JPH0656860A

JPH0656860A - 抗生物質ｏｈ−４１５６およびその製造方法

Info

Publication number: JPH0656860A
Application number: JP4212920A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Omura; 智大村; Hiroki Komiyama; 寛機小宮山
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1992-08-10
Filing date: 1992-08-10
Publication date: 1994-03-01

Abstract

(57)【要約】【目的】抗菌活性を示しかつ増殖抑制活性を有する抗
生物質及びそれを製造する方法を得るものである。【構成】物質ＯＨ−４６５１、ストレプトマイセス属
に属するＯＨ−４１５６生産菌を培地に培養し、その培
養物から物質ＯＨ−４１５６を採取することにより、物
質ＯＨ−４１５６を製造する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な抗生物質ＯＨ−
４１５６の製造方法に関する。さらに詳しく云えば、本
発明はストレプトマイセス属に属する抗生物質生産菌の
培養によつて産生され、グラム陽性菌に対して抗菌活性
を示し、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞に対して増殖抑制
活性を有する抗生物質ＯＨ−４１５６およびその製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまでに数多くの増殖抑制活性を有す
る抗生物質が開発されてきているが、その殆どはまだ完
全な治療薬とは言えないのが現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って、このようなグ
ラム陽性菌に対して抗菌活性を示し、Ｂ１６メラノーマ
細胞に対して増殖抑制活性を有する抗生物質が強く要望
されている。かかる実情において、本発明はヒトの医学
上または社会問題の解決策としてきわめて重要であるこ
とに鑑みて研究開発されたものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは上
記のごとき課題を解決すべく、新規な抗生物質の探索を
目的として種々の土壌から菌株ＯＨ−４１５６を分離
し、その生産する代謝産物について研究を続けた結果、
東京都江戸川の土壌から分離した菌株ＯＨ−４１５６の
培養物中に、グラム陽性菌に対して抗菌活性を示し、Ｂ
１６マウスメラノーマ細胞の増殖抑制作用を有する物質
が産生されることを見出した。次いで、該培養物から該
有効物質を分離、精製し、その理化学的性質を有する物
質は従来全く知られていないことから、本物質を抗生物
質ＯＨ−４１５６と称することにした。本発明はかかる
知見に基いて完成されたものである。

【０００５】本発明は、物質ＯＨ−４１５６およびスト
レプトマイセス属に属する物質ＯＨ−４１５６生産菌を
培地に培養して培養物中に物質ＯＨ−４１５６を蓄積せ
め、該培養物から物質ＯＨ−４１５６を採取する物質Ｏ
Ｈ−４１５６の製造方法である。

【０００６】本発明の物質ＯＨ−４１５６を生産するた
めに使用される菌株としては、１例として、本発明者ら
が分離したストレプトマイセス属に属するＯＨ−４６５
２菌株は、本発明の最も有効に使用される菌株の一例で
あって、本菌株の菌学的性状を示すと次の通りである。

【０００７】（Ｉ）形態的性質栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断が観察さ
れる。気菌糸はスターチ・無機塩寒天、グリセロール・
アスパラギン寒天等で豊富に着生し、白色からグレイ系
の色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸は直線状
を呈し、２０ケ以上の胞子の連鎖が認められる。胞子の
大きさは１．４×０．７μｍで円柱状である。胞子の表
面は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は見出さ
れない。

【０００８】（II）各種培地上での性状イー・ビー・シャーリング〔Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎ
ｇ〕とデー・ゴツトリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の
方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システ
ィマティック・バクテリオロジー、第１６巻、第３１３
頁、１９６６年）によって調べた本生産菌の培養性状を
表１、表２、表３に示す。色調は標準色として、カラー
・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポ
レーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を
用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコードを併
せて記した。以下は特記しない限り、２７℃、２週間目
の各培地における観察結果である。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】

【表３】

【００１２】（III)生理学的性質（１）メラニン色素の生成（イ）チロシン寒天陽性（ロ）ペプトン・イースト鉄寒天陽性（ハ）グルコース・ペプトン・ゼラチン培地陽性（２１〜２３℃）（ニ）トリプトン・イースト液陰性（２）チロシナーゼ反応陽性（３）硫化水素の生産陽性（４）硝酸塩の還元陰性（５）ゼラチンの液化（２１〜２３℃）陽性（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）（６）スターチの加水分解陽性（７）脱脂乳の凝固（３７℃）陽性（８）脱脂乳のペプトン化（３７℃）陰性（９）生育温度範囲１０〜３７℃ 生育至適温度２６℃ （１０）炭素源の利用性（プリーダム・ゴトリーブ寒天培地）利用する；グルコース、アラビノース、キシロースやや利用する；フラクトース、シュークロース利用しない；ラフイノース、メリビオース、マンニトール、ラムノース、イノシトール（１１）セルロースの分解陰性

【００１３】（IV）細胞壁組成細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。以上、本
菌の菌学的性状を要約すると次の通りである。細胞壁中
のジアミノピメリン酸はＬＬ型である。気菌糸の形態は
直線状で、長い胞子鎖を形成する。胞子の表面は平滑で
ある。培養状の諸性質としては、栄養菌糸はブラウン系
の色調を呈し、気菌糸はグレイ系あるいは白色系の色調
を呈する。可溶性色素はグルコース・硝酸塩寒天、グル
コース・ペプトン寒天で産生する。

【００１４】これらの結果から、本菌株はストレプトマ
イセス属に属する菌種であり、プリドハムとトレスナー
の分類（バージズ・マニュアル・オブ・デターミネーテ
ィブ・バクテリオロジー、第八版、第７４８〜８２９
頁、１９７４年）によるグレイシリーズあるいはホワイ
トに属する菌種であると考えられる。なお、本菌株は、
ストレプトマイセスエスピーＯＨ−４１５６（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．ＯＨ−４１５６として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。（ＦＥ
ＲＭＰ−１２９４７号）。

【００１５】以上、物質ＯＨ−４１５６生産菌について
説明したが、放線菌の一般的性状として菌学上の性状は
きわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的に
あるいは通常行われる紫外線照射またはＸ線照射または
変異誘導剤例えばＮ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異
手段により変異することは周知の事実であり、このよう
な人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ストレプト
マイセス属に属し、物質ＯＨ−４１５６を生産する能力
を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。

【００１６】本発明においては、先ずストレプトマイセ
ス属に属する物質ＯＨ−４１５６生産菌が培地に培養さ
れる。本菌の培養においては、通常の放線菌の培養が一
般に用いられる。培地としては、微生物が同化し得る炭
素源、消化し得る窒素源さらに必要に応じ無機塩などを
含有させた栄養培地が用いられる。同化し得る炭素源と
しては、ブドウ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロ
ース、コーン・ステイープ・リカー、グリセリン、有機
酸などが単独または組合わせて用いられる。消化し得る
窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆粉、コーン・ステイープ・リカー、綿実
粕、カゼイン、大豆蛋白分解物、アミノ酸、尿素などの
有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化
合物が単独または組み合わせて用いられる。その他、必
要に応じナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マ
グネシウム塩、リン酸塩などの無機塩類が添加される。
さらに、培地には、必要に応じて、本菌の生育や物質Ｏ
Ｈ−４１５６の生産を促進する微量栄養素、発育促進物
質、前駆物質を適当に添加してもよい。

【００１７】培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養な
どの好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気
攪拌培養が好ましい。培養のpHは中性付近で培養を行う
のが好ましい。培養温度は２０〜３７℃でも行い得る
が、通常はたとえば２４〜３０℃（好ましくは２７℃付
近）とする。培養時間は、液体培養の場合、通常３〜６
日間培養を行うと、本抗生物質が生成蓄積される。培養
物中の物質ＯＨ−４６５２の蓄積量が最大に達したとき
に培養を終了すればよい。これらの培地組成、培地の液
性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用
する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果
が得られるように適宜調節、選択されることはいうまで
もない。液体培養において、発泡があるときは、シリコ
ン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用でき
る。

【００１８】このようにして得られた培養物に蓄積され
た物質ＯＨ−４１５６は、培養濾液および培養菌体中に
含有されているので、培養濾液から物質ＯＨ−４１５６
を必要に応じて濾過補助剤たとえばセライト、ハイフロ
ースーパーセルなどを加えて濾過するか、または遠心分
離して培養濾液と菌体とに分離し、培養濾液と菌体の有
機溶媒抽出物を濃縮したものの混合物から物質ＯＨ−４
１５６を採取するのが有利である。また、培養濾液およ
び分離しないでそのまま非親水性有機溶媒により抽出す
るこができる。また、物質ＯＨ−４１５６の含有量が培
養濾液と菌体のどちらかに極端に多いときはその多い方
から抽出してもよい。培養菌体から物質ＯＨ−４１５６
を分離精製するためには、通常、培養濾液と菌体の有機
溶媒抽出物を濃縮した物の混合物またはそれぞれを非親
水性溶媒、たとえば酢酸エチル、クロロホルムで抽出す
ることにより、物質ＯＨ−４１５６が有機溶媒に転溶さ
れる。

【００１９】このようにして得られた有機溶媒層は、必
要に応じ種々の脱水剤、たとえば無水硫酸ナトリウム、
ビーズゲルなどを加えて脱水された後、減圧下で有機溶
媒が留去される。この濃縮操作において物質ＯＨ−４１
５６は安定な物質であるが、通常加熱温度を５０℃以下
となるように行うのが好ましい。残渣にヘキサン、石油
エーテルなどの有機溶媒を加えて物質ＯＨ−４１５６を
沈澱させることができる。得られた沈澱物は数回ヘキサ
ンなどで洗浄後、吸引濾過または遠心分離により物質Ｏ
Ｈ−４１５６の粗成物を採取することができる。上記の
粗成物をさらに精製するためには物質ＯＨ−４１５６と
混雑物との溶解度の差や混じり合わない二液相関の分配
の差や各種吸着担体に対する吸着力の差を利用した多く
の手段が可能であるが、特にクロマトグラフイーは物質
ＯＨ−４１５６の精製に有効な方法である。

【００２０】物質ＯＨ−４１５６の精製に有効なクロマ
トグラフイーは、シリカゲル、アルミナ、活性炭セルロ
ース、ヒドロキシアパタイトＨＰ−２０などの吸着樹脂
などによる吸着クロマトグラフイー、シラン化シリカゲ
ル、オクタデシルシラン化シリカゲルなどを用いる逆相
分配クロマトグラフイー、セファデックスＬＨ−２０、
トヨパールなどを用いる分子篩にもとずくゲル濾過クロ
マトグラフイーなどを用いるイオン交換クロマトグラフ
イーなどが挙げられる。

【００２１】物質ＯＨ−４１５６はこれらのクロマトグ
ラフイーや電気泳動、向流分配、限外濾過などの手段を
単独、あるいは任意の順序にて組み合わせまたは反復し
て用いることにより分離精製することができる。例えば
上記組製物を少量のクロロホルムに溶かしシリカゲルに
吸着させ、クロロホルム−メタノール系混合溶液を用い
てカラムクロマトグラフイーを行い、その活性画分を減
圧濃縮後、少量のクロロホルムに溶かし、これをクロロ
ホルム−メタノール系混合溶液で分子篩にもとづくゲル
濾過クロマトグラフイーを行うことにより物質ＯＨ−４
１５６を分離精製することができる。

【００２２】次に、本物質ＯＨ−４１５６の理化学的性
質および生物学的性質について述べる。理化学的性質（１）分子量；２０９６（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マス
スペクトルによる）（２）融点；１８８〜１９３℃ （３）比旋光度；〔α〕_D ²⁵＝−７０．３°（ｃ＝１．
０、メタノール）（４）紫外部吸収スペクトル（メタノール中で測定）；
図１に示すとおりであり、２０３、２２５（肩）、２６
５（肩）ｎｍに極大吸収を有する（５）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法で測
定）；図２に示すとおりであり、３４５０、３３００、
３０００、１６６０、１５３０、１３４０、１２６０cm
^-1付近に特徴的な吸収帯を有する

【００２３】（６）溶剤に対する溶解性；水、アセト
ン、酢酸エチル、エチルエーテル、ヘキサンに難溶、メ
タノール、エタノール、クロロホルム、ベンゼンに可溶（７）呈色反応；硫酸、ヨウ素に陽性（８）１Ｈ核磁気共鳴スペクトラム（ＣＤＣl₃中、３０
０ＭＨ_z）；図３に示す通り（９）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトラム（ＣＤＣl₃中、７
５ＭＨ_z）；図４に示す通り

【００２４】生物学的性質（１０）抗菌スペクトル（アガーダイリュウション法）寒天希釈法により各試験菌に対する最小生育阻止濃度
（ＭＩＣ）は下記表４に示す通りである。

【００２５】

【表４】

【００２６】以上の結果より物質ＯＨ−４１５６はマイ
クロコッカス・ルーテウス菌に対して抗菌活性を示す。（１１）物質ＯＨ−４１５６の殺細胞活性物質ＯＨ−４１５６はＢ１６メラノーマ（悪性黒色腫）
細胞に３日間作用させると、５．４μｇ／mlのＩＣ
₅₀（５０％発育阻止濃度）を示す。

【００２７】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、これにより本発明を限定するものではない。

【実施例】５００ml容三角フラスコにグルコース０．１
％、澱粉２．４％、ペプトン０．３％、肉エキス０．３
％、酵母エキス０．５％、炭酸カルシウム０．４％を含
む液体培地（pH７．０）１００mlを仕込み、蒸気滅菌し
た後、これに澱粉１％、ＮＺアミン０．３％、酵母エキ
ス０．１％、肉エキス０．１％、炭酸カルシウム０．３
％、寒天２％を含む寒天斜面培地上に２７℃、６日間培
養したストレプトマイセス・エスピーＯＨ−４１６５
（ＦＥＲＭＰ−１２９４７）の斜面培養から一白金耳
を接種し、振幅１７cm、毎分１２０回往復するレシプロ
カルシェーカーで２７℃で７２時間振投培養して種母を
得た。

【００２８】次に、３０l 容ジャーフアーメンタにマル
トース５％、乾燥酵母１．５％、エビオス２．５％、Ｋ
Ｂｒ１．０％、ＫＨ₂ＰＯ₄０．０５％、ＭｇＳＯ
₄０．０５％を含む培地２０l に仕込み滅菌した後、上
記方法で得られた種母２００mlを無菌的に移植し、９６
時間通気攪拌培養して培養物約２０l を得た。この培養
物から遠心分離により菌体を集め、これにメタノールを
加えて充分攪拌した後、濾過によりメタノール抽出液を
分離した。この酢酸エチル層を、減圧濃縮して得られた
油状残渣をあらかじめクロロホルムで充填されたシリカ
ゲル（メルク社）カラム（５０mm×２５０cm）に吸着せ
しめ、クロロホルム−メタノール混合溶媒で溶出するこ
とによるクロマトフラフイーを行った。得られた活性画
分を減圧濃縮して物質ＯＨ−４１５６を含む１４２mgの
粗成物を得た。

【００２９】次いで、物質ＯＨ−４１５６を含む粗成物
をセファデックスＬＨ−２０を充填したカラム（１５cm
×７０cm）を用いたカラムクロマトグラフイーを行っ
た。少量のメタノールに溶解した粗成物を通導し、メタ
ノールにて展開溶出せしめ、物質ＯＨ−４１５６を含む
９３mgの粗成物を得た。これを少量のメタノールに溶解
し、高速液体クロマトグラフイー（資生堂カプセルパッ
クＣ１８ＳＧ１２０Ａ、２０×２５０mm）にかけ、８０
％メタノール溶液を移動相として活性画分を分取るする
ことにより物質ＯＨ−４１５６の精製品４２mgを得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】物質ＯＨ−４１５６の紫外線吸収スペクトルで
ある。

【図２】物質ＯＨ−４１５６の赤外線吸収スペクトルで
ある。

【図３】物質ＯＨ−４１５６の１Ｈ核磁気共鳴スペクト
ルである。

【図４】物質ＯＨ−４１５６の１３Ｃ核磁気共鳴スペク
トルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有する物質ＯＨ−
４１５６。（１）分子量；２０９６（高速原子衝撃（ＦＡＢ）マス
スペクトルによる）（２）融点；１８８〜１９３℃ （３）比旋光度；〔α〕_D ²⁵＝−７０．３°（ｃ＝１．
０、メタノール）（４）紫外部吸収スペクトル（エタノール中）；２０
３、２２５（肩）、２６５（肩）ｎｍに極大吸収を有す
る（５）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ）：３４５０、３
３００、３０００、１６６０、１５３０、１３４０、１
２６０cm^-1付近に特徴的な吸収帯を有する（６）溶剤に対する溶解性：水、アセトン、酢酸エチ
ル、エチルエーテル、ヘキサンに難溶、メタノール、エ
タノール、クロロホルム、ベンゼンに可溶（７）呈色反応：硫酸、ヨウ素反応に陽性
【請求項２】ストレプトマイセス属に属する物質ＯＨ
−４１５６生産菌を培地に培養して、培養物中に物質Ｏ
Ｈ−４１５６を蓄積せしめ、該培養物から物質ＯＨ−４
１５６を採取することを特徴とする物質ＯＨ−４１５６
の製造方法。
【請求項３】ストレプトマイセス属に属する物質ＯＨ
−４１５６生産菌がストレプトマイセスエスピーＯＨ
−４１５６（ＦＥＲＭＰ−１２９４７）である請求項
２記載の製造方法。