JP2000228997A - 電解質測定用試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】液状試薬として流通に耐えうるような高い安定
性を備え、かつ正確性、定量性においても優れたα−ア
ミラーゼを利用した電解質測定用試薬組成物を提供す
る。 【解決手段】α−アミラーゼを用いた２試薬からなる電
解質測定用試薬組成物において、電解質により可逆的に
再活性化する不活性化型α−アミラーゼとキレート剤を
別々に処方することを特徴とする電解質測定用試薬組成
物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体液、特に血液ま
たは尿中の電解質、例えばカルシウムイオン、塩素イオ
ンなどの電解質を測定する試薬組成物に関する。更に詳
細には、α−アミラーゼを利用した電解質を測定する試
薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内の電解質の濃度は、通常厳密に代
謝調節されていることから、体液中の電解質の測定は生
体機能のバロメーターとして生化学的臨床検査の中で最
も一般的な分析であり、これらを測定することにより各
種疾患の診断が行われる。例えば、血清中のカルシウム
イオン量の測定は、低カルシウム血症として、低タンパ
ク血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠
乏症、副甲状腺機能低下症、クル病等の疾患、高カルシ
ウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲
状腺機能亢進症、腎不全等の疾患の診断に用いられる。
また例えば、血清中の塩素イオン量の測定は、低クロー
ル血症として、低張性脱水症、グルココルチコイド過剰
症、呼吸性アシドーシス等の疾患、高クロール血症とし
ては、高張性脱水症、尿細管性アシドーシス、呼吸性ア
ルカローシス等の疾患の診断に用いられる。

【０００３】体液中のカルシウムイオン測定法として
は、従来から、（１）滴定法、（２）比色法、（３）原
子吸光法、（４）炎光光度計法、（５）電極法、（６）
酵素法などが知られている。

【０００４】上記（１）の滴定法は、シュウ酸塩やキレ
ートを用いて化学的に滴定する方法であるが、この方法
は煩雑であり、実施者により測定値に差異が生ずる、多
量の試料を短時間に処理できないという欠点を有する。
また、上記（２）の比色法において、発色剤にｏ−ＣＰ
Ｃ（オルトクレゾールフタレインコンプラクソン）を用
いる方法は、汎用の自動分析機に適用できる方法である
が、この方法は温度、時間により吸光度が変化する、マ
グネシウムイオンの影響を受ける等の欠点を有する。

【０００５】また、上記（３）の原子吸光法は試料を希
釈することが必要である、手技に熟練を要する等の欠点
を有する。上記（４）の炎光光度計法は特異性、再現性
の点に問題を有する。さらに、上記（５）の電極法は、
ｐＨの影響を受ける、機器を一定の状態に維持すること
が煩雑である等の欠点を有する。

【０００６】上記（６）の酵素法については、（ａ）ホ
スホリパーゼＤを利用する方法（特開昭６２−１９５２
９７号公報）、（ｂ）カルモジュリンを利用する方法
（特開昭６２−３６１９９号公報）、（ｃ）α−アミラ
ーゼを利用する方法（特公平６−８７７９８号公報な
ど）などが挙げられる。

【０００７】上記（ａ）の方法は基質を均一に調製する
ことが困難であり、反応に時間がかかるという欠点を有
する。上記（ｂ）の方法は検体を希釈する（１００〜１
０００倍）ことが必要である。また、これに対して、
（ｃ）の方法はカルシウムイオンにより不活性化型α−
アミラーゼが再活性化され、糖基質を分解し、分解した
生成物を測定することにより、体液中のカルシウムイオ
ンを測定するカルシウムイオンにより不活性化型α−ア
ミラーゼが再活性化され、糖基質を分解し、分解した生
成物を測定することにより体液中のカルシウムイオンを
測定する方法であり、上記（１）〜（５）の方法におけ
る問題点を解消し、また（６）の（ａ）、（ｂ）の方法
よりも正確性かつ簡便性に優れた酵素法として実際に臨
床検査分野で用いられている。

【０００８】一方、体液中の塩素イオン測定法として
は、従来から（イ）電量滴定法、（ロ）イオン電極法、
（ハ）比色法、（ニ）酵素法などが知られている。上記
（イ）の電量滴定法、（ロ）のイオン電極法は専用の装
置が必要である、機器の保持、管理に注意が必要であ
る、試料の分析効率が悪いなどの問題点がある。また、
（ハ）の比色法はチオシアン酸水銀と硝酸鉄を用いた方
法などがあるが、測定後シアン、水銀を含む廃液を生じ
るため、特別な処理が必要であるといった欠点を有す
る。

【０００９】上記（ニ）の酵素法には、（ａ）α−アミ
ラーゼを利用する方法（特開平３−１７６０００号公
報、特開平４−９４６９８号公報など）、（ｂ）ザルコ
シンオキシダーゼを利用する方法（特開平９−１８７２
９６号公報）などがある。このうち、（ａ）の方法は塩
素イオンにより不活性化型α−アミラーゼが再活性化さ
れ、糖基質を分解し、分解された生成物を測定すること
により体液中の塩素イオンを測定する方法であるが、現
在実際に臨床検査分野で用いられており、電量滴定法、
イオン電極法、比色法に比べ、正確性、簡便性および分
析効率の点で優れている。

【００１０】一方、近年臨床検査分野では正確性及び安
定性向上、またはコスト削減、作業の省力化等の要求に
より、液状化試薬が主流になっている。従来は酵素等液
状状態で不安定なものは凍結乾燥状態で流通し、使用時
に添付の溶解液で溶解し測定に使用していたが、最近の
成分酵素等の耐熱化、またはｐＨ、バッファー条件の至
適化等による成分酵素の安定化により、液状状態での流
通が可能となり、製造側としては凍結乾燥の手間が省
け、また臨床検査現場においては溶解する手間が省け、
臨床検査に関わる省力化に大きく貢献しているものであ
る。

【００１１】α−アミラーゼを利用する電解質測定法
は、これまでの種々の測定法の中でも簡便性、正確性等
の点で優れていることは上述の通りである。この方法に
おいて、α−アミラーゼは、測定対象となるその活性発
現に必要なカルシウムまたは塩素イオンをあらかじめ除
去し、通常不活性化型の状態で用いられる。また、この
方法においては、ブランク反応を抑える、拮抗阻害剤と
して定量性を調節する、または測定対象外の類似共雑イ
オンをマスキングする等の目的で、測定試薬中にキレー
ト剤が処方されている。しかしながら、このような不活
性化型α−アミラーゼはキレート剤の存在下では不安定
であることから、溶液状態で長期の保存ができないとい
う問題を有している。

【００１２】それに対して、キレート剤存在下での不活
性化型α−アミラーゼの安定化方法としては、従来から
マルトース、α−シクロデキストリン等の少糖類、また
はこれらの混合物が有用であることが知られている（特
開平６−１１３８９４号公報）。しかしながら、この方
法でも、短期間（１〜２ヶ月間）の低温（２〜８℃）保
存には耐えうるが、長期間の保存、あるいは実際の作業
下の室温（１８〜３７℃）での安定性に関しては未だ十
分とは言えない。

【００１３】また、液状化に伴い派生する問題として、
外部からの測定検体以外のものに由来するα−アミラー
ゼの混入の影響がある。これは、例えば人の唾液等が偶
発的に測定試液中に混入することにより、唾液中に含ま
れるα−アミラーゼにより基質が分解され、試薬ブラン
クの上昇、測定感度の低下により定量性、精密性が損な
われるという問題である。特に、測定試液の製造時また
は使用時に混入しやすく、汗、唾液に由来するわずかな
α−アミラーゼの混入によっても、溶液のまま長期間保
存される可能性のある液状試薬では試薬性能に影響を与
えることから、α−アミラーゼに対する安定化が必要で
ある。

【００１４】測定検体以外のものに由来するα−アミラ
ーゼ混入の問題に対しては、特開平６−２７７０９６号
公報に記載されるように、α−アミラーゼ基質として用
いられるｐ−ニトロフェニル−β−ガラクトシル−α−
マルトペンタオシドをｐＨ２．０〜５．５の範囲内の水
溶液とすることで安定化を図る方法が知られている。し
かしながら、この方法ではα−アミラーゼの基質自体の
安定化は図れるが、各試液のｐＨ条件に制約が生じるこ
とから十分ではない。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、α−ア
ミラーゼを利用した電解質測定方法に関しては、今日臨
床検査用試薬で主流になっている液状試薬として流通に
耐えうるような高い溶液安定性は未だ達成されていない
のが現状である。本発明は、上記のような現状に鑑み、
安定性、正確性、定量性に優れた酵素アッセイに用いる
電解質測定用試薬組成物を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため鋭意検討した結果、測定試薬を２試薬の
構成とし、安定性不良に起因するキレート剤と電解質に
より可逆的に再活性化する不活性化型α−アミラーゼと
を別々に処方することで、従来のような安定化剤をむや
みに使用することなく低温から実使用レベルである室温
での長期的な溶液安定性が得られることを見出し、さら
に、２試薬の構成を少なくとも第一試薬において（ａ）
α−アミラーゼ基質、（ｂ）キレート剤、第二試薬にお
いて（ｃ）電解質により可逆的に再活性化する不活性化
型α−アミラ−ゼの構成とし、さらに第一試薬に（ｄ）
α−アミラーゼに対し阻害活性を有する物質を含有する
ことで混入α−アミラーゼの影響を回避できることを見
出し、本発明を完成するに至った。

【００１７】すなわち本発明は、以下のような構成より
成る。 （１）α−アミラーゼを用いた２試薬からなる電解質測
定用試薬組成物において、電解質により可逆的に再活性
化する不活性化型α−アミラーゼとキレート剤を別々に
処方することを特徴とする電解質測定用試薬組成物。 （２）第一試薬において（ａ）α−アミラーゼ基質およ
び（ｂ）キレート剤を含有し、かつ第二試薬において
（ｃ）電解質により可逆的に再活性化する不活性化型α
−アミラ−ゼを含有するように処方される（１）の電解
質測定用試薬組成物。 （３）第一試薬において（ｄ）α−アミラーゼに対し阻
害活性を有する物質を含有する（１）または（２）の電
解質測定用試薬組成物。 （４）α−アミラーゼ基質が２−クロロ−４−ニトロフ
ェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マ
ルトシドである（１）〜（３）のいずれかの電解質測定
用試薬組成物。 （５）α−アミラーゼに対し阻害活性を有する物質が、
５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサン、２−ク
ロロアセトアミド、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキ
サイド、イミダゾリジニルウレア、Ｎ−メチルイソチア
ゾロン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン
−３−オンおよびＮ−エチルマレイミドよりなる群から
選ばれた少なくとも１種類である（１）〜（４）のいず
れかの電解質測定用試薬組成物。 （６）キレート剤が１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキ
シ）エタン四酢酸である（１）〜（５）のいずれかの電
解質測定用試薬組成物。 （７）第一試薬がｐＨ７以上であり、かつ第二試薬がｐ
Ｈ６〜７である（１）〜（６）のいずれかの電解質測定
用試薬組成物。 （８）電解質がカルシウムイオンである（１）〜（７）
のいずれかの電解質測定用試薬組成物。 （９）電解質が塩素イオンである（１）〜（７）のいず
れかの電解質測定用試薬組成物。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明の電解質測定用試薬組成物
は、α−アミラーゼの活性化剤であるカルシウム、また
は塩素イオン等によりα−アミラーゼが活性化されるこ
とを利用し、分解された糖基質を測定することにより試
料中の電解質を測定するものであり、次のような測定原
理が考えられる。ここで、電解質とは、水その他の溶媒
に溶解して溶液がイオン電導を行うような物質をいうも
のであり、具体的には、カルシウムイオン、塩素イオ
ン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイ
オン、亜鉛イオン等を指す。

【００１９】（１）マルトオリゴ糖を基質とする方法 基質としてマルトテトラオース、マルトペンタオース、
マルトヘキサオースなどを用い、活性化されたα−アミ
ラーゼ、さらにはα−グルコシダーゼ等の追随酵素の作
用により、これらの基質からグルコースを遊離させ、グ
ルコースの量を測定することでカルシウム等の電解質量
を求める。生成したグルコースの測定方法としては、グ
ルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ法、ヘキソキ
ナーゼ−グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ法等がある。

【００２０】グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダー
ゼ法ではグルコースにグルコースオキシダーゼを作用さ
せ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下フ
ェノール等の酸化発色物質とカプラーを酸化縮合してキ
ノン色素に導き、その吸光度をレート測定する方法であ
る。ヘキソキナーゼ−グルコース６ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ法はヘキソキナーゼによりグルコースからグ
ルコース−６−リン酸に導き、続いてグルコース−６−
リン酸にＮＡＤ⁺またはＮＡＤＰ⁺の存在下グルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼを作用させＮＡＤＨ
またはＮＡＤＰＨの増加反応をレート測定する方法であ
る。

【００２１】（２）マルトオリゴ糖の還元末端にフェニ
ル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコン
として結合させた誘導体を基質とする方法 ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド、ｐ−ニトロフ
ェニルマルトヘキサオシド、ｐ−ニトロフェニルマルト
ヘプタオシド、２，４−ジクロロニトロフェニルマルト
ペンタオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルト
トリオシド、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトペ
ンタオシド等を基質として用い、活性化されたα−アミ
ラーゼを作用させ、必要によりα−グルコシダーゼ等の
追随酵素を作用させて、これらの基質からアグリコンを
遊離させ、遊離したアグリコンの量を光学的に測定する
ことによりカルシウム等の電解質量を求める。

【００２２】（３）マルトオリゴ糖の還元末端にフェニ
ル基、ナフチル基、またはそれらの誘導体をアグリコン
として結合させたマルトオリゴ糖誘導体の非還元末端の
グルコースの４位および６位のヒドロキシル基が何らか
の手段で修飾された誘導体を基質とする方法 （２）に準ずる方法であるが、基質として、非還元末端
グルコースがハロゲン、グルコピラノシル基等で修飾さ
れたタイプの基質（例えば、特開昭６０−２３７９９８
号公報）あるいは、４位および６位のヒドロキシル基を
アルキル基、アルコイル基またはフェニル基で置換した
タイプの基質（例えば、特開昭６０−５４３９５号公
報、特開平１−１５７９９６号公報）あるいは４位およ
び６位のヒドロキシル基をβ−ガラクトピラノシル基で
置換したタイプの基質（例えば、特開平３−２６４５９
６号公報、特開平６−３１５３９９号公報）を用いる方
法がある。

【００２３】上記のような公知の測定法の中でも、上記
（３）に示される測定法は原理的に優れている。なかで
も、２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを用いる方法
は、非還元末端が修飾されていることから内因性α−グ
ルコシダーゼ等による分解による試薬ブランクの上昇が
なく、また、追随酵素を必要としないことから低コスト
であり、しかも、α−アミラーゼの基質親和性が高いた
め好感度であるといったメリットがあり特に好ましい。

【００２４】本発明の一実施態様として、カルシウムイ
オンの測定について示すと、まず第一反応として試料に
α−アミラーゼに対し阻害活性を有する物質、キレート
剤、およびα−アミラーゼの基質として２−クロロ−４
−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル−α−マルトシドを含む電解質測定用試薬組成物を作
用させ、続いて第二反応として電解質により可逆的に再
活性化する不活性化型α−アミラーゼを含有する電解質
測定用試薬組成物を作用させることで、試料中のカルシ
ウムを得て再活性化したアミラーゼが前記基質を分解
し、遊離する２−クロロ−４−ニトロフェノールを測定
し、試料中のカルシウム量を求めるものである。

【００２５】本発明においてα−アミラーゼに対し阻害
活性を有する物質とは、α−アミラーゼのある特定の部
位に結合して反応速度を低下させる物質であり、特に阻
害形式としてはいわゆる拮抗阻害を除く阻害作用を有す
る物質をいうものであり、例えば、蛋白質を構成するチ
オール基、アミノ基等と作用または結合する物質が挙げ
られる。具体的には、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３
−ジオキサン、２−クロロアセトアミド、２−ヒドロキ
シピリジン−Ｎ−オキサイド、イミダゾリジニルウレ
ア、Ｎ−メチルイソチアゾロン、５−クロロ−２−メチ
ル−４−イソチアゾリン−３−オン、Ｎ−エチルマレイ
ミド、ｐ−クロロマーキュリ安息香酸、β−ブロモエチ
ルアミン等が挙げられるが、これらに限定されるもので
はなく、また、これらを複数組み合わせて用いても良
い。また、該α−アミラーゼに対し阻害活性を有する物
質の試薬組成中濃度は特に限定されないが、試薬組成物
に含まれる電解質により可逆的に再活性化する不活性化
型α−アミラーゼへの影響を考慮し、第一試薬中に０．
０１〜１００ｍＭの範囲で好適に用いられる。

【００２６】本発明においてα−アミラーゼとは、微生
物、植物、または動物のいずれの起源のものも用いるこ
とが可能であるが、好適には動物起源のものであり、例
えばブタ膵臓、人膵臓、人唾液由来のα−アミラーゼが
例示される。本発明に用いられるα−アミラーゼは、脱
塩処理によって不活性化型とされている必要がある。そ
して、実際に測定に関与する不活性化型α−アミラーゼ
は、上述のように試料中のカルシウムまたは塩素イオン
等の電解質を得て活性化型α−アミラーゼとなり、α−
アミラーゼの基質と反応する、電解質により可逆的に再
活性化するものである必要がある。該脱塩処理は、例え
ば、透析、限外濾過、イオン交換、カラム除去、電気膜
透析などの方法により行われるのが好ましい。電解質に
より可逆的に再活性化する不活性化型α−アミラーゼの
試薬組成中の濃度は、好ましくは反応液中に０．１〜１
０００ＩＵ／ｍｌの範囲で用いられる。

【００２７】なお、複数のイオンから特定のイオンを選
択されるための特異性に関しては、測定対象以外のイオ
ンなどの妨害イオンの各濃度範囲を推定し、その他の測
定される検体の性能も考慮したうえで、妨害イオンに特
異的なキレート剤を共存させることにより、該妨害イオ
ンによるα−アミラーゼの活性化を抑える、あるいは、
妨害イオンになりうるイオンを予め組成中に十分量存在
せしめることで、試料中の妨害イオンの濃度レベルでは
妨害を受けないようにするなどの方法により達成され
る。具体的な態様を例示すると、カルシウムイオンを測
定する場合は、塩素イオン等が妨害イオンとなるので、
例えば塩化ナトリウムのような塩素を含む化合物を試薬
組成中に測定に影響を受けないレベルで共存させる。ま
た、塩素イオンを測定する場合は、カルシウムイオン等
が妨害イオンとなりうるので、検体中のカルシウムイオ
ンをトラップするようなキレート剤を加えるなどの方法
が挙げられる。

【００２８】本発明においてキレート剤としては、例え
ば、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エ
タン四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサ
ン四酢酸ならびにこれらの塩等が挙げられる。なかで
も、本発明における至適ｐＨである中性付近での金属選
択性の点から、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）
エタン四酢酸が特に好ましい。該キレート剤の電解質測
定用試薬組成物中での役割としては、上述のようにブラ
ンク反応を抑える、拮抗阻害剤として定量性を調節す
る、または測定対象外の類似共雑イオンをマスキングす
る等が挙げられる。該キレート剤は、反応液中に好まし
くは０．０１〜１０ｍＭ、より好ましくは０．１〜１ｍ
Ｍの範囲で用いられる。また、上記に示されるキレート
剤を複数組合わせて用いても良い。

【００２９】本発明に係るα−アミラーゼの基質は、上
述の通り何ら限定されるものではないが、追随酵素を必
要としないことから低コストであるというメリットよ
り、２−クロロ−４−ニトロフェニルマルトトリオシ
ド、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシルマルトシドが好適である。さらに、
非還元末端が修飾されていることから内因性α−グルコ
シダーゼ等による分解による試薬ブランクの上昇がな
い、α−アミラーゼの基質親和性がより高いため好感度
であるといったメリットがあることから、２−クロロ−
４−ニトロフェニル４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ルマルトシドがさらに好適に用いられる。該基質の試薬
組成物中での濃度は、反応液中に好ましくは０．０５〜
５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜２ｍＭの範囲で用い
られる。

【００３０】また本発明の電解質測定用試薬組成物は、
第一反応、第二反応の２ステップで測定する必要がある
ことから、２試薬により構成させるいわゆる２試薬系で
ある必要がある。そして、キレート剤と電解質により可
逆的に再活性化する不活性化型α−アミラーゼを別々に
処方することを特徴とする。該キレート剤と該不活性化
型α−アミラーゼを別々に処方することにより、該不活
性型α−アミラーゼの長期的な溶液安定性を得ることが
できるものである。また、該電解質測定用試薬組成物の
最終ｐＨを５．０〜８．０の範囲にすることによって、
α−アミラーゼの糖分解反応速度そのものを制御し、測
定範囲をより広げることが可能となる。

【００３１】また、第二試薬添加後、より速やかにレー
ト測定可能な零次反応が得られる、または干渉電解質の
前処理、前消去のの点から、第一試薬において（ａ）α
−アミラーゼ基質および（ｂ）キレート剤を含有し、か
つ第二試薬において（ｃ）電解質により可逆的に再活性
化する不活性化型α−アミラ−ゼを含有するように処方
される態様が好ましい。さらには、外部からの測定検体
以外のものに由来するα−アミラ−ゼの混入の影響回避
の点から、上記の第一試薬において（ｄ）α−アミラー
ゼに対し阻害活性を有する物質を含有せしめることがよ
り好ましい。

【００３２】一方、α−アミラーゼの安定性至適ｐＨは
６〜８の中性付近であり、またキレート剤の安定性至適
ｐＨはアルカリ側であることより、本発明の試薬組成物
をｐＨ６〜８の範囲で調製するのが好ましいと考えられ
るが、同時に定量性等の性能を得るには、第一試薬と第
二試薬を混合した際に反応至適ｐＨになるように処方す
ることもできる。好ましくはキレート剤を含む試薬をｐ
Ｈ７以上、より好ましくはｐＨ７〜９、電解質により可
逆的に再活性化する不活性化型α−アミラーゼを含む試
薬をｐＨ６〜７とし、バッファー濃度またはこれら２試
薬の混合比を調整し、反応至適ｐＨになるように処方す
る。試薬ｐＨを保持する方法は、公知の方法であれば何
ら限定されるものではないが、一般的には緩衝剤が用い
られる。該緩衝剤としては、例えば、グッド緩衝剤、ト
リス緩衝剤、リン酸緩衝剤等が挙げられる。第一試薬、
第二試薬各々における緩衝剤は、好ましくは１０〜５０
０ｍＭ、より好ましくは５０〜３００ｍＭの濃度で用い
られる。

【００３３】また、本発明の電解質測定用試薬組成物に
は、上記α−アミラーゼ基質（いわゆるメディエーター
基質）とは別に、レギュレーター基質として、試薬ブラ
ンクを抑える、定量性を向上させる等の目的のため、必
要により最終的な光学的測定法が異なる２つの基質また
は基質とその生成物を組合わせて用いることで、糖分解
反応を競合せしめ、見かけの基質親和性を低下させるこ
とができる。例えば、マルトオリゴ糖、またはその非還
元末端グルコースを修飾したマルトオリゴ糖、またはそ
の還元末端グルコースに非発色源基が結合したマルトオ
リゴ糖より選ばれる基質を競合させ、主反応である還元
末端グルコースに発色源基を結合させるか、あるいは、
さらに非還元末端に置換基を結合させた基質に対するα
−アミラーゼの反応速度を調節する。なかでも、非還元
末端グルコースを修飾したマルトオリゴ糖は内因性α−
グルコシダーゼの分解を受けず測定値に影響を及ぼさな
いことから、好適に用いられる。

【００３４】上記マルトオリゴ糖としては、例えば、マ
ルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マ
ルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタ
オースなどグルコース数が２〜７のマルトオリゴ糖が挙
げられる。非還元末端グルコースを修飾したマルトオリ
ゴ糖としては、ガラクトシルマルトース、ガラクトシル
トリオース、ガラクトシルテトラオース、ガラクトシル
ペンタオースが挙げられ、還元末端グルコースに非発色
源基が結合したマルトオリゴ糖としては、例えば、２，
４−ジクロロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオシド、
２，４−ジクロロフェニル−（αまたはβ）−Ｄ−マル
トペンタオシド、２，４−ジクロロフェニル−（αまた
はβ）−Ｄ−マルトトリオシドなどが挙げられる。該マ
ルトオリゴ糖の用いる濃度としては、好ましくは反応液
中で０．０１〜２５０ｍＭ、より好ましくは０．１〜２
００ｍＭであり、第一試薬、第二試薬いずれにおいても
用いられ得る。

【００３５】さらに、本発明の電解質測定用試薬組成物
には、必要に応じてイオノフォア、クラウンエーテル等
の干渉電解質の影響回避、あるいは感度調節のため干渉
電解質または測定対象電解質に対する選択的結合剤を使
用することができる。該選択的結合剤としては、上述の
ようなキレート剤の他に、１８−クラウン−６（メルク
社製）、クリプトフィックス２２１（メルク社製）など
が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、界面活性
剤、酸化防止剤、プロテアーゼ阻害剤等を測定する電解
質の定量性に影響を及ぼさない範囲で添加することも可
能である。

【００３６】防腐剤は特に限定されないが、α−アミラ
ーゼの安定性に対する影響の少ないアジ化ナトリウム、
あるいは、セフェム系、ペニシリン系、アミノグリコシ
ド系、キノロン系等の抗生物質等が好適に用いられ、こ
れらを単独あるいは組合わせて使用することができる。
界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、陽イオン界
面活性剤、陰イオン界面活性剤などを単独あるいは組合
わせて使用することができる。

【００３７】測定する電解質がカルシウムイオンの場合
は、アルカリ金属のハロゲン化物、例えば、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウムなどを３〜３００ｍＭの濃度で添加
することが好ましい。また測定する電解質が塩素イオン
の場合は、２価カチオン、例えば、カルシウム、マグネ
シウム、バリウム、亜鉛等を０．０１〜２００ｍＭの濃
度で添加することができる。

【００３８】酸化防止剤としては、アスコルビン酸およ
びその塩、ソルボース等の糖類、カタラーゼ等が挙げら
れる。プロテアーゼ阻害剤としてはフッ化フェニルメチ
ルスルホニル等が挙げられる。

【００３９】本発明においては、電解質により可逆的に
再活性化する不活性化型α−アミラーゼが、上述のよう
に試料中のカルシウムまたは塩素イオン等の電解質を得
て活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミラーゼの基
質と反応することを利用し、上述のような測定方法に基
づき測定することができる。例えば、カルシウムの測定
の場合は、第一反応として試料にα−アミラーゼに対し
阻害活性を有する物質、キレート剤、およびα−アミラ
ーゼの基質として２−クロロ−４−ニトロフェニル−４
−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドを
含む第一試薬を作用させ、続いて第二反応として電解質
により可逆的に再活性化する不活性化型α−アミラーゼ
を含有する第二試薬を作用させることで、試料中のカル
シウムに依存して再活性化したアミラーゼの反応により
２−クロロ−４−ニトロフェノールを生成する。

【００４０】２−クロロ−４−ニトロフェノールがそれ
自体４００ｎｍ付近に吸収があることから、遊離後４０
０ｎｍ付近の吸光度の変化を測定し、既知濃度の試料の
吸光度を対照に、試料中のカルシウムの濃度を求める。
上記２−クロロ−４−ニトロフェノールの測定方法とし
ては、アミラーゼの反応を連続的に追跡するレート法お
よび一定時間反応させた後反応を止めて測定するエンド
ポイント法のいずれもが適用されうる。

【００４１】本発明の一実施様態として、塩素イオンの
測定について示すと、第一反応として試料にα−アミラ
ーゼに対し阻害活性を有する物質、キレート剤およびα
−アミラーゼの基質として２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マル
トシドを含む第一試薬を作用させ、続いて第二反応とし
て電解質により可逆的に再活性化する不活性化型α−ア
ミラーゼを含有する第二試薬を作用させることで、試料
中の塩素イオンに依存して再活性化したアミラーゼの反
応により、生成する２−クロロ−４−ニトロフェノール
を測定し、試料中の塩素イオン量を求めるものである。

【００４２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明する。なお、本発明はこれら実施例に限定されるもの
でない。

【００４３】実施例１ 下記組成からなるカルシウム測定試薬を調製し、α−ア
ミラーゼを含む第二試薬を３５℃で１４日間保存した。
そして、調製直後５、１０、１４日目の試液中のα−ア
ミラーゼ活性を市販のα−アミラーゼ活性測定試薬（ダ
イヤカラー・ＡＭＹネオレート：東洋紡績（株）製）を
用いて測定し、残存活性（％）を求めた。その結果を表
１に示す。

【００４４】 （１）第一試薬組成 トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド ０．９ｍＭ

【００４５】 （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．０） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ 不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） ４．２ＩＵ／ｍｌ

【００４６】比較例１ 下記組成からなるカルシウム測定試薬を調製し、α−ア
ミラーゼを含む第一試薬を３５℃で１４日間保存し、実
施例１と同様に３５℃保存後の残存活性（％）を求め
た。その結果を表１に示す。

【００４７】 （１）第一試薬組成 トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ＮａＣｌ ２００ｍＭ 不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） ２．１ＩＵ／ｍｌ

【００４８】 （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．０） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド １．８ｍＭ

【００４９】

【表１】

【００５０】上記表１より、比較例１のα−アミラーゼ
の残存活性が３９．４％に対し、実施例１では９７．２
％とほとんど劣化がなく、安定性が良好であることが確
認された。

【００５１】実施例２ 実施例１と同様のカルシウム測定試薬について３５℃で
１４日間保存し、調製直後とあわせて、下記に示すカル
シウム量の測定方法に従い、試料として精製水、１０ｍ
ｇ／ｄｌ標準液及び酢酸カルシウム水溶液（Ｃａイオン
換算で５０ｍｇ／ｄｌ）の１０水準の希釈系列を測定
し、高値直線性を検討した。

【００５２】カルシウム量の測定方法 試料量３．５μｌに第一試薬１８０μｌ加え、５分間予
備加温した後、さらに第二試薬９０μｌを加えて反応を
開始させ、該基質試液添加後２分後からの３分間におけ
る１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシ
ウム１０ｍｇ／ｄｌ標準液での２点検量線に基づき試料
中のカルシウム量を求めた。尚、測定装置は日立７１７
０形自動分析装置を使用し、測定波長は、主波長４０５
ｎｍ、副波長５４６ｎｍとし、測定温度は３７℃で実施
した。

【００５３】比較例２ 比較例１と同様のカルシウム測定試薬について３５℃で
１４日間保存し、調製直後とあわせて、実施例２と同様
に高値直線性を検討した。

【００５４】図１、２より、比較例２の直線性が高値に
おいて顕著にそり上がっているのに対し、実施例２では
ほとんどそり上りがなく、良好な直線性が得られ安定性
が良好であることが確認された。

【００５５】実施例３ 下記組成にα−アミラーゼに対し阻害活性を有する物質
として、（ア）５−ブロモ−５−ニトロ−１，３ジオキ
サン、（イ）２−クロロアセトアミド、（ウ）２−ヒド
ロキシピリジン−Ｎ−オキサイド、（エ）イミダゾリジ
ニルウレア、（オ）Ｎ−メチルイソチアゾロン、（カ）
５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オ
ン、（キ）Ｎ−エチルマレイミドを各々０．０５％添加
した７試薬、及び（ク）α−アミラーゼに対し阻害活性
を有する物質を含有しない試薬の計８種のカルシウム測
定試薬を調製し、各試薬にヒト唾液由来α−アミラーゼ
を試薬中で３ＩＵ／Ｌになるように混入させ、３５℃で
１４日間保存した。また、各試薬ともα−アミラーゼ未
混入の試薬について同様に保存した。測定は実施例２の
カルシウム量の測定方法に従い、試料として精製水を測
定して、調製直後３５℃で５，１０，１４日の試薬の初
期吸光度（精製水を測定したときの測光開始ポイントの
吸光度）を求めた。結果を表２に示す。

【００５６】 （１）第一試薬組成 トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド ０．９ｍＭ α−アミラーゼに対し阻害活性を有する物質 ０．０５％

【００５７】 （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．０） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ 不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） ４．２ＩＵ／ｍｌ

【００５８】比較例３ 上記比較例１に示される組成からなるカルシウム測定試
薬を調製して、実施例３と同様の用法で同様の試料を測
定し、調製直後３５℃で５，１０，１４日の試薬の初期
吸光度を求めた。結果を表２に示す。

【００５９】

【表２】

【００６０】上記表２より、比較例３のα−アミラーゼ
混入試薬の初期吸光度が未混入試薬に対し明らかに上昇
しているのに対し、実施例３においてはいずれの試薬に
関しても初期吸光度の上昇が抑えられる。なかでも、第
一試薬にさらにα−アミラーゼに対し阻害活性を有する
物質を含有する試薬において初期吸光度の上昇が顕著に
改善されることが確認された。

【００６１】実施例４ 下記組成からなるカルシウム測定試薬について４０℃で
保存し、調製直後より１、４、７日後の試薬を用い、実
施例２と同様の測定方法に従い、試料として精製水、１
０ｍｇ／ｄｌ標準液及び市販管理血清モニトロールＩ
Ｘ、モニトロールＩＩＸを測定し、１０ｍｇ／ｄｌ標準
液感度、血清値の経日変化を調製直後を対照に相対値
（％）を求めた。結果を表３、４に示す。

【００６２】 （１）第一試薬組成 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイド ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド ０．９ｍＭ （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．５） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ 不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） ４．２ＩＵ／ｍｌ

【００６３】比較例４ 下記組成からなるカルシウム測定試薬について実施例４
と同様の検討を行った。結果を表３、４に示す。 （１）第一試薬組成 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイド ０．０５％ 不活性化型α−アミラーゼ（ブタ膵臓由来） ２．１ＩＵ／ｍｌ （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．５） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド １．８ｍＭ

【００６４】実施例５ 下記組成からなるカルシウム測定試薬について実施例４
と同様の検討を行った。結果を表３、４に示す。

【００６５】 （１）第一試薬組成 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイド ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド ０．９ｍＭ

【００６６】 （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．５） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ 不活性化型α−アミラーゼ（人唾液由来） １２ ＩＵ／ｍｌ

【００６７】比較例５ 下記組成からなるカルシウム測定試薬について実施例４
と同様の検討を行った。結果を表３、４に示す。

【００６８】 （１）第一試薬組成 トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．１） ５０ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ １，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ ガラクトシルマルトース ２．３ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキサイド ０．０５％ 不活性化型α−アミラーゼ（人唾液由来） ６ ＩＵ／ｍｌ

【００６９】 （２）第二試薬組成 グッド緩衝液（ｐＨ６．５） ３００ｍＭ ＮａＣｌ ２００ｍＭ ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル ０．０５％ ２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α −マルトシド １．８ｍＭ

【００７０】

【表３】

【００７１】

【表４】

【００７２】表３より、１０ｍｇ／ｄｌ標準液感度の経
日変化では比較例４と実施例４、比較例５と実施例５の
比較において実施例４、５の４０℃保存経日後の感度低
下が小さいことがわかった。また実施例４と５の比較よ
りブタ膵臓由来α−アミラーゼよりも人唾液由来を用い
た試薬の感度低下が小さく、保存安定性が優れているこ
とがわかった。また、表４より、血清値の経日変化では
比較例４、５においてモニトロールＩＸの相対値（％）
に低下傾向がみられ、モニトロールＩＩＸに上昇傾向が
みられるのに対し、実施例４、５ではほとんど変動はみ
られなかった。

【００７３】

【発明の効果】上述したように、本発明における電解質
測定用試薬組成物は、測定試薬を２試薬の構成とし、安
定性不良に起因するキレート剤と電解質により可逆的に
再活性化する不活性化型α−アミラーゼとを別々に処方
することにより、従来のような安定化剤をむやみに使用
することなく低温から実使用レベルである室温での長期
的な溶液安定性が得られる。さらに、２試薬の構成を少
なくとも第一試薬において（ａ）α−アミラーゼ基質お
よび（ｂ）キレート剤、第二試薬において（ｃ）電解質
により可逆的に再活性化する不活性化型α−アミラ−ゼ
を含有する構成とし、さらに第一試薬において（ｄ）α
−アミラーゼに対し阻害活性を有する物質を含有するこ
とにより、混入α−アミラーゼの影響を回避できること
から、安定性、正確性および定量性に優れた電解質測定
用試薬組成物を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２において、調製直後及び３５℃、１４
日間保存した試薬を用いて〜５０ｍｇ／ｄｌのカルシウ
ム水溶液１０水準を測定した結果を、Ｘ軸に希釈水準、
Ｙ軸にカルシウム濃度（ｍｇ／ｄｌ）でプロットした図
である。

【図２】比較例２において、調製直後及び３５℃、１４
日間保存した試薬を用いて〜５０ｍｇ／ｄｌのカルシウ
ム水溶液１０水準を測定した結果を、Ｘ軸に希釈水準、
Ｙ軸にカルシウム濃度（ｍｇ／ｄｌ）でプロットした図
である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 α−アミラーゼを用いた２試薬からなる
   電解質測定用試薬組成物において、電解質により可逆的
   に再活性化する不活性化型α−アミラーゼとキレート剤
   を別々に処方することを特徴とする電解質測定用試薬組
   成物。
2. 【請求項２】 第一試薬において（ａ）α−アミラーゼ
   基質および（ｂ）キレート剤を含有し、かつ第二試薬に
   おいて（ｃ）電解質により可逆的に再活性化する不活性
   化型α−アミラ−ゼを含有するように処方された請求項
   １記載の電解質測定用試薬組成物。
3. 【請求項３】 第一試薬において（ｄ）α−アミラーゼ
   に対し阻害活性を有する物質を含有する請求項１または
   ２に記載の電解質測定用試薬組成物。
4. 【請求項４】 α−アミラーゼ基質が２−クロロ−４−
   ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル
   −α−マルトシドである請求項１〜３のいずれかに記載
   の電解質測定用試薬組成物。
5. 【請求項５】 α−アミラーゼに対し阻害活性を有する
   物質が、５−ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサ
   ン、２−クロロアセトアミド、２−ヒドロキシピリジン
   −Ｎ−オキサイド、イミダゾリジニルウレア、Ｎ−メチ
   ルイソチアゾロン、５−クロロ−２−メチル−４−イソ
   チアゾリン−３−オンおよびＮ−エチルマレイミドより
   なる群から選ばれた少なくとも１種類である請求項１〜
   ４のいずれかに記載の電解質測定用試薬組成物。
6. 【請求項６】 キレート剤が１，２−ビス（ｏ−アミノ
   フェノキシ）エタン四酢酸である請求項１〜５のいずれ
   かに記載の電解質測定用試薬組成物。
7. 【請求項７】 第一試薬がｐＨ７以上であり、かつ第二
   試薬がｐＨ６〜７である請求項１〜６のいずれかに記載
   の電解質測定用試薬組成物。
8. 【請求項８】 電解質がカルシウムイオンである請求項
   １〜７のいずれかに記載の電解質測定用試薬組成物。
9. 【請求項９】 電解質が塩素イオンである請求項１〜７
   のいずれかに記載の電解質測定用試薬組成物。