌを加えた。７０℃で
３時間加熱還流した後、メタノ−ルを減圧下に除き、酢
酸エチルで３回抽出した。水層を、４Ｎ塩酸で酸性に
した後、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を水、飽和
食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧
濃縮後。粗カルボン酸をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィーにより精製して光学活性（−）−ＴＦＩＢＡ（２
０．５ｍｇ，８０％）を得た。光学純度９７％ｅｅ。そ
の理化学的性質を下記の表８に示す。

【００５１】

【表８】

【００５２】

【発明の効果】本発明にしたがって酵素を用いて不斉加
水分解を行うことによってはじめて光学活性（＋）−Ｔ
ＦＩＢＡを製造するのに成功したものである。この光学
活性体は、非常に強力な発根促進作用及び根の伸長促進
作用を有しており、植物生長調節剤等農薬の技術分野で
有用であるのみならず、カルス栽培等植物バイオテクノ
ロジーの技術分野でもその有用性が大いに期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者木本博三重県桑名市大山田５−７−130 (72)発明者藤井省造愛知県名古屋市千種区鹿子殿18−52 (72)発明者片山正人愛知県名古屋市緑区篠ノ風１−1603 (72)発明者広瀬芳彦愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋敷51 天野製薬株式会社中央研究所内 (72)発明者佐々木征治愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋敷51 天野製薬株式会社中央研究所内 (72)発明者間瀬民生愛知県西春日井郡西春町大字九之坪西城屋敷51 天野製薬株式会社中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の化１で示される【化１】（式中、＊は不斉炭素原子を示す）式（Ｉ）の化合物、光学活性（＋）−４，４，４−トリ
フルオロ−３−（インドール−３−）酪酸。
【請求項２】下記の化２に示される【化２】式（II）の化合物にエチルアルコールを作用させてエス
テルを合成した後、該エステルにエステラーゼ活性を有
する酵素を作用させて下記の化３で示される【化３】（式中、＊は不斉炭素原子を示す）式（Ｉ）の光学活性体を生成せしめ、これを採取するこ
とを特徴とする光学活性（＋）−４，４，４−トリフル
オロ−３−（インドール−３−）酪酸の製造方法。
【請求項３】酵素による不斉加水分解を有機溶媒及び
／又は緩衝液の存在下で行うことを特徴とする請求項２
に記載の製造方法。
【請求項４】エステラーゼ活性を有する酵素としてリ
パーゼ及び／又はプロテアーゼを使用することを特徴と
する請求項２又は請求項３に記載の製造方法。