JPH0659216B2 - 新規ウレア−ゼおよびその製造法 - Google Patents
新規ウレア−ゼおよびその製造法Info
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- JPH0659216B2 JPH0659216B2 JP60099249A JP9924985A JPH0659216B2 JP H0659216 B2 JPH0659216 B2 JP H0659216B2 JP 60099249 A JP60099249 A JP 60099249A JP 9924985 A JP9924985 A JP 9924985A JP H0659216 B2 JPH0659216 B2 JP H0659216B2
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- JP
- Japan
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- mol
- urease
- optimum
- urea
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規ウレアーゼおよびその製造法に関する。さ
らに詳しくは極めて耐熱性で安定性がよく、かつ尿素に
対するKm値が小さい新規ウレアーゼおよびシュードモナ
ス属またはノカルデイア属に属する菌株によるその製造
法に関する。
らに詳しくは極めて耐熱性で安定性がよく、かつ尿素に
対するKm値が小さい新規ウレアーゼおよびシュードモナ
ス属またはノカルデイア属に属する菌株によるその製造
法に関する。
ウレアーゼは一般に植物、動物、微生物などに広く分布
しているが、特にナタマメに多量に含まれている故、現
在ではナタマメ由来のウレアーゼが工業生産され、尿素
態窒素の測定のための臨床診断試薬としてあるいは人工
腎臓装置などに広く利用されている。
しているが、特にナタマメに多量に含まれている故、現
在ではナタマメ由来のウレアーゼが工業生産され、尿素
態窒素の測定のための臨床診断試薬としてあるいは人工
腎臓装置などに広く利用されている。
しかしながらナタマメ由来のウレアーゼは、尿素に対す
るKm値が１．０５×１０−２Ｍと大きく、反応終了に長
時間を要するため臨床診断試薬として用いる場合、エン
ドポイント法での測定には難点があり、初速度法でしか
用いることができない。また、熱に対しても５０℃まで
しか安定でない。一方微生物起源のウレアーゼに関して
は、報告は多いが酵素の性質あるいは応用に関する研究
は少ない。最近、コリネバクテリウム属、プレビバクテ
リウム属、アースロバクター属、プロテウス属、ミクロ
バクテリウム属、ボルデテア属（特開昭５８−８６０８
１）およびバチルス属（特開昭５９−１７９８７）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なウレアーゼを
生産するとの報告がある。しかし、これらの菌株の生産
するウレアーゼもいずれも尿素に対するKm値が大きいた
め、初速度法しか適用できない。また、４５〜５０℃ま
での温度、pH７〜１０までのpHに安定であると記載され
ており、やや安定性に欠ける故、ウレアーゼの工業生産
には有利であるといい難い。そこで、臨床診断試薬とし
て初速度法にもエンドポイント法にも適用可能であり、
かつ極めて安定であるウレアーゼを生産する微生物の検
索が望まれている。
るKm値が１．０５×１０−２Ｍと大きく、反応終了に長
時間を要するため臨床診断試薬として用いる場合、エン
ドポイント法での測定には難点があり、初速度法でしか
用いることができない。また、熱に対しても５０℃まで
しか安定でない。一方微生物起源のウレアーゼに関して
は、報告は多いが酵素の性質あるいは応用に関する研究
は少ない。最近、コリネバクテリウム属、プレビバクテ
リウム属、アースロバクター属、プロテウス属、ミクロ
バクテリウム属、ボルデテア属（特開昭５８−８６０８
１）およびバチルス属（特開昭５９−１７９８７）など
の微生物が臨床診断試薬として使用可能なウレアーゼを
生産するとの報告がある。しかし、これらの菌株の生産
するウレアーゼもいずれも尿素に対するKm値が大きいた
め、初速度法しか適用できない。また、４５〜５０℃ま
での温度、pH７〜１０までのpHに安定であると記載され
ており、やや安定性に欠ける故、ウレアーゼの工業生産
には有利であるといい難い。そこで、臨床診断試薬とし
て初速度法にもエンドポイント法にも適用可能であり、
かつ極めて安定であるウレアーゼを生産する微生物の検
索が望まれている。
本発明者らは、上記現状に鑑み非常に安定性に優れたウ
レアーゼを生産する微生物について鋭意検討を重ねた結
果、ある種の微生物が培養物中に極めて安定でかつKm値
が小さく臨床診断試薬として使用可能な優れた性質を有
するウレアーゼを著量生産することを見出し、本発明を
完成した。従つて本発明の目的は微生物を培養して、極
めて安定でかつKm値が小さく臨床診断試薬として優れた
性質を有するウレアーゼを工業的に安価に製造する方法
を提供することにある。
レアーゼを生産する微生物について鋭意検討を重ねた結
果、ある種の微生物が培養物中に極めて安定でかつKm値
が小さく臨床診断試薬として使用可能な優れた性質を有
するウレアーゼを著量生産することを見出し、本発明を
完成した。従つて本発明の目的は微生物を培養して、極
めて安定でかつKm値が小さく臨床診断試薬として優れた
性質を有するウレアーゼを工業的に安価に製造する方法
を提供することにある。
本発明を概説すれば、本発明は新規ウレアーゼおよびそ
の製造法に関するものであつて、更に詳細には本発明は
下記の理化学的性質を有する新規ウレアーゼに関する。
の製造法に関するものであつて、更に詳細には本発明は
下記の理化学的性質を有する新規ウレアーゼに関する。
(1)作用： １モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。
１モルの炭酸ガスを生成する。
(2)基質特異性： 尿素に最もよく作用するが、ビウレツトおよびアラント
インにも若干作用する。
インにも若干作用する。
(3)至適pHおよびpH安定性： 至適pHが７．５〜８．５であり、３７℃、６０分間処理
ではpH５．０〜８．０の間で安定である。
ではpH５．０〜８．０の間で安定である。
(4)至適温度および熱安定性： 至適温度が７０℃〜８０℃であり、pH８．０、１０分間
処理では７０℃まで安定である。
処理では７０℃まで安定である。
(5)分子量： ゲル過法で測定した分子量が約２８００００である。
(6)等電点： ５．５〜５．６ (7)阻害剤： Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋およびＺｎ２＋
などの金属塩によつて阻害される。
などの金属塩によつて阻害される。
(8)Km値： １．５×１０−３Ｍ（pH８．０ リン酸緩衝液） また本発明はシュードモナス属またはノカルデイア属の
属する新規ウレアーゼ生産菌を培養し、培養物より上記
新規ウレアーゼを採取することからなる新規ウレアーゼ
の製造法にある。
属する新規ウレアーゼ生産菌を培養し、培養物より上記
新規ウレアーゼを採取することからなる新規ウレアーゼ
の製造法にある。
本発明方法で得られる新規ウレアーゼは極めて安定性が
よいので培養物より高収率で生産することができ、また
後記するごとく非常に優れた性質を有するので臨床診断
試薬等に使用できる。
よいので培養物より高収率で生産することができ、また
後記するごとく非常に優れた性質を有するので臨床診断
試薬等に使用できる。
本発明に使用される微生物にはシュードモナス属または
ノカルデイア属に属する新規ウレアーゼ生産菌株があげ
られる。具体的菌株の例としてシュードモナス・エルギ
ノサ（Pseudomomasaeruginosa）IAM１１５６またはノカ
ルデイア・エリスロポリス（Nocardia erythropolis）I
AM１３９９などがある。
ノカルデイア属に属する新規ウレアーゼ生産菌株があげ
られる。具体的菌株の例としてシュードモナス・エルギ
ノサ（Pseudomomasaeruginosa）IAM１１５６またはノカ
ルデイア・エリスロポリス（Nocardia erythropolis）I
AM１３９９などがある。
本発明方法を更に詳しく説明すれば、培地に加える栄養
源は使用する菌株が利用し、新規ウレアーゼを生産する
ものであればよく、炭素源としては例えばグルコース、
グリセロール、シユークロース、マルトース、ラクトー
ス、デンプン、デキストリン、油脂類などが利用でき、
窒素源としては酵母エキス、ペプトン、コーンスチープ
リカー、肉エキス、硫安、尿素などが適当である。その
他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ニツケル
塩などの無機質および金属塩類を加えてもよく、更には
ビタミン類、生長促進因子を加えてもよい。
源は使用する菌株が利用し、新規ウレアーゼを生産する
ものであればよく、炭素源としては例えばグルコース、
グリセロール、シユークロース、マルトース、ラクトー
ス、デンプン、デキストリン、油脂類などが利用でき、
窒素源としては酵母エキス、ペプトン、コーンスチープ
リカー、肉エキス、硫安、尿素などが適当である。その
他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ニツケル
塩などの無機質および金属塩類を加えてもよく、更には
ビタミン類、生長促進因子を加えてもよい。
新規ウレアーゼ生産菌を培養するに当り、新規ウレアー
ゼの生産量は培養条件により大きく変動するが、一般に
培養温度は２０〜４０℃、培地のpH６〜８が良く、１〜
５日間の通気攪拌培養で新規ウレアーゼの生産は最高に
達する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応
じ、新規ウレアーゼの生産量が最大になるように設定す
るのは当然である。本発明の菌株によつて生成された新
規ウレアーゼは主に菌体中にあるので、培養液を遠心分
離などして菌体を分離する。得られた菌体を超音波処理
など適当な手段で破砕し、遠心分離後上澄液を得る。こ
の上澄液に沈澱剤例えば硫安を２０〜８０w/v%加えるこ
とにより、あるいは有機溶媒例えばアルコール、アセト
ンなどを５０〜８０v/v%加えることにより沈澱として分
離される。得られた沈殿物を限外過、透析あるいはセ
フアデツクス処理などによつて脱塩し、粗酵素液を得
る。得られた粗酵素液を精製するには、予め０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアロース
（OL-６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸着させ、吸着物を
0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.3Ｍリン酸緩
衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集める。次にこの
活性区分を限外過で濃縮し、脱塩液、０．０５Ｍリン
酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアデツクス
（Ａ−５０）のカラムに吸着させ、吸着物を0.1Ｍリン
酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.2Ｍリン酸緩衝液（pH8.
0）で溶出して活性区分を集める。この活性区分をコロ
ジオン膜で濃縮後、予め0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で
緩衝化したセフアクリルＳ−３００のカラムでゲル過
を行ない、活性区分を得る。この活性区分を0.1Ｍリン
酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したフエニル−セフアロー
ス（OL-６Ｂ）のカラムに吸着させ、0.03Ｍリン酸緩衝
液（pH8.0）で洗浄後、0.01Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で
溶出して活性区分を集める。この活性区分を凍結乾燥し
て、精製酵素粉末を得る。
ゼの生産量は培養条件により大きく変動するが、一般に
培養温度は２０〜４０℃、培地のpH６〜８が良く、１〜
５日間の通気攪拌培養で新規ウレアーゼの生産は最高に
達する。培養条件は使用する菌株、培地組成などに応
じ、新規ウレアーゼの生産量が最大になるように設定す
るのは当然である。本発明の菌株によつて生成された新
規ウレアーゼは主に菌体中にあるので、培養液を遠心分
離などして菌体を分離する。得られた菌体を超音波処理
など適当な手段で破砕し、遠心分離後上澄液を得る。こ
の上澄液に沈澱剤例えば硫安を２０〜８０w/v%加えるこ
とにより、あるいは有機溶媒例えばアルコール、アセト
ンなどを５０〜８０v/v%加えることにより沈澱として分
離される。得られた沈殿物を限外過、透析あるいはセ
フアデツクス処理などによつて脱塩し、粗酵素液を得
る。得られた粗酵素液を精製するには、予め０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアロース
（OL-６Ｂ）のカラムに粗酵素液を吸着させ、吸着物を
0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.3Ｍリン酸緩
衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集める。次にこの
活性区分を限外過で濃縮し、脱塩液、０．０５Ｍリン
酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアデツクス
（Ａ−５０）のカラムに吸着させ、吸着物を0.1Ｍリン
酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.2Ｍリン酸緩衝液（pH8.
0）で溶出して活性区分を集める。この活性区分をコロ
ジオン膜で濃縮後、予め0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で
緩衝化したセフアクリルＳ−３００のカラムでゲル過
を行ない、活性区分を得る。この活性区分を0.1Ｍリン
酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したフエニル−セフアロー
ス（OL-６Ｂ）のカラムに吸着させ、0.03Ｍリン酸緩衝
液（pH8.0）で洗浄後、0.01Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で
溶出して活性区分を集める。この活性区分を凍結乾燥し
て、精製酵素粉末を得る。
本発明の新規ウレアーゼの酵素化学的および理化学的性
質は次のとおりである。
質は次のとおりである。
(1)作用： 本酵素は下記反応式のごとく、１モルの尿素と１モルの
水から、２モルのアンモニアと１モルの炭酸ガスを生成
する。
水から、２モルのアンモニアと１モルの炭酸ガスを生成
する。
H2NCONH2＋H2O→２NH3＋CO2 (2)基質特異性： 本酵素は尿素に最もよく作用するが、ビウレツトやアラ
ントインにも若干作用する（第１表）。
ントインにも若干作用する（第１表）。
(3)至適pHおよびpH安定性： 本酵素の至適pHは第１図の曲線で表わされるごとく、pH
７．５〜８．５に高い活性を有している。本酵素を３７
℃においてそれぞれのpHで６０分間処理したときのpH安
定性を第２図に示した。第２図より明らかなように本酵
素はpH５．０〜８．０の間で安定である。
７．５〜８．５に高い活性を有している。本酵素を３７
℃においてそれぞれのpHで６０分間処理したときのpH安
定性を第２図に示した。第２図より明らかなように本酵
素はpH５．０〜８．０の間で安定である。
(4)至適温度および熱安定性： 本酵素の至適温度は第３図の曲線で表わされるごとく、
７０℃〜８０℃に至適温度を有している。本酵素をpH
８．０においてそれぞれの温度で１０分間処理したとき
の熱安定性を第４図に示した。本酵素は７０℃まで安定
であつた。
７０℃〜８０℃に至適温度を有している。本酵素をpH
８．０においてそれぞれの温度で１０分間処理したとき
の熱安定性を第４図に示した。本酵素は７０℃まで安定
であつた。
(5)分子量： 本酵素の分子量は、セフアクリルＳ−３００（フアルマ
シア製）によるゲル過法では約２８００００であつ
た。
シア製）によるゲル過法では約２８００００であつ
た。
(6)等電点： ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法によ
り求めた本酵素の等電点は5.5〜5.6であつた。
り求めた本酵素の等電点は5.5〜5.6であつた。
(7)金属イオンの影響： 本酵素はＡｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋および
Ｚｎ２＋などの金属塩によつて阻害される（第２表）。
Ｚｎ２＋などの金属塩によつて阻害される（第２表）。
(8)Km値： ラインウイバー−バーク（Lineweaver-Burk）プロツト
により本酵素の尿素に対するKm値を求めたところ、1.5
×１０−３Ｍであつた。この値は従来のウレアーゼに比
し、約1/10である。
により本酵素の尿素に対するKm値を求めたところ、1.5
×１０−３Ｍであつた。この値は従来のウレアーゼに比
し、約1/10である。
(9)酵素活性測定法： 新規ウレアーゼ活性の測定は次のようにして求めた。即
ち、３００mM尿素溶液1.0ml、８０mMリン酸緩衝液（pH
8.0）1.0ml、２５mMα−ケトグルタール酸溶液0.1ml、
１０mM NADPH溶液0.1ml、グルタミン酸脱水素酵素溶液
〔７５単位／ml、東洋紡（株）製〕0.1ml、水0.6mlおよ
び適当に希釈した酵素液0.1ml、反応液量3.0mlで３７
℃、１０分間反応させた後、３４０nmの吸光度（ODサン
プル）を測定する。別に対照として尿素溶液の代わりに
水を1.0ml加え同様の操作によつて吸光度（ODブラン
ク）を測定し、△OD340（ODブランク−ODサンプル）を
求めた。新規ウレアーゼ活性は下記の計算式によつて求
められる。
ち、３００mM尿素溶液1.0ml、８０mMリン酸緩衝液（pH
8.0）1.0ml、２５mMα−ケトグルタール酸溶液0.1ml、
１０mM NADPH溶液0.1ml、グルタミン酸脱水素酵素溶液
〔７５単位／ml、東洋紡（株）製〕0.1ml、水0.6mlおよ
び適当に希釈した酵素液0.1ml、反応液量3.0mlで３７
℃、１０分間反応させた後、３４０nmの吸光度（ODサン
プル）を測定する。別に対照として尿素溶液の代わりに
水を1.0ml加え同様の操作によつて吸光度（ODブラン
ク）を測定し、△OD340（ODブランク−ODサンプル）を
求めた。新規ウレアーゼ活性は下記の計算式によつて求
められる。
Vt：反応液量（3.0ml） Vs：酵素液（0.1ml） ｔ：反応時間（１０分間） df：希釈率 〔実施例〕 以下に、本発明による新規ウレアーゼの製造方法を実施
例をもつて示すが、本発明が以下の実施例に限定される
ものではない。なお、％は他に特記せぬ限りw/v%であ
る。
例をもつて示すが、本発明が以下の実施例に限定される
ものではない。なお、％は他に特記せぬ限りw/v%であ
る。
実施例１ シュードモナス・エルギノサIAM１１５６をグルコース
２％、酵母エキス0.3％、ペプトン１％、K2HPO4 0.1
％、KH2PO4 0.1％およびMgSO4・7H2O 0.05％、pH7.0か
らなる培地１００mlを分注して殺菌（１２０℃、２０分
間）した５００mlの三角フラスコに接種し、３０℃で２
４時間培養して種培養液とした。グルコース２％、コー
ンスチープリカー６v/v%、(NH4)2SO4 0.2％、Nacl 0.
1％、K2HPO4 0.4％、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.2
％、NiSO4 １０ppmおよび消泡剤（日本油脂社製CB-４
４２）０．０２v/v%、pH7.0からなる培地２０を３０
容のジヤーフアーメンターに入れ、１２０℃で２０分
間殺菌した。冷却後、上記の種培養液１００mlを接種
し、３０℃で７２時間毎分２０の通気量と毎分３００
回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、0.01Ｍリン酸緩衝液（pH8.
0）１に懸濁した後、超音波処理で菌体を破砕した。
菌体破砕液を遠心分離して上澄液1.1を得た。この上
澄液の新規ウレアーゼ活性は３６０単位／mlであつた。
この上澄液1.1に硫酸アンモニウムを５０％飽和にな
るように加えて、一昼夜放置後得た硫安沈殿物を約５０
０mlの0.01Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解した。この
粗酵素液を限外過で濃縮、脱塩後、予め0.05Ｍリン酸
緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアロース（OL-
６Ｂ）のカラム（直径5.0cm×長さ５０cm）に吸着さ
せ、吸着物を0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.
3Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集め
た。次にこの活性区分を限外過で濃縮、脱塩後、0.05
Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアデツ
クス（Ａ−５０）のカラム（直径5.0cm×長さ４０cm）
に吸着させ、0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.
2Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集め
た。この活性区分をコロジオン膜で濃縮後、予め0.1Ｍ
リン酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したセフアクリルＳ−
３００のカラム（直径3.5cm×長さ１００cm）でゲル
過を行なつた。さらに、この活性区分を0.1Ｍリン酸緩
衝液（pH8.0）で緩衝化したフエニル−セフアロース（O
L-６Ｂ）のカラム（直径2.5cm×長さ１０cm）に吸着さ
せ、0.03Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.01Ｍリ
ン酸緩衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集めた。こ
の活性区分を凍結乾燥して、精製酵素粉末２６１mgを得
た。この粉末の比活性は９１２単位／mgであつた。これ
らの結果を第３表に示す。
２％、酵母エキス0.3％、ペプトン１％、K2HPO4 0.1
％、KH2PO4 0.1％およびMgSO4・7H2O 0.05％、pH7.0か
らなる培地１００mlを分注して殺菌（１２０℃、２０分
間）した５００mlの三角フラスコに接種し、３０℃で２
４時間培養して種培養液とした。グルコース２％、コー
ンスチープリカー６v/v%、(NH4)2SO4 0.2％、Nacl 0.
1％、K2HPO4 0.4％、KH2PO4 0.1％、MgSO4・7H2O 0.2
％、NiSO4 １０ppmおよび消泡剤（日本油脂社製CB-４
４２）０．０２v/v%、pH7.0からなる培地２０を３０
容のジヤーフアーメンターに入れ、１２０℃で２０分
間殺菌した。冷却後、上記の種培養液１００mlを接種
し、３０℃で７２時間毎分２０の通気量と毎分３００
回転の攪拌速度の条件で培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、0.01Ｍリン酸緩衝液（pH8.
0）１に懸濁した後、超音波処理で菌体を破砕した。
菌体破砕液を遠心分離して上澄液1.1を得た。この上
澄液の新規ウレアーゼ活性は３６０単位／mlであつた。
この上澄液1.1に硫酸アンモニウムを５０％飽和にな
るように加えて、一昼夜放置後得た硫安沈殿物を約５０
０mlの0.01Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解した。この
粗酵素液を限外過で濃縮、脱塩後、予め0.05Ｍリン酸
緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアロース（OL-
６Ｂ）のカラム（直径5.0cm×長さ５０cm）に吸着さ
せ、吸着物を0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.
3Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集め
た。次にこの活性区分を限外過で濃縮、脱塩後、0.05
Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE-セフアデツ
クス（Ａ−５０）のカラム（直径5.0cm×長さ４０cm）
に吸着させ、0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.
2Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集め
た。この活性区分をコロジオン膜で濃縮後、予め0.1Ｍ
リン酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したセフアクリルＳ−
３００のカラム（直径3.5cm×長さ１００cm）でゲル
過を行なつた。さらに、この活性区分を0.1Ｍリン酸緩
衝液（pH8.0）で緩衝化したフエニル−セフアロース（O
L-６Ｂ）のカラム（直径2.5cm×長さ１０cm）に吸着さ
せ、0.03Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）で洗浄後、0.01Ｍリ
ン酸緩衝液（pH8.0）で溶出して活性区分を集めた。こ
の活性区分を凍結乾燥して、精製酵素粉末２６１mgを得
た。この粉末の比活性は９１２単位／mgであつた。これ
らの結果を第３表に示す。
実施例２ ノカルデイア・エリスロポリスIAM１３９９を、グリセ
ロール２％、酵母エキス0.8％、ペプトン1.2％、(NH4)2
SO4 0.5％、Nacl 0.3％、K2HPO4 0.5％、KH2PO4 0.
1％、MgSO4・7H2O 0.3％およびNiSO4 １０ppm、pH7.0
からなる培地１００mlを分注して殺菌（１２０℃、２０
分間）した５００mlの三角フラスコに接種して、３０℃
で４８時間培養した。この培養物中の新規ウレアーゼ活
性は16.8単位／mlであつた。
ロール２％、酵母エキス0.8％、ペプトン1.2％、(NH4)2
SO4 0.5％、Nacl 0.3％、K2HPO4 0.5％、KH2PO4 0.
1％、MgSO4・7H2O 0.3％およびNiSO4 １０ppm、pH7.0
からなる培地１００mlを分注して殺菌（１２０℃、２０
分間）した５００mlの三角フラスコに接種して、３０℃
で４８時間培養した。この培養物中の新規ウレアーゼ活
性は16.8単位／mlであつた。
以上詳細に説明したとおり、本発明により臨床診断試薬
として有用な新規ウレアーゼおよびその製造法が提供さ
れた。本発明の新規ウレアーゼは、尿素に対するKm値が
小さく、かつ耐熱性が高いというすぐれた性質を有す
る。
として有用な新規ウレアーゼおよびその製造法が提供さ
れた。本発明の新規ウレアーゼは、尿素に対するKm値が
小さく、かつ耐熱性が高いというすぐれた性質を有す
る。
第１図は本発明により得られる新規ウレアーゼのpHと活
性の関係を表わし、第２図は本発明による酵素を３７℃
においてそれぞれのpHで６０分間処理した後のpHと活性
の関係を表わす。第３図は本発明による酵素の温度と活
性の関係を表わし、第４図はpH8.0においてそれぞれの
温度で１０分間処理した後の温度と活性の関係を表わ
す。
性の関係を表わし、第２図は本発明による酵素を３７℃
においてそれぞれのpHで６０分間処理した後のpHと活性
の関係を表わす。第３図は本発明による酵素の温度と活
性の関係を表わし、第４図はpH8.0においてそれぞれの
温度で１０分間処理した後の温度と活性の関係を表わ
す。
Claims (2)
- 【請求項１】次の理化学的性質を有する新規ウレアー
ゼ。 (1)作用： １モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。 (2)基質特異性： 尿素に最もよく作用するが、ビウレツトおよびアラント
インにも若干作用する。 (3)至適pHおよびpH安定性： 至適pHが７．５〜８．５であり、３７℃、６０分間処理
ではpH５．０〜８．０の間で安定である。 (4)至適温度および熱安定性： 至適温度が７０℃〜８０℃であり、pH８．０、１０分間
処理では７０℃まで安定である。 (5)分子量： ゲル濾過法で測定した分子量が約２８００００である。 (6)等電点： ５．５〜５．６ (7)阻害剤： Ａｇ＋，Ｃｕ２＋，Ｈｇ２＋，Ｎｉ２＋およびＺｎ２＋
などの金属塩によって阻害される。 (8)Ｋｍ値： １．５×１０−３Ｍ（pH８．０ リン酸緩衝液） - 【請求項２】シュードモナス属またはノカルデイア属に
属する新規ウレアーゼ生産菌を培養し、該培養物より下
記の理化学的性質を有する新規ウレアーゼを採取するこ
とを特徴とする新規ウレアーゼの製造法。 (1)作用： １モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。 (2)基質特異性： 尿素に最もよく作用するが、ビウレツトおよびアラント
インにも若干作用する。 (3)至適pHおよびpH安定性： 至適pHが７．５〜８．５であり、３７℃、６０分間処理
ではpH５．０〜８．０の間で安定である。 (4)至適温度および熱安定性： 至適温度が７０℃〜８０℃であり、pH８．０、１０分間
処理では７０℃まで安定である。 (5)分子量： ゲル濾過法で測定した分子量が約２８００００である。 (6)等電点： ５．５〜５．６ (7)阻害剤： Ａｇ＋，Ｃｕ２＋，Ｈｇ２＋，Ｎｉ２＋およびＺｎ２＋
などの金属塩によって阻害される。 (8)Ｋｍ値： １．５×１０−３Ｍ（pH８．０ リン酸緩衝液）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60099249A JPH0659216B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | 新規ウレア−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60099249A JPH0659216B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | 新規ウレア−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61257183A JPS61257183A (ja) | 1986-11-14 |
| JPH0659216B2 true JPH0659216B2 (ja) | 1994-08-10 |
Family
ID=14242430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60099249A Expired - Fee Related JPH0659216B2 (ja) | 1985-05-10 | 1985-05-10 | 新規ウレア−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0659216B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0657149B2 (ja) * | 1986-01-13 | 1994-08-03 | サッポロビール株式会社 | ウレア−ゼ及びその製造法 |
-
1985
- 1985-05-10 JP JP60099249A patent/JPH0659216B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61257183A (ja) | 1986-11-14 |
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