JPH0661265B2 - 酵素又は微生物菌体の粒状固定化成形物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素又は微生物菌体の固定化法に関し、さらに
詳しくは酵素又は微生物菌体を粒状固定化成形物として
固定化する方法に関する。

酵素又は微生物の固定化法としては、従来から、包括
法、物理的吸着法、共有結合法等多くの方法が得られて
いる。これらの方法によって得られる塊状あるいはシー
ト状の固定化物は、微生物反応や酵素反応に使用する場
合には、細かく切断したり磨砕したりした後カラムに充
填するのが普通である。しかしその場合固定化物は面同
志で密着することが多く、微生物反応や、酵素反応の効
率が悪くなり、たびたびチャネリング現象を起こしてカ
ラムを閉塞する等の欠点もある。

本発明者らは先に酵素又は微生物菌体を粒状成形物とし
て固定化することができれば、流動しやすくカラムへの
充填作業が容易で、粒子同志の接触面積も少なく微生物
反応や酵素反応の効率をアップすることができると考
え、親水性光硬化性樹脂と水溶性高分子多糖類とよりな
る混合物を用いて、これを多価金属イオンを含有する水
性媒体中に滴下して粒状化した後、光硬化せしめること
により酵素又は菌体を固定した粒状物を容易に得ること
に成功した（特開昭５９−１１１８２号公報参照）。し
かしながら、疎水性光硬化性樹脂を用いて上記の方法に
よって粒状固定化物を得ることは困難であり従来はシー
ト状や塊状にして使用されていた。

そこで、本発明者らは疎水性樹脂を用いて粒状固定化物
を得ることについて、さらに研究を進めた結果、固定化
担体として或る種の疎水性光硬化性樹脂を、界面活性剤
を含有する水性媒体中に滴下することにより樹脂の表面
張力及び樹脂表面へのミセルの形成等により、安定な粒
状固定化物を製造することができることを見出し本発明
を完成させるに至った。

しかして、本発明によれば、 （ａ）１分子中に少なくとも２個のエチレン性不飽和結
合を有する疎水性光硬化性樹脂 （ｂ）光重合開始剤 （ｃ）疎水性光硬化性樹脂を希釈することのできる溶媒
および （ｄ）酵素、又は微生物菌体 を含んでなる液状組成物を、界面活性剤を含有する水性
媒体中に滴下して該組成物を粒状にさせ、次いで得られ
る粒状物に活性光線を照射して該粒状物中の光硬化性樹
脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生物菌体の
粒状固定化成形物の製造方法が提供される。

以下本発明の方法についてさらに詳しく説明する。

（ａ）疎水性光硬化性樹脂 (i)無水マレイン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン
酸、無水イタコン酸などの不飽和多価カルボン酸の少な
くとも一種とまたはこれらとトリメリット酸、無水トリ
メリット酸、ピロメリット酸、無水ピロメリット酸など
の飽和多価カルボン酸の少なくとも１種とから成る多価
カルボン酸成分と、多価アルコールとのエステル化によ
って得られる酸価が約４０未満の不飽和ポリエステル
（数平均分子量は約１０００以上、好ましくは約３００
０以上）。

(ii)無水マレイン酸、マレイン酸、フマル酸、イタコン
酸、無水イタコン酸などの不飽和多価カルボン酸の少な
くとも１種と１分子中に３個より多いヒドロキシル基を
有する多価アルコールを少なくとも５重量％含む多価ア
ルコールとのエステル化物またはこのエステル化物中の
ヒドロキシル基に酸無水物を反応させた酸価４０未満の
不飽和ポリエステル類（数平均分子量約１０００以上、
好ましくは約３０００以上）。

(iii)不飽和エポキシド類；ｎモルのグリシジル基を有
するエピコート８２８，１００１，１００４（シェルケ
ミカル社製、商品名）などの多価グリシジル化合物と
（ｎ−２）モルのカルボキシル基を有するマレイン酸、
アジピン酸、トリメリット酸などの多価カルボン酸と２
モルの（メタ）アクリル酸などの不飽和カルボキシル化
合物との付加反応物またはこれらに残存するヒドロキシ
ル基に酸無水物を付加した酸価４０未満の不飽和エポキ
シド類；ｎモルのグリシジル基を有する該多価グリシジ
ル化合物と（ｎ＋２）モルのカルボキシル基を有する該
多価カルボン酸との付加反応物に残存するヒドロキシル
基に酸無水物を付加させた化合物に（メタ）アクリル酸
グリシジルなどの不飽和グリシジル化合物を反応させた
酸価４０未満の不飽和エポキシド類など。

(iv)アニオン製不飽和アクリル樹脂類；ここでいうアニ
オン性不飽和アクリル樹脂とは、（メタ）アクリル酸お
よび（メタ）アクリル酸エステルの共重合体であり、 Ｃ＋５Ｐ＋１０Ｓ＝Ａ……(1) ［ここでＣは樹脂中のカルボキシル基の濃度(mol/kg)、
Ｐは樹脂中のリン酸基濃度(mol/kg)、Ｓは樹脂中のスル
ホン酸基濃度(mol/kg)である。］ 前記(1)式のＡが０．８未満(mol/kg)であり、樹脂中の
光重合可能なエチレン性不飽和基の濃度が０．１〜５(m
ol/kg)である樹脂である。該（メタ）アクリル酸および
（メタ）アクリル酸エステルの共重合体は公知の方法で
合成される。樹脂中にカルボキシル基を導入するには、
（メタ）アクリル酸などの不飽和カルボキシル化合物
を、リン酸基を導入するにはホスマーＭ、ホスマーＣ１
（両者との油脂製品社製、商品名）などの不飽和リン酸
エステルを、スルホン酸基を導入するためには（メタ）
アクリル酸−２−スルホエチル、（メタ）アクリル酸−
３−スルホプロピルなどの不飽和スルホン酸エステル
を、共重合可能なエチレン性不飽和基を導入するために
は共重合体中に存在するカルボキシル基、リン酸基、あ
るいはスルホン酸基に（メタ）アクリル酸グリシジルな
どの不飽和グリシジル化合物を反応させることにより可
能となる。

(v)カチオン性不飽和アクリル樹脂類；（メタ）アクリ
ル酸−２−ジエチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸
−ｔｅｒｔ−ブチルアミノエチル、ビニルピリジンなど
の不飽和アミノ化合物を５重量％より少ない量を含む
（メタ）アクリル酸エステルの共重合体に（メタ）アク
リル酸グリシジルなどの不飽和グリシジル化合物を反応
させた不飽和アクリル樹脂、ポリスチレンをクロロメチ
ル化後、不飽和アミノ化合物で４級化した不飽和アクリ
ル樹脂、ポリエチレンイミンと不飽和グリシジル化合物
との付加物などがあげられる。

(vi)ポリプロピレングリコールと（メタ）アクリル酸と
のポリエステル類；分子量４００〜１００００で３０重
量％未満のエチレンオキサイド基を含むポリプロピレン
グリコールの（メタ）アクリル酸などの不飽和モノカル
ボン酸とのジエステル。

(vii)ポリプロピレングリコールと（メタ）アクリル酸
２−ヒドロキシエチルとのウレタン化付加物；ｎモルの
トリレンジイソシアネート、キシリレンジイソシアネー
ト、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイ
ソシアネートなどのジイソシアネート、ｎ−１モルのポ
リプロピレングリコールおよび２モルの（メタ）アクリ
ル酸２−ヒドロキシエチルなどの不飽和モノヒドロキシ
化合物とのウレタン化物；１モルのトリメチロールプロ
パンなどの３官ヒドロキシ化合物と４モルのジイソシア
ネート、２モルのポリプロピレングリコールおよび２モ
ルの（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチルなどの不
飽和モノヒドロキシ化合物とのウレタン化物に無水マレ
イン酸、無水コハク酸などの酸無水物を反応さたカルボ
キシル化ウレタン化物などがあげられる。

以上に例示した如き疎水性光硬化性樹脂はそれぞれ単独
で使用することができ、或いは２種以上組み合わせて使
用してもよい。これらの光硬化性樹脂のうち、本発明に
おいて特に有利に使用しうるものとしては、前記(vii)
のポリプロピレングリコールと（メタ）アクリル酸２−
ヒドロキシエチルとのウレタン化付加物をあげることが
できる。

（ｂ）光重合開始剤 上記（ａ）に述べた光硬化性樹脂の光重合反応を促進す
る目的で、本発明に従う液状組成物には光重合開始剤
（光増感剤）を含ませる。使用しうる光重合開始剤は光
照射により分解してラジカルを生成し、このものが重合
開始種となって重合性不飽和基を有する樹脂間に橋かけ
反応を起こさせるもので、例えばベンゾイン、アセトイ
ン、α−ヒドロキシイソブチルフェノンなどのα−カル
ボニルアルコール類；ベンゾインメチルエーテル、ベン
ゾインエチルエーテル、ベンゾインプロピルエーテル、
アニソインエチルエーテル、ピパロインエチルエーテル
等のアシロインエーテル類；ナフトール、ヒドロキシア
ントラセンなどの多環芳香族化合物類；メチルベンゾイ
ン、α−メトキシベンゾインなどのα−置換アシロイン
類；２−シアノ−２−ブチルアゾホルムアミドなどのア
ゾアミド化合物類；硝酸ラウニル、塩化第２鉄などの金
属塩類；メルカプタン類；ジスルフィド類；ハロゲン化
合物類；染料類等をあげることができる。

これらの光重合開始剤は単独又は２種以上組合せて通常
０．０１〜１０ＰＨＲ（重量部／樹脂１００重量部）の
割合で使用できる。

（ｃ）疎水性光硬化性樹脂を希釈することのできる溶媒 疎水性光硬化性樹脂の中で粘度の高いもの（１０poise
以上）は、粒状化することは可能であるが、粒状化操作
がしにくい。そこで、疎水性光硬化性樹脂を溶解するこ
とができるが、固定化重合物を溶解しないような溶媒を
用いて希釈することによりたやすく粒状化することがで
きる。この溶剤としては例えば、石油ベンジン、ヘキサ
ン、ヘプタン、ベンゼン、石油エーテル、トルエン、酢
酸エチル、アセトン、アルコール、ジオキサン、エチレ
ングリコール、ホルムアミド、ピリジン、テトラヒドロ
フラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド
などの有機溶剤；オレイン酸、リノール酸、リノレン酸
などの脂肪酸類；オリーブ油、パーム油、ヤシ油などの
油脂類；などが使用でき、これらは、１種で用いても良
いし、２種以上の混合液として用いても良い。好ましく
は、反応における基質で希釈することが望ましい。例え
ば、オリーブ油の加水分解反応を行なう際、オリーブ油
で疎水性光硬化性樹脂を希釈して粘度を下げる。

（ｄ）酵素又は微生物菌体 本発明の方法により固定化しうる酵素又は微生物菌体は
多種多様であり、その種類には特に制約はない。本発明
の方法によれば、どのような種類の酵素又は微生物菌体
でも、その酵素活性を実質的に失活させることなく固定
化することができる。本発明の方法を適用しうる酵素お
よび微生物菌体を以下に示すがこれはごく一例にすぎな
い。

微生物菌体の例としては、 ラクトバチルス・ブルガリス (Lactobacillus bulgaris) アエロバクター・アエロゲネス (Aerobactor aerogenes) バチルス・ズブチルス(Bacillus subtillis) アゾトバクター・ビランディ (Azotobacter vinelandii) プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris) アースロバクター・シンプレックス (Arthrobacter simplex) ノカルディア・ロドクラス (Nocardia rhodocrous) カルバラリア・ルナタ(Curvularia lunata) キャンディダ・シリンドレシア (Candida cylindracea) アスパラギルス・ニガア(Aspergills niger) リゾパス・デレマア(Rhizopus delemar) ゲオトリカム・キャンディダム (Geotrichum candidum) ペニシリウム・シクロピウム (Penicillium cyclopium) などをあげることができる。

また、酵素の例としては、 グルコースオキシターゼ（１、１、３、４） アルデヒドオキシターゼ（１、２、３、１） Ｌ−アミノ酸オキシターゼ（１、４、３、２） Ｄ−アミノ酸オキシターゼ（１、４、３、３） カタラーゼ（１、１１、１、６） グルコキナーゼ（２、７、１、２） カルボキシエステラーゼ（３、１、１、１） アリールエステラーゼ（３、１、１、２） リパーゼ（３、１、１、３） ホスホリパーゼＡ（３、１、１、４） リソレクチンアシルヒドラーゼ（３、１、１、５） アセチルエステラーゼ（３、１、１、６） ペクチンエステラーゼ（３、１、１、１１） コレステロールエステラーゼ（３、１、１、１３） グルコアミラーゼ（３、２、１、３） α−ガラクトシターゼ（３、２、１、２２） β−ガラクトシターゼ（３、２、１、２３） インベルターゼ（３、２、１、２６） ペプシン（３、４、４、１） トリプシン（３、４、４、４） キモトリプシンＡ（３、４、４、５） カテプシンＡ（３、４） パパイン（３、４、４、１０） トロンビン（３、４、４、１３） アミターゼ（３、５、１、４） ウレアーゼ（３、５、１、５） ペニシリンアシターゼ（３、５、１、１１） アミノアシラーゼ（３、５、１、１４） アルドラーゼ（４、１、２、１３） アスペルターゼ（４、３、１、１） グリコール−６−リン酸イソメラーゼ（５、３、１、
９） ステロイドΔ−イソメラーゼ（５、３、３、１） など、をあげることができる。

液状組成物の調製 以上の述べた（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成
分は、相互に充分混合することにより液状組成物にする
ことができる。（ｄ）の酵素又は微生物菌体は、原末あ
るいは乾燥菌体として分散しても良いし、酵素溶液ある
いは微生物懸濁液として、エマルジョン状にして用いて
も良い。また、酵素又は微生物をあらかじめ吸着したも
の；たとえば、セライト、石英砂、白土、活性炭、コロ
イダルシリカ、アルミナなどを分散して用いても良い。

上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各成分の相互
の使用割合は厳密に制限されるものではなく、各成分の
種類等に応じて広範にわたって変えることができるが、
一般には、（ａ）成分の疎水性光硬化性樹脂１００重量
部に対し、下記の割合で使用するのが適当である（カッ
コ内は好適範囲である）。

（ｂ）光重合開始剤：０．１〜５重量部 （０．５〜２重量部） （ｃ）疎水性光硬化性樹脂を希釈することのできる溶
媒：０〜１０００重量部 （１０〜２００重量部） （ｄ）酵素又は微生物菌体：０．００１〜５０重量部 （０．０１〜２０重量部） 粒状化 上記の如くして調製された液状組成物は次いで界面活性
剤を含有する水性媒体中に滴下して粒状化する。水性媒
体中に界面活性剤を加えなくても粒状化は可能である
が、界面活性剤を加えないと大部分は水性媒体中で広が
ってしまい粒状化は非常に困難である。また、粒状化し
たものでも粒状化物どおしで融合してしまったりする。
ところが、水性媒体中に界面活性剤を加えると、滴下さ
れた液状組成物の表面張力及び液状組成物表面へのミセ
ルの形成などの作用により安定な粒状化物を形成する。
すなわち、水性媒体中に界面活性剤を加えることによ
り、液状組成物が水性媒体中で粒状化しなかったり、粒
状化物同志が融合したりすることは起こらず、たやすく
粒状化できる。

界面活性剤は、特に制限なく使用することができる。た
とえば、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エ
ステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エス
テル、大豆リン脂質、プロピレングリコール脂肪酸エス
テル、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキ
ルエーテル硫酸エステルナトリウム、ポリエチレングリ
コールオクチルフェニルエーテルなどがあげられる。

この際、水性媒体中の界面活性剤の濃度は、一般に０．
０００１〜１０重量％、好ましくは０．０１〜３重量％
の範囲である。

かかる界面活性剤を含有する水性媒体中への前記液状組
成物の滴下は、例えば、注射針のような先の細い管の先
端から該液状組成物を滴下する方法。スプレーノズル先
端から、該液状組成物を霧化して粒状として滴下する方
法などの方法により行なうことができる。滴下する液滴
の大きさは最終の粒状固定化物に望まれる粒径に応じて
自由に変えることができるが、通常は直径が約０．１〜
約５mm、好ましくは約０．５〜約３mmの液滴として滴下
させるのが好都合である。

滴下した液状組成物は界面活性剤を含有する水性媒体中
に滴下すると直ちに粒状化する。この粒状化における温
度は通常室温で充分であるが、必要により、酵素又は微
生物菌体が失活しない程度の加温下に粒状化を行なって
もよく、或いは冷却下に行なってもよい。

光硬化 上記の如くして生成せしめた粒状化物は、そのまま水性
媒体中に分散させた状態で活性光線を照射することによ
り、該粒状化物中の疎水性光硬化性樹脂を硬化、粒状ゲ
ル化せしめる。これにより機械的強度の大きい酵素又は
微生物菌体の粒状固定化物が得られる。

上記の光硬化に使用しうる活性光線の波長は該粒状化物
中に含まれる光硬化性樹脂の種類等に応じて異なるが、
一般に約２５０〜約６００nmの範囲内の波長の光を発す
る光源を照射に使用するのが有利である。そのような光
源の例としては、低圧水銀灯、高圧水銀灯、蛍光灯、キ
セノンランプ、カーボンアーク灯、太陽光等が挙げられ
る。

照射時間は光源の光の強さ、光源からの距離等に応じて
変える必要があるが、一般には約０．５〜約１０分間の
範囲内とすることができる。なお、照射を不活性ガス雰
囲気中で行なうと、照射時間が短縮されることがある。
照射は生成せしめた全粒状化物に活性光線が出来るだけ
満遍無く行きわたるようにすべきである。

このように照射処理が終った粒状固定化物は水性媒体か
ら分離採取し、水、緩衝水溶液あるいは粒状固定化物を
溶解しない有機溶媒等で洗浄し、そのまま保存したりあ
るいは粒状化物を凍結乾燥して保存することができる。

かくして本発明により粒径が約０．１〜約５mmの酵素又
は微生物菌体の粒状固定化物が、極めて簡単な操作で製
造することができ、連続的生産も可能である。

本発明の方法によればこれまで困難であった疎水性光硬
化性樹脂担体による酵素又は微生物菌体の粒状固定化が
容易にでき得られた粒状固定化物は疎水性条件下での酵
素又は微生物菌体反応における基質の透過拡散性の増大
に基づく反応速度の向上を達成できるものであり、特に
反応装置規模が余り大きくないリアクター、流動床型の
リアクターなどに簡便に用いることができる。

次に実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１ 数平均分子量約４０００のポリプロピレングリコール２
０００ｇとイソホロンジイソシアネート１モル（２２２
ｇ）およびメタクリル酸２−ヒドロキシエチル１モル
（１３０ｇ）の混合物からなる光硬化性（樹脂）プレポ
リマー１００重量部と、α−ヒドロキシイソブチルフェ
ノン０．５重量部およびヤシ油６０重量部をよく混合す
る。これに酵素リパーゼ５重量部（原末のまま）を加え
てよく分散し、得られる光硬化性樹脂−酵素混合液を１
重量％−ラウリル硫酸ナトリウム水溶液中に、注射器先
端の注射針から液面高さ１０cmより連続的に滴下したと
ころ、粒径約２mmの粒状化物が得られた。

この粒状化物を上面及び下面から波長３００〜４００nm
の活性光線を５分間照射したところ圧縮強度５０kg/cm²
の粒状固定化酵素が得られた。

ヤシ油８０重量部、水２０重量部の混合液中に上記粒状
固定化物５重量部を加え、３０℃、６００rpmで７時間
後に、９５％のヤシ油が加水分解した。

実施例２ アクリル酸ｎ−ブチル６１９重量部、アクリル酸１３６
重量部およびスチレン１０３重量部からなる共重合体に
メタクリル酸グリシジル１４２重量部を反応させた樹脂
酸価４５、不飽和度１０、数平均分子量３００００の光
硬化性樹脂１０重量部をとりベンゾインエチルエーテル
０．１重量部を添加した後、アンモニア水で１．０当量
中和し、これにベンゼン３重量部、ｎ−ヘプタン３重量
部を加え、良く攪拌した。これに０．１Ｍリン酸緩衝液
に懸濁させたノカルディア・ロドクラスを１．５重量部
加え良く攪拌し、光硬化性樹脂−微生物菌体混合液を得
た。この混合液を０．５重量％ポリエチレングリコール
オクチルフェニルエーテル水溶液中に、注射器先端の注
射針から液面高さ１０cmより滴下したところ、粒径約２
mmの粒状化物が得られた。

この粒状化物を上面及び下面から波長３００〜４００nm
の活性光線を５分間照射したところ圧縮強度３０kg/cm²
の粒状固定化微生物が得られた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）１分子中に少なくとも２個のエチレ
   ン性不飽和結合を有する疎水性光硬化性樹脂 （ｂ）光重合開始剤 （ｃ）疎水性光硬化性樹脂を希釈することのできる溶媒
   および （ｄ）酵素又は微生物菌体、 を含んでなる液状組成物を、界面活性剤を含有する水性
   媒体中に滴下して該組成物を粒状にさせ、次いで得られ
   る粒状物に活性光線を照射して該粒状物中の光硬化性樹
   脂を硬化させることを特徴とする酵素又は微生物菌体の
   粒状固定化成形物の製造方法。