JPH0733736A

JPH0733736A - 新規抗生物質アジセマイシンｂおよびその製造方法

Info

Publication number: JPH0733736A
Application number: JP20250093A
Authority: JP
Inventors: Tomio Takeuchi; 富雄竹内; Toshio Tsuchida; 外志夫土田; Hironobu Iinuma; 寛信飯沼; Yoshikazu Takahashi; 良和高橋; Hiroshi Osanawa; 博長縄; Tsutomu Sawa; 力澤; Masa Hamada; 雅濱田
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 1995-02-03

Abstract

(57)【要約】【目的】グラム陽性菌特に抗酸性菌に対して優れた抗
菌活性を有する新規な抗生物質を製造し、収得すること
である。【構成】次式で表されて抗菌活性を有する両性な黄色粉末である抗生
物質アジセマイシンＢ。この抗生物質は、アミコラトプ
シス属に属する微生物、MJ126-NF4 株の培養により製造
される。【効果】このアジセマイシンＢは抗菌活性を有し、グ
ラム陽性菌特に抗酸性菌に強力な抗菌活性を示して、医
療用抗菌剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アミコラトプシス属に
属する微生物によって産生され、抗菌活性を有しグラム
陽性菌特に抗酸性菌に対して強力な抗菌活性をしめす新
規な抗生物質アジセマイシン（Azicemicin）Ｂまたはそ
れの塩、並びにその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物の生産する抗菌活性、特に抗酸性
菌活性を有する抗生物質としてリファマイシン，カナマ
イシン，ストレプトマイシン，カプレオマイシン，エン
ビロマイシン，サイクロセリンなど多数の有用な化合物
が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】抗菌活性、特に抗酸性
菌に対する抗菌活性をしめす抗生物質、例えばリファマ
イシンは、現在広く利用されているが耐性菌の出現及び
肝障害、血液障害等の副作用をしめすなど、種々の問題
点がある。リファマイシン耐性菌に対して強力な抗菌活
性を有し、かつ毒性の少ない新規な抗菌活性物質の提供
が待たれる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来より
有用な抗生物質の開発、実用化研究を促進してきたが、
かかる研究の一端として先に、本発明者らによって、土
壌より分離された放線菌の一種であるアミコラトプシス
属に属してMJ126-NF4 の菌株番号が付された微生物が新
規な抗生物質を産生することを知見した。この抗生物質
を分離してそれの物理化学的性状を調べ且つ分子式Ｃ₂₃
Ｈ₂₅Ｏ₉Ｎで示される両性な黄褐色固体の物質であって
グラム陽性菌、特に抗酸性菌に強い抗菌活性を有するこ
とを見出し、これを抗生物質MJ126-NF4Aと命名した（特
願平5-69072 号；1993年３月５日出願）。

【０００５】最近の研究によって、本発明者らは、この
抗生物質MJ126-NF4Aの化学構造が次式で表されることを認め、また抗生物質MJ126-NF4Aをアジ
セマイシン（Azicemicin）Ａと改名した。

【０００６】更に、本発明者らは、研究を進めて前記の
アミコラトプシス属のMJ126-NF4 株がアジセマイシンＡ
と異なる新規な抗生物質を産生し且つこれもグラム陽性
菌、特に抗酸性菌の発育を強く阻止することを見出し
た。この新規抗生物質を単離することに成功し、またそ
れの物理化学的性状を調べ、それの化学構造が下記の式
（Ｉ）で表されることを知見して、この新規抗生物質を
アジセマイシンＢ(Azicemicin Ｂ）と命名した。本発明
は、これらの知見に基づいて完成したものである。

【０００７】従って、第１の本発明によると、下記の式で表されるアジセマイシンＢまたはその塩が提供され
る。

【０００８】第１の本発明によるアジセマイシンＢは下
記の性質を有するものである。（１）抗生物質アジセマイシンＢの理化学的性状Ａ）性状：黄色粉末Ｂ）薄層クロマトグラフィー〔メルク社Art.5715，展開
溶媒クロロホルム−メタノール−水(4:1:0.1）で展
開〕：Ｒｆ値0.42 Ｃ）両性の物質である。Ｄ）マススペクトル(m/z）：446(Ｍ＋Ｈ）⁺ 444(Ｍ−
Ｈ）^-

【０００９】Ｅ）紫外線吸収スペクトル： (i) メタノール中で測定したＵＶ吸収スペクトル図を添
付図面の図１に示す。 λmax, nm(ε）234(20100), 278(35700), 322(5270), 3
36sh(4220),409(11500) (ii) 0.1N-NaOH-90％メタノール中で測定したＵＶ吸収
スペクトル図を添付図面の図２に示す。 λmax, nm(ε）242(13700), 290(38100), 414(18800) (iii) 0.1N-HCl−90％メタノール中で測定したＵＶ吸収
スペクトル図を添付図面の図３に示す。 λmax, nm(ε）234(22500), 277(37000), 323(5630), 3
35sh(4510),409(11400)

【００１０】Ｆ）赤外線吸収スペクトル(KBr錠剤法) ：
添付図面の図４に示す。 νmax(cm^-1), 3410, 2940, 1720, 1620, 1520, 1390 Ｇ）¹³C-NMR スペクトル（CDCl₃）：添付図面の図５に
示す。Ｈ）¹H-NMR スペクトル（CDCl₃/TMS）：添付図面の図
６に示す。

【００１１】（２）抗生物質アジセマイシンＢの生物学
的性質Ａ）抗菌スペクトル抗生物質アジセマイシンＢの普通栄養寒天板上での各種
細菌に対する最低発育阻止濃度は、次の表１にしめす通
りである。

【００１２】

【００１３】Ｂ）急性毒性新規抗生物質アジセマイシンＢのマウスに対する急性毒
性を試験した結果、マウスに静脈注射により72.5mg／kg
を投与したが異常は見られなかった。

【００１４】第２の本発明によると、新規抗生物質アジ
セマイシンＢの製造法として、アミコラプトシス属に属
するアジセマイシンＢ生産菌を栄養培地中に培養してア
ジセマイシンを生成、蓄積させ、その培養物から該抗生
物質を採取することを特徴とする前記の式（Ｉ）で表さ
れるアジセマイシンＢの製造方法が提供される。

【００１５】第２の本発明にいうアジセマイシンＢ生産
菌とは、抗生物質アジセマイシンＢを生産しうる微生物
であれば、その属、種を問わないが、それの好ましい具
体的な一例としてはアミコラプトシス菌に属する微生物
であってMJ126-NF4 の菌株番号を付された菌がある。

【００１６】このMJ126-NF4 株は、平成元年９月、微生
物化学研究所において、東京都世田谷区の土壌より分離
された放線菌で、MJ126-NF4 の菌株番号が付されたもの
である。このMJ126-NF4 株の菌学的性状を以下に詳細に
記載する。

【００１７】１．形態よく分枝した基生菌糸は分断が認められる。気菌糸は直
状あるいは不規則な曲状で、円筒形〜長円形の断片また
は胞子様の構造に分断する。その大きさは約0.3 〜0.5
×0.8 〜1.1 ミクロンである。また、培養後18日目頃よ
り気菌糸は１〜２回転のいびつならせん形成が認められ
る。輪生枝および胞子のうは認められない。

【００１８】２．各種培地における生育状態色の記載について［］内に示す標準は、コンティナー
・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニー・マニュアル(Container Corporation ofAmerica
の color harmony manual)を用いた。

【００１９】（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（30
℃培養）うす黄［2ca, Lt Ivory ］の発育上に、白の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（30℃培養）うす黄［2ca, Lt Ivory]〜うすオリーブ［1 ie, Dusty
Olive]の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は
かすかに緑色味を帯びる。（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP-培地
５、30℃培養）うす黄だいだい［3gc, Lt Tan]〜黄茶［3 le, Cinnamon
〜3ng, Yellow Maple]の発育上に、白〜茶白の気菌糸を
着生し、溶解性色素はかすかに茶色味を帯びる。（４）スターチ・無機塩寒天培地（ISP-培地４、30℃培
養）うす黄だいだい［3gc, Lt Tan]〜灰味黄茶［3ni, Clove
Brown］の発育上に、白の気菌糸を着生し、溶解性色素
は認められない。

【００２０】（５）チロシン寒天培地（ISP-培地７、30
℃培養）灰味黄茶［3ni, Clove Brown］の発育上に、白〜灰白
［b, Oyster White]の気菌糸を着生し、溶解性色素は部
分的に暗い茶を呈する。（６）栄養寒天培地（30℃培養）うす黄だいだい［3gc, Lt Tan]の発育上に、白の気菌糸
をうっすらと着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。（７）イースト・麦芽寒天培地（ISP-培地２、30℃培
養）うす黄茶［3 le, Cinnamon］の発育上に、白の気菌糸を
着生し、溶解性色素は茶色味を帯びる。（８）オートミール寒天培地（ISP-培地3 、30℃培養）うす黄［2ca, Lt Ivory]の発育上に、白の気菌糸を着生
し、溶解性色素は認められない。（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（30℃培養）うす黄だいだい［3gc, Lt Tan]〜うす黄茶［3ic, Lt Am
ber]の発育上に、茶白［3ba, Pearl］の気菌糸をうっす
らと着生し、溶解性色素は黄色味を帯びる。

【００２１】（10）スターチ寒天培地（30℃培養）無色〜うす黄だいだい［3ca, Pearl Pink]の発育上に、
白の気菌糸を着生する。溶解性色素は認めらない。（11）リンゴ酸石灰寒天培地（30℃培養）うすオリーブ［1 gc, Citron］の発育上に、白の気菌糸
をうっすらと着生し、溶解性色素はうすオリーブを呈す
る。（12）セルロース（ろ紙片添加合成液、30℃培養）発育は無色、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認めら
れない。（13）ゼラチン穿刺培養 15％単純ゼラチン培地（20℃培養）では、発育はうす
黄、白の気菌糸を着生し、溶解性色素は黄茶を呈する。
グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（27℃培養）の場
合、発育はうす黄、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶
解性色素は茶色である。（14）脱脂牛乳（37℃培養）発育はうす黄〜暗いオリーブ、気菌糸は着生せず、しか
も溶解性色素は認められない。

【００２２】３．生理的性質（１）生育温度範囲イースト・スターチ寒天培地（溶性デンプン 1.0％、イ
ースト・エキス 0.2％、ひも寒天 3.0％、pH 7.0）を用
い、10℃、20℃、24℃、27℃、30℃、37℃および50℃の
各温度で試験した結果、10℃、50℃を除き、そのいずれ
の温度でも生育したが、生育至適温度は30℃付近と思わ
れる。

【００２３】（２）ゼラチンの液化（15％単純ゼラチン
培地、20℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培
地、27℃培養） 15％単純ゼラチン培地、グルコース・ペプトン・ゼラチ
ン培地のいずれの場合も培養後３日目頃より液化が始ま
るが、液化の進行は極めて遅く、３週間の培養では完了
しなかった。

【００２４】（３）スターチの加水分解（スターチ・無
機塩寒天培地およびスターチ寒天培地、いずれも30℃培
養）スターチ・無機塩寒天培地では、培養後14日目頃より水
解性が認められるが、その作用は弱い方である。また、
スターチ寒天培地においては、培養後20日目頃より水解
性が認められるが、その作用は極めて弱い。

【００２５】（４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂
牛乳、37℃培養）約３週間の培養では、凝固及びペプトン化は認められな
い。（５）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス、ISP-培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培
地、ISP-培地６；チロシン寒天培地、ISP-培地７；いず
れも30℃培養）トリプトン・イースト・ブロス及びペプトン・イースト
・鉄寒天培地では陽性、チロシン寒天培地では、判然と
しない。

【００２６】（６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴド
リーブ寒天培地、ISP-培地９；30℃培養）Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、
イノシトール、Ｄ−マンニトールを利用して発育し、シ
ュクロースは利用しない。Ｌ−アラビノース、ラムノー
ス、ラフィノースの利用は判然としない。

【００２７】（７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰
寒天培地、30℃培養）培養後７日目頃より溶解性が認められ、その作用は中等
度である。（８）硝酸塩の還元反応（0.1 ％硝酸カリウム含有ペプ
トン水、ISP-培地８、30℃培養）陽性である。（９）セルロースの分解（ろ紙片添加合成液、30℃培
養）約３ヵ月間の観察で分解は認められない。

【００２８】以上の性状を要約すると、MJ126-NF4 株
は、その形態上、基生菌糸は分断を認め、気菌糸は直状
あるいは不規則な曲状で、円筒形〜長円形の断片または
胞子様の構造に分断する。培養後18日目頃よりいびつな
らせん形成を認める。輪生枝及び胞子のうは認められな
い。種々の培地で、うす黄〜黄茶、あるいはうすオリー
ブの発育上に白の気菌糸を着生し、溶解性色素はかすか
に茶色味を帯びる。メラニン様色素をおそらく生成して
いると判断され、スターチの水解性および蛋白分解力は
弱く、硝酸塩の還元反応は陽性である。

【００２９】ところで、MJ126-NF4 株の菌体成分は、細
胞壁にメソ型の2,6-ジアミノピメリン酸、アラビノース
及びガラクトースを含み、タイプIVを示した。全菌体中
の還元糖はアラビノース、ガラクトースを含むＡ型であ
る。グリコレートテストの結果はアセチル型であった。
また、ミコール酸を含まず、リン脂質はＰII型（ホスフ
ァチジルエタノールアミンを含みホスファチジルコリン
及び未知のグルコサミン含有リン脂質を含まない）、主
要なメナキノンはMK-9(H₄) である。脂肪酸はi-16:0,
16:0, ai-17 及び10Me-16:0 を主要に含有している。

【００３０】以上の結果より、MJ126-NF4 株はアミコラ
トプシス属〔Amycolatopsis, 文献, International Jo
urnal of Systematic Bacteriology, 36巻, 29-37 頁
（1986）〕に属するものと考えられる。アミコラトプシ
ス属の既知菌種を検索すると、アミコラトプシス・スル
フレア〔Amycolatopsis sulphurea, 文献１, 同上及び
文献２, International Journal of Systematic Bacter
iology, 37巻, 292-295頁（1987) 〕が、近縁の種とし
てあげられた。

【００３１】そこで、MJ126-NF4 株と上記の当研究所保
存菌株とを実地に比較検討中である。現時点ではMJ126-
NF4 株をアミコラトプシス・エスピー（Amycolatopsis
sp.）MJ126-NF4 とする。なお、MJ126-NF4 株を工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成５年１
月11日、FERM P-13362として受託された。

【００３２】第２の本発明の方法において、アジセマイ
シンＢ生産菌の培養には、栄養源として、放線菌の栄養
源として通常使用されるもの、例えば炭水化物、窒素
源、無機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例え
ば、ぶどう糖、麦芽糖、糖蜜、デキストリン、グリセリ
ン、澱粉などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油
脂のごとき炭素源を用いることができ、またペプトン、
肉エキス、綿実紛、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コ
ーン・スチープリカー、NZ- アミン、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源
を用いることができる。更に、燐酸二カリウム、燐酸ナ
トリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、
塩化マンガンなどの無機塩が使用でき、必要により微量
金属例えばコバルト、鉄などを添加することができる。
栄養源としては、その他、抗生物質アジセマイシンＢの
生産に使用菌が利用しうるものであればいずれの公知の
栄養源でも使用できる。

【００３３】上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約
されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、
使用するアジセマイシンＢ生産菌にとって最適の栄養源
の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単な小規模実
験により容易に決定することができる。

【００３４】また、上記の栄養源からなる栄養培地は、
培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後
で、培地のpHを 6〜8 の範囲、特にpH 6.5〜7.5 の範囲
に調節するのが有利である。

【００３５】かかる栄養培地でのアジセマイシンＢ生産
菌の培養は、一般の放線菌による抗生物質の製造におい
て通常使用されている方法に準じて行なうことができ
る。通常、好気条件下に培養するのが好適であり、通
常、攪拌しながら及び／又は通気しながら行なうことが
できる。また、培養方法としては静置培養、振とう培
養、通気攪拌をともなう液内培養の諸方法のいずれも使
用可能であるが、液体培養が抗生物質アジセマイシンＢ
の大量生産に適している。

【００３６】使用しうる培養温度はアジセマイシンＢ生
産菌の発育が実質的に阻害されず、該抗生物質を生産し
うる範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用
する生産菌に応じて適宜選択できるが、特に好ましい培
養温度は25〜30℃の範囲内の温度を挙げることができ
る。

【００３７】培養は通常では新規抗生物質アジセマイシ
ンＢが培養物中に生成されて十分に蓄積するまで継続す
ることができる。その培養時間は培地の組成や培養温
度、使用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常
72〜96時間の培養で目的の抗生物質を得ることができ
る。培養物中の新規抗生物質アジセマイシンＢの蓄積量
はミクロコッカス・ルテウス、エシェリヒア・コリ、マ
イコバクテリウム・コリ、マイコバクテリウム・スメガ
タス607 を使用して、通常の抗生物質の定量に用いられ
る円筒平板法により定量することができる。

【００３８】かくして、培養物中に蓄積された新規抗生
物質アジセマイシンＢは、培養後に必要により、濾過、
遠心分離などのそれ自体公知の分離方法によって菌体を
除去した後、その濾液を酸性（pH 2〜4)に調整し、アル
コール系有機溶媒、特にブタノールなどを用いた溶媒抽
出や、吸着やイオン交換能を利用したクロマトグラフィ
ーを単独でまたは、組み合わせて使用することにより単
離精製して採取することができる。吸着やイオン交換能
を有するクロマトグラフィー用担体としては、活性炭、
シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹
脂もしくは各種のイオン交換樹脂を用いることができ
る。かくして、前記した特性を有する新規抗生物質アジ
セマイシンＢが得られる。

【００３９】なお、本発明のアジセマイシンＢは塩酸、
硫酸等の薬学的に許容できる無機酸、あるいは酢酸等の
薬学的に許容できる有機酸と付加塩を形成し、またアル
キルアミン等の有機塩基との塩を形成する。

【００４０】次に実施例により本発明を更に詳細に説明
する。

【００４１】

【実施例】実施例１抗生物質アジセマイシンＢの製造ガラクトース２％、デキストリン２％、バクト−ソイト
ン１％、コーンステープリカー 0.5％、グリセン１％、
硫酸アンモニウム 0.2％、炭酸カルシウム 0.2％、シリ
コンオイル１滴（pH 7.4に調整）を含む液体培地を三角
フラスコに 110mlずつ分注し、常法により 120℃で20分
滅菌後、寒天斜面培地に培養したMJ126-NF4 株（微工研
菌寄第13362 号）を接種し、30℃で８日間、回転振とう
培養(180回転／分）した。

【００４２】これで得られた培養物を種培養液として用
い、グリセリン２％、デキストリン２％、バクト−ソイ
トン１％、粉末酵母エキス 0.3％、硫酸アンモニウム
0.2％、炭酸カルシウム 0.2％、シリコンオイル１滴を
含む液体培地（pH 7.4に調整）を110 mlずつ分注した三
角フラスコ45本を 120℃で20分間滅菌した後、それぞれ
のフラスコに２mlずつ接種し、27℃で５日間回転振とう
培養(180回転／分）した。得られた培養液を濾過し、濾
液をダイヤイオンHP-20 (320ml）を充填したカラムに吸
着させ、順次、水２L, 30 ％メタノール水1.5L, 80％メ
タノール水1.5Lで溶出し、抗菌活性をしめすフラクショ
ンを集めて濃縮乾固した。残留物をメタノールに溶かし
シリカゲル60（メルク社Art.7734）10ｇを加え減圧下に
濃縮乾燥して粉体を得た。

【００４３】この粉体を上記シリカゲル60ｇを充填した
カラムにのせクロマトグラフィーを行なった。溶出溶媒
としてクロロホルム(250ml）、クロロホルム−メタノー
ル混合溶媒（混合比20:1) (210ml）、さらに同じくクロ
ロホルム−メタノール混合溶媒（混合比10:1) (220m
l）、同じく（混合比7:1)(240ml）、同じく（混合比5:
1）(300ml) 、同じく（混合比4:1)(250ml）、同じく
（混合比2:1)(240ml) を用い順次溶出し、アジセマイシ
ンＡを含まないが、アジセマイシンＢを含むフラクショ
ンを集めた(0.205g)。さらに、該フラシションを減圧下
に濃縮乾固してその残渣の56mgをＴＬＣ（メルク社Art.
5715）によりＲｆ値0.42〔展開溶媒：クロロホルム−メ
タノール−水（4:1:0.1)〕の位置にＵＶ(254nm）の吸収
をしめす部分の物質を分離精製すると黄色粉末としてア
ジセマイシンＢが 8.1mg得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】メタノール中のアジセマイシンＢの紫外線吸収
スペクトル曲線図である。

【図２】0.1N-NaOH-90％メタノール中のアジセマイシン
Ｂの紫外線吸収スペクトル曲線図である。

【図３】0.1N-HCl-90 ％メタノール中のアジセマイシン
Ｂの紫外線吸収スペクトル曲線図である。

【図４】アジセマイシンＢの赤外線吸収スペクトル曲線
図である。

【図５】アジセマイシンＢの¹H-NMR スペクトル曲線図
である。

【図６】アジセマイシンＢの¹³C-NMR スペクトル曲線図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高橋良和東京都多摩市桜ケ丘３丁目２番地の３ (72)発明者長縄博東京都大田区田園調布本町３番17号 (72)発明者澤力神奈川県綾瀬市綾西四丁目６番７号 (72)発明者濱田雅東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデンス405号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式で表される抗生物質アジセマイシンＢまたはその塩。
【請求項２】アミコラトプシス属に属する請求項１記
載の抗生物質アジセマイシンＢの生産菌を栄養培地中に
培養してアジセマイシンＢを生成、蓄積させ、その培養
物から該抗生物質を採取することを特徴とする抗生物質
アジセマイシンＢの製造法。