JPH066078B2 - 塩素イオン定量用試薬 - Google Patents
塩素イオン定量用試薬Info
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- JPH066078B2 JPH066078B2 JP549588A JP549588A JPH066078B2 JP H066078 B2 JPH066078 B2 JP H066078B2 JP 549588 A JP549588 A JP 549588A JP 549588 A JP549588 A JP 549588A JP H066078 B2 JPH066078 B2 JP H066078B2
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- ion
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- chloride ion
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素法による塩素イオンの定量用試薬に係
り、特に共存する妨害イオンの影響を回避した塩素イオ
ン定量用試薬に関する。
り、特に共存する妨害イオンの影響を回避した塩素イオ
ン定量用試薬に関する。
生体試料、例えば血清、尿、髄液中のイオンの定量法と
して、現在、電量滴定および電極法が繁用されている。
しかし、電量滴定法は生化学自動分析装置への組み込み
が困難であり、電極法はイオン特異性の点で問題があ
る。そこで、次のような酵素法が存在する。
して、現在、電量滴定および電極法が繁用されている。
しかし、電量滴定法は生化学自動分析装置への組み込み
が困難であり、電極法はイオン特異性の点で問題があ
る。そこで、次のような酵素法が存在する。
この酵素法は、例えばEur.J.Biochem,41,P1
71/−180(1974)、で示されるように、哺乳
類由来のアミラーゼと、カルシウムイオンとの親和性が
塩素イオンにより変化する性質を利用した方法である。
酵素法による塩素イオンの測定原理は、次にようであ
る。
71/−180(1974)、で示されるように、哺乳
類由来のアミラーゼと、カルシウムイオンとの親和性が
塩素イオンにより変化する性質を利用した方法である。
酵素法による塩素イオンの測定原理は、次にようであ
る。
塩素イオン非存在下にブタすい臓のα−アミラーゼを、
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等のカルシウムイ
オンと錯体を形成する錯体形成試薬(カルシウムキレー
タ)および微量のカルシウムイオン共存させると、ブタ
すい臓α−アミラーゼは分子内カルシウムイオンを放出
して、非活性のα−アミラーゼに変化する。本状態に、
血清等の試料を添加すると、試料中の塩素イオン濃度に
応じて、非活性アミラーゼがカルシウムイオンと再結合
して、活性型に変化する。変化した活性型のα−アミラ
ーゼを、α−アミラーゼ活性測定用試薬で測定し、塩素
イオン濃度に換算する。
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)等のカルシウムイ
オンと錯体を形成する錯体形成試薬(カルシウムキレー
タ)および微量のカルシウムイオン共存させると、ブタ
すい臓α−アミラーゼは分子内カルシウムイオンを放出
して、非活性のα−アミラーゼに変化する。本状態に、
血清等の試料を添加すると、試料中の塩素イオン濃度に
応じて、非活性アミラーゼがカルシウムイオンと再結合
して、活性型に変化する。変化した活性型のα−アミラ
ーゼを、α−アミラーゼ活性測定用試薬で測定し、塩素
イオン濃度に換算する。
この酵素法は、電極法に比べイオン特異性が高く、生化
学自動分析装置への適用も可能な測定法にある。次の第
1表に、電極法と酵素法のイオンの特異性を、塩素イオ
ンに対する感度を100%として示す。
学自動分析装置への適用も可能な測定法にある。次の第
1表に、電極法と酵素法のイオンの特異性を、塩素イオ
ンに対する感度を100%として示す。
上記第1表に示されるように、酵素法では電極法に比べ
イオン特異性が優れていることがわかる。
イオン特異性が優れていることがわかる。
上記従来の酵素法では、亜硝酸イオンと硝酸イオンの影
響の回避についての配慮がなされておらず、選択性の面
で問題が残されていた。すなわち、本発明者らが鋭意検
討したところ、亜硝酸イオンおよび硝酸イオンが存在す
ると、イオン特異性が劣化することを見い出した。すな
わち、前記第1表からわかるように、亜硝酸イオンで1
0.3%、硝酸イオンで9.8%の値を示しており、これら
のイオンの影響を回避する配慮がなされていないことが
わかった。
響の回避についての配慮がなされておらず、選択性の面
で問題が残されていた。すなわち、本発明者らが鋭意検
討したところ、亜硝酸イオンおよび硝酸イオンが存在す
ると、イオン特異性が劣化することを見い出した。すな
わち、前記第1表からわかるように、亜硝酸イオンで1
0.3%、硝酸イオンで9.8%の値を示しており、これら
のイオンの影響を回避する配慮がなされていないことが
わかった。
本発明は、かかる問題点を解決するために、硝酸イオ
ン、亜硝酸イオンの影響を回避したイオン特異性の高い
塩素イオン定量用試薬を提供することを目的とする。
ン、亜硝酸イオンの影響を回避したイオン特異性の高い
塩素イオン定量用試薬を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明は、カルシウムイオ
ンと錯体を形成する錯体形成試薬と、アミラーゼと、カ
ルシウムイオンと、を備えた塩素イオン定量用試薬であ
って、亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分解する試薬が
含有されてなることを特徴とする塩素イオン定量用試薬
である。
ンと錯体を形成する錯体形成試薬と、アミラーゼと、カ
ルシウムイオンと、を備えた塩素イオン定量用試薬であ
って、亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分解する試薬が
含有されてなることを特徴とする塩素イオン定量用試薬
である。
上記本発明において、カルシウムイオンと錯体を形成す
る錯体形成試薬としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸、トランス−1,2−シクロヘキサンジアミン−
N,N,N,N′−テトラ酢酸、グリコールエーテルジ
アミン四酢酸、イミノ四酢酸、ジアミノプロパン四酢酸
などが用いられる。
る錯体形成試薬としては、例えば、エチレンジアミン四
酢酸、トランス−1,2−シクロヘキサンジアミン−
N,N,N,N′−テトラ酢酸、グリコールエーテルジ
アミン四酢酸、イミノ四酢酸、ジアミノプロパン四酢酸
などが用いられる。
また、アミラーゼ活性測定用試薬としては、通常のα−
アミラーゼ活性測定法において公知慣用の試薬である。
例えば、4−ニトロフェニル−α−D−アルトペンタオ
シド、2−クロル−4−ニトルフェニル−β−ローマル
トペンタオシド、2−クロル−4−ニトロフェニル−β
−D−マルトヘプタオシドなどがある。
アミラーゼ活性測定法において公知慣用の試薬である。
例えば、4−ニトロフェニル−α−D−アルトペンタオ
シド、2−クロル−4−ニトルフェニル−β−ローマル
トペンタオシド、2−クロル−4−ニトロフェニル−β
−D−マルトヘプタオシドなどがある。
アミラーゼとしては、各種アミラーゼ、例えばα−アミ
ラーゼ、β−アミラーゼ等を用いることができる。
ラーゼ、β−アミラーゼ等を用いることができる。
また、本発明において、硝酸イオンおよび亜硝酸イオン
を分解する物質としては、例えば硝酸レダクターゼ、亜
硝酸レダクターゼ等の酵素を用いることができる。この
他に、無機、有機の各種の分解物質を用いることもでき
る。酵素を用いて亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分解
する場合には、基質特異性があり、他のイオンに影響を
与えないという利点が存在する。
を分解する物質としては、例えば硝酸レダクターゼ、亜
硝酸レダクターゼ等の酵素を用いることができる。この
他に、無機、有機の各種の分解物質を用いることもでき
る。酵素を用いて亜硝酸イオンおよび硝酸イオンを分解
する場合には、基質特異性があり、他のイオンに影響を
与えないという利点が存在する。
本実施例は、試料溶液中、例えば血清試料に含まれてい
る硝酸イオン、亜硝酸イオンを酵素によって分解する。
硝酸イオンを分解するものとしては硝酸レダクターゼで
あり、亜硝酸イオンを分解する酵素は亜硝酸レダクター
ゼである。
る硝酸イオン、亜硝酸イオンを酵素によって分解する。
硝酸イオンを分解するものとしては硝酸レダクターゼで
あり、亜硝酸イオンを分解する酵素は亜硝酸レダクター
ゼである。
硝酸レダクターゼと硝酸との酵素反応を以下に示す。
本実施例では、上記酵素反応を利用して亜硝酸イオンお
よび硝酸イオンを分解することができる。
よび硝酸イオンを分解することができる。
次に、本発明に係る塩素イオン定量用試薬の具体的な組
成について説明する。
成について説明する。
本例では、塩素イオン定量時の妨害成分となる硝酸イオ
ン、亜硝酸イオンを分解するために、硝酸レダクター
ゼ、亜硝酸レダクターゼおよびNAD(P)Hを使用し
た。また、α−アミラーゼ測定用試薬として、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびユークロル−4
−ニトロフェニル−β−D−マルトヘプタオシドも使用
した。試薬は第1試薬と第2試薬から構成される。
ン、亜硝酸イオンを分解するために、硝酸レダクター
ゼ、亜硝酸レダクターゼおよびNAD(P)Hを使用し
た。また、α−アミラーゼ測定用試薬として、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびユークロル−4
−ニトロフェニル−β−D−マルトヘプタオシドも使用
した。試薬は第1試薬と第2試薬から構成される。
(1)第1試薬 第1試薬は次の組成からなる。
エチレンジアミン四酢酸カルシウム15mgおよびエチレ
ンジアミン四酢酸ニナトリウム1.1gを0.1Mリン酸緩
衝液100mに加え、5%水酸化ナトリウム水溶液を
用いてpHを7.0に調整した。この溶液を溶液Aとする。
その後、α−グルコシダーゼ11K単位(U)、β−グ
ルコシダーゼ300U、ブタすい臓α−アミラーゼ2K
U、硝酸レダクターゼ200U、亜硝酸レダクターゼ2
00U、NAD(P)H0.6mMを加え、第1試薬とし
た。
ンジアミン四酢酸ニナトリウム1.1gを0.1Mリン酸緩
衝液100mに加え、5%水酸化ナトリウム水溶液を
用いてpHを7.0に調整した。この溶液を溶液Aとする。
その後、α−グルコシダーゼ11K単位(U)、β−グ
ルコシダーゼ300U、ブタすい臓α−アミラーゼ2K
U、硝酸レダクターゼ200U、亜硝酸レダクターゼ2
00U、NAD(P)H0.6mMを加え、第1試薬とし
た。
(2)第2試薬 第2試薬の組成は次のものからなる。
2−クロル−4−ニトフェニル−β−D−マルトヘプタ
オシド1.0gを、前記第1試薬で説明した溶液A100
mに溶解し、第2試薬とした。
オシド1.0gを、前記第1試薬で説明した溶液A100
mに溶解し、第2試薬とした。
次に、塩素イオン測定について説明する。
(3)キャリブレーション 標準溶液として、0,40,80,120,160,2
00mMの各食塩水を調整した。それぞれ、6μに対
し、第1試薬320μ、第2試薬80μを加え、3
7℃で主波長405mm、副波長480mmにおける経時的
な吸光度の上昇を、日立7150型自動分析装置で測定
し、キャリブレーションを行った。
00mMの各食塩水を調整した。それぞれ、6μに対
し、第1試薬320μ、第2試薬80μを加え、3
7℃で主波長405mm、副波長480mmにおける経時的
な吸光度の上昇を、日立7150型自動分析装置で測定
し、キャリブレーションを行った。
経時的な吸光度の上昇は、塩素イオンの濃度に比例して
生じる。
生じる。
第1図に、自動分析装置の操作手順を示す。
本実施例に係る試薬を用いての塩素イオンの測定は、第
1図で示された工程に従って行われる。
1図で示された工程に従って行われる。
第1図に示すように、サンプル分注後、第1試薬を添
加、攪拌し、数分間反応させたのち、第2試薬を添加、
攪拌し、さらに反応させる。第1試薬添加後から測定終
了までの間の反応液の吸光度を、数10秒間隔で測定
し、分析法に応じたタイミングの吸光度を用いて、塩素
イオンの定量を行う。
加、攪拌し、数分間反応させたのち、第2試薬を添加、
攪拌し、さらに反応させる。第1試薬添加後から測定終
了までの間の反応液の吸光度を、数10秒間隔で測定
し、分析法に応じたタイミングの吸光度を用いて、塩素
イオンの定量を行う。
(4)硝酸イオン添加による影響 試料としてコントロール血清に硝酸ナトリウム溶液を添
加した溶液を用いた。コントロール血清は、指定量の半
量の蒸留水で溶解した。これを溶液Bとする。硝酸ナト
リウム1.7gを100mの蒸留水で溶解し、200m
M硝酸イオンを調整した。これを溶液Cとする。溶液C
を適宜希釈し、40,80,120,160,200m
M硝酸ナトリウム溶液を調整し、それぞれを溶液Bと
1:1の割合で混合した。このときの塩素イオンの定量
結果を、従来試薬((1)の第1試薬より硝酸レダクター
ゼ、亜硝酸レダクターゼ、NAD(P)Hを除去したも
の、第2試薬は(2)と同じ)での定量結果と共に、第2
図に示す。第2図に示すように、従来法では、試料中の
硝酸イオンの濃度が高濃度になると、塩素イオンの定量
結果も高く測定されていたが、本法によれば、硝酸イオ
ンの影響が完全に回避できた。
加した溶液を用いた。コントロール血清は、指定量の半
量の蒸留水で溶解した。これを溶液Bとする。硝酸ナト
リウム1.7gを100mの蒸留水で溶解し、200m
M硝酸イオンを調整した。これを溶液Cとする。溶液C
を適宜希釈し、40,80,120,160,200m
M硝酸ナトリウム溶液を調整し、それぞれを溶液Bと
1:1の割合で混合した。このときの塩素イオンの定量
結果を、従来試薬((1)の第1試薬より硝酸レダクター
ゼ、亜硝酸レダクターゼ、NAD(P)Hを除去したも
の、第2試薬は(2)と同じ)での定量結果と共に、第2
図に示す。第2図に示すように、従来法では、試料中の
硝酸イオンの濃度が高濃度になると、塩素イオンの定量
結果も高く測定されていたが、本法によれば、硝酸イオ
ンの影響が完全に回避できた。
(5)亜硝酸イオン添加による影響 亜硝酸ナトリウム0.38gを100mの蒸留水で溶解
し、200mM亜硝酸イオン溶液を調整した。(4)と同
様に試料を調整し、本法と従来法で塩素イオンを定量し
た。その結果を第3図に示す。(4)と同様、本法によれ
ば、亜硝酸イオン影響が完全に回避できた。
し、200mM亜硝酸イオン溶液を調整した。(4)と同
様に試料を調整し、本法と従来法で塩素イオンを定量し
た。その結果を第3図に示す。(4)と同様、本法によれ
ば、亜硝酸イオン影響が完全に回避できた。
本発明の塩素イオン定量用試薬により定量可能な塩素イ
オンの濃度は、試料中の濃度として約10mM〜300
0mMである。この濃度範囲は、通常血清中の塩素濃度
を測定する際に必要な範囲である70〜130mMを十
分に担保することができる。本発明試薬によれば、血液
中の塩素イオン濃度を十分定量することができる。
オンの濃度は、試料中の濃度として約10mM〜300
0mMである。この濃度範囲は、通常血清中の塩素濃度
を測定する際に必要な範囲である70〜130mMを十
分に担保することができる。本発明試薬によれば、血液
中の塩素イオン濃度を十分定量することができる。
本発明に係る塩素イオン定量用試薬における試薬の各成
分の許容濃度範囲を次に示す。
分の許容濃度範囲を次に示す。
第1試薬については、次のとおりである。
α−グルコシダーゼ80〜110KU/、β−グルコ
シダーゼ2.5〜3KU/、α−アミラーゼ2〜20K
U/、Ca+0.75〜1.5mM/、EDTA30〜
100mM/、リン酸緩衝液pH7.0、0.1M/、硝
酸レダクターゼ2〜20KU/、亜硝酸レダクターゼ
2〜20KU/、NAD(P)H6〜60mM/。
シダーゼ2.5〜3KU/、α−アミラーゼ2〜20K
U/、Ca+0.75〜1.5mM/、EDTA30〜
100mM/、リン酸緩衝液pH7.0、0.1M/、硝
酸レダクターゼ2〜20KU/、亜硝酸レダクターゼ
2〜20KU/、NAD(P)H6〜60mM/。
第2試薬の成分の含有量としては、例えば次のとおりで
ある。Ca+0.75〜1.5mM/、EDTA30〜1
00mM/、2−クロル−4−ニトロフェニル−β−
D−マルトヘプタオシド3.8〜7.5mM/。
ある。Ca+0.75〜1.5mM/、EDTA30〜1
00mM/、2−クロル−4−ニトロフェニル−β−
D−マルトヘプタオシド3.8〜7.5mM/。
なお、2−クロル−4−ニトロフェニル−β−D−マル
トヘプタオシドの代わりに、マルトペンタオース2.5%
を用いることもできる。
トヘプタオシドの代わりに、マルトペンタオース2.5%
を用いることもできる。
以上説明したように、本発明によれば、硝酸イオン、亜
硝酸イオンを分解できるので、硝酸イオン、および亜硝
酸イオンの影響を回避したイオン特異性の高い塩素イオ
ン定量用試薬を提供することができる。したがって、よ
り正確な塩素イオンの定量を行うことができる。
硝酸イオンを分解できるので、硝酸イオン、および亜硝
酸イオンの影響を回避したイオン特異性の高い塩素イオ
ン定量用試薬を提供することができる。したがって、よ
り正確な塩素イオンの定量を行うことができる。
第1図は、自動分析装置の測定手順の工程図、第2図は
硝酸イオン添加による塩素イオン測定値の影響を示すグ
ラフ、第3図は亜硝酸イオン添加による塩素イオン測定
値の影響を示すグラフでる。
硝酸イオン添加による塩素イオン測定値の影響を示すグ
ラフ、第3図は亜硝酸イオン添加による塩素イオン測定
値の影響を示すグラフでる。
Claims (4)
- 【請求項1】カルシウムイオンと錯体を形成する錯体形
成試薬と、アミラーゼと、カルシウムイオンと、を備え
た塩素イオン定量用試薬であって、亜硝酸イオンおよび
硝酸イオンを分解する試薬が含有されてなることを特徴
とする塩素イオン定量用試薬。 - 【請求項2】特許請求の範囲第1項において、前記亜硝
酸イオンおよび硝酸イオンを分解する試薬が、硝酸レダ
クターゼ、亜硝酸レダクターゼであることを特徴とする
塩素イオン定量用試薬。 - 【請求項3】特許請求の範囲第1項において、前記錯体
形成試薬はEDTAであることを特徴とする塩素イオン
定量用試薬。 - 【請求項4】特許請求の範囲第1項〜第3項のいずれか
1項において、前記アミラーゼは哺乳類由来のα−アミ
ラーゼであることを特徴とする塩素イオン定量用試薬。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP549588A JPH066078B2 (ja) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | 塩素イオン定量用試薬 |
| DE19893900755 DE3900755A1 (de) | 1988-01-13 | 1989-01-12 | Verfahren zur quantitativen analyse von chloridionen und testpackung zur durchfuehrung des verfahrens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP549588A JPH066078B2 (ja) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | 塩素イオン定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01181799A JPH01181799A (ja) | 1989-07-19 |
| JPH066078B2 true JPH066078B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=11612811
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP549588A Expired - Fee Related JPH066078B2 (ja) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | 塩素イオン定量用試薬 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH066078B2 (ja) |
| DE (1) | DE3900755A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6818415B2 (en) * | 2001-06-22 | 2004-11-16 | Abaxis, Inc. | Sodium activation of amylase |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4472499A (en) * | 1982-01-22 | 1984-09-18 | American Hoechst Corporation | Reagents for the determination of enzymes |
| JPH0612999B2 (ja) * | 1986-11-17 | 1994-02-23 | 関東化学株式会社 | 塩素イオン定量用試薬 |
-
1988
- 1988-01-13 JP JP549588A patent/JPH066078B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-01-12 DE DE19893900755 patent/DE3900755A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01181799A (ja) | 1989-07-19 |
| DE3900755A1 (de) | 1989-07-27 |
| DE3900755C2 (ja) | 1992-03-26 |
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