JPH0663B2 - ミエロペルオキシダーゼの調整方法 - Google Patents
ミエロペルオキシダーゼの調整方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト白血球を精製し、かつ活性化させ、得ら
れた細胞生成物の分解及び抽出を行ない、最後に精製を
行なうことにより、ミエロペルオキシダーゼを調製する
新規な方法に関する。
れた細胞生成物の分解及び抽出を行ない、最後に精製を
行なうことにより、ミエロペルオキシダーゼを調製する
新規な方法に関する。
この方法の特徴は、インターフェロンまたはインターロ
イキンをつくるために使用された軟膜を出発材料として
用いること、カルボキシメチル調整細孔ガラス（CM-CPG
と略称する）充填によるクロマトグラフ法を適用するこ
とである。
イキンをつくるために使用された軟膜を出発材料として
用いること、カルボキシメチル調整細孔ガラス（CM-CPG
と略称する）充填によるクロマトグラフ法を適用するこ
とである。
（従来の技術） ミエロペルオキシダーゼは、心筋梗塞の診断用薬として
使用される。梗塞程度は、組織のミエロペルオキシダー
ゼ量に比例している。
使用される。梗塞程度は、組織のミエロペルオキシダー
ゼ量に比例している。
酵素のこのような使用法が、ジャーナル・オブ・カーデ
ィオヴァスキュラー・ファーマコロジー（J.of Cardiov
ascular Pharmacology）７，1154〜1160ページ（1985
年）に記載されている。
ィオヴァスキュラー・ファーマコロジー（J.of Cardiov
ascular Pharmacology）７，1154〜1160ページ（1985
年）に記載されている。
炎症性疾患とミエロペルオキシダーゼ濃度との相関関係
が、ブラッド（Blood），60巻，第３号（1982年）に報
告されている。
が、ブラッド（Blood），60巻，第３号（1982年）に報
告されている。
ミエロペルオキシダーゼの調製法が、アーカイヴス・
オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス
(Archives of Biochem.and Biophys.)245，(1)167〜173
ページ（1986年），およびバイオケミストリー(Biochem
istry)，３(9)，1234〜1238ページ（1964年）に記載さ
れている。
オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス
(Archives of Biochem.and Biophys.)245，(1)167〜173
ページ（1986年），およびバイオケミストリー(Biochem
istry)，３(9)，1234〜1238ページ（1964年）に記載さ
れている。
これらの方法には、活性化物質が全く使用されていな
い。
い。
（発明の要約） 本発明は、とりわけ、インターフェロンまたはインター
ロイキン-2をつくるために使用された軟膜を、ミエロペ
ルオキシダーゼの誘導に必要な白血球懸濁液を調製のた
めの出発材料として用いると効果的であるという認識に
基づいている。
ロイキン-2をつくるために使用された軟膜を、ミエロペ
ルオキシダーゼの誘導に必要な白血球懸濁液を調製のた
めの出発材料として用いると効果的であるという認識に
基づいている。
本発明は、ヒト白血球を精製し、かつ活性化させ、得ら
れた細胞生成物の分解及び抽出を行なってから、精製す
ることにより、ミエロペルオキシダーゼを調製する方法
に関する。
れた細胞生成物の分解及び抽出を行なってから、精製す
ることにより、ミエロペルオキシダーゼを調製する方法
に関する。
この方法は、インターフェロンまたはインターロイキン
をつくるために使用された軟膜を出発材料として用いる
段階と、センダイウイルスもしくはコンカナバリンＡ、
植物凝集素、レンズマメレクチンまたはCa2+イオノフォ
アを活性化剤として用いる段階と、カルボキシメチル調
整細孔ガラス充填式のクロマトグラフ法を適用する段階
とからなっている。
をつくるために使用された軟膜を出発材料として用いる
段階と、センダイウイルスもしくはコンカナバリンＡ、
植物凝集素、レンズマメレクチンまたはCa2+イオノフォ
アを活性化剤として用いる段階と、カルボキシメチル調
整細孔ガラス充填式のクロマトグラフ法を適用する段階
とからなっている。
ヒト白血球インターフェロンの調製は、ハンガリー国特
許第182,209号明細書に記載されている。
許第182,209号明細書に記載されている。
（実施例） 以下、白血球の精製、活性化および分解、得られた細胞
生成物の抽出、並びに酵素精製について、実施例に基づ
き説明する。ただし、この実施例は、本発明を制約する
ものではない。
生成物の抽出、並びに酵素精製について、実施例に基づ
き説明する。ただし、この実施例は、本発明を制約する
ものではない。
実施例１ 白血球の精製 全血の分離によって得られる白血球リッチな画分である
いわゆる「軟膜」を、出発材料として用いる。軟膜は、
約40ml中に1.4×109の白血球を含んでいる。濃縮された
軟膜は、10ml単位で市販されている。
いわゆる「軟膜」を、出発材料として用いる。軟膜は、
約40ml中に1.4×109の白血球を含んでいる。濃縮された
軟膜は、10ml単位で市販されている。
軟膜は、白血球のほかに、赤血球や血漿を含んでいる。
それらを、白血球を精製過程で取り除かなければならな
い。
それらを、白血球を精製過程で取り除かなければならな
い。
軟膜（それぞれ、4000mlもしくは1000ml）100部に対
し、０±４℃の３倍量の0.38％塩化アンモニウム溶液を
加え、その溶液を、氷冷しながら10分間放置する。
し、０±４℃の３倍量の0.38％塩化アンモニウム溶液を
加え、その溶液を、氷冷しながら10分間放置する。
次に、1400rpmで20分間の遠心分離により、懸濁液中の
細胞を沈澱させ、上澄み液を別の容器に移し、残った細
胞部分を、PBS（リン酸緩衝溶液）約400ml中に再懸濁す
る。
細胞を沈澱させ、上澄み液を別の容器に移し、残った細
胞部分を、PBS（リン酸緩衝溶液）約400ml中に再懸濁す
る。
このようにして、3×108〜4×108細胞/mlの濃度の細胞
懸濁液約500mlが得られる。
懸濁液約500mlが得られる。
PBSの組成は、次の通りである。
mg/l 塩化ナトリウム 8,800 塩化カリウム 220 リン酸水素二ナトリウム・12H2O 3,500 リン酸二水素ナトリウム・H2O 224 pH＝7.2〜7.4 塩化アンモニウムによる処理を繰り返す。ただし、１部
/volの細胞懸濁液に対し、９部/Volの0.83％塩化アンモ
ニウム懸濁液を加える。
/volの細胞懸濁液に対し、９部/Volの0.83％塩化アンモ
ニウム懸濁液を加える。
得られた細胞を、PBS400ml中に再懸濁させると、約500m
lの細胞懸濁液が得られる。
lの細胞懸濁液が得られる。
実施例２ 活性化 活性化処理により、細胞が賦活させ、ミエロペルオキシ
ダーゼを生成させる。
ダーゼを生成させる。
約1.4×1011の細胞を含む白血球懸濁液500mlを、次の組
成からなる栄養溶液10000mlに加える。
成からなる栄養溶液10000mlに加える。
ｍｇ／ｌ 塩化カルシウム ２００ 硝酸第二鉄・9H2O ０．１ 塩化カリウム ４００ リン酸マグネシウム・7H2O ２００ 塩化ナトリウム ６４００ 炭酸水素ナトリウム ２０００ リン酸二水素ナトリウム・H2O １２０ グルコース ４５００ フェノールレッド １０ アガマ血清 １０００ 100HE/mlのセンダイウイルス15mlを用いて、活性化を行
なう。系を、37℃にて15〜20時間撹拌する。
なう。系を、37℃にて15〜20時間撹拌する。
培養後、200×ｇ、30分間の遠心分離により、栄養溶液
の細胞を移行させる。上澄み液を捨て、細胞部分をPBS
に懸濁させると、500mlの懸濁液が得られる。
の細胞を移行させる。上澄み液を捨て、細胞部分をPBS
に懸濁させると、500mlの懸濁液が得られる。
実施例３ 白血球の分解と分離 分解は、細胞からミエロペルオキシダーゼを得るために
行なう。
行なう。
細胞懸濁液を、−70℃で凍結させ、室温で融解させる。
これを７回続けて行なうことにより、細胞は分解し、酵
素は溶液へ移行する。20000×ｇ、60分の遠心分離によ
り、酵素を含んでいる溶液から、細胞片を分離する。
これを７回続けて行なうことにより、細胞は分解し、酵
素は溶液へ移行する。20000×ｇ、60分の遠心分離によ
り、酵素を含んでいる溶液から、細胞片を分離する。
実施例４ ミエロペルオキシダーゼの精製 限外濾過による低分子物質の分離： 「カットオフ」値100000の中空繊維が詰められ、分子量
100000ダルトン以上の分子を捕捉することができ、かつ
低分子量のものを通過させることができるAMICON DC-4
型限外濾過装置を用いて、抽出物を濾過する。
100000ダルトン以上の分子を捕捉することができ、かつ
低分子量のものを通過させることができるAMICON DC-4
型限外濾過装置を用いて、抽出物を濾過する。
活性化酵素は、分子量100000以上の画分中に入ってい
る。酵素を含んでいる画分の量を約200mlに調整する。
る。酵素を含んでいる画分の量を約200mlに調整する。
pH変化による不純物の沈殿： 0.1Mクエン酸カリウム溶液（pH＝４）200mlを、上記の2
00ml画分に加えて、pH値4.1の溶液400mlを得る。pH変化
の作用で、一部の蛋白質不純物が沈殿する。7000×ｇ、
30分間の遠心分離により沈殿物を移行させると、酵素を
含む約350mlの上澄み液が得られる。
00ml画分に加えて、pH値4.1の溶液400mlを得る。pH変化
の作用で、一部の蛋白質不純物が沈殿する。7000×ｇ、
30分間の遠心分離により沈殿物を移行させると、酵素を
含む約350mlの上澄み液が得られる。
CM-CPG充填剤によるクロマトグラフィー： (a)吸 着 350ml、pH値4.5の酵素含有画分液を、20mlのCM-CPG充填
のC16/20カラムに100ml/hの流量で押し流す。カラムの
底量から流出した溶液を、吸着効率を上げるために再循
環させる。
のC16/20カラムに100ml/hの流量で押し流す。カラムの
底量から流出した溶液を、吸着効率を上げるために再循
環させる。
吸着は、０〜４℃の範囲で一晩かけて行なう。
(b)洗浄Ｉ 0.1Mクエン酸カリウム溶液（pH＝４）60mlを用いて、充
填剤を洗う。
填剤を洗う。
カラムから流出した液には、活性酵素は認められず、そ
の液は捨てる。
の液は捨てる。
(c)洗浄II PBS溶液60mlで充填剤を洗浄し、使用後の洗浄液は捨て
る。
る。
(d)溶 離 1.5M塩化ナトリウム及び0.5Mトリスを含有する溶液（pH
＝8.2）を用いて、カラムからミエロペルオキシダーゼ
を溶離させる。
＝8.2）を用いて、カラムからミエロペルオキシダーゼ
を溶離させる。
活性化物は、約20mlの量ではっきりした単一画分になっ
ている。
ている。
ウルトラゲルAcA54充填剤によるクロマトグラフィー： CM-CPGカラムから得られた20mlの酵素含有画分液を、18
00mlのウルトラゲルAcA54充填剤を詰めたK50/100カラム
にかけ、2M NaCl/PBS溶液で展開させる。
00mlのウルトラゲルAcA54充填剤を詰めたK50/100カラム
にかけ、2M NaCl/PBS溶液で展開させる。
分子量6040〜8040の画分中に、ミエロペルオキシダーゼ
が純粋な状態で得られる。対応する画分の選択ができる
よう、標準分子量を用いて、コラムを予め補正してお
く。
が純粋な状態で得られる。対応する画分の選択ができる
よう、標準分子量を用いて、コラムを予め補正してお
く。
このようにして得られた生成物は、平均して2000Uの活
性を有している。生成物の純度を特徴づける蛋白質の活
性度は70〜100U/mgであり、50U/mlの濃度である。
性を有している。生成物の純度を特徴づける蛋白質の活
性度は70〜100U/mgであり、50U/mlの濃度である。
ミエロペルオキシダーゼの量の決定： 酵素の量は、通常、活性量に基づく酵素のユニットで表
わす。
わす。
pH6.00の媒体中、25℃で１分間に１μＭ過酸化水素を分
解する酵素の量が、１ユニットを意味する。
解する酵素の量が、１ユニットを意味する。
過酸化水素の分解量は、分光測光法にかけて調べること
ができる。この方法に関しては、ジー・アラン（Ｇ．Al
lan）らが、〔Ｊ．Cardiovasc．Pharm．7,1154〜1160ペ
ージ（1985年）〕に詳述している。
ができる。この方法に関しては、ジー・アラン（Ｇ．Al
lan）らが、〔Ｊ．Cardiovasc．Pharm．7,1154〜1160ペ
ージ（1985年）〕に詳述している。
実施例５ 活性化剤として、センダイウイルスの代わりに15μg/ml
のコンカナバリンＡを用いたこと以外、実施例２に記載
の要領に従って処理する。
のコンカナバリンＡを用いたこと以外、実施例２に記載
の要領に従って処理する。
実施例６ 活性化剤として、センダイウイルスの代わりに10μg/ml
の植物凝集素を用いたこと以外、実施例２に記載の要領
で行なう。
の植物凝集素を用いたこと以外、実施例２に記載の要領
で行なう。
実施例７ 活性化剤として、センダイウイルスの代わりに30μg/ml
のレンズマメレクチンを用いたこと以外、実施例２に記
載の容量で行なう。
のレンズマメレクチンを用いたこと以外、実施例２に記
載の容量で行なう。
実施例８ 活性化剤としてCa2+イオノフォアを用いたこと以外、実
施例２に記載の容量で行なう。
施例２に記載の容量で行なう。
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト白血球を精製し、かつ活性化させ、得
られた細胞生成物の分解及び抽出を行なってから、精製
することにより、ミエロペルオキシダーゼを調製する方
法において、 インターフェロンまたはインターロイキンをつくるため
に使用された軟膜を、出発材料として用いる段階と、 センダイウイルス、コンカナバリンＡ、植物凝集素、レ
ンズマメレクチン、またはCa2+イオノフォアを、活性化
剤として用いる段階と、 カルボキシメチル調整細孔ガラス充填によるクロマトグ
ラフ法を適用する段階とからなることを特徴とするミエ
ロペルオキシダーゼの調製方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU105188A HU204081B (en) | 1988-03-04 | 1988-03-04 | Process for producing myeloperoxidase enzyme |
| HU2251-1051/88 | 1988-03-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01269491A JPH01269491A (ja) | 1989-10-26 |
| JPH0663B2 true JPH0663B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=10952641
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5021189A Expired - Lifetime JPH0663B2 (ja) | 1988-03-04 | 1989-03-03 | ミエロペルオキシダーゼの調整方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0663B2 (ja) |
| AT (1) | AT391480B (ja) |
| DE (1) | DE3907162A1 (ja) |
| HU (1) | HU204081B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120132529A (ko) | 2010-04-14 | 2012-12-05 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 면역글로불린 응집물 제거 |
-
1988
- 1988-03-04 HU HU105188A patent/HU204081B/hu not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-03-03 JP JP5021189A patent/JPH0663B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-03 AT AT48089A patent/AT391480B/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-06 DE DE19893907162 patent/DE3907162A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3907162A1 (de) | 1989-09-14 |
| HUT50210A (en) | 1989-12-28 |
| JPH01269491A (ja) | 1989-10-26 |
| ATA48089A (de) | 1990-04-15 |
| HU204081B (en) | 1991-11-28 |
| DE3907162C2 (ja) | 1992-05-21 |
| AT391480B (de) | 1990-10-10 |
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