JPH0669398B2 - 過酸化水素又は過酸化水素形成系又はペルオキシダーゼ又は過酸化性作用物質の検出法及び検出剤 - Google Patents

過酸化水素又は過酸化水素形成系又はペルオキシダーゼ又は過酸化性作用物質の検出法及び検出剤

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JPH0669398B2
JPH0669398B2 JP3213337A JP21333791A JPH0669398B2 JP H0669398 B2 JPH0669398 B2 JP H0669398B2 JP 3213337 A JP3213337 A JP 3213337A JP 21333791 A JP21333791 A JP 21333791A JP H0669398 B2 JPH0669398 B2 JP H0669398B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、色原体の酸化性カップ
リングによりレドックス−系を検出する薬剤及び検出法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】分析化学にとっても医学診断にとって
も、適当な色原体物質を用い、ペルオキシダーゼ又は過
酸化性作用物質の触媒作用下に過酸化水素を検出するこ
とは非常に重要である。このことは特に、基質と相応す
る基質オキシダーゼ及び酸素との反応の中間体として過
酸化水素を形成し引続き適当な色原体物質の存在で、有
利に触媒としてのペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下
に、光学的に確認可能で、生じた過酸化水素に対して定
量的関係にある化合物に変じる多くの検出法にあてはま
る。更に、ペルオキシダーゼは、免疫テストにおいて屡
々酵素−マーカーとして使用され、過酸化水素及び前記
色原体物質の添加により検出される。
【０００３】例としては、次の化合物が挙げられ、ここ
で括弧内に存在する相応するオキシダーゼは過酸化水素
形成系である：グルコース（グルコースオキシダー
ゼ）、ガラクトース（ガラクトースオキシダーゼ）、Ｌ
−アミノ酸（Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ）、コレステリ
ン（コレステリンオキシダーゼ）、尿酸（ウリカー
ゼ）、サルコシン（サルコシンオキシダーゼ）、グリセ
リン（グリセリンオキシダーゼ）、グリセリンホスフェ
ート（グリセリンホスフェートオキシダーゼ）、ピルベ
ート（ピルベートオキシダーゼ）。
【０００４】過酸化水素／ペルオキシダーゼの検出のた
めに、既に多くの色原体もしくは指示薬系が挙げられて
おり、使用されている。最も公知なものの１つは、トリ
ンダー（Ｔｒｉｎｄｅｒ）によりアン・クリニ・ビオケ
ム（Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）６巻（１９
６９年）２４〜２７頁に記載されているものであり、こ
れでは、フェノールがＰＯＤの存在でＨ2Ｏ2酸化性の作
用下に４−アミノアンチピリンとカップリングして色素
になる。この際カップリング成分としてのフェノールの
代りにフェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトー
ル、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミ
ン誘導体又は類似の反応性物質が使用できる。カップリ
ング成分としての４−アミノアンチピリンは、例えばア
ミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン
酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴ
Ｈ）、スルホン化されたメチルベンズチアゾリノンヒド
ラゾン（ＳＭＢＴＨ）で置換されていてよい。
【０００５】更に、例えば酵素反応時に遊離する芳香族
アミンを測定するために、酸化性カップリングが使用さ
れる。γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−Ｇ
Ｔ）及びロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）の検出
並びにトロンビンの検出は、診断の目的にとって特に重
要である。この場合に、アミノ酸配列がそれぞれの酵素
に一致し、そのアミド部分は芳香アミン殊にフェニレン
ジアミン又はアミノフェノール又はその誘導体であるペ
プチドアミド（これは前記反応のカップリング成分とし
て使用できる）を、まず酵素で分解し、次いで、カップ
リング成分としてのフェノール又はアニリンを用い、酸
化剤により酸化して色素にする（西ドイツ特許公開ＤＥ
−Ａ３３３１５８８号及び欧州特許公開ＥＰ−Ａ７６０
４２号明細書参照）。
【０００６】この検出反応は、キュベット中でも乾燥試
薬担持材上でも実施できる。この際その定量は光度計
で、透過率測定、反射光度計で、反射測定又は比色を用
いて眼により比較することにより行なう。
【０００７】文献中には、４−アミノアンチピリンもし
くは置換されたベンゾチアゾリノンヒドラゾンの縮合に
よる、過酸化水素に関する敏感な検出系を製造すること
のできる多くのアニリン誘導体が記載されている（西ド
イツ特許ＤＥ−Ｃ−２８３３６１２号、欧州特許ＥＰ−
Ａ−７７８７号、西ドイツ特許ＤＥ−Ａ−３０３７３４
２号）。こうして形成されたカップリング生成物は、高
いモル吸光係数を有し、これは、相応する過酸化水素形
成化合物の検出のために好適であることを示している。
このカップリング生成物の血清成分に対する高い障害性
が欠点として挙げられ、３０％より高い純粋な水溶液に
比べた吸光度差は、部分的に、化合物又はカップリング
生成物の不充分な安定性を示している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、殊に過酸化水素もしくは過酸化性作用物質及び血清
中に含まれる障害物質と反応しない芳香族のカップリン
グしうるアミンの検出のために、弱酸性〜弱アルカリ性
領域で安定であり、従ってキュベットテストでも、乾燥
試薬担持材を得るために使用可能なマトリックス中でも
使用することのできる色形成剤としてのフェノール−又
はアニリン誘導体を見つけることであった。
【０００９】
【課題を解決する手段】ところで、意外にも、次のＩ式
のアニリン誘導体中に、前記要求をみたす化合物が見つ
けられた。
【００１０】本発明の目的は、一般式Ｉ：
【００１１】
【化５】
【００１２】［式中Ｒ1は水素、低級アルキル及びアリ
ールであってよく、Ｒ2は水素、低級アルキル基であ
り、これはヒドロキシ−、アミノ−、カルボキシ−、低
級アルコキシカルボニル−、低級アルカノイルアミド
基、アリール低級アルキル及びアリール及び構造：
【００１３】
【化６】
【００１４】（Ｒ5は水素又は低級アルキル基であって
よく、Ｒ6はヒドロキシ−、低級アルコキシ、低級アル
キル又はアリール基である）の基で置換されていてよ
く、Ｒ3は水素、カルボキシ又はハロゲンであってよ
く、Ｒ4及びＲ4´は水素、ハロゲン、カルボキシ、低級
アルコキシ又は有利にｍ−位に存在する低級アルキル基
であり、Ｒ1とＲ2もしくはＲ2とＲ4もしくはＲ4とＲ4´
は双方の基が相互にオルト位に存在する場合に、一緒に
なってＣ−原子数２〜６の飽和又は不飽和の炭化水素基
を形成してよく、これらは、ヒドロキシ又はオキソ基で
置換されていてよい］のアニリン誘導体又は酸又は塩基
とのその塩をトリンダー反応の色形成剤として使用する
こと、並びにこれを含有する薬剤である。
【００１５】明細書に使用されている「低級アルキル」
とは、Ｃ−原子数１〜６有利に１〜３の直鎖又は分子鎖
のアルキル基である。その例は、メチル−、エチル−、
イソプロピル−、イソブチル−又はｔ−ブチル基であ
る。
【００１６】用語「アリール」とは、有利に、付加的に
低級アルキル又はアルコキシ又はハロゲンにより置換さ
れていてよいフェニル基及び部分水素化されていてよい
ナフチル基である。ハロゲンには、弗素、塩素、臭素及
び沃素が包含され、この際弗素及び塩素が有利である。
【００１７】Ｒ1とＲ4もしくはＲ2とＲ4もしくはＲ4と
Ｒ4´は一緒になって飽和又は不飽和の炭化水素を形成
してよい。このような基は、Ｃ−原子２〜６有利に２〜
４を包含してよい。その例は、−（ＣＨ2）2−、−（Ｃ
Ｈ2）3−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−で
ある。ヒドロキシ又はオキソ基で置換された飽和又は不
飽和の炭化水素鎖の例は、−ＣＨ（ＯＨ）−（ＣＨ2）2
−、ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＣＨ＝ＣＨ＝Ｃ＝Ｏである。
【００１８】低級アルカノイル基はＣ−原子数１〜６の
脂肪族カルボン酸例えば、ホルミル、アセチル、プロピ
オニル、ピバロイル、イソブチリルである。低級アルコ
キシ基は、Ｃ−原子数１〜６有利に１〜４を有する基例
えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキ
シ、ｔ−ブトキシである。
【００１９】特にＲ3が低級アルキルでＲ6が低級アルコ
キシである一般式Ｉの化合物は、部分的に文献に記載さ
れている［例えばズルナール・オブシュケイ・キミイイ
（Ｚｎ．Ｏｂｓｈｃｈ．Ｋｈｉｍ．）４７、２７４１
（１９７７）、イズベスチャ・アカデミィ・ナウク・Ｓ
ＳＳＲ、セリヤ・ケミスカヤ（Ｉｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａ
ｕｋ．ＳＳＳＲ，Ｓｅｒ．Ｋｈｉｍ．）４２４（１９６
７）、同１７８（１９８２）、米国特許ＵＳ−Ａ３８１
６４２８号、ツアイトシュリフト・ナトウアフォルシュ
ング（Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．）３６ｃ、２４２
（１９８１）ケミカル・アブストラクツ（Ｃ．Ａ．）９
９：２２９１４Ｋ．ケミカル・アブストラクツ９１：１
５７８１２ｔ、ビュレチン・ソシエテ・シミク・フラン
ス・Ｐｔ（Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｃｈｉｍ．Ｆｒ．ｐ
ｔ．）２３４３（１９７９）、テトラヘドロン（Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ）３７、２２９７（１９８１）、ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ
（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）７４、１５２８
（１９５２）、チェコスロバキア発明者証ＣＳ−Ａ−１
９０２４０参照］。ここに記載の化合物は、例えば植物
成長調節剤、流動化助剤、ケレート形成剤及び腐蝕防止
剤として使用することができる。Ｈ2Ｏ2もしくはペルオ
キシダーゼ又は過酸化性作用物質の呈色反応検出のため
の酸化性カップリング反応における成分として使用する
ことは従来記載されていなかった。
【００２０】本発明で使用される化合物のうち、式
Ｉ′：
【００２１】
【化７】
【００２２】［式中Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ4′は前
記のものを表わし、Ｒ6′はヒドロキシ、低級アルコキ
シ、低級アルキル又はアリール基である、但し、Ｒ6′
がヒドロキシ基、Ｃ−原子数１〜６のアルキル基又はフ
ェニル基である場合には、Ｒ3、Ｒ4及びＲ4′が同時に
水素を表わすことはなく、Ｒ2は水素であり得ないかも
しくはＲ6′がヒドロキシ基である場合に、Ｒ1はハロゲ
ンで置換されているフェニルではあり得ない］のアニリ
ン誘導体は新規化合物である。
【００２３】Ｉ式及びＩ′式の前記化合物は安定な物質
であり、これらはそれ自体良好な水溶性であるか又は慣
用の酸（鉱酸、例えば塩酸、硫酸、燐酸、等又は有機酸
例えば酢酸、クエン酸、蓚酸等）又は塩基（苛性ソー
ダ、苛性カリ、アンモニア、アミン、炭酸アルカリ等）
との反応により、易溶性塩に変じることができる。
【００２４】一般式Ｉの化合物の合成は、公知方法で行
なうことができる。＞Ｎ−Ｃ−Ｐ−系の形成のための可
能な反応の一般的概要は、トピックス・イン・ホスホラ
ウス・ケミストリィ（Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｏｕｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）８巻、５１５ｆ
（１９７６）に存在する。次にＩ式の化合物の合成に特
に使用できる個々の例を挙げる： 1. ジャーナル・オブ・ゼ・アメリカン・ケミカル・ソ
サエティ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）７４、
１５２８（１９５２）に記載のように１級又は２級アミ
ンとアルデヒド及び亜燐酸ジアルキル又は亜ホスホン酸
ジアルキルエステルと反応させて、Ｉ式の化合物にす
る：
【００２５】
【化８】
【００２６】出発物質１級アミン及びアルデヒドの代り
にこれから製造しうるシッフの塩基を使用することもで
きる。
【００２７】2. ＩＩ式の構造（Ｒ7＝低級アルキル）
のＮ，Ｏ−アセタールをＨ+−触媒の存在下に亜燐酸ト
リアルキル（ＩＩＩ：Ｒ6＝低級アルコキシ）と反応さ
せて、Ｉ式の構造（Ｒ2＝Ｈ）を有するホスホン酸エス
テルを形成させる（イズベスチャ・アカデミィ・ナウク
・ＳＳＳＲ．セリヤ・キミケスカヤ４２４（１９６７）
参照）：
【００２８】
【化９】
【００２９】この反応は、亜ホスホン酸ジアルキルエス
テル（ＩＩＩ：Ｒ6＝低級アルキル又はアリール）を用
いても実施できる。
【００３０】同様な方法で、環状Ｎ，Ｏ−アセタール例
えばＮ−アリールオキサゾリジン（ＩＶ）と亜燐酸トリ
アルキルもしくは亜ホスホン酸ジアルキルエステルと反
応させることもできる。この際、特にオキサゾリジンか
ら出発し、分子内エステル交換のもとに、ホスホン酸も
しくはホスフィン酸の環状エステルが生じる。
【００３１】
【化１０】
【００３２】出発物質として必要なＮ，Ｏ−アセタール
は、文献記載（ジャーナル・アメリカン・ケミカル・ソ
サエティ５４、４１７６（１９３２））と類似法で、２
級アニリンとホルムアルデヒド及びアルコールとの反応
により得ることができる。出発物質としてＮ，Ｎ−ジメ
チルアニリンを使用することができる場合は、ホルムア
ルデヒドの相応するＮ，Ｏ−アセタール［ジャーナル・
オブ・オルガニック・ケミストリィ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈ
ｅｍ．３１、４０５８（１９６６）に記載］をメタノー
ル性ＫＯＨ中での陽極酸化により製造することができ
る。相応する長い電気分解時間で、次の構造：：
【００３３】
【化１１】
【００３４】のビス−Ｎ，Ｏ−アセタールも入手でき、
これは、亜燐酸トリアルキルもしくは亜ホスホン酸ジア
ルキルエステル２モルと反応して相応するイミノジメタ
ンホスホン酸に変えることができる。
【００３５】環状Ｎ，Ｏ−アセタールは閉鎖状化合物と
同様に製造できる。例えば、Ｎ−アリールオキサゾリジ
ンは、Ｎ−ヒドロキシエチルアニリンとアルデヒド例え
ばホルムアルデヒドとの反応により製造できる。
【００３６】3. アニリンを構造Ｖ（ここでＸはＢｒ、
Ｉ、トシロキシ、ベンゾールスルホニルオキシ、メタン
スルホニルであってよい）のホスホン酸エステルを用い
てアルキル化することも文献に公知である［ジャーナル
・ド・レヒエルヒエ（Ｊ．Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ）Ｃ．
Ｎ．Ｒ．Ｓ．１１９（１９５６）、ズルナール・オブシ
ュケイ・キミイ（Ｚｈ．Ｏｂｓｈｃｈ．Ｋｈｉｍ．）４
７、２７４１（１９７７）参照］：
【００３７】
【化１２】
【００３８】4. 一般式Ｉのアミノアルキルホスホン酸
エステル（Ｒ5＝低級アルキル、Ｒ6＝低級アルコキシ、
有利にＲ1＝Ｈ）は、強塩基例えばｎ−ブチルリチウム
を用いてα−Ｃ−原子の所で金属化し、アルキル化剤例
えば沃化メチルでアルキル化することができる［シンセ
シス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）３３６、(１９７７)］：
【００３９】
【化１３】
【００４０】Ｉ式の化合物（Ｒ5＝低級アルキル、Ｒ6＝
低級アルキル及び低級アルコキシ）は、沸騰加熱時の濃
鉱酸例えばＨＣｌの作用により又はトリメチルシリルハ
ロゲニド特にトリメチルシリルブロミド又は−ヨージド
との反応でかつ引続く水での処理により鹸化することが
できる。ナトリウムアルコレート又はアルカリ金属塩例
えば沃化ナトリウムでの処理によりＩ式の化合物（Ｒ5
＝低級アルキル、Ｒ6＝低級アルコキシ）から公知方法
で相応するホスホン酸半エステルを製造することができ
る。
【００４１】Ｉ式の化合物は、遊離塩基の形で又は強酸
例えばＨＣｌ、ＨＦ、ＨＢｒとの塩として単離すること
ができる。Ｒ5＝Ｈに関して、Ｉ式の化合物は、分子内
塩、アルカリ金属塩又はアンモニウム−もしくはアミン
塩としても包含される。
【００４２】本発明は特許請求の範囲に詳述されてい
る。
【００４３】本発明のアニリン誘導体は、通例、酸性基
も塩基性基も含有するので、分子内塩として存在する。
【００４４】アミン窒素に対して３位にアルキル基殊に
メチル基を有する化合物は、高い吸光度を有するので有
利である。
【００４５】Ｈ2Ｏ2／ＰＯＤの検出用の酸化可能なカッ
プリング成分としては、４−アミノアンチピリン（４−
ＡＡＰ）、２−ヒドラゾノ−２，３−ジヒドロ−３−メ
チルベンズチアゾロン（ＭＢＴＨ）殊に２−ヒドラゾノ
−２，３−ジヒドロ−３−メチルベンズチアゾロン−ス
ルホン酸−６（ＳＭＢＴＨ）が有利であるが、他の、酸
化性カップリング可能性に関して公知の物質も同様に使
用できる。
【００４６】芳香族アミン即ち、殊にｐ−フェニレンジ
アミン−又はｐ−アミノフェノール誘導体の検出のため
に、Ｉ式のアニリン誘導体は、障害が起こらず、酸化性
カップリングの際に良好な安定性及び高い吸光度の色素
を生じるので、同様に極めて好適である。酵素検出に好
適な基質はＶＩＩ式に相当する：
【００４７】
【化１４】
【００４８】［式中Ｒ1″〜Ｒ4″は水素、ハロゲン、Ｃ
−原子数１〜６のアルキル、Ｃ−原子数１〜６のアルコ
キシ、カルボキシ−又はスルホニル基であるか又は
Ｒ1″とＲ2″又はＲ3″とＲ4″は１個のアルキル−又は
アルキレン橋を形成していてもよく、Ｘはヒドロキシ基
又はアミノ基を表わし、これは１個又は２個のアルキル
で置換されていてよくＹは場合により保護されたアミノ
酸又はペプチド基を表わす］。
【００４９】ロイシルアミノペプチダーゼの検出のため
にＹはＬ−ロイシルであり、γ−ＧＴの検出のためにγ
−Ｌ−グルタミルであり、トロンビンの検出のためには
例えばトシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−である。
【００５０】酸化剤としてはＨ2Ｏ2／ＰＯＤ以外にペル
オキシド例えば過硫酸塩又は過酢酸塩並びに過沃素酸
塩、クロラミンＴ及び殊にシアノフェリー錯体例えばＫ
3Ｆｅ（ＣＮ）6もこれに該当する。西ドイツ特許ＤＥ−
Ａ３３３１５８８号明細書によればオキシダーゼも使用
できる。
【００５１】前記のように、本発明による系は、過酸化
水素もしくは過酸化水素生成系並びにペルオキシダーゼ
又は過酸化性作用化合物の検出のために使用される。過
酸化水素形成系とは、殊に、臨床診断に重要な基質／基
質オキシダーゼ対であり、ここで基質は空気酸素の存在
で酸化され、Ｈ2Ｏ2が形成される。従って、試薬にいか
なる成分を添加するかに応じて、基質又は基質オキシダ
ーゼが検出できる。更に、本発明の物質は、カップリン
グ可能な芳香族アミンの検出のために使用でき、この際
前者は酸化剤の存在で後者と接触される。例としては、
先に記載の系が参照される。
【００５２】試薬組成物を用いて、キュベット中で測定
されるテストが製造できる。このために、Ｉ式の本発明
の物質１種をそれぞれのパラメーター検出に必要な酵素
又は他の試薬、緩衝剤並びに場合によっては湿潤剤、活
性剤及び他の助剤と混合して粉末とするか又は圧縮して
錠剤とするか又は水中に溶かし、再び乾燥させるか又は
凍結乾燥させる。こうして得た試薬混合物を使用前に水
中又は他の好適な溶剤中に溶かして試薬溶液を調製す
る。試料（基質溶液、酵素溶液、血清又は血漿）と部分
量の試薬混合物との混合の後に、生じる色を光度計で測
定し、モル吸光係数及び添加された試薬もしくは試料量
から、それぞれの濃度もしくは基質濃度を算出する。こ
れは速度論的にも最終点測定でも可能である。
【００５３】同様にＩ式の物質は、酸化可能なカップリ
ング成分と組合せて、ペルオキシダーゼ、その都度のパ
ラメータ検出に必要な試薬もしくは他の酵素、緩衝系、
場合によっては湿潤剤及び活性剤並びに他の助剤と共に
吸収性試薬担持材例えば紙、フリース等上に含浸するこ
とができる。このために、試薬又は助剤を溶かす水又は
有機もしくは混合溶液の形の１種以上の含浸溶液を製造
することができる。この溶液を、吸収性又は膨潤性担持
材有利に濾紙又は吸収性ガラス−又はプラスチックフリ
ースに含浸させるか又はスプレーする。引続き、乾燥さ
せる。このように製造した試薬担持材は、迅速診断材と
して、液体（例えば体液例えば血液、尿又は唾液又は食
料品例えば果実液、牛乳等）の内容物の直接測定のため
に使用できる。この際、液体を直接試薬担持材上に施与
するか又はこれを短時間液体中に浸漬する。半定量的測
定も可能であり、この際、こうして得た色を比色する。
定量評価は、反射光度法で実施することができる。吸収
性担持材からの水もしくは緩衝液又は血清を用いる前記
試薬の溶離により、試薬溶液を製造することができ、こ
れを用いて、キュベット中の前記の基質又は酵素を光度
計で測定することができる。拡散反射光度法評価による
定量的測定は、指示薬を残りの必要試薬及び助剤及び膜
形成性プラスチックと共に西ドイツ特許ＤＥ−Ｃ−１５
９８１５３号明細書の記載のように加工して試薬フイル
ムにする際に、特に良好に実施することができる。この
種のフイルムの平らな表面は、慣用の紙よりも少ない反
射障害及びより均質な呈色を示す。
【００５４】本発明における緩衝液は、ｐＨ６〜１０殊
に６．５〜７．５を有する。アルカリ−又はアンモニウ
ム逆イオンを有する燐酸塩−クエン酸塩−、ホウ酸塩、
ＧＯＯＤ−緩衝液が最も頻繁に使用されるが、他の系も
同様に使用可能である。
【００５５】湿潤剤は、殊に、本発明の化合物の双性イ
オンとイオン交換作用をするアニオン性及びカチオン性
湿潤剤である。しかしながら、酵素を活性化する非イオ
ン性湿潤剤も同様に使用可能である。ラウリル硫酸ナト
リウム、ジオクチルナトリウムスルホサクシネート及び
アルキルアリールポリエーテルアルコールが有利であ
る。
【００５６】活性剤としては、それぞれの基質反応にと
って公知のものを使用する。トリンダー反応そのもの
は、付加的活性化を必要としない程度に迅速である。
【００５７】その他の助剤としては、他の色原体を用い
る相応するテスト中におけると同様に、慣用の濃稠化
剤、乳化剤、光学的明化剤、コントラスト剤等が有意義
である。
【００５８】カップリング反応は、通例、室温で行なう
が直ちに、例えば先の酵素反応の反応速度にとって有利
である場合には、より高い温度、例えば３７℃で実施す
ることができる。
【００５９】基質もしくは酵素との通例提案される反応
にとってはテスト溶液の次の濃度が有効である： アニリン誘導体 ０．０５〜１００ｍモル／ｌ 有利に０．１ 〜１ ｍモル／ｌ カップリング成分 ０．０５〜５０ ｍモル／ｌ 有利に０．１ 〜１ ｍモル／ｌ 緩衝液（ｐＨ６〜１０） ０．０５〜１ モル／ｌ 有利にｐＨ６．５〜８ 有利に０．１ 〜０．５ モル／ｌ 湿潤剤 ０ 〜１．０ モル／ｌ 有利に０．０５〜０．１ モル／ｌ ａ）ペルオキシダーゼ １．０ 〜５０００ＫＵ／ｌ ｂ）Ｈ2Ｏ2もしくはＨ2Ｏ2形成性基質／酵素混合物 ０．１ 〜１０ ｍモル／ｌ その他の助剤 ０ 〜５ モル／ｌ 前記濃度範囲は、下部範囲は、キュベット中での光度法
によるテストに対して、かつ上部範囲は固体担持材上の
迅速テストに対して有利であると理解すべきである。
【００６０】アミダーゼ作用酵素の検出のためには、カ
ップリング成分の前記規定を相応する量のペプチドアミ
ド基質に代え、場合によっては、Ｈ2Ｏ2の代りに、相応
する量の他の酸化剤を添加する。
【００６１】次の例で本発明を説明するが、本発明はこ
れらのみに限定されるものではない。
【００６２】
【実施例】
例１（参考例） 1. 1 Ｎ−メチルアニリン２１．４ｇおよび亜リン酸ジエチル
２７．６ｇから成る混合物に、９０℃で撹拌しながらベ
ンズアルデヒド２１．６ｇを加える。反応混合物を１時
間９０℃に保ち、最後に真空中で蒸発乾涸させる。
【００６３】粗生成物をシリカゲル１．５ｌ上、リグロ
イン／アセトン（３：１）を用いてクロマトグラフィー
にかける。生成物含有フラクションを濃縮および蒸発さ
せる。油状α−（Ｎ−メチルアニリノ）−ベンジル−ホ
スホン酸ジエチルエステル２５ｇ（３８％）が得られ
る。
【００６４】1. 2 α−（Ｎ−メチルアニリノ）−ベンジルホスホン酸ジエ
チルエステル３．３ｇを無水塩化メチレン６０ｍｌ中に
溶かし、トリメチルシリルブロミド７．９２ｍｌを滴加
する。混合物を一晩中放置し、次いで蒸発乾涸させ、残
分をエーテルと撹拌し、その後粗生成物１．８５ｇを吸
引濾過する。これを水および少量のＨＣｌ中に溶かす。
水溶液をエーテルで抽出し、活性炭処理し、蒸発乾涸さ
せる。残分をエーテルと擦する。沈殿を吸引濾過および
乾燥させる。α−（Ｎ−メチルアニリノ）−ベンジルホ
スホン酸・臭化水素酸塩１．１ｇ（３１％）が得られ
る。融点１４２〜１４６℃。
【００６５】例２（参考例） 2. 1 Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン７１．６ｇを２％水酸化カリ
ウムメタノール溶液８００ｍｌ中に溶かし、ビーカー中
で２５時間１．５Ａで電解する。陽極は白金ネット（約
５０ｃｍ2）から成り、陰極は特殊鋼ネットから成る。
反応溶液を蒸発乾涸させ、残分をエーテル中に入れる。
不溶残分を濾去し、エーテル相を蒸発濃縮させる。残留
する油状物を真空中で蒸留する。ビグロー塔での２回蒸
留の後に沸点８８．５〜８９℃のＮ−メトキシメチル−
Ｎ−メチルアニリン２４．３ｇ（２７％）が７ｍｍＨｇ
で得られる。
【００６６】2. 2 撹拌機、蒸留ブリッジを有する滴下ロートを有する三頚
フラスコ中で、Ｎ−メトキシメチル−Ｎ−メチルアニリ
ン５ｍｌおよび亜リン酸トリメチル４．６ｍｌを、撹拌
しながら１３５℃（浴温）に加熱する。１時間かかっ
て、酢酸１．４ｍｌを少量宛滴加し、混合物をさらに１
時間撹拌し、反応混合物を高度真空中で蒸留する。沸点
１２６〜１２８℃（０．１ｍｍＨｇ）の油状（Ｎ−メチ
ルアニリノ）−メタンホスホン酸ジメチルエステル４．
４ｇ（５８％）が得られる。
【００６７】2. 3 （Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸ジメチルエ
ステル４．２ｇを濃ＨＣｌ １５ｍｌと共に４時間還流
下に沸騰させる。蒸発乾涸させ、残分を熱いエタノール
１０ｍｌ中に溶かし、いくらか冷却された混合物にエー
テルを加える。沈殿した結晶を吸引濾過し、乾燥させ
る。（Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸−塩酸
塩３．０８ｇ（７８％）が得られる。融点１６６〜１６
８℃（分解）。
【００６８】例３（参考例） 例２と同様に第１表に挙げられたアニリノホスホン酸を
製造する。第２表は出発生成物として合成されたＮ−メ
トキシメチル−Ｎ−メチルアニリンおよび第３表はそれ
から製造されるアニリノホスホン酸エステルを包含す
る。
【００６９】
【表１】
【００７０】
【表２】
【００７１】
【表３】
【００７２】例４（参考例） 4. 1 Ｎ−エチルアニリン６０．５ｇおよびパラホルムアルデ
ヒド１５ｇを、ベンゾール１００ｍｌおよびエタノール
５０ｍｌ中に溶かし、水滴分離器を付して４時間沸騰さ
せる。その後溶液を蒸発濃縮させ、残渣を分別蒸留す
る。主フラクションとしてＮ−エチル−Ｎ−エトキシメ
チルアニリン４９．８ｇ（５６％）が得られる。沸点７
７〜８０゜（０．１ｍｍＨｇ）。
【００７３】4. 2 例2. 2 と同様に、Ｎ−エチル−Ｎ−エトキシメチルア
ニリンを亜燐酸トリメチルと反応させる。主に存在する
ジメチルホスホン酸エステルと共に、エステル交換によ
りなお少量のジエチル−ないしエチルメチルエステルを
含有する、エステル混合物が得られる。沸点１３９．５
〜１４１．５゜（０．２ｍｍＨｇ）。
【００７４】例2. 3 と同様に、濃ＨＣｌを用いる鹸化
により、融点１０５〜１１０゜（分解）の（Ｎ−エチル
−アニリノ）−メタンホスホン酸−塩酸塩が得られる。
【００７５】例５（参考例） 例４と同様に、第４表に挙げられたホスホン酸（Ｒ＝Ｐ
Ｏ（ＯＨ）2）が得られる。更に、第４表には中間生成
物として製造されたアルコキシメチルアミン（Ｒ＝−Ｃ
Ｈ2−Ｏ−アルキル）およびそれから製造されるホスホ
ン酸ジアルキルエステル（Ｒ＝ＰＯ（Ｏ−アルキ
ル）2）を包含する。個々のホスホン酸エステル（第４
表４注参照）を例1. 2 と同様にトリメチルシリルブロ
ミドを用いて分解した。化合物３〜８の製造の際に、亜
リン酸トリエチルを使用した。
【００７６】
【表４】
【００７７】
【表５】
【００７８】ａ）シリカゲルでのクロマトグラフィーに
より精製 展開剤：酢酸エチルエステル、２−１０％エタノール ｂ）この燐酸は相当するジアルキルエステルから、トリ
メチルブロムシランを用いるエステルの分解により得ら
れる（例1. 2 と同様に）。
【００７９】ｃ）この燐酸は、強酸性イオン交換体ドウ
エックス（ＤＯＷＥＸ）５０Ｈ+−形を用い溶離剤とし
て水を用いるクロマトグラフィーにより精製。
【００８０】例６（参考例） 例２と同様に、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−ナフチルアミン
から、亜リン酸トリメチルとの反応により、油状Ｎ−メ
チル−１−ナフチルアミノ−メタンホスホン酸ジメチル
エステルを形成するＮ−メトキシメチル化合物が得ら
れ、該エステルをシリカゲルでのクロマトグラフィーに
よりリグロイン／アセトン（３：１〜３：２）を用いて
精製する。濃ＨＣｌと共に沸騰することによるこのエス
テルの鹸化により、Ｎ−メチル−１−ナフチルアミノメ
タンホスホン酸−塩酸塩が得られる。融点７８〜８０゜
（分解）。
【００８１】例７（参考例） 7. 1 ３−フェニルオキサゾリジン１８ｇを例2. 2 と同様
に、氷酢酸の存在で亜リン酸トリメチルと反応させる。
粗生成物をシリカゲルでのクロマトグラフィーによりリ
グロイン／エタノール（８０：２０〜７０：３０）を用
いて精製する。次の構造を有する、油状生成物１５ｇが
得られる。
【００８２】
【化１５】
【００８３】7. 2 前記のようにして得られた化合物２．３ｇを無水塩化メ
チレン６０ｍｌ中に溶かし、撹拌しながらトリメチルシ
リルブロミド７．９ｍｌを加える。一晩中放置した後、
反応混合物に濃ＮＨ3 ６０ｍｌを加える。１時間後撹拌
し、蒸発乾涸させる。残分を濃ＨＣｌの添加下にエタノ
ール中に溶かす。溶液にプロピレンオキシドを加え、生
じた沈殿を吸引濾過する。（Ｎ−（２−アミノエチル）
−アニリノ）−メタンホスホン酸０．８５ｇ（４０％）
が得られる。融点２８０〜２８５゜（分解）。
【００８４】例８（参考例） Ｎ−メチル−アニリノ−メタン−ホスホン酸ジメチルエ
ステル（例2. 2 から)１８．３ｇを無水エーテル１００
ｍｌ中に溶かし、−７０゜に冷却する。窒素下にｎ−ブ
チルリチウム溶液（ヘキサン中１５％）５４ｍｌを滴加
する。反応混合物を−７０℃で２時間撹拌し、エーテル
２０ｍｌ中のヨウ化メチル４．９ｍｌの溶液を加え、−
７０℃でさらに２時間撹拌し、室温で一晩中放置し、水
２０ｍｌと振とうする。有機相を分離し、乾燥させかつ
蒸発濃縮させる。残留する油状物を酢酸エチルエステル
／エタノール（９８：２）を用いて、シリカゲルでのク
ロマトグラフィーにかける。油状１−（Ｎ−メチルアニ
リノ）−エタン−ホスホン酸ジメチルエステル２．１５
ｇが得られる。このエステルを例1. 2 と同様に、トリ
メチルブロムシランを用いて分解する。粗生成物を溶離
剤としてのｎ−プロパノール／水／ＮＨ3（６：３：
１）を用いて、シリカゲルでのクロマトグラフィーにか
ける。生成物含有フラクションを集め、ＮＨ4 +−イオン
の除去のために、酸性イオン交換体ドウエックス（ＤＯ
ＷＥＸ）５０Ｈ+−形上に与える。水を用いる溶離で、
蒸発後ガラス状生成物０．５ｇを生じ、これを精製する
ためにアセトン／エーテルから再結晶させる。結局融点
１０３〜１０６゜（分解）の１−（Ｎ−メチルアニリ
ノ）−エタンホスホン酸０．２７ｇが得られる。
【００８５】例９（参考例） 例7. 1 で得られた化合物３．５ｇを、濃ＨＣｌ ２５
ｍｌと共に、還流下に５時間沸騰する。反応混合物を蒸
発させ、展開剤としてｎ−プロパノール／Ｈ2Ｏ／濃Ｎ
Ｈ3（６：３：１）を用いてシリカゲルでのクロマトグ
ラフィーにかける。生成物含有フラクションを集め、蒸
発させ、残分をＮＨ4 +−イオンの除去のため、水を用い
てドウエックス（ＤＯＷＥＸ）５０Ｈ+−形上のクロマ
トグラフィーにかける。相当するフラクションの蒸発
後、油状物が残留し、これは数日後完全に結晶する。Ｎ
−ヒドロキシエチルアニリノメタンホスホン酸１．７８
ｇ（５０％）が得られる。融点１２０〜１２１゜。
【００８６】例１０（参考例） Ｎ，Ｎ−（ビスメトキシメチル）−アニリンを、例2. 2
と同様に、亜リン酸トリメチル２モルと反応させ、得
られたビスホスホン酸ジメチルエステルを、例1. 2 と
同様にトリメチルシリルブロミドで鹸化する。粗生成物
を精製するために、強酸性イオン交換体の水を用いて
（ＤＯＷＥＸ５０Ｈ+−形）クロマトグラフィーにかけ
る。生成物含有フラクションの蒸発濃縮によりガラス状
物が得られ、これはアセトン、エーテルおよびリグロイ
ンから成る混合物と擦した後結晶する。融点１３０〜１
３１゜のフェニルイミノ−ジメタンホスホン酸が得られ
る。
【００８７】例１１（参考例） 1 1. 1 例2. 2 と同様に、メタン亜ホスホン酸ジエチルエステ
ル２．２ｍｌをＮ−メトキシメチル−Ｎ−メチルアニリ
ン２ｇと、１００℃の浴温で反応させる。（（Ｎ−メチ
ルアニリノ）−メチル）−メチルホスフィン酸エチルエ
ステル１．６５ｇ（５５％）が得られ（沸点１２３゜
（０．１ｍｍＨｇ））。これはなお相当するメチルエス
テルの少量を含有する。
【００８８】1 1. 2 上で得られた生成物２ｇを、濃塩酸８ｍｌと共に還流下
に４時間加熱する。混合物を蒸発乾涸させ、残分をエタ
ノール／エーテルから再結晶させる。融点１６６〜１６
８゜（分解）の（（Ｎ−メチルアニリノ）−メチル）−
メチルホスフィン酸−塩酸塩１．９８ｇ（９５％）が得
られる。
【００８９】例１２（参考例） （Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸ジメチルエ
ステル４．５ｇを、メチルエチルケトン２０ｍｌ中に溶
かし、ヨウ化ナトリウム３ｇを加える。混合物を３０分
間還流下に沸騰させ、冷却させ、エーテルを加える。生
じた沈殿を濾別し、エタノール／エーテルから再結晶さ
せる。さらに精製するために、生成物を溶離剤としてエ
タノールを用いてシリカゲル上のクロマトグラフィーに
かける。生成物含有フラクションを蒸発濃縮させ、残分
をエタノール／エーテルから再結晶させる。１８０゜よ
り上で加熱することにより分解する（Ｎ−メチルアニリ
ノ）メタンホスホン酸モノメチルエステル０．７１ｇ
（１５％）が得られる。
【００９０】例１３（参考例） （Ｎ−（２−アミノエチル）−アニリノ）−メタンホス
ホン酸（例７から）１．５ｇを水４ｍｌおよび２Ｎ Ｎ
ａＯＨ６ｍｌ中に溶かす。溶液に、濁りが生じるまで少
量の氷酢酸を加える。その後無水アセトン２ｍｌを添加
し、混合物を室温で２時間撹拌し、溶液を濃縮する。残
分をドウエックス（ＤＯＷＥＸ）５０Ｈ+−形２０ｍｌ
で、水を用いてクロマトグラフィーにかける。生成物含
有フラクションを集め、蒸発濃縮させる。残分をエタノ
ール／エーテルから再結晶させる。融点１１７〜１１８
゜（分解）の（Ｎ−（２−アセトアミドエチル）−アニ
リノ−メタンホスホン酸１．２５ｇ（７１％）が得られ
る。
【００９１】例１４（参考例） 1 4. 1 スクシンイミド１９．８５ｇ、ホルムアルデヒド水溶液
（３７％）１６．２ｍｌおよびエタノール１５０ｍｌを
還流下に４５分間沸騰する。混合物をいくらか冷却さ
せ、次いで、エタノール５０ｍｌ中の３−アミノ安息香
酸メチルエステル３０．２ｇの溶液を添加し、還流下に
６時間沸騰する。反応溶液をいくらか濃縮し、冷蔵庫内
で保存する。生じた結晶を吸引濾過する。３−スクシン
イミドメチルアミノ安息香酸メチルエステル３３．４ｇ
が得られ、これをジメチルスルホキシド９０ｍｌ中に溶
かし、ホウ水素化ナトリウム（錠剤）４．７５ｇを加え
る。錠剤の溶解の後混合物をなお２０分間１００゜に加
熱する。混合物を氷水に注ぎ、エーテルで抽出する。エ
ーテル相に水９ｍｌ中の塩化亜鉛９ｇの溶液を加え、強
力に撹拌する。水相を分離し、エーテル相を水で洗浄す
る。油状の３−Ｎ−メチルアミノ安息香酸メチルエステ
ル１５．１ｇが得られる。
【００９２】1 4. 2 上で得られた安息香酸エステルを、例4. 1 と同様に、
パラホルムアルデヒドおよびメタノールと反応させて、
相当するＮ，Ｏ−アセタールを形成させ、これは例2. 2
と同様に、亜リン酸トリメチルを用いて、油状３−
（Ｎ−ジメトキシホスホノメチル−Ｎ−メチル）−安息
香酸メチルエステルを生じ、これを展開剤としての酢酸
エチルエステル／１％エタノールを用いるシリカゲルで
のクロマトグラフィーにより精製する。例2. 3 と同様
の、このエステルの鹸化により、融点１８９〜１９１゜
（分解）の３−（Ｎ−ジヒドロキシ−ホスホノメチル−
Ｎ−メチル）−安息香酸が得られる。
【００９３】例１５ 水性溶液中のＨ2Ｏ2の測定 試薬溶液 溶液Ａ：ＳＭＢＴＨ(1) ０．０５ｍモル／ｌ アニリン誘導体 ０．５ ｍモル／ｌ ペルオキシダーゼ ５００ ＫＵ／ｌ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝８．０） ０．１ モル／ 溶液Ｂ：ＭＢＴＨ(2) ０．０５ｍモル／ｌ アニリン誘導体 ０．５ ｍモル／ｌ ペルオキシダーゼ ５００ ＫＵ／ｌ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝８．０） ０．１ モル／ｌ 溶液Ｃ：４−ＡＡＰ(3) ０．０５ｍモル／ｌ アニリン誘導体 ０．５ ｍモル／ｌ ペルオキシダーゼ ５０００ＫＵ／ｌ 燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝８．０） ０．１ モル／ｌ (1) ＝３−メチル−２−ベンズチアゾリノン−ヒドラゾ
ン−６−スルホン酸 (2) ＝３−メチル−２−ベンズチアゾリノン−ヒドラゾ
ン (3) ＝４−アミノアンチピリン １ｃｍ−キュベット中に燐酸塩緩衝液（ｐＨ８）６００
μｌを入れ、アニリン誘導体、ペルオキシダーゼ及びカ
ップラー含有溶液各々１００μｌを添加する。エッペン
ドルフ−ホトメーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｐｈｏｔ
ｏｍｅｔｅｒ）で盲検値との比較の後に、Ｈ2Ｏ2−原液
（Ｃ H2O2∧５×１０-5モル／ｌ）１００μｌを加え、２
分及び５分後に吸光度をλmaxで測定する。次の吸光度
が測定され、ここでアニリン誘導体８〜１０は比較のた
めに挙げた。この表から、アニリノホスホン酸誘導体
は、従来、本発明の目的に使用されていた他の酸性基を
有するアニリンよりも２〜３倍高い吸光度を有すること
が明らかである。
【００９４】
【表６】
【００９５】表中の化合物： １＝（Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホスホン酸 ２＝（４−フルオル−Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホ
スホン酸 ３＝（３−メチル−Ｎ−メチルアニリノ）−メタンホス
ホン酸 ４＝（４−フルオル−３−メチル−Ｎ−メチルアニリ
ノ）−メタンホスホン酸 ５＝（Ｎ−エチル−４−フルオルアニリノ）−メタンホ
スホン酸 ６＝１，２，３，４−テトラヒドロキノリニル−Ｎ−メ
タンホスホン酸 ７＝６−フルオル−１，２，３，４−テトラヒドロキノ
リニル−Ｎ−メタンホスホン酸 ８＝（３−メチル−Ｎ−エチルアニリノ）−エタンスル
ホン酸 ９＝４−（Ｎ−エチル−３−メチルアニリノ）−メチル
安息香酸 １０＝ビス−（３−メチルフェニルイミノ）−プロピオ
ン酸ナトリウム １１＝４−ビス−（３−メチルフェニルイミノ）−メチ
ル安息香酸 １２＝Ｎ−ヒドロキシエチル−１，２，３，４−テトラ
ヒドロキノリン 例１６ 血清障害の測定 試薬溶液 溶液Ａ：ＳＭＢＴＨ(1) ０．０５ｍモル／ｌ アニリン誘導体＊ ０．５ ｍモル／ｌ ペルオキシダーゼ ５００ ＫＵ／ｌ 燐酸塩緩衝液 ０．１ ｍモル／ｌ 溶液Ｂ：ＳＭＢＴＨ(1) ０．０５ｍモル／ｌ アニリン誘導体＊ ０．５ ｍモル／ｌ ペルオキシダーゼ ５００ ＫＵ／ｌ 人血清(1) ＝３−メチル−２−ベンズチアゾロン−ヒド
ラゾン−６−スルホン酸 ＊ ：燐酸塩緩衝液（０．１ｍモル／ｌ、ｐＨ＝８．
０）中に溶解 例１５に記載と同様に溶液Ａを用いて吸光度測定を実施
する。
【００９６】溶液Ｂでは前記の燐酸塩緩衝液６００μｌ
を人血清に代えた。
【００９７】双方の場合に測定した２分もしくは５分後
の吸光度値を次表に対比させて示した：
【００９８】
【表７】
【００９９】例１７（参考例） 血清中のトリグリセリドの測定 フイルムの被覆物質中に検出に必要な試薬を導入する： 燐酸塩緩衝液（ｐＨ＝８） ０．２モル／ｌ 界面活性剤（脂肪アルコールポリグリコールエーテル） ０．５％ ＳＭＢＴＨ ０．２ｍモル／ｌ （Ｎ−エチル−４−フルオルアニリノ）−メタンホス ホン酸 １ｍモル／ｌ グリセリンホスファトオキシダーゼ １ＫＵ／ｌ グリセリンキナーゼ ３ＫＵ／ｌ コレステリンエステラーゼ ３ＫＵ／ｌ ペルオキシダーゼ １０ＫＵ／ｌ 被覆物質を２００μｍの厚さでポカロンフイルム（Ｐｏ
ｋａｌｏｎｆｏｌｉｅ）上にドクタ塗布する。膜形成の
ために、乾燥箱中、４５℃で約３０分間乾燥させる。
【０１００】トリグリセリド濃度の測定のために、この
膜上に血清１０μｌを施こす。３７℃での２〜３分の反
応時間の後に、光度計で反射を測定する。予め測定した
較正曲線から、トリグリセリド濃度を精確に計算するこ
とができる。
【０１０１】次表にトリグリセリド濃度の測定のための
較正曲線の値を示す： 例１８（参考例）血清中のクレアチニンの測定 吸収性担持材［例えばシエラー・ウント・ヘシュ社の型
紙（Ｓｃｈａｂｌｏｎｅｎｐａｐｉｅｒ Ｆａ．Ｓｃｈ
ｏｅｌｌｅｒ ｕｎｄ Ｈｏｅｓｃｈ）、面重量１２ｇ
／ｍ2、吸収性５０ｍｌ／ｍ2］に、１，２，３，４−テ
トラヒドロキノリニル−メタンホスホン酸３０ｍモル／
ｌ、ペルオキシダーゼ３００ＫＵ／ｌを燐酸塩緩衝液
（ｐＨ７、０．２モル）中に溶かした溶液で含浸し乾燥
させる（試薬紙Ａ）。前記と同じ担持材にサルコシンオ
キシダーゼ２０ＫＵ／ｌ、クレアチンアミノヒドロラー
ゼ３０ＫＵ／ｌ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ４０
ＫＵ／ｌ、スルホン化されたメチルベンズチアゾリノン
ヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）１００ｍモル／ｌ並びに界面
活性剤（脂肪アルコールポリグリコールエーテル）０．
１％を燐酸塩緩衝液（ｐＨ８、０．２モル）中に溶かし
た含浸液で含浸し、乾燥させて、試薬紙Ｂを作る。
【０１０２】クレアチニンの検出のために双方の紙（Ａ
＋Ｂ）をテストモデル中に装入する（図１参照）。
【０１０３】配量部上にクレアチニンの検出のために血
清３０μｌをピペット施与する。反応を開始させこの
際、１工程で指示紙及び酵素紙を移行部上に押し付け
る。１分間の反応時間（３７℃）の後に、生じる色を反
射光度法で測定する。相応する較正曲線から、被測定ク
レアチニン濃度が検知される。
【０１０４】 クイック（Ｑｕｉｃｋ）による光度計での単相凝固時間
の測定 キュベット中に次の組成の溶液１２００μｌをピペット
導入する：トリス／ＨＣＬ（ｐＨ８．１）１００ｍモル
／ｌ、塩化カルシウム６ｍモル／ｌ、Ｔｏｓ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−フェニレンジアミン０．１ｍモル
／ｌ、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルフェニル）−メチ
レン−ホスホン酸５ｍモル／ｌ、ウサギ尿−トロンボプ
ラスチン１．２ｍｇ／ｍｌ。
【０１０５】この溶液を３７℃に加温する。同時に、各
々クエン酸塩血漿１００μｌ及びＫ3［Ｆｅ（ＣＮ）6］
１０モル／ｌの水溶液１００μｌをピポット導入し、充
分に混合し、試料の添加と同時に始動した記録装置で、
６７０ｍｍの波長で、吸光度の増加を時間に応じて追跡
する。
【０１０６】測定値として、反応の開始から０．１の吸
光度変化の達成までに経過する時間を採用する。
【０１０７】前記方法で得られた機能曲線値を表に挙げ
る：
【図面の簡単な説明】 【図１】例１８における血清中のクレアチニン測定用の
テストモデルを示す図である。 【符号の説明】 １ 保護織布 ２ 分離部 ３ 移行部 ４ 担持シート ５ 試薬担持材（Ｂ） ６ 試薬担持材（Ａ） ７ 被覆シート（透明）

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 過酸化水素又は過酸化水素形成系、ペル
    オキシダーゼ又は過酸化性作用物質を検出するために、
    色形成剤としての式Ｉ： 【化１】 ［式中Ｒ1は水素、低級アルキル及びアリールであって
    よく、Ｒ2は水素、低級アルキル基であり、これはヒド
    ロキシ−、アミノ−、カルボキシ−、低級アルコキシカ
    ルボニル−、低級アルカノイルアミド基、アリール低級
    アルキル及びアリール及び構造： 【化２】 の基で置換されていてよく、Ｒ3は水素、カルボキシ又
    はハロゲンであってよく、Ｒ4及びＲ4´は水素、ハロゲ
    ン、カルボキシ、低級アルコキシ又は有利にｍ−位に存
    在する低級アルキル基であり、Ｒ1とＲ2もしくはＲ2と
    Ｒ4もしくはＲ4とＲ4´は双方の基が相互にオルト位に
    存在する場合に、一緒になってＣ−原子数２〜６の飽和
    又は不飽和の炭化水素基を形成してよく、これらはヒド
    ロキシ又はオキソ基で置換されていてよく、Ｒ5は水素
    又は低級アルキル基であり、Ｒ6はヒドロキシ−、低級
    アルコキシ、低級アルキル又はアリール基である］のア
    ニリン誘導体又は酸又は塩基とのその塩を酸化可能なカ
    ップリング成分と共にトリンダー反応で使用することを
    特徴とする、過酸化水素又は過酸化水素形成系又はペル
    オキシダーゼ又は過酸化性作用物質を検出する方法。
  2. 【請求項２】 カップリング成分として４−アミノアン
    チピリン又はその誘導体又はスルホン化されたか又はさ
    れていないメチルベンズチアゾリノンヒドラゾンを使用
    する、請求項第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】 カップリング成分及びトリンダー反応の
    色形成剤及びａ）過酸化性作用化合物又はｂ）Ｈ2Ｏ2又
    はＨ2Ｏ2形成系並びに適当な緩衝剤及び場合によっては
    湿潤剤、活性剤又はトリンダー反応に公知の他の助剤を
    含有する、過酸化水素又は過酸化水素形成系又はペルオ
    キシダーゼ又は過酸化性作用物質を検出するための薬剤
    において、色形成剤として、式Ｉ： 【化３】 ［式中Ｒ1は水素、低級アルキル及びアリールであって
    よく、Ｒ2は水素、低級アルキル基であり、これはヒド
    ロキシ−、アミノ−、カルボキシ−、低級アルコキシカ
    ルボニル−、低級アルカノイルアミド基、アリール低級
    アルキル及びアリール及び構造： 【化４】 の基で置換されていてよく、Ｒ3は水素、カルボキシ又
    はハロゲンであってよく、Ｒ4及びＲ4´は水素、ハロゲ
    ン、カルボキシ、低級アルコキシ又は有利にｍ−位に存
    在する低級アルキル基であり、Ｒ1とＲ2もしくはＲ2と
    Ｒ4もしくはＲ4とＲ4´は双方の基が相互にオルト位に
    存在する場合に、一緒になってＣ−原子数２〜６の飽和
    又は不飽和の炭化水素基を形成してよく、これらはヒド
    ロキシ又はオキソ基で置換されていてよく、Ｒ5は水素
    又は低級アルキル基であってよく、Ｒ6はヒドロキシ
    −、低級アルコキシ、低級アルキル又はアリール基であ
    る］のアニリン誘導体又は酸又は塩基とのその塩を含有
    することを特徴とする、過酸化水素又は過酸化水素形成
    系又はペルオキシダーゼ又は過酸化性作用物質の検出
    剤。
  4. 【請求項４】 カップリング成分として、４−アミノア
    ンチピリン又はその誘導体又はスルホン化された又はさ
    れていないメチルベンズチアゾリノンヒドラゾンを使用
    する、請求項第３項記載の検出剤。
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