JPH0670796A - 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び感染症の診断方法 - Google Patents
前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び感染症の診断方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】血液由来試料中のβ−グルカン及びエンドトキ
シンの高検出率・迅速測定法の提供。 【構成】ヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属
水酸化物を含む前処理剤、の前処理剤であって、
更に非イオン性界面活性剤およびアルカリ土類金属ハロ
ゲン化物を含む前処理剤、の前処理剤であって、
更にアルカリ金属ハロゲン化物を含む前処理剤、アル
カリ金属水酸化物を主成分とする前処理剤、〜
に記載された前処理剤と試料を混合し、加温することを
特徴とする前処理方法、リムルス反応を利用して試料
中のリムルス試薬に特異的に反応する物質を測定する方
法であって、試料をの方法で前処理し、処理後の試料
をリムルス試薬と混合して反応させ、基質の変化を検出
する測定法、（Ａ）前記前処理剤。（Ｂ）リムルス試
薬からなる測定用キット、前記測定法で物質を定量
し、該物質が一定量を超えたときに感染症に罹患したと
判定する診断方法。
シンの高検出率・迅速測定法の提供。 【構成】ヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属
水酸化物を含む前処理剤、の前処理剤であって、
更に非イオン性界面活性剤およびアルカリ土類金属ハロ
ゲン化物を含む前処理剤、の前処理剤であって、
更にアルカリ金属ハロゲン化物を含む前処理剤、アル
カリ金属水酸化物を主成分とする前処理剤、〜
に記載された前処理剤と試料を混合し、加温することを
特徴とする前処理方法、リムルス反応を利用して試料
中のリムルス試薬に特異的に反応する物質を測定する方
法であって、試料をの方法で前処理し、処理後の試料
をリムルス試薬と混合して反応させ、基質の変化を検出
する測定法、（Ａ）前記前処理剤。（Ｂ）リムルス試
薬からなる測定用キット、前記測定法で物質を定量
し、該物質が一定量を超えたときに感染症に罹患したと
判定する診断方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生化学反応に対する反
応妨害因子を含む試料の前処理剤、その前処理方法、前
処理された試料による測定法、その測定法に使用される
測定用キット、および試料からの感染症の診断方法に関
し、特に、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用
いたリムルス反応による測定において、その反応を妨害
する因子を含む生体由来試料、特に血液由来試料中の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンおよびエンドトキシンの
測定法に関するものであり、殊に真菌感染症およびグラ
ム陰性菌感染症患者の血液由来試料中のそれぞれ（１→
３）−β−Ｄ−グルカンおよびエンドトキシンを高い精
度で測定して真菌感染症およびグラム陰性菌感染症を診
断するために有効な上記血液由来試料の処理および前記
測定法に関するものである。
応妨害因子を含む試料の前処理剤、その前処理方法、前
処理された試料による測定法、その測定法に使用される
測定用キット、および試料からの感染症の診断方法に関
し、特に、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用
いたリムルス反応による測定において、その反応を妨害
する因子を含む生体由来試料、特に血液由来試料中の
（１→３）−β−Ｄ−グルカンおよびエンドトキシンの
測定法に関するものであり、殊に真菌感染症およびグラ
ム陰性菌感染症患者の血液由来試料中のそれぞれ（１→
３）−β−Ｄ−グルカンおよびエンドトキシンを高い精
度で測定して真菌感染症およびグラム陰性菌感染症を診
断するために有効な上記血液由来試料の処理および前記
測定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来から、生化学反応を利用した生体試
料中の目的物質の測定が、臨床診断と関わりながら広く
行われている。例えば、典型的な生化学的診断として、
リムルス反応を利用した真菌あるいはグラム陰性菌の検
出が挙げられる。リムルス反応は、リムルス試薬を用い
る生化学反応である。
料中の目的物質の測定が、臨床診断と関わりながら広く
行われている。例えば、典型的な生化学的診断として、
リムルス反応を利用した真菌あるいはグラム陰性菌の検
出が挙げられる。リムルス反応は、リムルス試薬を用い
る生化学反応である。
【０００３】リムルス試薬に含まれるカブトガニ・アメ
ボサイト・ライセート（以下、単に「ライセート」とい
うこともある）には、エンドトキシンと反応して活性化
されるカスケードタイプの凝固系（Ｃ因子系）と（１→
３）−β−Ｄ−グルカン（以下「β−グルカン」という
こともある）と反応して活性化されるカスケードタイプ
の凝固系（Ｇ因子系）とが共存しており（図１）、前者
の系のみを利用してエンドトキシンを特異的に測定する
方法、後者の系のみを利用してβ−グルカンを特異的に
測定する方法がそれぞれ知られている（Obayashi T. et
al., Clin. Chim. Acta, １４９，５５−６５（１９８
５））。また、真菌感染症の患者は血液中のβ−グルカ
ンが増加し、グラム陰性菌感染症の患者は血液中のエン
ドトキシンが増加する。血液中のβ−グルカンまたはエ
ンドトキシンを測定することによってそれぞれ真菌感染
症またはグラム陰性菌感染症を診断できることも知られ
ている。
ボサイト・ライセート（以下、単に「ライセート」とい
うこともある）には、エンドトキシンと反応して活性化
されるカスケードタイプの凝固系（Ｃ因子系）と（１→
３）−β−Ｄ−グルカン（以下「β−グルカン」という
こともある）と反応して活性化されるカスケードタイプ
の凝固系（Ｇ因子系）とが共存しており（図１）、前者
の系のみを利用してエンドトキシンを特異的に測定する
方法、後者の系のみを利用してβ−グルカンを特異的に
測定する方法がそれぞれ知られている（Obayashi T. et
al., Clin. Chim. Acta, １４９，５５−６５（１９８
５））。また、真菌感染症の患者は血液中のβ−グルカ
ンが増加し、グラム陰性菌感染症の患者は血液中のエン
ドトキシンが増加する。血液中のβ−グルカンまたはエ
ンドトキシンを測定することによってそれぞれ真菌感染
症またはグラム陰性菌感染症を診断できることも知られ
ている。
【０００４】このようなＧ因子系を利用するβ−グルカ
ンおよびＣ因子系を利用するエンドトキシンの測定法
は、検出感度が非常に高いため生体試料中の上記各物質
の微量検出に適しており、特に深在性真菌感染症および
グラム陰性菌感染症の診断への有効性が検討確認され、
臨床検査に使用され始めている。ところで、生体試料、
特に血液中のβ−グルカンおよびエンドトキシンをそれ
ぞれライセートのＧ因子系およびＣ因子系によるカスケ
ード反応を利用して測定する場合には、該反応がライセ
ート中のセリンプロテアーゼの反応を利用するため、そ
の中に含まれる種々の反応妨害因子（例えば、トロンビ
ンやＸａ因子はライセート中の凝固酵素と類似の作用を
示すため、偽陽性因子となり、α2 −プラスミンインヒ
ビター、α1 −アンチトリプシンおよびアンチトロンビ
ンIII は反応を強力に阻害し、偽陰性因子となる）を失
活あるいは除去するための前処理が必要である。この目
的のために従来は、血液試料に特定の処理を施して多血
小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、さらに過塩素酸を加えて
３７℃で加温処理した後に、変性析出物を遠心分離して
除去し、その上澄液を採取し、アルカリで中和して被検
液とする方法が採用されていた（Obayashi T. et al.,
Clin. Chim. Acta, １４９，５５−６５（１９８５））
が、変性析出物の分離操作が煩雑で全操作工程も多く、
操作中に反応系に影響を与える物質による汚染の危険性
があるなどの問題があった。
ンおよびＣ因子系を利用するエンドトキシンの測定法
は、検出感度が非常に高いため生体試料中の上記各物質
の微量検出に適しており、特に深在性真菌感染症および
グラム陰性菌感染症の診断への有効性が検討確認され、
臨床検査に使用され始めている。ところで、生体試料、
特に血液中のβ−グルカンおよびエンドトキシンをそれ
ぞれライセートのＧ因子系およびＣ因子系によるカスケ
ード反応を利用して測定する場合には、該反応がライセ
ート中のセリンプロテアーゼの反応を利用するため、そ
の中に含まれる種々の反応妨害因子（例えば、トロンビ
ンやＸａ因子はライセート中の凝固酵素と類似の作用を
示すため、偽陽性因子となり、α2 −プラスミンインヒ
ビター、α1 −アンチトリプシンおよびアンチトロンビ
ンIII は反応を強力に阻害し、偽陰性因子となる）を失
活あるいは除去するための前処理が必要である。この目
的のために従来は、血液試料に特定の処理を施して多血
小板血漿（ＰＲＰ）を調製し、さらに過塩素酸を加えて
３７℃で加温処理した後に、変性析出物を遠心分離して
除去し、その上澄液を採取し、アルカリで中和して被検
液とする方法が採用されていた（Obayashi T. et al.,
Clin. Chim. Acta, １４９，５５−６５（１９８５））
が、変性析出物の分離操作が煩雑で全操作工程も多く、
操作中に反応系に影響を与える物質による汚染の危険性
があるなどの問題があった。
【０００５】ところで、エンドトキシンやβ−グルカン
を測定するための上記のような前処理法は、すべて試験
管中で前処理を行い、しかも、このように前処理された
試料の一部を他の試験管に取り出してリムルス反応を行
うことにより実施されていた。さらに、測定を合成基質
法で行う際には、リムルス反応後、基質が開裂して生成
したｐ−ニトロアニリンをジアゾ化反応によって赤色色
素に変換して吸光度を測定するというエンドポイント法
が一般的に使用されていた。エンドポイント法は、通
常、操作が煩雑で測定時間も長い方法であり、多数の検
体を短時間で一度に処理できる方法が望まれている。試
験管の代わりにマイクロプレートを使用すれば、多数の
検体を同時に扱うことができるが、エンドポイント法で
は連続的な自動測定は困難である。
を測定するための上記のような前処理法は、すべて試験
管中で前処理を行い、しかも、このように前処理された
試料の一部を他の試験管に取り出してリムルス反応を行
うことにより実施されていた。さらに、測定を合成基質
法で行う際には、リムルス反応後、基質が開裂して生成
したｐ−ニトロアニリンをジアゾ化反応によって赤色色
素に変換して吸光度を測定するというエンドポイント法
が一般的に使用されていた。エンドポイント法は、通
常、操作が煩雑で測定時間も長い方法であり、多数の検
体を短時間で一度に処理できる方法が望まれている。試
験管の代わりにマイクロプレートを使用すれば、多数の
検体を同時に扱うことができるが、エンドポイント法で
は連続的な自動測定は困難である。
【０００６】そこで、このようなマイクロプレートを使
用でき、かつ基質の変化を直接自動測定できるカイネテ
ィック法（特開平３−２２０４５６）による測定が望ま
れているが、マイクロプレートの反応液量は少なく、反
応液の濁り等の影響により精度よく測定できないという
問題があった。また、エンドトキシンとβ−グルカンは
使用する反応系が異なるために試料の前処理も異なり、
これらを同一試料について測定しようとすると各々異な
る方法による前処理が必要であるから、非常に労力が必
要であると共に不経済であり、１回の処理で両者の測定
に利用可能な前処理剤が望まれていた。
用でき、かつ基質の変化を直接自動測定できるカイネテ
ィック法（特開平３−２２０４５６）による測定が望ま
れているが、マイクロプレートの反応液量は少なく、反
応液の濁り等の影響により精度よく測定できないという
問題があった。また、エンドトキシンとβ−グルカンは
使用する反応系が異なるために試料の前処理も異なり、
これらを同一試料について測定しようとすると各々異な
る方法による前処理が必要であるから、非常に労力が必
要であると共に不経済であり、１回の処理で両者の測定
に利用可能な前処理剤が望まれていた。
【０００７】そして、生体試料を一種の前処理剤で前処
理し、種々の生化学反応に適用できる汎用性のある前処
理剤があれば、測定法、生体試料でそれぞれ異なる煩雑
な前処理を行う必要がなく、生化学的研究、診断等に寄
与する効果は非常に大きいことが期待できるため、この
ような前処理剤が望まれていた。
理し、種々の生化学反応に適用できる汎用性のある前処
理剤があれば、測定法、生体試料でそれぞれ異なる煩雑
な前処理を行う必要がなく、生化学的研究、診断等に寄
与する効果は非常に大きいことが期待できるため、この
ような前処理剤が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の従来
の前処理法の問題点を解決しようとするもので、生化学
反応に対する反応妨害因子、例えば、リムルス反応にお
けるＧ因子系またはＣ因子系反応に対する反応妨害因子
を含む血液由来試料中の該妨害因子を簡単な処理で除去
又は変性し、変性析出物の分離操作を必要としない方法
で、かつ生化学反応による測定時に濁りが生じない方法
を採用することによって血液由来試料中のβ−グルカン
またはエンドトキシンを極めて高い検出率で、迅速に効
率よく測定できる前処理剤、前処理方法、測定方法、測
定用キット、及び感染症の診断方法を提供するものであ
る。
の前処理法の問題点を解決しようとするもので、生化学
反応に対する反応妨害因子、例えば、リムルス反応にお
けるＧ因子系またはＣ因子系反応に対する反応妨害因子
を含む血液由来試料中の該妨害因子を簡単な処理で除去
又は変性し、変性析出物の分離操作を必要としない方法
で、かつ生化学反応による測定時に濁りが生じない方法
を採用することによって血液由来試料中のβ−グルカン
またはエンドトキシンを極めて高い検出率で、迅速に効
率よく測定できる前処理剤、前処理方法、測定方法、測
定用キット、及び感染症の診断方法を提供するものであ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、生化学反応に
対する反応妨害因子を含む試料の前処理剤であって、ヘ
キサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物を含
むことを特徴とする前処理剤（以下「汎用前処理剤」と
もいう）である。本発明の前処理剤は、特にリムルス反
応に対する反応妨害因子を含む試料に好適に使用され
る。
対する反応妨害因子を含む試料の前処理剤であって、ヘ
キサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物を含
むことを特徴とする前処理剤（以下「汎用前処理剤」と
もいう）である。本発明の前処理剤は、特にリムルス反
応に対する反応妨害因子を含む試料に好適に使用され
る。
【００１０】本発明は、リムルス反応を利用して試料中
のエンドトキシンを測定する際に使用する、前記ヘキサ
ジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物を含む前
処理剤であって、更に非イオン性界面活性剤もしくは陰
イオン界面活性剤およびアルカリ土類金属ハロゲン化物
を含む前処理剤（エンドトキシン測定用前処理剤）を提
供する。
のエンドトキシンを測定する際に使用する、前記ヘキサ
ジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物を含む前
処理剤であって、更に非イオン性界面活性剤もしくは陰
イオン界面活性剤およびアルカリ土類金属ハロゲン化物
を含む前処理剤（エンドトキシン測定用前処理剤）を提
供する。
【００１１】本発明は、リムルス反応を利用して試料中
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する際に使用す
る、前記ヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水
酸化物を含む前処理剤であって、更にアルカリ金属ハロ
ゲン化物を含む前処理剤（β−グルカン測定用前処理剤
Ａ）を提供する。本発明は、リムルス反応を利用して試
料中の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する際に、
リムルス反応に対する反応妨害因子を含む試料をリムル
ス反応に先立って処理するために使用する前処理剤であ
って、アルカリ金属水酸化物を主成分とすることを特徴
とする前処理剤（β−グルカン測定用前処理剤Ｂ）を提
供する。
の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する際に使用す
る、前記ヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水
酸化物を含む前処理剤であって、更にアルカリ金属ハロ
ゲン化物を含む前処理剤（β−グルカン測定用前処理剤
Ａ）を提供する。本発明は、リムルス反応を利用して試
料中の（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する際に、
リムルス反応に対する反応妨害因子を含む試料をリムル
ス反応に先立って処理するために使用する前処理剤であ
って、アルカリ金属水酸化物を主成分とすることを特徴
とする前処理剤（β−グルカン測定用前処理剤Ｂ）を提
供する。
【００１２】本発明の上記種々の前処理剤は、複数の溶
液として保存され、使用時に該溶液が混合される構成で
もよい。特に、予め混合しておくと濁りが生じたり、分
解するような成分同士は分離して別々の溶液に存在させ
て保存することが好ましい。本発明は、リムルス反応に
対する反応妨害因子を含む試料中に含まれるリムルス反
応によって検出できる物質を、該反応を利用して検出す
る際に、リムルス反応に先立って試料を処理するための
前処理方法において、前記前処理剤の群から選択される
特定の前処理剤と試料を混合し、加温することを特徴と
する前処理方法を提供する。尚、測定目的物質が同じ場
合等は、場合によりこれら前処理剤は、組み合わせて混
合して使用し得る場合がある。
液として保存され、使用時に該溶液が混合される構成で
もよい。特に、予め混合しておくと濁りが生じたり、分
解するような成分同士は分離して別々の溶液に存在させ
て保存することが好ましい。本発明は、リムルス反応に
対する反応妨害因子を含む試料中に含まれるリムルス反
応によって検出できる物質を、該反応を利用して検出す
る際に、リムルス反応に先立って試料を処理するための
前処理方法において、前記前処理剤の群から選択される
特定の前処理剤と試料を混合し、加温することを特徴と
する前処理方法を提供する。尚、測定目的物質が同じ場
合等は、場合によりこれら前処理剤は、組み合わせて混
合して使用し得る場合がある。
【００１３】この前処理方法は、試料が血液由来の試料
である場合に好適に用いられる。本発明は、リムルス反
応によって検出できる物質がエンドトキシンであり、前
処理剤がエンドトキシン測定用前処理剤である前記前処
理方法、およびリムルス反応によって検出できる物質が
（１→３）−β−Ｄ−グルカンであり、前処理剤がβ−
グルカン測定用前処理剤ＡまたはＢである前記前処理方
法を提供する。
である場合に好適に用いられる。本発明は、リムルス反
応によって検出できる物質がエンドトキシンであり、前
処理剤がエンドトキシン測定用前処理剤である前記前処
理方法、およびリムルス反応によって検出できる物質が
（１→３）−β−Ｄ−グルカンであり、前処理剤がβ−
グルカン測定用前処理剤ＡまたはＢである前記前処理方
法を提供する。
【００１４】本発明は、リムルス反応を利用して試料中
のリムルス試薬に特異的に反応する物質を測定する方法
であって、試料を前記前処理法のいずれかの方法で前処
理し、処理後の試料をリムルス試薬と混合して反応さ
せ、基質の変化を検出することを特徴とする測定法を提
供する。本発明は、少なくとも下記の構成試薬からなる
ことを特徴とするリムルス試薬に特異的に反応する物質
を測定するための測定用キットを提供する。 （Ａ）前記前処理剤からなる群から選択される１種以上
の前処理剤。 （Ｂ）カブトガニ・アメボサイト・ライセートを原料と
して得られたリムルス試薬。
のリムルス試薬に特異的に反応する物質を測定する方法
であって、試料を前記前処理法のいずれかの方法で前処
理し、処理後の試料をリムルス試薬と混合して反応さ
せ、基質の変化を検出することを特徴とする測定法を提
供する。本発明は、少なくとも下記の構成試薬からなる
ことを特徴とするリムルス試薬に特異的に反応する物質
を測定するための測定用キットを提供する。 （Ａ）前記前処理剤からなる群から選択される１種以上
の前処理剤。 （Ｂ）カブトガニ・アメボサイト・ライセートを原料と
して得られたリムルス試薬。
【００１５】ここで、エンドトキシンを特異的に測定す
るためには、（Ｂ）のリムルス試薬は、エンドトキシン
に特異的に反応する試薬であり、リムルス試薬に特異的
に反応する物質がエンドトキシンであることが好まし
い。構成試薬として、さらに（Ｃ）エンドトキシンの一
定量を含む標準試薬を含むことが好ましい。また、β−
グルカンを特異的に測定するためには、（Ｂ）のリムル
ス試薬は、β−グルカンに特異的に反応する試薬であ
り、リムルス試薬に特異的に反応する物質がβ−グルカ
ンであることが好ましい。構成試薬として、さらに
（Ｄ）β−Ｄ−グルカンの一定量を含む標準試薬を含む
ことが好ましい。
るためには、（Ｂ）のリムルス試薬は、エンドトキシン
に特異的に反応する試薬であり、リムルス試薬に特異的
に反応する物質がエンドトキシンであることが好まし
い。構成試薬として、さらに（Ｃ）エンドトキシンの一
定量を含む標準試薬を含むことが好ましい。また、β−
グルカンを特異的に測定するためには、（Ｂ）のリムル
ス試薬は、β−グルカンに特異的に反応する試薬であ
り、リムルス試薬に特異的に反応する物質がβ−グルカ
ンであることが好ましい。構成試薬として、さらに
（Ｄ）β−Ｄ−グルカンの一定量を含む標準試薬を含む
ことが好ましい。
【００１６】そして、本発明は、生体由来の試料中のリ
ムルス試薬に特異的に反応する物質を前記基質の変化を
検出する測定法で定量し、該物質の測定値が一定量を超
えたときに感染症に罹患した生体に由来する試料である
と判定することを特徴とする感染症の診断方法を提供す
る。以下本発明を具体的に説明する。
ムルス試薬に特異的に反応する物質を前記基質の変化を
検出する測定法で定量し、該物質の測定値が一定量を超
えたときに感染症に罹患した生体に由来する試料である
と判定することを特徴とする感染症の診断方法を提供す
る。以下本発明を具体的に説明する。
【００１７】本発明の前処理剤において対象とする「生
化学反応に対する反応妨害因子を含む試料」とは、生化
学反応により測定される目的物質を含む可能性のある試
料であって、反応妨害因子の一種以上を生化学反応に影
響を及ぼす程度に含むものである。該試料は典型的に
は、生体由来試料であり、特に血液由来試料である。血
液由来試料としては、典型的にはヒトを含む哺乳動物か
ら採取された血液を公知の方法で処理して得られた血漿
又は血清そのもの、あるいはプロテアーゼ類、プロテア
ーゼインヒビター類、血液由来の蛋白製剤等を含む血漿
又は血清等である。ここで、「反応妨害因子」とは所定
の生化学反応とは無関係に反応する因子（偽陽性因子）
又はいずれかの段階における反応に阻害的に作用する因
子（偽陰性因子）で、典型的には血液中に含まれる前記
因子等である。
化学反応に対する反応妨害因子を含む試料」とは、生化
学反応により測定される目的物質を含む可能性のある試
料であって、反応妨害因子の一種以上を生化学反応に影
響を及ぼす程度に含むものである。該試料は典型的に
は、生体由来試料であり、特に血液由来試料である。血
液由来試料としては、典型的にはヒトを含む哺乳動物か
ら採取された血液を公知の方法で処理して得られた血漿
又は血清そのもの、あるいはプロテアーゼ類、プロテア
ーゼインヒビター類、血液由来の蛋白製剤等を含む血漿
又は血清等である。ここで、「反応妨害因子」とは所定
の生化学反応とは無関係に反応する因子（偽陽性因子）
又はいずれかの段階における反応に阻害的に作用する因
子（偽陰性因子）で、典型的には血液中に含まれる前記
因子等である。
【００１８】血液から血漿を調製するためには通常、血
液にヘパリン等の血液凝固阻止剤を添加し、遠心分離し
て血球を沈澱させればよい。その際、遠心分離を低回転
数（例えば、１５０×ｇ程度）で行うと、血小板を多く
含んだ多血小板血漿（ＰＲＰ）が得られ、高回転数（例
えば、１０００×ｇ程度）で行うと、貧血小板血漿（Ｐ
ＰＰ）が得られる。本発明で測定対象とする血液由来試
料が血漿である場合、ＰＲＰ又はＰＰＰのいずれであっ
てもよい。
液にヘパリン等の血液凝固阻止剤を添加し、遠心分離し
て血球を沈澱させればよい。その際、遠心分離を低回転
数（例えば、１５０×ｇ程度）で行うと、血小板を多く
含んだ多血小板血漿（ＰＲＰ）が得られ、高回転数（例
えば、１０００×ｇ程度）で行うと、貧血小板血漿（Ｐ
ＰＰ）が得られる。本発明で測定対象とする血液由来試
料が血漿である場合、ＰＲＰ又はＰＰＰのいずれであっ
てもよい。
【００１９】また血清は、血液から血球といくつかの血
液凝固因子を取り除いたものであり、通常採取した血液
を容器中に放置し、生成した血餅を分離除去することに
よって調製される。上記血液由来試料等を、本発明の前
処理剤で処理することによって反応妨害因子によるリム
ルス反応等の生化学反応への影響が除去される。
液凝固因子を取り除いたものであり、通常採取した血液
を容器中に放置し、生成した血餅を分離除去することに
よって調製される。上記血液由来試料等を、本発明の前
処理剤で処理することによって反応妨害因子によるリム
ルス反応等の生化学反応への影響が除去される。
【００２０】「生化学反応」としては、リムルス反応、
抗原抗体反応、酵素反応等一般的に生体物質の測定に使
用される反応が例示される。本発明において「リムルス
反応」とは、カブトガニのアメボサイト（血球細胞）を
低張液等で抽出したライセート（カブトガニ・アメボサ
イト・ライセート）のＣ因子系成分（少なくともＣ因子
とＢ因子と凝固酵素前駆体を含む成分）とエンドトキシ
ンとの反応およびＧ因子系成分（少なくともＧ因子と凝
固酵素前駆体を含む成分）とβ−グルカンとの反応の一
方または両方を包含する意味で使用する。「リムルス試
薬」および「カブトガニ・アメボサイト・ライセートを
原料として得られたリムルス試薬」は、いずれも上記リ
ムルス反応によってエンドトキシンまたはβ−グルカン
を測定するための試薬を意味し、リムルス・ポリフェム
ス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギ
ガス、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ等のカ
ブトガニの血リンパ液から、公知の方法（例えば、J. B
iochem.,80,1011-1021(1976)参照）で調製した通常のカ
ブトガニ・アメボサイト・ライセートを含有し、必要に
応じて後述のペプチド合成基質を添加した試薬である。
「エンドトキシンに特異的に反応するリムルス試薬」と
は、上記ライセートのＧ因子を特異的に阻害または吸
着、除去すること（例えば、ＷＯ９０／０２９５１、Ｕ
ＳＰ５，１５５，０３２、ＵＳＰ５，１７９，００６、
ＷＯ９２／０３７３６、ＷＯ９２／０６３８１、特願平
５−６１４６４、またはＣ因子系成分を分画、再構成す
ること（例えば、特公平２−１８０８０、特公平３−１
８０８０、Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, １
４９，５５−６５（１９８５））により調製される。ま
た、「β−グルカンに特異的に反応するリムルス試薬」
とは、上記ライセートのＣ因子を特異的に阻害または吸
着、除去すること（例えば、ＷＯ９１／１９９８１、Ｗ
Ｏ９２／１６６５１）、またはＧ因子系成分を分画、再
構成すること（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Act
a, １４９，５５−６５（１９８５））により調製され
る。従って、β−グルカン用リムルス試薬は、エンドト
キシンでは活性化されずβ−グルカンによって特異的に
反応系が活性化されるように調製したものである。ま
た、エンドトキシン用リムルス試薬は、β−グルカンで
は活性化されずエンドトキシンによって特異的に反応系
が活性化されるように調製したものである。
抗原抗体反応、酵素反応等一般的に生体物質の測定に使
用される反応が例示される。本発明において「リムルス
反応」とは、カブトガニのアメボサイト（血球細胞）を
低張液等で抽出したライセート（カブトガニ・アメボサ
イト・ライセート）のＣ因子系成分（少なくともＣ因子
とＢ因子と凝固酵素前駆体を含む成分）とエンドトキシ
ンとの反応およびＧ因子系成分（少なくともＧ因子と凝
固酵素前駆体を含む成分）とβ−グルカンとの反応の一
方または両方を包含する意味で使用する。「リムルス試
薬」および「カブトガニ・アメボサイト・ライセートを
原料として得られたリムルス試薬」は、いずれも上記リ
ムルス反応によってエンドトキシンまたはβ−グルカン
を測定するための試薬を意味し、リムルス・ポリフェム
ス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギ
ガス、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダ等のカ
ブトガニの血リンパ液から、公知の方法（例えば、J. B
iochem.,80,1011-1021(1976)参照）で調製した通常のカ
ブトガニ・アメボサイト・ライセートを含有し、必要に
応じて後述のペプチド合成基質を添加した試薬である。
「エンドトキシンに特異的に反応するリムルス試薬」と
は、上記ライセートのＧ因子を特異的に阻害または吸
着、除去すること（例えば、ＷＯ９０／０２９５１、Ｕ
ＳＰ５，１５５，０３２、ＵＳＰ５，１７９，００６、
ＷＯ９２／０３７３６、ＷＯ９２／０６３８１、特願平
５−６１４６４、またはＣ因子系成分を分画、再構成す
ること（例えば、特公平２−１８０８０、特公平３−１
８０８０、Obayashi T. et al., Clin. Chim. Acta, １
４９，５５−６５（１９８５））により調製される。ま
た、「β−グルカンに特異的に反応するリムルス試薬」
とは、上記ライセートのＣ因子を特異的に阻害または吸
着、除去すること（例えば、ＷＯ９１／１９９８１、Ｗ
Ｏ９２／１６６５１）、またはＧ因子系成分を分画、再
構成すること（Obayashi T. et al., Clin. Chim. Act
a, １４９，５５−６５（１９８５））により調製され
る。従って、β−グルカン用リムルス試薬は、エンドト
キシンでは活性化されずβ−グルカンによって特異的に
反応系が活性化されるように調製したものである。ま
た、エンドトキシン用リムルス試薬は、β−グルカンで
は活性化されずエンドトキシンによって特異的に反応系
が活性化されるように調製したものである。
【００２１】本発明において利用し得るリムルス試薬は
前記のような機能を有するものであればよく、製法、組
成等には限定されない。該リムルス反応においては、β
−グルカンまたはエンドトキシンを測定しようとする場
合の反応妨害因子としては、Ｇ因子系またはＣ因子系反
応に影響を及ぼす因子が挙げられる。ここで、「反応妨
害因子」は、β−グルカンまたはエンドトキシンによっ
て開始される、図１に示したライセートのＧ因子系およ
び／またはＣ因子系の段階的酵素反応（カスケード反
応）のいずれかの段階においてβ−グルカンまたはエン
ドトキシンとは無関係に反応する前記偽陽性因子又は偽
陰性因子である。
前記のような機能を有するものであればよく、製法、組
成等には限定されない。該リムルス反応においては、β
−グルカンまたはエンドトキシンを測定しようとする場
合の反応妨害因子としては、Ｇ因子系またはＣ因子系反
応に影響を及ぼす因子が挙げられる。ここで、「反応妨
害因子」は、β−グルカンまたはエンドトキシンによっ
て開始される、図１に示したライセートのＧ因子系およ
び／またはＣ因子系の段階的酵素反応（カスケード反
応）のいずれかの段階においてβ−グルカンまたはエン
ドトキシンとは無関係に反応する前記偽陽性因子又は偽
陰性因子である。
【００２２】以下、本発明の前処理剤について具体的に
述べる。本発明の汎用前処理剤は、少なくともヘキサジ
メトリン化合物とアルカリ金属水酸化物からなる。この
アルカリ金属水酸化物は、カリウム、ナトリウム等のア
ルカリ金属の水酸化物であり、具体的には水酸化カリウ
ム（ＫＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナ
トリウム（ＮａＯＨ）等である。該前処理剤としては通
常単独又は複数のアルカリ金属水酸化物を含む水溶液が
使用される。
述べる。本発明の汎用前処理剤は、少なくともヘキサジ
メトリン化合物とアルカリ金属水酸化物からなる。この
アルカリ金属水酸化物は、カリウム、ナトリウム等のア
ルカリ金属の水酸化物であり、具体的には水酸化カリウ
ム（ＫＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、水酸化ナ
トリウム（ＮａＯＨ）等である。該前処理剤としては通
常単独又は複数のアルカリ金属水酸化物を含む水溶液が
使用される。
【００２３】前処理剤中のアルカリ金属水酸化物の濃度
は、通常、被検液中の該アルカリ金属水酸化物濃度が
０. ０４〜０. ４モル／l となるように調整することが
好ましい。本発明に使用されるヘキサジメトリン化合物
は、好ましくは、ヘキサジメトリンの塩、例えば、ヘキ
サジメトリンハロゲン化物が挙げられる。ヘキサジメト
リンハロゲン化物としては、ヘキサジメトリンブロマイ
ド（一般名；ポリブレン）、ヘキサジメトリンクロライ
ド等が好ましいものとして例示されるが、本発明におい
ては、これらハロゲン化物等に限定されるものでなく、
所望によりヘキサジメトリンの水素原子を他の置換基、
例えば、アルキル基などで置換されたヘキサジメトリン
誘導体の塩をも含むものである。
は、通常、被検液中の該アルカリ金属水酸化物濃度が
０. ０４〜０. ４モル／l となるように調整することが
好ましい。本発明に使用されるヘキサジメトリン化合物
は、好ましくは、ヘキサジメトリンの塩、例えば、ヘキ
サジメトリンハロゲン化物が挙げられる。ヘキサジメト
リンハロゲン化物としては、ヘキサジメトリンブロマイ
ド（一般名；ポリブレン）、ヘキサジメトリンクロライ
ド等が好ましいものとして例示されるが、本発明におい
ては、これらハロゲン化物等に限定されるものでなく、
所望によりヘキサジメトリンの水素原子を他の置換基、
例えば、アルキル基などで置換されたヘキサジメトリン
誘導体の塩をも含むものである。
【００２４】本発明に使用されるヘキサジメトリン化合
物の分子量は、約１，０００〜５０，０００、好ましく
は５，０００〜１０，０００の範囲から選択され、前処
理剤中、０．０５〜０．３％、好ましくは０．１〜０．
２％（重量／容量）の範囲で使用される。そして、その
使用量は、試料が適用される生化学反応に応じて適宜調
整される。
物の分子量は、約１，０００〜５０，０００、好ましく
は５，０００〜１０，０００の範囲から選択され、前処
理剤中、０．０５〜０．３％、好ましくは０．１〜０．
２％（重量／容量）の範囲で使用される。そして、その
使用量は、試料が適用される生化学反応に応じて適宜調
整される。
【００２５】この汎用前処理剤は、その他任意の化学物
質を適宜含有することができ、後述するリムルス反応に
適用される前処理剤の組成成分として使用されるものも
使用することができる。前記汎用前処理剤は、例えば、
リムルス反応に適用される場合は、エンドトキシン測定
用、β−グルカン測定用、あるいはこれら両者兼用の測
定用として用いることができ、適宜その種類に応じてヘ
キサジメトリン化合物の量、その他成分の量を微調整す
ることが可能である。
質を適宜含有することができ、後述するリムルス反応に
適用される前処理剤の組成成分として使用されるものも
使用することができる。前記汎用前処理剤は、例えば、
リムルス反応に適用される場合は、エンドトキシン測定
用、β−グルカン測定用、あるいはこれら両者兼用の測
定用として用いることができ、適宜その種類に応じてヘ
キサジメトリン化合物の量、その他成分の量を微調整す
ることが可能である。
【００２６】即ち、本発明は、エンドトキシンおよびβ
−グルカンの両者兼用の測定用前処理剤（以下、兼用前
処理剤ともいう）として、少なくとも前記アルカリ金属
水酸化物およびヘキサジメトリン化合物を含む前処理剤
を提供することができる。アルカリ金属水酸化物は、主
として反応妨害因子を変性させる等の機能を有している
と考えられ、ヘキサジメトリン化合物は、測定試料の濁
度を低減せしめる作用、換言すれば中性脂肪、リポ蛋白
に起因すると考えられる非特異的な濁りの増大を抑制す
る作用を有し、かつ両者の反応系を妨害しない性質を兼
ね備えている。両物質を含有する兼用前処理剤は、この
一つの前処理剤による検体の処理で各々の反応系での測
定が可能なものである。
−グルカンの両者兼用の測定用前処理剤（以下、兼用前
処理剤ともいう）として、少なくとも前記アルカリ金属
水酸化物およびヘキサジメトリン化合物を含む前処理剤
を提供することができる。アルカリ金属水酸化物は、主
として反応妨害因子を変性させる等の機能を有している
と考えられ、ヘキサジメトリン化合物は、測定試料の濁
度を低減せしめる作用、換言すれば中性脂肪、リポ蛋白
に起因すると考えられる非特異的な濁りの増大を抑制す
る作用を有し、かつ両者の反応系を妨害しない性質を兼
ね備えている。両物質を含有する兼用前処理剤は、この
一つの前処理剤による検体の処理で各々の反応系での測
定が可能なものである。
【００２７】本発明の兼用前処理剤は、該２成分の他に
所定の成分を追加することにより、更に測定精度を向上
させることができる。例えば、そのような成分として
は、アミノあるいはイミノ化合物、ビシン〔化学名：
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；グッ
ドの緩衝剤の一種〕等が挙げられる。アミノあるいはイ
ミノ化合物としては、アミノ酸、イミノ酸、ポリアミノ
酸、ポリエチレンイミン、アミノ基を有する核酸塩基ま
たはこれらの塩が挙げられる。具体的には、ヒスタミン
二塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン二塩酸塩、ポリ−Ｌ−ヒスチ
ジン塩酸塩（分子量１５，０００〜５０，０００）、ポ
リ−Ｌ−リジン塩酸塩（分子量２，０００〜７０，００
０）、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（分子量５，０００
〜１５０，０００）、ポリエチレンイミン（分子量１，
０００〜７０，０００）、アデニン塩酸塩、シトシン塩
酸塩等が例示される。
所定の成分を追加することにより、更に測定精度を向上
させることができる。例えば、そのような成分として
は、アミノあるいはイミノ化合物、ビシン〔化学名：
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン；グッ
ドの緩衝剤の一種〕等が挙げられる。アミノあるいはイ
ミノ化合物としては、アミノ酸、イミノ酸、ポリアミノ
酸、ポリエチレンイミン、アミノ基を有する核酸塩基ま
たはこれらの塩が挙げられる。具体的には、ヒスタミン
二塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン二塩酸塩、ポリ−Ｌ−ヒスチ
ジン塩酸塩（分子量１５，０００〜５０，０００）、ポ
リ−Ｌ−リジン塩酸塩（分子量２，０００〜７０，００
０）、ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（分子量５，０００
〜１５０，０００）、ポリエチレンイミン（分子量１，
０００〜７０，０００）、アデニン塩酸塩、シトシン塩
酸塩等が例示される。
【００２８】これらアミノあるいはイミノ化合物は、前
処理剤に中に０．０３〜０．３％（重量／容量）の範囲
で含まれるように使用される。また、ビシンは、前処理
剤中に０．００５〜０．０５モル／l 、好ましくは０．
０２〜０．０５モル／l の範囲で含まれるように使用さ
れる。また、本発明の兼用前処理剤は、エンドトキシン
測定用の専用前処理剤および／またはβ−グルカン測定
用の専用前処理剤を調製するための中間試薬として利用
することもできる。
処理剤に中に０．０３〜０．３％（重量／容量）の範囲
で含まれるように使用される。また、ビシンは、前処理
剤中に０．００５〜０．０５モル／l 、好ましくは０．
０２〜０．０５モル／l の範囲で含まれるように使用さ
れる。また、本発明の兼用前処理剤は、エンドトキシン
測定用の専用前処理剤および／またはβ−グルカン測定
用の専用前処理剤を調製するための中間試薬として利用
することもできる。
【００２９】エンドトキシン測定用前処理剤は、組成成
分として前記兼用前処理剤の組成成分に非イオン性界面
活性剤もしくは陰イオン界面活性剤、およびアルカリ土
類金属ハロゲン化物を少なくとも追加した構成である。
ここで、非イオン性界面活性剤としては、特に制限はな
いが、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチ
レンソルビタンアルキルエステル類およびｎ−アルキル
グルコピラノシド類等が挙げられる。
分として前記兼用前処理剤の組成成分に非イオン性界面
活性剤もしくは陰イオン界面活性剤、およびアルカリ土
類金属ハロゲン化物を少なくとも追加した構成である。
ここで、非イオン性界面活性剤としては、特に制限はな
いが、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチ
レンソルビタンアルキルエステル類およびｎ−アルキル
グルコピラノシド類等が挙げられる。
【００３０】ポリオキシエチレンエーテル類としては、
ポリオキシエチレン−ｐ−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、
ポリオキシエチレン−４−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）シクロヘキシルエーテル（重合度８〜４
０）、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテ
ル（重合度９〜１５）、ポリオキシエチレンヘプタメチ
ルヘキシルエーテル（重合度１０〜２０）、ポリオキシ
エチレンドデシルエーテル（重合度１０〜２９）等が挙
げられ、市販品としてはトリトン系（Triton series）
界面活性剤、ブリジ系（Brij series）界面活性剤等が
包含される。
ポリオキシエチレン−ｐ−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、
ポリオキシエチレン−４−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）シクロヘキシルエーテル（重合度８〜４
０）、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテ
ル（重合度９〜１５）、ポリオキシエチレンヘプタメチ
ルヘキシルエーテル（重合度１０〜２０）、ポリオキシ
エチレンドデシルエーテル（重合度１０〜２９）等が挙
げられ、市販品としてはトリトン系（Triton series）
界面活性剤、ブリジ系（Brij series）界面活性剤等が
包含される。
【００３１】ｎ−アルキルグルコピラノシド類として
は、ｎ−ヘプチル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノ
シド、ｎ−オクチル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｎ−ノニル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｎ−デシル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラ
ノシド、又はｎ−ドデシル−（α−又はβ−）Ｄ−グル
コピラノシド等が挙げられる。
は、ｎ−ヘプチル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノ
シド、ｎ−オクチル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｎ−ノニル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラ
ノシド、ｎ−デシル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラ
ノシド、又はｎ−ドデシル−（α−又はβ−）Ｄ−グル
コピラノシド等が挙げられる。
【００３２】ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエ
ステル類としては、ポリオキシエチレンソルビタン（重
合度約２０）のモノラウレート、モノパルミテート、モ
ノステアレート、モノオレエート又はトリオレエート等
が挙げられ、市販品としてはトウィーン系（Tween seri
es）界面活性剤が包含される。トリトン系界面活性剤と
しては、トリトン（Triton）Ｘ−１００、Ｘ−１１４、
Ｘ−１０２、Ｘ−１６５、Ｘ−３０５、Ｘ−４０５、ノ
ニデット（Nonidet）Ｐ−４０等が例示される。ブリジ
系界面活性剤としては、ブリジ（Brij）３５，５８、エ
マルゲン（Emulgen）１２０等が例示される。トウィー
ン系界面活性剤としてはトウィーン（Tween）２０，４
０，６０，８０，８５が例示される。
ステル類としては、ポリオキシエチレンソルビタン（重
合度約２０）のモノラウレート、モノパルミテート、モ
ノステアレート、モノオレエート又はトリオレエート等
が挙げられ、市販品としてはトウィーン系（Tween seri
es）界面活性剤が包含される。トリトン系界面活性剤と
しては、トリトン（Triton）Ｘ−１００、Ｘ−１１４、
Ｘ−１０２、Ｘ−１６５、Ｘ−３０５、Ｘ−４０５、ノ
ニデット（Nonidet）Ｐ−４０等が例示される。ブリジ
系界面活性剤としては、ブリジ（Brij）３５，５８、エ
マルゲン（Emulgen）１２０等が例示される。トウィー
ン系界面活性剤としてはトウィーン（Tween）２０，４
０，６０，８０，８５が例示される。
【００３３】陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫
酸塩等のアルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸
塩が挙げられる。ドデシル硫酸塩としては、具体的には
ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデ
シル硫酸カルシウム等を例示できる。アルカリ土類金属
ハロゲン化物としては、塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム、塩化ストロンチウム等が挙げられる。
酸塩等のアルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸
塩が挙げられる。ドデシル硫酸塩としては、具体的には
ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデ
シル硫酸カルシウム等を例示できる。アルカリ土類金属
ハロゲン化物としては、塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム、塩化ストロンチウム等が挙げられる。
【００３４】このエンドトキシン測定用前処理剤におけ
るヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物
の配合割合は、前記兼用前処理剤とほぼ同じ範囲で調整
でき、界面活性剤は、前処理剤中に０．０４〜０．４％
（重量／容量）の範囲で使用され、アルカリ土類金属ハ
ロゲン化物は、前処理剤中に０．００５〜０．０５モル
／l の範囲で使用される。
るヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物
の配合割合は、前記兼用前処理剤とほぼ同じ範囲で調整
でき、界面活性剤は、前処理剤中に０．０４〜０．４％
（重量／容量）の範囲で使用され、アルカリ土類金属ハ
ロゲン化物は、前処理剤中に０．００５〜０．０５モル
／l の範囲で使用される。
【００３５】また、本発明のエンドトキシン測定用前処
理剤は、組成成分として、さらに所望の成分を追加する
ことができ、例えば、前記したアミノまたはイミノ化合
物、ビシン等を前記兼用前処理剤と同じ程度の範囲で使
用することもできる。本発明のβ−グルカン測定用前処
理剤Ａは、組成成分として前記兼用前処理剤の組成成分
にアルカリ金属ハロゲン化物を少なくとも追加した構成
である。
理剤は、組成成分として、さらに所望の成分を追加する
ことができ、例えば、前記したアミノまたはイミノ化合
物、ビシン等を前記兼用前処理剤と同じ程度の範囲で使
用することもできる。本発明のβ−グルカン測定用前処
理剤Ａは、組成成分として前記兼用前処理剤の組成成分
にアルカリ金属ハロゲン化物を少なくとも追加した構成
である。
【００３６】ここで、アルカリ金属ハロゲン化物として
は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等が
例示される。このアルカリ金属ハロゲン化物は、β−グ
ルカンの血液成分への吸着抑制作用を有するものと考え
られる。本発明のβ−グルカン測定用前処理剤Ａにおけ
るヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物
の配合割合は、前記兼用前処理剤とほぼ同じ範囲で調整
でき、アルカリ金属ハロゲン化物は、前処理剤中に０．
０５〜０．５モル／l の範囲で使用される。
は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等が
例示される。このアルカリ金属ハロゲン化物は、β−グ
ルカンの血液成分への吸着抑制作用を有するものと考え
られる。本発明のβ−グルカン測定用前処理剤Ａにおけ
るヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸化物
の配合割合は、前記兼用前処理剤とほぼ同じ範囲で調整
でき、アルカリ金属ハロゲン化物は、前処理剤中に０．
０５〜０．５モル／l の範囲で使用される。
【００３７】また、本発明のβ−グルカン測定用前処理
剤Ａは、組成成分として、さらに所望の成分を追加する
ことができ、例えば、前記したアミノまたはイミノ化合
物、ビシン等を前記兼用前処理剤と同じ程度の範囲で使
用することもできる。また、本発明は、前記アルカリ金
属水酸化物を主成分とするβ−グルカン測定用前処理剤
Ｂをも提供する。この前処理剤Ｂには必要に応じて他の
添加物が添加されていてもよい。このような添加物とし
ては、例えば、β−グルカンが血液成分に吸着されてＧ
因子系カスケード反応を抑制するのを防いだり、反応系
を安定化したり、再現性を高める作用を有する物質が挙
げられる。例えば、アルカリ金属ハロゲン化物等が好適
に例示される。
剤Ａは、組成成分として、さらに所望の成分を追加する
ことができ、例えば、前記したアミノまたはイミノ化合
物、ビシン等を前記兼用前処理剤と同じ程度の範囲で使
用することもできる。また、本発明は、前記アルカリ金
属水酸化物を主成分とするβ−グルカン測定用前処理剤
Ｂをも提供する。この前処理剤Ｂには必要に応じて他の
添加物が添加されていてもよい。このような添加物とし
ては、例えば、β−グルカンが血液成分に吸着されてＧ
因子系カスケード反応を抑制するのを防いだり、反応系
を安定化したり、再現性を高める作用を有する物質が挙
げられる。例えば、アルカリ金属ハロゲン化物等が好適
に例示される。
【００３８】上記前処理剤を用いた試料の処理は、基本
的には試料に添加混合し、加温することにより行うこと
ができる。そして、所望により攪拌、あるいは振動等を
与えながら加温することもできる。この際の処理温度
は、前処理後に適用される生化学反応、あるいは試料の
種類により適宜、選定され、通常、２５〜７０℃、特に
３７〜５６℃の範囲が好ましく、処理時間は５〜４０
分、特に５〜２０分の範囲が好ましい。
的には試料に添加混合し、加温することにより行うこと
ができる。そして、所望により攪拌、あるいは振動等を
与えながら加温することもできる。この際の処理温度
は、前処理後に適用される生化学反応、あるいは試料の
種類により適宜、選定され、通常、２５〜７０℃、特に
３７〜５６℃の範囲が好ましく、処理時間は５〜４０
分、特に５〜２０分の範囲が好ましい。
【００３９】リムルス反応を利用して試料中のリムルス
試薬に特異的に反応する物質、即ち、エンドトキシンま
たはβ−グルカンを測定する方法は、本発明の前処理剤
で処理された試料をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートから得られたリムルス試薬と混合して反応させ、基
質の変化を検出することにより行うことができる。この
場合、エンドトキシンを測定する場合は、前記兼用前処
理剤またはエンドトキシン測定用前処理剤で処理した試
料を、少なくともエンドトキシンと反応するＣ因子系成
分を含有したリムルス試薬と混合、反応させることが必
要であり、好ましくは該リムルス試薬としてエンドトキ
シンのみと特異的に反応するものを選択することが極め
て好ましい。このようなリムルス試薬としては、Ｃ因子
系成分を含有し、Ｇ因子系成分は、除去もしくは阻害さ
れたものが挙げられる。
試薬に特異的に反応する物質、即ち、エンドトキシンま
たはβ−グルカンを測定する方法は、本発明の前処理剤
で処理された試料をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートから得られたリムルス試薬と混合して反応させ、基
質の変化を検出することにより行うことができる。この
場合、エンドトキシンを測定する場合は、前記兼用前処
理剤またはエンドトキシン測定用前処理剤で処理した試
料を、少なくともエンドトキシンと反応するＣ因子系成
分を含有したリムルス試薬と混合、反応させることが必
要であり、好ましくは該リムルス試薬としてエンドトキ
シンのみと特異的に反応するものを選択することが極め
て好ましい。このようなリムルス試薬としては、Ｃ因子
系成分を含有し、Ｇ因子系成分は、除去もしくは阻害さ
れたものが挙げられる。
【００４０】尚、ここで兼用前処理剤とエンドトキシン
測定用前処理剤は、場合により混合して使用することも
できる。また、β−グルカンを測定する場合は、前記兼
用前処理剤またはβ−グルカン測定用前処理剤Ａもしく
はＢ（尚、これら３種の前処理剤は適宜組み合わせて混
合して用いてもよい）で処理した試料を、少なくともβ
−グルカンと反応するＧ因子系成分を含有したリムルス
試薬と混合、反応させることが必要であり、該リムルス
試薬としてβ−グルカンのみと特異的に反応するものを
選択することが極めて好ましい。このようなリムルス試
薬としては、Ｇ因子系成分を含有有し、Ｃ因子系成分
は、除去もしくは阻害されたものが挙げられる。
測定用前処理剤は、場合により混合して使用することも
できる。また、β−グルカンを測定する場合は、前記兼
用前処理剤またはβ−グルカン測定用前処理剤Ａもしく
はＢ（尚、これら３種の前処理剤は適宜組み合わせて混
合して用いてもよい）で処理した試料を、少なくともβ
−グルカンと反応するＧ因子系成分を含有したリムルス
試薬と混合、反応させることが必要であり、該リムルス
試薬としてβ−グルカンのみと特異的に反応するものを
選択することが極めて好ましい。このようなリムルス試
薬としては、Ｇ因子系成分を含有有し、Ｃ因子系成分
は、除去もしくは阻害されたものが挙げられる。
【００４１】従って、エンドトキシンまたはβ−グルカ
ンを測定する際の反応混合液は、Ｇ因子系またはＣ因子
系の至適ｐＨ付近に調整されることが好ましく、通常ｐ
Ｈ７〜９になるように従来公知の緩衝液により所望に調
整される。なお、本発明の前処理で失活した偽陽性因
子、偽陰性因子は、後述の実施例等から活性が再生する
ことはないことが判明している。また、逆に、該前処理
剤で処理された比較的高濃度の塩基性物質を含む被検液
とＧ因子系成分またはＣ因子系成分を含有するリムルス
試薬との混合において、該前処理剤が該Ｇ因子系または
Ｃ因子系中の各成分の反応性に悪影響を与えることがな
いのも該緩衝作用によるものであると考えられる。
ンを測定する際の反応混合液は、Ｇ因子系またはＣ因子
系の至適ｐＨ付近に調整されることが好ましく、通常ｐ
Ｈ７〜９になるように従来公知の緩衝液により所望に調
整される。なお、本発明の前処理で失活した偽陽性因
子、偽陰性因子は、後述の実施例等から活性が再生する
ことはないことが判明している。また、逆に、該前処理
剤で処理された比較的高濃度の塩基性物質を含む被検液
とＧ因子系成分またはＣ因子系成分を含有するリムルス
試薬との混合において、該前処理剤が該Ｇ因子系または
Ｃ因子系中の各成分の反応性に悪影響を与えることがな
いのも該緩衝作用によるものであると考えられる。
【００４２】該反応混合液において、上記被検液のβ−
グルカンまたはエンドトキシンを測定するには、前述し
たように図１のライセートのＧ因子系カスケード反応ま
たはＣ因子系カスケード反応によって活性化されて生成
するクロッティングエンザイムの、基質に対するアミダ
ーゼ活性又はプロテアーゼ活性を公知の方法で測定すれ
ばよい。ここで、基質とは、合成のものでも天然のもの
でも任意であり、クロッティングエンザイムによって加
水分解されて容易に検出可能な生成物に導かれ、反応混
合液に酵素反応に基づく変化を生じさせる基質であり、
この変化を定性または定量的に測定できればかまわな
い。
グルカンまたはエンドトキシンを測定するには、前述し
たように図１のライセートのＧ因子系カスケード反応ま
たはＣ因子系カスケード反応によって活性化されて生成
するクロッティングエンザイムの、基質に対するアミダ
ーゼ活性又はプロテアーゼ活性を公知の方法で測定すれ
ばよい。ここで、基質とは、合成のものでも天然のもの
でも任意であり、クロッティングエンザイムによって加
水分解されて容易に検出可能な生成物に導かれ、反応混
合液に酵素反応に基づく変化を生じさせる基質であり、
この変化を定性または定量的に測定できればかまわな
い。
【００４３】例えば、β−グルカンまたはエンドトキシ
ン測定用のライセートと、ペプチド合成基質を含む反応
系を被検液と接触させて反応を行うことによってアミダ
ーゼ活性を測定することができる。このようなペプチド
合成基質としては、上記クロッティングエンザイムの基
質となり得るペプチド（例えば、メトキシカルボニル−
Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；Ｎ末端が
保護されたＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ａｒｇ等の配列からなるペプチド）のＣ末端の
アルギニンのカルボキシル基に発色性残基（例えば、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ア
ニリン、ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチ
ル）アニリン等）、発蛍光性残基（例えば、７−アミノ
メチルクマリン等）、発光性残基あるいはアンモニアな
どがアミド結合により置換したペプチド合成基質が例示
される。すなわち、アミダーゼ活性の測定はクロッティ
ングエンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する
反応生成物（ｐ−ニトロアニリン、アンモニア等）を測
定することによって行うことができる。具体的には、上
記前処理を施した被検液と、ライセートのＧ因子系また
はＣ因子系成分を含む反応系に上記ペプチド合成基質を
共存させて反応（カスケード反応および必要に応じて生
成物の他色素等への変換反応）させ、反応によって生成
する色素、発蛍光物質、発光物質またはアンモニアを、
それぞれ分光光度計（特公昭６３−２６８７１、特公平
３−６６３１９等）、蛍光光度計、化学発光測定装置、
アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４８８６０）等
によって測定するというエンドトキシンの測定に採用さ
れている方法を例示することができる。
ン測定用のライセートと、ペプチド合成基質を含む反応
系を被検液と接触させて反応を行うことによってアミダ
ーゼ活性を測定することができる。このようなペプチド
合成基質としては、上記クロッティングエンザイムの基
質となり得るペプチド（例えば、メトキシカルボニル−
Ｄ−ヘキサヒドロチロシル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；Ｎ末端が
保護されたＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ａｒｇ等の配列からなるペプチド）のＣ末端の
アルギニンのカルボキシル基に発色性残基（例えば、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）ア
ニリン、ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチ
ル）アニリン等）、発蛍光性残基（例えば、７−アミノ
メチルクマリン等）、発光性残基あるいはアンモニアな
どがアミド結合により置換したペプチド合成基質が例示
される。すなわち、アミダーゼ活性の測定はクロッティ
ングエンザイムがこれらの合成基質に作用して生成する
反応生成物（ｐ−ニトロアニリン、アンモニア等）を測
定することによって行うことができる。具体的には、上
記前処理を施した被検液と、ライセートのＧ因子系また
はＣ因子系成分を含む反応系に上記ペプチド合成基質を
共存させて反応（カスケード反応および必要に応じて生
成物の他色素等への変換反応）させ、反応によって生成
する色素、発蛍光物質、発光物質またはアンモニアを、
それぞれ分光光度計（特公昭６３−２６８７１、特公平
３−６６３１９等）、蛍光光度計、化学発光測定装置、
アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４８８６０）等
によって測定するというエンドトキシンの測定に採用さ
れている方法を例示することができる。
【００４４】特に、本発明の前処理剤は、マイクロプレ
ート中で該前処理剤で前処理を行い、引き続いてリムル
ス反応等の生化学反応を行う測定に有効に使用される。
特にカイネティック法における２波長同時測光による測
定に好適に使用できるので、迅速、的確な所望物質の測
定が可能である。
ート中で該前処理剤で前処理を行い、引き続いてリムル
ス反応等の生化学反応を行う測定に有効に使用される。
特にカイネティック法における２波長同時測光による測
定に好適に使用できるので、迅速、的確な所望物質の測
定が可能である。
【００４５】一方、クロッティングエンザイムのプロテ
アーゼ活性の測定には、例えば、凝固酵素の天然基質で
あるコアギュローゲンを含有するβ−グルカン測定用の
リムルス試薬またはエンドトキシン測定用のリムルス試
薬に、カスケード反応で生成した凝固酵素が作用して生
成するコアギュリンゲル形成反応を、例えば適当な機器
（例えば、濁度測定装置、粘度測定装置等）で測定する
か、または肉眼で判定するエンドトキシンの測定に採用
されている方法（特公平４−１４３１０等）を利用する
ことができる。上記反応に使用されるリムルス試薬とし
ては、前記したようにライセートのＧ因子を特異的に阻
害または吸着、除去した試薬（エンドトキシン用）また
はライセートのＣ因子を特異的に阻害または吸着、除去
した試薬（β−グルカン用）が好適に使用される。これ
らのリムルス試薬には通常コアギュローゲンが含まれて
いるが、もちろん別途添加してもよい。
アーゼ活性の測定には、例えば、凝固酵素の天然基質で
あるコアギュローゲンを含有するβ−グルカン測定用の
リムルス試薬またはエンドトキシン測定用のリムルス試
薬に、カスケード反応で生成した凝固酵素が作用して生
成するコアギュリンゲル形成反応を、例えば適当な機器
（例えば、濁度測定装置、粘度測定装置等）で測定する
か、または肉眼で判定するエンドトキシンの測定に採用
されている方法（特公平４−１４３１０等）を利用する
ことができる。上記反応に使用されるリムルス試薬とし
ては、前記したようにライセートのＧ因子を特異的に阻
害または吸着、除去した試薬（エンドトキシン用）また
はライセートのＣ因子を特異的に阻害または吸着、除去
した試薬（β−グルカン用）が好適に使用される。これ
らのリムルス試薬には通常コアギュローゲンが含まれて
いるが、もちろん別途添加してもよい。
【００４６】本発明によるβ−グルカンの測定法は、真
菌感染症、特に診断が極めて困難な深在性真菌感染症の
早期診断に、また、エンドトキシンの測定は、グラム陰
性菌感染症の早期診断に有用である。真菌感染症の診断
を行うためには、真菌感染症が疑われる患者から採取し
た血液由来試料を本発明の前処理剤で処理した後、β−
グルカンを測定し、血液中のβ−グルカンが一定量（正
常値）を超えたときに患者が真菌感染症に罹患している
と判断することができる。
菌感染症、特に診断が極めて困難な深在性真菌感染症の
早期診断に、また、エンドトキシンの測定は、グラム陰
性菌感染症の早期診断に有用である。真菌感染症の診断
を行うためには、真菌感染症が疑われる患者から採取し
た血液由来試料を本発明の前処理剤で処理した後、β−
グルカンを測定し、血液中のβ−グルカンが一定量（正
常値）を超えたときに患者が真菌感染症に罹患している
と判断することができる。
【００４７】同様にグラム陰性菌の感染症の診断を行う
ためには、該感染症が疑われる患者から採取した血液由
来試料を本発明の前処理剤で処理した後、エンドトキシ
ンを測定し、血液中のエンドトキシンが一定量（正常
値）を超えたときに患者がグラム陰性菌感染症に罹患し
ていると判断することができる。
ためには、該感染症が疑われる患者から採取した血液由
来試料を本発明の前処理剤で処理した後、エンドトキシ
ンを測定し、血液中のエンドトキシンが一定量（正常
値）を超えたときに患者がグラム陰性菌感染症に罹患し
ていると判断することができる。
【００４８】本発明においては、本発明の前記兼用前処
理剤、エンドトキシン測定用前処理剤、β−グルカン測
定用前処理剤ＡまたはＢ等の前処理剤から選択される１
種以上の組合せと、前記エンドトキシン測定用リムルス
試薬、β−グルカン測定用リムルス試薬等の１種以上と
を適宜組み合わせることにより、所望の測定用キットを
構成することができる。
理剤、エンドトキシン測定用前処理剤、β−グルカン測
定用前処理剤ＡまたはＢ等の前処理剤から選択される１
種以上の組合せと、前記エンドトキシン測定用リムルス
試薬、β−グルカン測定用リムルス試薬等の１種以上と
を適宜組み合わせることにより、所望の測定用キットを
構成することができる。
【００４９】本発明のキットは、必要により他の任意の
構成試薬を付加することができる。そのような試薬とし
ては、エンドトキシンまたはβ−グルカンの一定量を含
有する標準試薬、ブランクテスト用蒸留水、反応試薬溶
解・反応用緩衝液等を挙げることができる。該緩衝液と
しては、グッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸）緩衝液等）、トリス−塩酸緩衝液等が例示でき
る。
構成試薬を付加することができる。そのような試薬とし
ては、エンドトキシンまたはβ−グルカンの一定量を含
有する標準試薬、ブランクテスト用蒸留水、反応試薬溶
解・反応用緩衝液等を挙げることができる。該緩衝液と
しては、グッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホ
ン酸）緩衝液等）、トリス−塩酸緩衝液等が例示でき
る。
【００５０】
【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１−１：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のＫＯＨ濃度） 血液１ml当たりヘパリンを５ユニット添加して採血した
健常人の血液２mlを、１５０×ｇ、１０分間遠心分離し
て、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１−１：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のＫＯＨ濃度） 血液１ml当たりヘパリンを５ユニット添加して採血した
健常人の血液２mlを、１５０×ｇ、１０分間遠心分離し
て、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。
【００５１】このＰＲＰ試料１９０μl にブクリョウ菌
(Poria cocos ) 由来のβ−グルカン調製品（パキマ
ン；斉藤ら、Agric.Biol.Chem.,32,1261-1269(1968) の
方法に従って調製）の０. ０１Ｍ水酸化ナトリウム（Ｎ
ａＯＨ）水溶液（１. ０ng／ml）を１０μl 加え、よく
混合した後、その５μl をβ−グルカン・フリーのマイ
クロプレート（トキシペットプレート９６Ｆ、生化学工
業（株）販売、商品名）にとり、０〜１. ０モル／l の
範囲内で選択された水酸化カリウム（ＫＯＨ）水溶液
〔前処理剤〕２０μl を加え（被検液中のＫＯＨ濃度は
０〜０．８モル／l となる）、３７℃で１０分間加温保
持し、これを被検液とした。
(Poria cocos ) 由来のβ−グルカン調製品（パキマ
ン；斉藤ら、Agric.Biol.Chem.,32,1261-1269(1968) の
方法に従って調製）の０. ０１Ｍ水酸化ナトリウム（Ｎ
ａＯＨ）水溶液（１. ０ng／ml）を１０μl 加え、よく
混合した後、その５μl をβ−グルカン・フリーのマイ
クロプレート（トキシペットプレート９６Ｆ、生化学工
業（株）販売、商品名）にとり、０〜１. ０モル／l の
範囲内で選択された水酸化カリウム（ＫＯＨ）水溶液
〔前処理剤〕２０μl を加え（被検液中のＫＯＨ濃度は
０〜０．８モル／l となる）、３７℃で１０分間加温保
持し、これを被検液とした。
【００５２】被検液に存在するβ−グルカンの量は、以
下の方法で定量した。Obayashi, T.et al. （Clin. Chi
m. Acta, １４９，５５−６５（１９８５））の方法に
したがってカブトガニ・アメボサイト・ライセートから
調製したＧ因子系成分と発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリド））と
を含むβ−グルカン測定用発色合成基質法試薬凍結乾燥
品（以下「Ｇテスト」という）を使用し、被検液２５μ
l に０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）
で溶解したＧテスト液５０μl と蒸留水５０μl を加
え、３７℃で３０分間加温して反応させ、次いで０. ０
４％（重量／容量）の亜硝酸ナトリウム（１モル／l 塩
酸容液）５０μl 、０. ３％（重量／容量）スルファミ
ン酸アンモニウム５０μl ならびに０. ０７％（重量／
容量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１
４％（重量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリドン溶液）
５０μl を順次加えてジアゾカップリングし、マイクロ
プレートリーダーにより６３０nmを対照波長として５４
５nmで吸光度を測定（５４５−６３０nm）することによ
って定量した。
下の方法で定量した。Obayashi, T.et al. （Clin. Chi
m. Acta, １４９，５５−６５（１９８５））の方法に
したがってカブトガニ・アメボサイト・ライセートから
調製したＧ因子系成分と発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（ｐ−ニトロアニリド））と
を含むβ−グルカン測定用発色合成基質法試薬凍結乾燥
品（以下「Ｇテスト」という）を使用し、被検液２５μ
l に０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）
で溶解したＧテスト液５０μl と蒸留水５０μl を加
え、３７℃で３０分間加温して反応させ、次いで０. ０
４％（重量／容量）の亜硝酸ナトリウム（１モル／l 塩
酸容液）５０μl 、０. ３％（重量／容量）スルファミ
ン酸アンモニウム５０μl ならびに０. ０７％（重量／
容量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１
４％（重量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリドン溶液）
５０μl を順次加えてジアゾカップリングし、マイクロ
プレートリーダーにより６３０nmを対照波長として５４
５nmで吸光度を測定（５４５−６３０nm）することによ
って定量した。
【００５３】表１に前処理剤溶液のＫＯＨ濃度を種々変
化させて被検液中のＫＯＨ濃度を種々調整した場合のβ
−グルカン添加回収率を、同一条件で前処理されたβ−
グルカン無添加のＰＲＰについての測定結果（吸光度）
とともに示す。
化させて被検液中のＫＯＨ濃度を種々調整した場合のβ
−グルカン添加回収率を、同一条件で前処理されたβ−
グルカン無添加のＰＲＰについての測定結果（吸光度）
とともに示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】なお、表１中、ＫＯＨ濃度（モル／l ）は
ＰＲＰを処理するときの被検液における濃度を示し、β
−グルカン無添加被検液の吸光度は、β−グルカン無添
加前処理ＰＲＰについての５４５−６３０nm測定の吸光
度を示す。β−グルカン添加回収率は、β−グルカンを
添加した被検液（β−グルカン添加前処理ＰＲＰ）の回
収率を、対照の測定値を１００％とした場合の百分率と
して示す。該対照は、ＰＲＰの代わりに注射用生理食塩
水を用い、前処理剤の代わりに注射用蒸留水を使用し、
β−グルカンを添加したものと無添加について測定した
値を基準とする。
ＰＲＰを処理するときの被検液における濃度を示し、β
−グルカン無添加被検液の吸光度は、β−グルカン無添
加前処理ＰＲＰについての５４５−６３０nm測定の吸光
度を示す。β−グルカン添加回収率は、β−グルカンを
添加した被検液（β−グルカン添加前処理ＰＲＰ）の回
収率を、対照の測定値を１００％とした場合の百分率と
して示す。該対照は、ＰＲＰの代わりに注射用生理食塩
水を用い、前処理剤の代わりに注射用蒸留水を使用し、
β−グルカンを添加したものと無添加について測定した
値を基準とする。
【００５６】表１によれば、注射用蒸留水のみによる処
理では、β−グルカンは全く検出されず、被検液のＫＯ
Ｈの濃度を増やして行くと回収率が著しく増加すること
が判る。また、ＫＯＨの濃度が０. ６モル／l を超える
か、０. ０３モル／l より低濃度ではβ−グルカンの回
収率が低下するが、０. ０４〜０. ４モル／l 程度の濃
度となるように使用すれば、Ｇ因子系反応の偽陽性因子
ならびに阻害因子（偽陰性因子）の影響を無くすことが
でき、ＰＲＰ中のβ−グルカンの真の値を正確かつ高い
信頼度を以て再現性よく検出することが可能であること
が明らかである。
理では、β−グルカンは全く検出されず、被検液のＫＯ
Ｈの濃度を増やして行くと回収率が著しく増加すること
が判る。また、ＫＯＨの濃度が０. ６モル／l を超える
か、０. ０３モル／l より低濃度ではβ−グルカンの回
収率が低下するが、０. ０４〜０. ４モル／l 程度の濃
度となるように使用すれば、Ｇ因子系反応の偽陽性因子
ならびに阻害因子（偽陰性因子）の影響を無くすことが
でき、ＰＲＰ中のβ−グルカンの真の値を正確かつ高い
信頼度を以て再現性よく検出することが可能であること
が明らかである。
【００５７】すなわち、β−グルカン無添加前処理ＰＲ
Ｐの吸光度が、β−グルカン無添加の対照のそれと同値
であるような場合、ＰＲＰ中のＧ因子系反応偽陽性因子
が完全に変性されたことを示し、また、β−グルカンを
添加して測定した実施例（β−グルカン添加前処理ＰＲ
Ｐ）におけるβ−グルカンの回収率が１００％である場
合にＰＲＰ中のＧ因子系反応阻害因子（偽陰性因子）が
完全に変性されていることを意味する。従って、これら
の反応妨害因子を同時に変性失活させることができる条
件、つまり、β−グルカン無添加前処理ＰＲＰの測定値
が対照とほぼ同値で、かつβ−グルカン添加前処理ＰＲ
Ｐのβ−グルカン添加回収率がほぼ１００％となる条件
が理想的である。
Ｐの吸光度が、β−グルカン無添加の対照のそれと同値
であるような場合、ＰＲＰ中のＧ因子系反応偽陽性因子
が完全に変性されたことを示し、また、β−グルカンを
添加して測定した実施例（β−グルカン添加前処理ＰＲ
Ｐ）におけるβ−グルカンの回収率が１００％である場
合にＰＲＰ中のＧ因子系反応阻害因子（偽陰性因子）が
完全に変性されていることを意味する。従って、これら
の反応妨害因子を同時に変性失活させることができる条
件、つまり、β−グルカン無添加前処理ＰＲＰの測定値
が対照とほぼ同値で、かつβ−グルカン添加前処理ＰＲ
Ｐのβ−グルカン添加回収率がほぼ１００％となる条件
が理想的である。
【００５８】表１の結果から被検液のＫＯＨ濃度が０.
０４〜０. ４モル／l であるときが上記の理想的条件を
満足する条件であることが示された。 実施例１−２：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のＮａＯＨ濃度） 実施例１−１と同様の手段により調製したＰＲＰ試料１
９０μl に実施例１−１と同じβ−グルカン調製品（パ
キマン）の０. ０１Ｍ ＮａＯＨ水溶液 (１.０ng／ml)
を１０μl 加え（被検液中のＮａＯＨ濃度は、０〜
０．８モル／l となる）、よく混合した後、その５μl
をトキシペットプレート９６Ｆにとり、０〜０. ８モル
／l の範囲内で選択されたＮａＯＨ水溶液〔前処理剤〕
２０μl を加え、３７℃で１０分間保持加温し、これを
被検液とした。
０４〜０. ４モル／l であるときが上記の理想的条件を
満足する条件であることが示された。 実施例１−２：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のＮａＯＨ濃度） 実施例１−１と同様の手段により調製したＰＲＰ試料１
９０μl に実施例１−１と同じβ−グルカン調製品（パ
キマン）の０. ０１Ｍ ＮａＯＨ水溶液 (１.０ng／ml)
を１０μl 加え（被検液中のＮａＯＨ濃度は、０〜
０．８モル／l となる）、よく混合した後、その５μl
をトキシペットプレート９６Ｆにとり、０〜０. ８モル
／l の範囲内で選択されたＮａＯＨ水溶液〔前処理剤〕
２０μl を加え、３７℃で１０分間保持加温し、これを
被検液とした。
【００５９】被検液に存在するβ−グルカンの量は、Ｇ
テストを使用し、実施例１−１と同様にして測定した。
表２にＮａＯＨ濃度を種々変化させた場合のβ−グルカ
ン添加回収率を、同一条件で前処理されたβ−グルカン
無添加のＰＲＰについての測定結果（吸光度）とともに
示す。
テストを使用し、実施例１−１と同様にして測定した。
表２にＮａＯＨ濃度を種々変化させた場合のβ−グルカ
ン添加回収率を、同一条件で前処理されたβ−グルカン
無添加のＰＲＰについての測定結果（吸光度）とともに
示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】なお、表２中、ＮａＯＨ濃度（モル／l ）
はＰＲＰを処理するときの被検液における濃度を示し、
β−グルカン無添加被検液の吸光度は、β−グルカン無
添加前処理ＰＲＰについての５４５−６３０nm測定の吸
光度を示し、β−グルカン添加回収率は、β−グルカン
を添加した被検液（β−グルカン添加前処理ＰＲＰ）の
回収率を、対照の測定値を１００％とした場合の百分率
として示す。該対照は、ＰＲＰの代わりに注射用生理食
塩水を用い、前処理剤の代わりに注射用蒸留水を使用
し、β−グルカンを添加したものと無添加について測定
した値を基準とする。
はＰＲＰを処理するときの被検液における濃度を示し、
β−グルカン無添加被検液の吸光度は、β−グルカン無
添加前処理ＰＲＰについての５４５−６３０nm測定の吸
光度を示し、β−グルカン添加回収率は、β−グルカン
を添加した被検液（β−グルカン添加前処理ＰＲＰ）の
回収率を、対照の測定値を１００％とした場合の百分率
として示す。該対照は、ＰＲＰの代わりに注射用生理食
塩水を用い、前処理剤の代わりに注射用蒸留水を使用
し、β−グルカンを添加したものと無添加について測定
した値を基準とする。
【００６２】表２によれば、注射用蒸留水のみによる処
理では、β−グルカンは全く検出されず、被検液中のＮ
ａＯＨの濃度を増やして行くと回収率が著しく増加する
ことが判る。表２の結果から、実施例１−１のＫＯＨ水
溶液を前処理剤として使用した場合と同様に、被検液中
のＮａＯＨ濃度が０. ０４〜０. ４モル／l となるよう
なＮａＯＨ水溶液を前処理剤として使用したときに、Ｐ
ＲＰ中の偽陽性因子及び偽陰性因子の影響を除去できる
ことが判った。
理では、β−グルカンは全く検出されず、被検液中のＮ
ａＯＨの濃度を増やして行くと回収率が著しく増加する
ことが判る。表２の結果から、実施例１−１のＫＯＨ水
溶液を前処理剤として使用した場合と同様に、被検液中
のＮａＯＨ濃度が０. ０４〜０. ４モル／l となるよう
なＮａＯＨ水溶液を前処理剤として使用したときに、Ｐ
ＲＰ中の偽陽性因子及び偽陰性因子の影響を除去できる
ことが判った。
【００６３】実施例１−３：血清へのβ−グルカン添加
回収試験（処理時間） 抗凝固剤を入れないで採血した健常人の血液３mlを４℃
に１時間静置した後、１，０００×ｇ、１０分間遠心分
離して血清を得た。この血清試料１９０μl に１０pgの
実施例１と同じβ−グルカン調製品（パキマン）を含有
する水溶液１０μl を添加した後、その５μl をトキシ
ペットプレート９６Ｆにとり、０. １モル／l のＫＯＨ
水溶液〔前処理剤〕２０μl を加え、３７℃において所
定の時間加温保持し、これを被検液とした。
回収試験（処理時間） 抗凝固剤を入れないで採血した健常人の血液３mlを４℃
に１時間静置した後、１，０００×ｇ、１０分間遠心分
離して血清を得た。この血清試料１９０μl に１０pgの
実施例１と同じβ−グルカン調製品（パキマン）を含有
する水溶液１０μl を添加した後、その５μl をトキシ
ペットプレート９６Ｆにとり、０. １モル／l のＫＯＨ
水溶液〔前処理剤〕２０μl を加え、３７℃において所
定の時間加温保持し、これを被検液とした。
【００６４】そして、上記被検液に添加されたβ−グル
カンを実施例１の場合と同様の手段により測定した。各
加温時間についての測定結果を実施例１−１の場合と同
様に表３として示す。
カンを実施例１の場合と同様の手段により測定した。各
加温時間についての測定結果を実施例１−１の場合と同
様に表３として示す。
【００６５】
【表３】
【００６６】表３によると、加温時間０すなわち、該前
処理剤を添加した後、直ちに被検液とした場合にはβ−
グルカンの回収率は非常に低い。これに対して５分〜４
０分の加温時間を経たものを使用すれば血清に添加した
β−グルカンを定量的に検出することができた。すなわ
ち、このような条件で前処理した際には偽陽性因子及び
阻害因子を変性することができ、血清中のβ−グルカン
の真の値を正確かつ高い信頼度を以て再現性よく検出す
ることが可能であることが明らかである。
処理剤を添加した後、直ちに被検液とした場合にはβ−
グルカンの回収率は非常に低い。これに対して５分〜４
０分の加温時間を経たものを使用すれば血清に添加した
β−グルカンを定量的に検出することができた。すなわ
ち、このような条件で前処理した際には偽陽性因子及び
阻害因子を変性することができ、血清中のβ−グルカン
の真の値を正確かつ高い信頼度を以て再現性よく検出す
ることが可能であることが明らかである。
【００６７】実施例１−４：ＰＰＰへのβ−グルカン添
加回収試験（前処理温度） 血液１ml当たりヘパリンを５ユニット添加して採血した
健常人の血液２mlを１，０００×ｇ、１０分間遠心分離
して、貧血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。このＰＰＰ試料
１９０μl に４０pgのアルカリゲネス・フェカリス・バ
ール・ミキソゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅ
ｃａｌｉｓ ｖａｒ． ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ
１３１４０由来のβ−グルカン（カードラン；和光純薬
工業（株）販売）を含有する０. ０１モル／l ＮａＯ
Ｈ水溶液１０μl を添加した後、その５μl をトキシペ
ットプレート９６Ｆにとり、０. １モル／l ＫＯＨ溶液
２０μl を加え、所定の温度において１０分間加温保持
し、これを被検液とした。
加回収試験（前処理温度） 血液１ml当たりヘパリンを５ユニット添加して採血した
健常人の血液２mlを１，０００×ｇ、１０分間遠心分離
して、貧血小板血漿（ＰＰＰ）を得た。このＰＰＰ試料
１９０μl に４０pgのアルカリゲネス・フェカリス・バ
ール・ミキソゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅ
ｃａｌｉｓ ｖａｒ． ｍｙｘｏｇｅｎｅｓ）ＩＦＯ
１３１４０由来のβ−グルカン（カードラン；和光純薬
工業（株）販売）を含有する０. ０１モル／l ＮａＯ
Ｈ水溶液１０μl を添加した後、その５μl をトキシペ
ットプレート９６Ｆにとり、０. １モル／l ＫＯＨ溶液
２０μl を加え、所定の温度において１０分間加温保持
し、これを被検液とした。
【００６８】そして、上記被検液に添加されたβ−グル
カンを実施例１−１の場合と同様の手段により測定し
た。各加温温度についての測定結果を実施例１−１の場
合と同様に表４として示す。
カンを実施例１−１の場合と同様の手段により測定し
た。各加温温度についての測定結果を実施例１−１の場
合と同様に表４として示す。
【００６９】
【表４】
【００７０】表４によれば、処理温度が４℃の場合には
β−グルカンの回収率が低かったが、２５℃以上の温度
で処理すればＰＰＰに添加したβ−グルカンを定量的に
検出することができた。 実施例１−５：真菌感染症患者ＰＲＰ検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例１と同様の
方法で採血し、ＰＲＰ検体を調製した。その５μl をト
キシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
０. １モル／l ＮａＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を
加え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とした。以
後実施例１−１と同様の手段によりＧテストと反応さ
せ、吸光度を測定した。実施例１−４と同じ既知量のカ
ードランを標準試薬として用い、別に作成した検量線よ
り上記被検液中のβ−グルカン含量を換算した結果を表
５に示す。
β−グルカンの回収率が低かったが、２５℃以上の温度
で処理すればＰＰＰに添加したβ−グルカンを定量的に
検出することができた。 実施例１−５：真菌感染症患者ＰＲＰ検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例１と同様の
方法で採血し、ＰＲＰ検体を調製した。その５μl をト
キシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
０. １モル／l ＮａＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を
加え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とした。以
後実施例１−１と同様の手段によりＧテストと反応さ
せ、吸光度を測定した。実施例１−４と同じ既知量のカ
ードランを標準試薬として用い、別に作成した検量線よ
り上記被検液中のβ−グルカン含量を換算した結果を表
５に示す。
【００７１】
【表５】
【００７２】表５に示したように全例（Ｎｏ. １〜Ｎ
ｏ. ６）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量：０. ２±０. ３ｐｇ／ml）、
そのうちの３例（Ｎｏ. １〜Ｎｏ. ３）については、血
培にて、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびクリプトコッカ
ス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎ
ｅｏｆｏｒｍａｎｓ）をそれぞれ検出し、１例（Ｎｏ.
４）は血培では陰性であったが、死亡後の解剖による組
織病理学的検査によりアスペルギルス・フミガツス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出し
た。残り２例（Ｎｏ. ５、Ｎｏ. ６）については、臨床
症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったに
もかかわらず血培では陰性であったが、抗真菌剤（ミコ
ナゾール）投与により、臨床的に顕著な改善を見たこと
から真菌に感染していたものと考えられる。
ｏ. ６）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量：０. ２±０. ３ｐｇ／ml）、
そのうちの３例（Ｎｏ. １〜Ｎｏ. ３）については、血
培にて、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびクリプトコッカ
ス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎ
ｅｏｆｏｒｍａｎｓ）をそれぞれ検出し、１例（Ｎｏ.
４）は血培では陰性であったが、死亡後の解剖による組
織病理学的検査によりアスペルギルス・フミガツス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）を検出し
た。残り２例（Ｎｏ. ５、Ｎｏ. ６）については、臨床
症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を強く疑ったに
もかかわらず血培では陰性であったが、抗真菌剤（ミコ
ナゾール）投与により、臨床的に顕著な改善を見たこと
から真菌に感染していたものと考えられる。
【００７３】従って、真菌感染症患者のＰＲＰを本発明
の前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定すること
によって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断
がきわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正
確に行うことができた。 実施例１−６：真菌感染症患者血清検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例１−３と同
様の方法で採血し、血清検体を調製した。その５μl を
トキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
０. １モル／l ＫＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を加
え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とした。以後
実施例１と同様の手段によりＧテストと反応させ、吸光
度を測定した。実施例１−４と同じ既知量のカードラン
を標準試薬として用い、別に作成したの検量線より上記
被検液中のβ−グルカン含量を換算した結果を表６に示
す。
の前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定すること
によって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断
がきわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正
確に行うことができた。 実施例１−６：真菌感染症患者血清検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例１−３と同
様の方法で採血し、血清検体を調製した。その５μl を
トキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
０. １モル／l ＫＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を加
え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とした。以後
実施例１と同様の手段によりＧテストと反応させ、吸光
度を測定した。実施例１−４と同じ既知量のカードラン
を標準試薬として用い、別に作成したの検量線より上記
被検液中のβ−グルカン含量を換算した結果を表６に示
す。
【００７４】
【表６】
【００７５】表６に示したように全例（Ｎｏ. １〜Ｎ
ｏ. ５）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量：０. ２±０. ２ｐｇ／ml）、
そのうちの２例（Ｎｏ. １、Ｎｏ. ２）については、血
培にて、カンジダ・グリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｄｉ）およびカンジダ・クルセ
イ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）をそれぞれ検出
し、１例（Ｎｏ. ３）は血培では陰性であったが、死亡
後の解剖による組織病理学的検査によりアスペルギルス
・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａ
ｔｕｓ）を検出した。残り２例（Ｎｏ. ４、Ｎｏ. ５）
については、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感
染を強く疑ったにもかかわらず血培では陰性であった
が、抗真菌剤（アムホテリシンＢ、フルコナゾール）投
与により、臨床的に顕著な改善を見たことから真菌感染
症に感染していたものと考えられる。
ｏ. ５）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量：０. ２±０. ２ｐｇ／ml）、
そのうちの２例（Ｎｏ. １、Ｎｏ. ２）については、血
培にて、カンジダ・グリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｄｉ）およびカンジダ・クルセ
イ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）をそれぞれ検出
し、１例（Ｎｏ. ３）は血培では陰性であったが、死亡
後の解剖による組織病理学的検査によりアスペルギルス
・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａ
ｔｕｓ）を検出した。残り２例（Ｎｏ. ４、Ｎｏ. ５）
については、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感
染を強く疑ったにもかかわらず血培では陰性であった
が、抗真菌剤（アムホテリシンＢ、フルコナゾール）投
与により、臨床的に顕著な改善を見たことから真菌感染
症に感染していたものと考えられる。
【００７６】従って、真菌感染症患者の血清を本発明の
前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定することに
よって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断が
きわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正確
に行うことができた。 実施例１−７：β−グルカン測定用ゲル化法（比濁法）
キット 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用ゲル化法
（比濁法）キット（５０検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 １. ０ml ０. １モル／l ＮａＯＨ水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 リムルス・ポリフェムス由来の市販ライセート（リムル
スＨＳII−テストワコー，和光純薬工業（株）販売）に
１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量７０,０００）
を添加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、多孔性セル
ロースゲル（セルロファインＧＣ−２００ｍ，生化学工
業（株）販売）と混合し、ガラスフィルターで濾過し、
その濾液を凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. １モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 市販カードラン（実施例１−４参照） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） １. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） １. ０ml 実施例１−８：β−グルカン測定用発色合成基質法キッ
ト 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用発色合成
基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml ０. １モル／l ＫＯＨ水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートに１５
％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量４０, ０００）を添
加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、孔径０. ２０μ
m のナイロン膜フィルター（ナルゲンシリンジフィルタ
ー，直径２５mm，ナルジェ社製）を通過させ、通過液を
ＭＳ混液（０. ８Ｍ塩化マグネシウムと６ｍＭ Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとを含む）に添加
し、凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 ブクリョウ菌由来のβ−グルカン調製品（パキマン）
（実施例１−１参照） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） ２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） ２. ０ml
前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定することに
よって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断が
きわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正確
に行うことができた。 実施例１−７：β−グルカン測定用ゲル化法（比濁法）
キット 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用ゲル化法
（比濁法）キット（５０検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 １. ０ml ０. １モル／l ＮａＯＨ水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 リムルス・ポリフェムス由来の市販ライセート（リムル
スＨＳII−テストワコー，和光純薬工業（株）販売）に
１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量７０,０００）
を添加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、多孔性セル
ロースゲル（セルロファインＧＣ−２００ｍ，生化学工
業（株）販売）と混合し、ガラスフィルターで濾過し、
その濾液を凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. １モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 市販カードラン（実施例１−４参照） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） １. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） １. ０ml 実施例１−８：β−グルカン測定用発色合成基質法キッ
ト 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用発色合成
基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml ０. １モル／l ＫＯＨ水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートに１５
％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量４０, ０００）を添
加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、孔径０. ２０μ
m のナイロン膜フィルター（ナルゲンシリンジフィルタ
ー，直径２５mm，ナルジェ社製）を通過させ、通過液を
ＭＳ混液（０. ８Ｍ塩化マグネシウムと６ｍＭ Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとを含む）に添加
し、凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 ブクリョウ菌由来のβ−グルカン調製品（パキマン）
（実施例１−１参照） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） ２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） ２. ０ml
【００７７】実施例２−１：ＰＲＰへのエンドトキシン
添加回収試験（前処理剤のポリブレン濃度） 血液１ml当たりヘパリンを５ユニット添加して採血した
健常人の血液２mlを、１５０×ｇ、１０分間遠心分離し
て、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。
添加回収試験（前処理剤のポリブレン濃度） 血液１ml当たりヘパリンを５ユニット添加して採血した
健常人の血液２mlを、１５０×ｇ、１０分間遠心分離し
て、多血小板血漿（ＰＲＰ）を得た。
【００７８】このＰＲＰ試料１９０μl に大腸菌０１１
１：Ｂ４株由来のエンドトキシン調製品の水溶液（２ｎ
ｇ／ml）１０μl 加え、よく混合した後、その５μl を
反応容器としてエンドトキシン・フリーのマイクロプレ
ート（トキシペットプレート９６Ｆ、生化学工業（株）
販売、商品名）にとり、前処理剤として、０．１モル／
ｌ ＫＯＨ、０．０１モル／ｌ 塩化カルシウム（Ｃａ
Ｃｌ2 ）、０．１％（重量／容量）トリトンＸ−１００
を含有する水溶液に０．０１〜０．５％（重量／容量）
になるようにポリブレンを添加した水溶液の混液（２０
μｌ）を加え、強制エアー循環式マイクロプレートリー
ダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株）販
売、商品名）内で３７℃、１０分間保持した。この被検
液２５μｌにエンドトキシン特異的合成基質法リムルス
テスト試薬（エンドスペシーＥＳ−２００，生化学工業
（株）販売、商品名）１００μｌ（０．１モル／l トリ
ス−塩酸緩衝液、ｐＨ８. ０、５．６mlに溶解）を添加
して、３７℃、３０分間反応させた。４９２ｎｍを対照
とする４０５ｎｍの吸光度を１５秒間隔で２波長測光
し、１分間当たりの吸光度変化率（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）
を算出した（カイネティック法）。ＰＲＰおよび前処理
剤の代わりにＤＷ（蒸留水）を使用したときの測定値を
コントロールとし、ＰＲＰ１ml当たりのエンドトキシン
濃度とエンドトキシン添加回収率を算出した。また、同
時に前処理容器として試験管を用い、ポリブレンを含有
しないほかは上記と同じ組成の前処理剤で３７℃の恒温
水槽中において同様に前処理した被検液２５μｌを試験
管にとり、恒温水槽中で３７℃、３０分間反応させた。
０．０４％（重量／容量）の亜硝酸ナトリウム（１モル
／l 塩酸容液）５０μl 、０. ３％（重量／容量）スル
ファミン酸アンモニウム５０μl ならびに０. ０７％
（重量／容量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩
酸塩（１４％（重量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン溶液）５０μl を順次加えてジアゾカップリングした
後、その全量をマイクロプレートに移し、ウェルリーダ
ーにより、６３０nmを対照として５４５nmで吸光度を測
定し、ＰＲＰ１ml当たりのエンドトキシン濃度と回収率
を算出した（エンドポイント法）。表７に前処理および
反応容器としてマイクロプレートを使用したカイネティ
ック法による、前処理剤のポリブレン濃度を種々変化さ
せた場合のエンドトキシン添加回収率を同一条件で処理
されたエンドトキシン無添加のＰＲＰについての測定結
果（吸光度およびエンドトキシン換算値）と共に示す。
また前処理および反応容器に試験管を使用し、ポリブレ
ンを含有しない前処理剤による結果も同様に示した。
１：Ｂ４株由来のエンドトキシン調製品の水溶液（２ｎ
ｇ／ml）１０μl 加え、よく混合した後、その５μl を
反応容器としてエンドトキシン・フリーのマイクロプレ
ート（トキシペットプレート９６Ｆ、生化学工業（株）
販売、商品名）にとり、前処理剤として、０．１モル／
ｌ ＫＯＨ、０．０１モル／ｌ 塩化カルシウム（Ｃａ
Ｃｌ2 ）、０．１％（重量／容量）トリトンＸ−１００
を含有する水溶液に０．０１〜０．５％（重量／容量）
になるようにポリブレンを添加した水溶液の混液（２０
μｌ）を加え、強制エアー循環式マイクロプレートリー
ダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業（株）販
売、商品名）内で３７℃、１０分間保持した。この被検
液２５μｌにエンドトキシン特異的合成基質法リムルス
テスト試薬（エンドスペシーＥＳ−２００，生化学工業
（株）販売、商品名）１００μｌ（０．１モル／l トリ
ス−塩酸緩衝液、ｐＨ８. ０、５．６mlに溶解）を添加
して、３７℃、３０分間反応させた。４９２ｎｍを対照
とする４０５ｎｍの吸光度を１５秒間隔で２波長測光
し、１分間当たりの吸光度変化率（ｍＡｂｓ／ｍｉｎ）
を算出した（カイネティック法）。ＰＲＰおよび前処理
剤の代わりにＤＷ（蒸留水）を使用したときの測定値を
コントロールとし、ＰＲＰ１ml当たりのエンドトキシン
濃度とエンドトキシン添加回収率を算出した。また、同
時に前処理容器として試験管を用い、ポリブレンを含有
しないほかは上記と同じ組成の前処理剤で３７℃の恒温
水槽中において同様に前処理した被検液２５μｌを試験
管にとり、恒温水槽中で３７℃、３０分間反応させた。
０．０４％（重量／容量）の亜硝酸ナトリウム（１モル
／l 塩酸容液）５０μl 、０. ３％（重量／容量）スル
ファミン酸アンモニウム５０μl ならびに０. ０７％
（重量／容量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩
酸塩（１４％（重量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリド
ン溶液）５０μl を順次加えてジアゾカップリングした
後、その全量をマイクロプレートに移し、ウェルリーダ
ーにより、６３０nmを対照として５４５nmで吸光度を測
定し、ＰＲＰ１ml当たりのエンドトキシン濃度と回収率
を算出した（エンドポイント法）。表７に前処理および
反応容器としてマイクロプレートを使用したカイネティ
ック法による、前処理剤のポリブレン濃度を種々変化さ
せた場合のエンドトキシン添加回収率を同一条件で処理
されたエンドトキシン無添加のＰＲＰについての測定結
果（吸光度およびエンドトキシン換算値）と共に示す。
また前処理および反応容器に試験管を使用し、ポリブレ
ンを含有しない前処理剤による結果も同様に示した。
【００７９】
【表７】
【００８０】表７によれば、エンドトキシン添加回収率
はポリブレン添加の有無によらず、１００％と良好な結
果を与えるが、エンドトキシン無添加での血中エンドト
キシン濃度換算値はポリブレンの濃度により０〜３０ｐ
ｇ／mlと非常に変動が大きい事が分かる。反応容器とし
てマイクロプレートの代わりに試験管を用いたエンドト
ポイント法による測定結果は、０ｐｇ／mlである。マイ
クロプレートを用いたカイネティック法でこのような顕
著な偽陽性反応を生じる原因としては、マイクロプレー
ト内での少液量（すなわち、検体の濃度は逆に高い）に
おいては、その反応時における検体特有の非特異的濁度
の上昇を挙げることができる。その結果として、該濁度
上昇が有意の変化率として計測され、エンドトキシンに
依存する変化率と実質的に区別がつかなくなることによ
るものである。このような非特異的濁度の増加を抑える
添加剤としては、ポリブレンが効果的で、通常前処理剤
中０．０５〜０．３％、より好ましくは０．１〜０．２
％の濃度で使用すれば良い。このような条件下において
は、ＰＲＰ中のエンドトキシンの真の濃度を正確にかつ
迅速に再現性良く検出することが可能であることが明ら
かである。
はポリブレン添加の有無によらず、１００％と良好な結
果を与えるが、エンドトキシン無添加での血中エンドト
キシン濃度換算値はポリブレンの濃度により０〜３０ｐ
ｇ／mlと非常に変動が大きい事が分かる。反応容器とし
てマイクロプレートの代わりに試験管を用いたエンドト
ポイント法による測定結果は、０ｐｇ／mlである。マイ
クロプレートを用いたカイネティック法でこのような顕
著な偽陽性反応を生じる原因としては、マイクロプレー
ト内での少液量（すなわち、検体の濃度は逆に高い）に
おいては、その反応時における検体特有の非特異的濁度
の上昇を挙げることができる。その結果として、該濁度
上昇が有意の変化率として計測され、エンドトキシンに
依存する変化率と実質的に区別がつかなくなることによ
るものである。このような非特異的濁度の増加を抑える
添加剤としては、ポリブレンが効果的で、通常前処理剤
中０．０５〜０．３％、より好ましくは０．１〜０．２
％の濃度で使用すれば良い。このような条件下において
は、ＰＲＰ中のエンドトキシンの真の濃度を正確にかつ
迅速に再現性良く検出することが可能であることが明ら
かである。
【００８１】実施例２−２ グラム陰性菌感染症患者ＰＲＰ検体の測定 対象は、健常人３０例（エンドトキシン含量：２．４２
±２．９ｐｇ／ml）ならびにグラム陰性菌による敗血症
を疑った白血病等の重症血液疾患および感染を合併した
肝、胆道疾患を有する患者の１０例で、それぞれヘパリ
ンを添加して無菌的に採血した血液を、４℃で１５０×
ｇ、１０分間遠心してＰＲＰ検体を得た。その５μｌを
トキシペットプレート９６Ｆにとり、０．１％トリトン
Ｘ−１００、０．１モル／ｌ ＫＯＨ、０．０３モル／
ｌビシン（前処理剤の溶解性を高めるために添加したグ
ッド緩衝剤、（株）同仁化学研究所製造、一般名）、
０．０７％ＥＩＰ（エチレンイミンポリマー）、０．０
１モル／ｌ Ｃａｃｌ2 および０．１％ポリブレンから
なる前処理剤２０μｌを加え、３７℃に１０分間保持
し、被検液とした。
±２．９ｐｇ／ml）ならびにグラム陰性菌による敗血症
を疑った白血病等の重症血液疾患および感染を合併した
肝、胆道疾患を有する患者の１０例で、それぞれヘパリ
ンを添加して無菌的に採血した血液を、４℃で１５０×
ｇ、１０分間遠心してＰＲＰ検体を得た。その５μｌを
トキシペットプレート９６Ｆにとり、０．１％トリトン
Ｘ−１００、０．１モル／ｌ ＫＯＨ、０．０３モル／
ｌビシン（前処理剤の溶解性を高めるために添加したグ
ッド緩衝剤、（株）同仁化学研究所製造、一般名）、
０．０７％ＥＩＰ（エチレンイミンポリマー）、０．０
１モル／ｌ Ｃａｃｌ2 および０．１％ポリブレンから
なる前処理剤２０μｌを加え、３７℃に１０分間保持
し、被検液とした。
【００８２】そして、実施例２−１の場合と同様にカイ
ネティック法により、エンドトキシンを測定した。表８
に本実施例の結果を、別に作成した検量線より求めたエ
ンドトキシン換算量として表した。
ネティック法により、エンドトキシンを測定した。表８
に本実施例の結果を、別に作成した検量線より求めたエ
ンドトキシン換算量として表した。
【００８３】
【表８】
【００８４】表８の患者１〜１０は、血培、白血球数そ
の他の検査成績および発熱等の臨床症状からグラム陰性
菌敗血症の疑い有りと診断された症例であり、本発明方
法においては、全例高濃度のエンドトキシンが検出され
た。なお、上記ＰＲＰの代わりにＰＰＰを検体として使
用しても同様の結果が得られた。通常の検査法では確定
診断が極めて困難なグラム陰性菌敗血症の迅速診断法と
して極めて有力な手法として評価されるものであること
が理解できよう。
の他の検査成績および発熱等の臨床症状からグラム陰性
菌敗血症の疑い有りと診断された症例であり、本発明方
法においては、全例高濃度のエンドトキシンが検出され
た。なお、上記ＰＲＰの代わりにＰＰＰを検体として使
用しても同様の結果が得られた。通常の検査法では確定
診断が極めて困難なグラム陰性菌敗血症の迅速診断法と
して極めて有力な手法として評価されるものであること
が理解できよう。
【００８５】実施例２−３：エンドトキシン測定用発色
合成基質法キット 下記の構成試薬からなる、エンドトキシン測定用発色合
成基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml Ａ液：０．２モル／l ＫＯＨ、０．２％ポリブレン Ｂ液：０．２％トリトンＸ−１００、０．１４％エチレ
ンイミンポリマー、０．０２モル／l ＣａＣｌ2 、０．
０６モル／l ビシン 使用直前にＡ液とＢ液を混合する。 （Ｂ）Ｃ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートからOb
ayashi,T.et al.の方法（前出）に従って調製したＣ因
子系成分と発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ）を含む凍結乾燥品 （Ｃ）Ｃ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準エンドトキシン試薬（凍結乾燥品） 適量 大腸菌０１１１：Ｂ４株由来のエンドトキシン調製調製
品 （Ｅ）標準エンドトキシン試薬溶解用蒸留水（エンドト
キシン・フリー）２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（エンドトキシン・フリ
ー） ２. ０ml （Ｇ）０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液調製用蒸留水
（エンドトキシン・フリー） ２. ０ml 実施例３−１：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のポリブレン濃度） 実施例２−１と同様の手段により調製したＰＲＰ試料１
９０μｌにブクリョウ菌 (Poria cocos ) 由来のβ−
グルカン調製品（パキマン）の水溶液（４ｎｇ／ml）１
０μlを加え、よく混合した後、その５μl をβ−グル
カン・フリーのマイクロプレート（トキシペットプレー
ト９６Ｆ、生化学工業（株）販売、商品名）に取り、前
処理剤として０．１モル／l ＫＯＨおよび０．３モル／
l 塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する水溶液に０．０１
〜０．５％（重量／容量）になるようにポリブレンを添
加した水溶液の混液（２０μｌ）を加え、強制エアー循
環式マイクロプレートリーダー（ウェルリーダーＳＫ６
０１、生化学工業（株）販売、商品名）内で３７℃、１
０分間保持した。
合成基質法キット 下記の構成試薬からなる、エンドトキシン測定用発色合
成基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml Ａ液：０．２モル／l ＫＯＨ、０．２％ポリブレン Ｂ液：０．２％トリトンＸ−１００、０．１４％エチレ
ンイミンポリマー、０．０２モル／l ＣａＣｌ2 、０．
０６モル／l ビシン 使用直前にＡ液とＢ液を混合する。 （Ｂ）Ｃ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートからOb
ayashi,T.et al.の方法（前出）に従って調製したＣ因
子系成分と発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ）を含む凍結乾燥品 （Ｃ）Ｃ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準エンドトキシン試薬（凍結乾燥品） 適量 大腸菌０１１１：Ｂ４株由来のエンドトキシン調製調製
品 （Ｅ）標準エンドトキシン試薬溶解用蒸留水（エンドト
キシン・フリー）２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（エンドトキシン・フリ
ー） ２. ０ml （Ｇ）０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液調製用蒸留水
（エンドトキシン・フリー） ２. ０ml 実施例３−１：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のポリブレン濃度） 実施例２−１と同様の手段により調製したＰＲＰ試料１
９０μｌにブクリョウ菌 (Poria cocos ) 由来のβ−
グルカン調製品（パキマン）の水溶液（４ｎｇ／ml）１
０μlを加え、よく混合した後、その５μl をβ−グル
カン・フリーのマイクロプレート（トキシペットプレー
ト９６Ｆ、生化学工業（株）販売、商品名）に取り、前
処理剤として０．１モル／l ＫＯＨおよび０．３モル／
l 塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する水溶液に０．０１
〜０．５％（重量／容量）になるようにポリブレンを添
加した水溶液の混液（２０μｌ）を加え、強制エアー循
環式マイクロプレートリーダー（ウェルリーダーＳＫ６
０１、生化学工業（株）販売、商品名）内で３７℃、１
０分間保持した。
【００８６】被検液に存在するβ−グルカンの量は以下
の方法で測定した。被検液２５μlに、０. １モル／l
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６）で溶解したＧテスト
（Ｇ因子系成分と発色合成基質、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含むβ−グルカン測定用発色合成
基質法試薬凍結乾燥品；実施例１−１参照）１００μｌ
を添加して、３７℃で３０分間反応させた。４９２ｎｍ
を対照とする４０５ｎｍの吸光度を１５秒間隔で２波長
測光し、１分間当たりの吸光度変化率（ｍＡｂｓ／ｍｉ
ｎ）を算出した（カイネティック法）。ＰＲＰおよび前
処理剤の代わりにＤＷを使用したときの測定値をコント
ロールとし、ＰＲＰ１ml当たりのβ−グルカン濃度とβ
−グルカン添加回収率を算出した。また、同時に前処理
容器として試験管を用い、ポリブレンを含有しないほか
は上記と同じ組成の前処理剤で３７℃の恒温水槽中にお
いて同様に前処理した被検液２５μｌを試験管にとり、
恒温水槽中で３７℃、３０分間反応させた。０．０４％
（重量／容量）の亜硝酸ナトリウム（１モル／l 塩酸容
液）５０μl 、０. ３％（重量／容量）スルファミン酸
アンモニウム５０μl ならびに０. ０７％（重量／容
量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１４
％（重量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリドン溶液）５
０μl を順次加えてジアゾカップリングした後、その全
量をマイクロプレートに移し、ウェルリーダーにて６３
０nmを対照として５４５nmで吸光度を測定し、ＰＲＰ１
ml当たりのβ−グルカン濃度と回収率を算出した（エン
ドポイント法）。表９に前処理および反応容器としてマ
イクロプレートを使用したカイネティック法による、前
処理剤のポリブレン濃度を種々変化させた場合のβ−グ
ルカン添加回収率を同一条件で処理されたβ−グルカン
無添加のＰＲＰについての測定結果（吸光度およびβ−
グルカン換算値）と共に示す。また前処理および反応容
器に試験管を使用し、ポリブレンを含有しない混液の結
果も同様に示した。
の方法で測定した。被検液２５μlに、０. １モル／l
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６）で溶解したＧテスト
（Ｇ因子系成分と発色合成基質、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡを含むβ−グルカン測定用発色合成
基質法試薬凍結乾燥品；実施例１−１参照）１００μｌ
を添加して、３７℃で３０分間反応させた。４９２ｎｍ
を対照とする４０５ｎｍの吸光度を１５秒間隔で２波長
測光し、１分間当たりの吸光度変化率（ｍＡｂｓ／ｍｉ
ｎ）を算出した（カイネティック法）。ＰＲＰおよび前
処理剤の代わりにＤＷを使用したときの測定値をコント
ロールとし、ＰＲＰ１ml当たりのβ−グルカン濃度とβ
−グルカン添加回収率を算出した。また、同時に前処理
容器として試験管を用い、ポリブレンを含有しないほか
は上記と同じ組成の前処理剤で３７℃の恒温水槽中にお
いて同様に前処理した被検液２５μｌを試験管にとり、
恒温水槽中で３７℃、３０分間反応させた。０．０４％
（重量／容量）の亜硝酸ナトリウム（１モル／l 塩酸容
液）５０μl 、０. ３％（重量／容量）スルファミン酸
アンモニウム５０μl ならびに０. ０７％（重量／容
量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩（１４
％（重量／容量）Ｎ−メチル−２−ピロリドン溶液）５
０μl を順次加えてジアゾカップリングした後、その全
量をマイクロプレートに移し、ウェルリーダーにて６３
０nmを対照として５４５nmで吸光度を測定し、ＰＲＰ１
ml当たりのβ−グルカン濃度と回収率を算出した（エン
ドポイント法）。表９に前処理および反応容器としてマ
イクロプレートを使用したカイネティック法による、前
処理剤のポリブレン濃度を種々変化させた場合のβ−グ
ルカン添加回収率を同一条件で処理されたβ−グルカン
無添加のＰＲＰについての測定結果（吸光度およびβ−
グルカン換算値）と共に示す。また前処理および反応容
器に試験管を使用し、ポリブレンを含有しない混液の結
果も同様に示した。
【００８７】
【表９】
【００８８】表９によれば、β−グルカン添加回収率は
ポリブレン添加の有無によらず、１００％と良好な結果
を与えるが、β−グルカン無添加での血中β−グルカン
濃度換算値はポリブレンの濃度により１０〜３０ｐｇ／
mlと非常に変動が大きい事が分かる。反応容器としてマ
イクロプレートの代わりに試験管を用いた測定結果よ
り、本来は１０ｐｇ／mlでなければならないのに、この
ような顕著な偽陽性反応を生じる原因としては、エンド
トキシンの場合と同様、反応時における検体特有の非特
異的濁度の上昇を挙げることができる。その結果とし
て、該濁度上昇が有意の変化率として計測され、β−グ
ルカンに依存する変化率と実質的に区別がつかなくなる
ことによるものである。このような非特異的濁度の増加
を抑える添加剤としては、実施例２−１と同様、ポリブ
レンが効果的で、通常前処理在中０．０５〜０．３％、
より好ましくは０．１〜０．２％の濃度で使用すれば良
い。
ポリブレン添加の有無によらず、１００％と良好な結果
を与えるが、β−グルカン無添加での血中β−グルカン
濃度換算値はポリブレンの濃度により１０〜３０ｐｇ／
mlと非常に変動が大きい事が分かる。反応容器としてマ
イクロプレートの代わりに試験管を用いた測定結果よ
り、本来は１０ｐｇ／mlでなければならないのに、この
ような顕著な偽陽性反応を生じる原因としては、エンド
トキシンの場合と同様、反応時における検体特有の非特
異的濁度の上昇を挙げることができる。その結果とし
て、該濁度上昇が有意の変化率として計測され、β−グ
ルカンに依存する変化率と実質的に区別がつかなくなる
ことによるものである。このような非特異的濁度の増加
を抑える添加剤としては、実施例２−１と同様、ポリブ
レンが効果的で、通常前処理在中０．０５〜０．３％、
より好ましくは０．１〜０．２％の濃度で使用すれば良
い。
【００８９】実施例３−２：真菌感染症患者ＰＲＰ検体
の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例２−１と同
様の方法で採血し、ＰＲＰ検体を調製した。その５μl
をトキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さら
に前処理剤として０. １モル／l ＮａＯＨ、０．３モル
／l ＮａＣｌおよび０．２％ポリブレンからなる混液２
０μl を加え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液と
した。以後実施例３−１と同様の手段によりＧテストと
反応させ、吸光度変化率を自動測定した。実施例３−１
と同じ既知量のブクリョウ菌由来のβ−グルカンを標準
試薬として用い、別に作成した検量線より上記被検液中
のβ−グルカン含量を換算した結果を表１０に示す。
の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例２−１と同
様の方法で採血し、ＰＲＰ検体を調製した。その５μl
をトキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さら
に前処理剤として０. １モル／l ＮａＯＨ、０．３モル
／l ＮａＣｌおよび０．２％ポリブレンからなる混液２
０μl を加え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液と
した。以後実施例３−１と同様の手段によりＧテストと
反応させ、吸光度変化率を自動測定した。実施例３−１
と同じ既知量のブクリョウ菌由来のβ−グルカンを標準
試薬として用い、別に作成した検量線より上記被検液中
のβ−グルカン含量を換算した結果を表１０に示す。
【００９０】
【表１０】
【００９１】表１０に示したように全例（Ｎｏ. １〜Ｎ
ｏ. ６）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量（１８例）：８. ０±４. ０ｐ
ｇ／ml）、そのうちの３例（Ｎｏ. １〜Ｎｏ. ３）につ
いては、血培にて、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス
（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびクリ
プトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）をそれぞれ検出し、１
例（Ｎｏ. ４）は血培では陰性であったが、死亡後の解
剖による組織病理学的検査によりアスペルギルス・フミ
ガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕ
ｓ）を検出した。残り２例（Ｎｏ. ５、Ｎｏ. ６）につ
いては、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を
強く疑ったにもかかわらず血培では陰性であったが、抗
真菌剤（ミコナゾール）投与により、臨床的に顕著な改
善を見たことから真菌に感染していたものと考えられ
る。なお、上記ＰＲＰのかわりにＰＰＰを検体として使
用しても同様の結果が得られた。
ｏ. ６）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量（１８例）：８. ０±４. ０ｐ
ｇ／ml）、そのうちの３例（Ｎｏ. １〜Ｎｏ. ３）につ
いては、血培にて、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス
（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびクリ
プトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）をそれぞれ検出し、１
例（Ｎｏ. ４）は血培では陰性であったが、死亡後の解
剖による組織病理学的検査によりアスペルギルス・フミ
ガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕ
ｓ）を検出した。残り２例（Ｎｏ. ５、Ｎｏ. ６）につ
いては、臨床症状、経過、薬剤感受性等から真菌感染を
強く疑ったにもかかわらず血培では陰性であったが、抗
真菌剤（ミコナゾール）投与により、臨床的に顕著な改
善を見たことから真菌に感染していたものと考えられ
る。なお、上記ＰＲＰのかわりにＰＰＰを検体として使
用しても同様の結果が得られた。
【００９２】従って、真菌感染症患者の血漿検体（ＰＲ
Ｐ、ＰＰＰ）を本発明の前処理剤で処理した後にβ−グ
ルカンを測定することによって、真菌感染症、とりわけ
通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染
症の診断を迅速かつ正確に行うことができた。 実施例３−３：真菌感染症患者血清検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例３−１と同
様の方法で採血し、血清検体を調製した。その５μl を
トキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
前処理剤として０. １モル／l ＫＯＨ、０．３モル／l
ＮａＣｌおよび０．１％ポリブレンからなる混液２０μ
l を加え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とし
た。以後実施例３−１と同様の手段によりＧテストと反
応させ、吸光度の変化率を自動測定した。実施例３−１
と同じ既知量のブクリョウ菌由来のβ−グルカンを標準
試薬として用い、別に作成した検量線より上記被検液中
のβ−グルカン含量を換算した結果を表１１に示す。
Ｐ、ＰＰＰ）を本発明の前処理剤で処理した後にβ−グ
ルカンを測定することによって、真菌感染症、とりわけ
通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌感染
症の診断を迅速かつ正確に行うことができた。 実施例３−３：真菌感染症患者血清検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例３−１と同
様の方法で採血し、血清検体を調製した。その５μl を
トキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
前処理剤として０. １モル／l ＫＯＨ、０．３モル／l
ＮａＣｌおよび０．１％ポリブレンからなる混液２０μ
l を加え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とし
た。以後実施例３−１と同様の手段によりＧテストと反
応させ、吸光度の変化率を自動測定した。実施例３−１
と同じ既知量のブクリョウ菌由来のβ−グルカンを標準
試薬として用い、別に作成した検量線より上記被検液中
のβ−グルカン含量を換算した結果を表１１に示す。
【００９３】
【表１１】
【００９４】表１１に示したように全例（Ｎｏ. １〜Ｎ
ｏ. ５）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量（１８例）：７. ２±２. ９ｐ
ｇ／ml）、そのうちの２例（Ｎｏ. １、Ｎｏ. ２）につ
いては、血培にて、カンジダ・グリエルモンディ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｄｉ）およびカンジ
ダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）をそれ
ぞれ検出し、１例（Ｎｏ. ３）は血培では陰性であった
が、死亡後の解剖による組織病理学的検査によりアスペ
ルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕ
ｍｉｇａｔｕｓ）を検出した。残り２例（Ｎｏ. ４、Ｎ
ｏ. ５）については、臨床症状、経過、薬剤感受性等か
ら真菌感染を強く疑ったにもかかわらず血培では陰性で
あったが、抗真菌剤（アムホテリシンＢ、フルコナゾー
ル）投与により、臨床的に顕著な改善を見たことから真
菌感染症に感染していたものと考えられる。
ｏ. ５）において高濃度のβ−グルカンが検出され（健
常人のβ−グルカン含量（１８例）：７. ２±２. ９ｐ
ｇ／ml）、そのうちの２例（Ｎｏ. １、Ｎｏ. ２）につ
いては、血培にて、カンジダ・グリエルモンディ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｄｉ）およびカンジ
ダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）をそれ
ぞれ検出し、１例（Ｎｏ. ３）は血培では陰性であった
が、死亡後の解剖による組織病理学的検査によりアスペ
ルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕ
ｍｉｇａｔｕｓ）を検出した。残り２例（Ｎｏ. ４、Ｎ
ｏ. ５）については、臨床症状、経過、薬剤感受性等か
ら真菌感染を強く疑ったにもかかわらず血培では陰性で
あったが、抗真菌剤（アムホテリシンＢ、フルコナゾー
ル）投与により、臨床的に顕著な改善を見たことから真
菌感染症に感染していたものと考えられる。
【００９５】従って、真菌感染症患者の血清を本発明の
前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定することに
よって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断が
きわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正確
に行うことができた。 実施例３−４：β−グルカン測定用ゲル化法（比濁法）
キット 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用ゲル化法
（比濁法）キット（５０検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 １. ０ml ０. １モル／l ＫＯＨ−０．０５モル／l ＫＣｌ−０．
２％ポリブレン 水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 リムルス・ポリフェムス由来の市販ライセート（リムル
スＨＳII−テストワコー，和光純薬工業（株）販売）に
１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量７０,０００）
を添加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、多孔性セル
ロースゲル（セルロファインＧＣ−２００ｍ，生化学工
業（株）販売）と混合し、ガラスフィルターで濾過し、
その濾液を凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. １モル／l ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 ブクリョウ由来のβ−グルカン調製品（パキマン） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） １. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） １. ０ml 実施例３−５：β−グルカン測定用発色合成基質法キッ
ト 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用発色合成
基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml ０. １モル／l ＫＯＨ−０．３モル／l ＫＣｌ−０．１
％ポリブレン水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートに１５
％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量４０, ０００）を添
加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、孔径０. ２０μ
m のナイロン膜フィルター（ナルゲンシリンジフィルタ
ー，直径２５mm，ナルジェ社製）を通過させ、通過液を
ＭＳ混液（０. ８Ｍ塩化マグネシウムと６ｍＭ Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとを含む）に添加
し、凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 ブクリョウ菌由来のβ−グルカン調製品（パキマン）
（実施例３−４参照） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） ２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） ２. ０ml （Ｇ）０. １モル／l ＨＥＰＥＳ緩衝液調製用蒸留水
（β−グルカン・フリー）５. ０ml
前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定することに
よって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断が
きわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正確
に行うことができた。 実施例３−４：β−グルカン測定用ゲル化法（比濁法）
キット 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用ゲル化法
（比濁法）キット（５０検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 １. ０ml ０. １モル／l ＫＯＨ−０．０５モル／l ＫＣｌ−０．
２％ポリブレン 水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 リムルス・ポリフェムス由来の市販ライセート（リムル
スＨＳII−テストワコー，和光純薬工業（株）販売）に
１５％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量７０,０００）
を添加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、多孔性セル
ロースゲル（セルロファインＧＣ−２００ｍ，生化学工
業（株）販売）と混合し、ガラスフィルターで濾過し、
その濾液を凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. １モル／l ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 ブクリョウ由来のβ−グルカン調製品（パキマン） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） １. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） １. ０ml 実施例３−５：β−グルカン測定用発色合成基質法キッ
ト 下記の構成試薬からなる、β−グルカン測定用発色合成
基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml ０. １モル／l ＫＯＨ−０．３モル／l ＫＣｌ−０．１
％ポリブレン水溶液 （Ｂ）Ｇ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートに１５
％（Ｗ／Ｖ）デキストラン（分子量４０, ０００）を添
加し、3,500rpmで１０分間遠心分離後、孔径０. ２０μ
m のナイロン膜フィルター（ナルゲンシリンジフィルタ
ー，直径２５mm，ナルジェ社製）を通過させ、通過液を
ＭＳ混液（０. ８Ｍ塩化マグネシウムと６ｍＭ Ｂｏｃ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとを含む）に添加
し、凍結乾燥したもの。 （Ｃ）Ｇ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７. ６） （Ｄ）標準β−グルカン試薬（凍結乾燥品） 適量 ブクリョウ菌由来のβ−グルカン調製品（パキマン）
（実施例３−４参照） （Ｅ）標準β−グルカン試薬溶解用蒸留水（β−グルカ
ン・フリー） ２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（β−グルカン・フリ
ー） ２. ０ml （Ｇ）０. １モル／l ＨＥＰＥＳ緩衝液調製用蒸留水
（β−グルカン・フリー）５. ０ml
【００９６】実施例４−１ 感染症患者ＰＲＰ検体の測定 対象は、健常人１８例、グラム陰性菌による敗血症を疑
った白血病等の重症血液疾患および感染を合併した肝、
胆道疾患を有する患者の１０例ならびに真菌症が疑われ
る患者６例で、それぞれヘパリンを添加して無菌的に採
血した血液を、４℃で１５０×ｇ、１０分間遠心してＰ
ＲＰ検体を得た。その５μｌをトキシペットプレート９
６Ｆにとり、０．１モル／ｌ ＫＯＨおよび０．１％ポ
リブレンからなる混液２０μｌを加え、３７℃に１０分
間保持し、被検液とした。
った白血病等の重症血液疾患および感染を合併した肝、
胆道疾患を有する患者の１０例ならびに真菌症が疑われ
る患者６例で、それぞれヘパリンを添加して無菌的に採
血した血液を、４℃で１５０×ｇ、１０分間遠心してＰ
ＲＰ検体を得た。その５μｌをトキシペットプレート９
６Ｆにとり、０．１モル／ｌ ＫＯＨおよび０．１％ポ
リブレンからなる混液２０μｌを加え、３７℃に１０分
間保持し、被検液とした。
【００９７】エンドトキシンの測定は、実施例２−１の
場合と同様にエンドスペーシーを用いたカイネティック
法により行い、既知量のエンドトキシン（大腸菌０１１
１：Ｂ４株由来）を標準試薬として用い、別に作成した
検量線より被検液中のエンドトキシン含量を算出した。
β−グルカンの測定は、実施例３−１と同様にＧテスト
を用いたカイネティック法により行い、既知量のβ−グ
ルカン調製品（ブクリョウ菌由来パキマン）標準試薬と
して用い、別に作成した検量線より被検液中のβ−グル
カン含量を算出した。表１２に結果をまとめて示す。
場合と同様にエンドスペーシーを用いたカイネティック
法により行い、既知量のエンドトキシン（大腸菌０１１
１：Ｂ４株由来）を標準試薬として用い、別に作成した
検量線より被検液中のエンドトキシン含量を算出した。
β−グルカンの測定は、実施例３−１と同様にＧテスト
を用いたカイネティック法により行い、既知量のβ−グ
ルカン調製品（ブクリョウ菌由来パキマン）標準試薬と
して用い、別に作成した検量線より被検液中のβ−グル
カン含量を算出した。表１２に結果をまとめて示す。
【００９８】
【表１２】
【００９９】表１２の患者Ｎｏ．１〜１０は、グラム陰
性菌敗血症の疑い有りと診断された症例であり、本発明
方法においては、全例高濃度のエンドトキシンが検出さ
れた（健常人のエンドトキシン含量（１８例）：２．０
±２．５ｐｇ／ml）。なお、上記ＰＲＰの代わりにＰＰ
Ｐを検体として使用しても同様の結果が得られた。ま
た、表１２の患者Ｎｏ．１１〜１６は、真菌感染症の罹
患を疑われた症例であるが、他の検査では全例について
は確認できなかった。上記方法では全例について高濃度
のβ−グルカンが検出された（健常人のβ−グルカン含
量（１８例）：７．０±２．５ｐｇ／ml）。
性菌敗血症の疑い有りと診断された症例であり、本発明
方法においては、全例高濃度のエンドトキシンが検出さ
れた（健常人のエンドトキシン含量（１８例）：２．０
±２．５ｐｇ／ml）。なお、上記ＰＲＰの代わりにＰＰ
Ｐを検体として使用しても同様の結果が得られた。ま
た、表１２の患者Ｎｏ．１１〜１６は、真菌感染症の罹
患を疑われた症例であるが、他の検査では全例について
は確認できなかった。上記方法では全例について高濃度
のβ−グルカンが検出された（健常人のβ−グルカン含
量（１８例）：７．０±２．５ｐｇ／ml）。
【０１００】なお、上記ＰＲＰの代わりにＰＰＰを検体
として使用しても同様の結果が得られた。以上の結果か
ら、同一前処理剤で処理した検体を用いてエンドトキシ
ンとβ−グルカンをそれぞれ測定できることが確認され
た。
として使用しても同様の結果が得られた。以上の結果か
ら、同一前処理剤で処理した検体を用いてエンドトキシ
ンとβ−グルカンをそれぞれ測定できることが確認され
た。
【０１０１】
【発明の効果】本発明は、種々の生化学反応が適用され
る血液等の生体試料の前処理を効果的に行うことができ
る前処理剤を提供でき、特に、Ｇ因子系反応妨害因子を
含む血漿、血清等の生体由来試料中のβ−グルカンを測
定する際、またはＣ因子系反応妨害因子を含む該試料中
のエンドトキシンを測定する際に、該試料をアルカリ金
属水酸化物およびヘキサジメトリン化合物を必須成分と
する前処理剤で処理するという簡便な手段を採用するこ
とによって上記反応妨害因子の反応系への影響を完全に
除去するとともに、処理後の被検液の濁度の上昇を抑制
することができた。また、処理後に変性析出物を分離除
去する必要がないので全操作行程を短縮することができ
た。さらに、本発明の測定法は、生体試料由来中のエン
ドトキシンまたはβ−グルカンをマイクロプレート中で
カイネティック法により自動測定することができるの
で、簡易、迅速かつ高精度で再現性の高い結果が得られ
る。本発明の測定法を臨床検査に応用することによっ
て、通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌
感染症、グラム陰性菌感染症の診断を迅速かつ正確に行
うことができる。
る血液等の生体試料の前処理を効果的に行うことができ
る前処理剤を提供でき、特に、Ｇ因子系反応妨害因子を
含む血漿、血清等の生体由来試料中のβ−グルカンを測
定する際、またはＣ因子系反応妨害因子を含む該試料中
のエンドトキシンを測定する際に、該試料をアルカリ金
属水酸化物およびヘキサジメトリン化合物を必須成分と
する前処理剤で処理するという簡便な手段を採用するこ
とによって上記反応妨害因子の反応系への影響を完全に
除去するとともに、処理後の被検液の濁度の上昇を抑制
することができた。また、処理後に変性析出物を分離除
去する必要がないので全操作行程を短縮することができ
た。さらに、本発明の測定法は、生体試料由来中のエン
ドトキシンまたはβ−グルカンをマイクロプレート中で
カイネティック法により自動測定することができるの
で、簡易、迅速かつ高精度で再現性の高い結果が得られ
る。本発明の測定法を臨床検査に応用することによっ
て、通常の検査法では診断がきわめて困難な深在性真菌
感染症、グラム陰性菌感染症の診断を迅速かつ正確に行
うことができる。
【０１０２】また、生体由来試料中のβ−グルカンを測
定する際、該試料をアルカリ金属水酸化物を必須成分と
する前処理剤で処理すると、Ｇ因子系反応妨害因子のＧ
因子系反応への影響を完全に除去することができた。
定する際、該試料をアルカリ金属水酸化物を必須成分と
する前処理剤で処理すると、Ｇ因子系反応妨害因子のＧ
因子系反応への影響を完全に除去することができた。
【図１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートの（１
→３）−β−Ｄ−グルカン及びエンドトキシンによるカ
スケード反応の反応機構を示す。
→３）−β−Ｄ−グルカン及びエンドトキシンによるカ
スケード反応の反応機構を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月２１日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】以下、本発明の前処理剤について具体的に
述べる。本発明の汎用前処理剤は、少なくともヘキサジ
メトリン化合物とアルカリ金属水酸化物からなる。この
アルカリ金属水酸化物は、カリウム、リチウム、ナトリ
ウム等のアルカリ金属の水酸化物であり、具体的には水
酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯ
Ｈ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等である。該前処
理剤としては通常単独又は複数のアルカリ金属水酸化物
を含む水溶液が使用される。最も好ましいのはＫＯＨ及
びＮａＯＨである。
述べる。本発明の汎用前処理剤は、少なくともヘキサジ
メトリン化合物とアルカリ金属水酸化物からなる。この
アルカリ金属水酸化物は、カリウム、リチウム、ナトリ
ウム等のアルカリ金属の水酸化物であり、具体的には水
酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化リチウム（ＬｉＯ
Ｈ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等である。該前処
理剤としては通常単独又は複数のアルカリ金属水酸化物
を含む水溶液が使用される。最も好ましいのはＫＯＨ及
びＮａＯＨである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】前処理剤中のアルカリ金属水酸化物の濃度
は、通常、被検液中の該アルカリ金属水酸化物濃度が
０. ０４〜０. ４モル／l となるように調整することが
好ましい。本発明に使用されるヘキサジメトリン化合物
は、好ましくは、ヘキサジメトリンの塩、例えば、ヘキ
サジメトリンハロゲン化物が挙げられる。ヘキサジメト
リンハロゲン化物としては、ヘキサジメトリンブロマイ
ド（一般名；ポリブレン）、ヘキサジメトリンクロライ
ド等が好ましいものとして例示されるが、本発明におい
ては、これらハロゲン化物等に限定されるものでなく、
所望によりヘキサジメトリンの水素原子を他の置換基、
例えば、炭素数１〜６のアルキル基（メチル、エチル
等）などで置換されたヘキサジメトリン誘導体の塩をも
含むものである。最も好ましいものは、ヘキサジメトリ
ンブロマイドである。
は、通常、被検液中の該アルカリ金属水酸化物濃度が
０. ０４〜０. ４モル／l となるように調整することが
好ましい。本発明に使用されるヘキサジメトリン化合物
は、好ましくは、ヘキサジメトリンの塩、例えば、ヘキ
サジメトリンハロゲン化物が挙げられる。ヘキサジメト
リンハロゲン化物としては、ヘキサジメトリンブロマイ
ド（一般名；ポリブレン）、ヘキサジメトリンクロライ
ド等が好ましいものとして例示されるが、本発明におい
ては、これらハロゲン化物等に限定されるものでなく、
所望によりヘキサジメトリンの水素原子を他の置換基、
例えば、炭素数１〜６のアルキル基（メチル、エチル
等）などで置換されたヘキサジメトリン誘導体の塩をも
含むものである。最も好ましいものは、ヘキサジメトリ
ンブロマイドである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】エンドトキシン測定用前処理剤は、組成成
分として前記兼用前処理剤の組成成分に非イオン性界面
活性剤もしくは陰イオン界面活性剤、およびアルカリ土
類金属ハロゲン化物を少なくとも追加した構成である。
ここで、非イオン性界面活性剤としては、特に制限はな
いが、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチ
レンソルビタンアルキルエステル類およびアルキルグル
コシド類等が挙げられる。
分として前記兼用前処理剤の組成成分に非イオン性界面
活性剤もしくは陰イオン界面活性剤、およびアルカリ土
類金属ハロゲン化物を少なくとも追加した構成である。
ここで、非イオン性界面活性剤としては、特に制限はな
いが、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチ
レンソルビタンアルキルエステル類およびアルキルグル
コシド類等が挙げられる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３０】ポリオキシエチレンエーテル類としては、
ポリオキシエチレン−ｐ−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、
ポリオキシエチレン−４−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）シクロヘキシルエーテル（重合度８〜４
０）、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテ
ル（重合度９〜１５）、ポリオキシエチレンヘプタメチ
ルヘキシルエーテル（重合度１０〜２０）、ポリオキシ
エチレンドデシルエーテル（重合度１０〜２９）等が挙
げられ、市販品としてはトリトン系（Triton series）
界面活性剤（octoxynol; polyoxyethylene p-t-octylph
enyl ethers)、ブリジ系（Brij series）界面活性剤(po
lyoxyethylene alkyl ethers)及びエマルゲン系(Emulge
n series)界面活性剤( polyoxyethylene nonylphenyl e
thers) が包含される。
ポリオキシエチレン−ｐ−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、
ポリオキシエチレン−４−ターシャリーオクチル（又は
イソオクチル）シクロヘキシルエーテル（重合度８〜４
０）、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテ
ル（重合度９〜１５）、ポリオキシエチレンヘプタメチ
ルヘキシルエーテル（重合度１０〜２０）、ポリオキシ
エチレンドデシルエーテル（重合度１０〜２９）等が挙
げられ、市販品としてはトリトン系（Triton series）
界面活性剤（octoxynol; polyoxyethylene p-t-octylph
enyl ethers)、ブリジ系（Brij series）界面活性剤(po
lyoxyethylene alkyl ethers)及びエマルゲン系(Emulge
n series)界面活性剤( polyoxyethylene nonylphenyl e
thers) が包含される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】アルキルグルコシド類としては、ｎ−ヘプ
チル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オ
クチル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−
ノニル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−
デシル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、又は
ｎ−ドデシル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド
等が挙げられる。
チル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オ
クチル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−
ノニル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−
デシル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド、又は
ｎ−ドデシル−（α−又はβ−）Ｄ−グルコピラノシド
等が挙げられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエ
ステル類としては、ポリオキシエチレンソルビタン（重
合度約２０）のモノラウレート、モノパルミテート、モ
ノステアレート、モノオレエート又はトリオレエート等
が挙げられ、市販品としてはトウィーン系（Tween seri
es）界面活性剤が包含される。トリトン系界面活性剤と
しては、トリトン（Triton）Ｘ−１００、Ｘ−１１４、
Ｘ−１０２、Ｘ−１６５、Ｘ−３０５、Ｘ−４０５、Ｉ
ｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎｅｕｔｒｏｎｙｘ ６０
５、Ｃｏｎｃｏ ＮＩＸ−１００、ノニデット（Nonide
t）Ｐ−４０等が例示される。ブリジ系界面活性剤とし
ては、ブリジ（Brij）３５，５８が例示される。エマル
ゲン系界面活性剤としてはＥｍｕｌｇｅｎ ９１１、９
１３等が例示される。トウィーン系界面活性剤としては
トウィーン（Tween）２０，４０，６０，８０，８５が
例示される。非イオン性界面活性剤としては、トリトン
系及びトウィーン系界面活性剤が最も好ましい。
ステル類としては、ポリオキシエチレンソルビタン（重
合度約２０）のモノラウレート、モノパルミテート、モ
ノステアレート、モノオレエート又はトリオレエート等
が挙げられ、市販品としてはトウィーン系（Tween seri
es）界面活性剤が包含される。トリトン系界面活性剤と
しては、トリトン（Triton）Ｘ−１００、Ｘ−１１４、
Ｘ−１０２、Ｘ−１６５、Ｘ−３０５、Ｘ−４０５、Ｉ
ｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、Ｎｅｕｔｒｏｎｙｘ ６０
５、Ｃｏｎｃｏ ＮＩＸ−１００、ノニデット（Nonide
t）Ｐ−４０等が例示される。ブリジ系界面活性剤とし
ては、ブリジ（Brij）３５，５８が例示される。エマル
ゲン系界面活性剤としてはＥｍｕｌｇｅｎ ９１１、９
１３等が例示される。トウィーン系界面活性剤としては
トウィーン（Tween）２０，４０，６０，８０，８５が
例示される。非イオン性界面活性剤としては、トリトン
系及びトウィーン系界面活性剤が最も好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫
酸塩等のアルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸
塩が挙げられる。ドデシル硫酸塩としては、具体的には
ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデ
シル硫酸カルシウム等を例示できる。ドデシル硫酸ナト
リウムが最も好ましい。アルカリ土類金属ハロゲン化物
としては、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ス
トロンチウム等が挙げられる。塩化カルシウムが最も好
ましい。
酸塩等のアルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸
塩が挙げられる。ドデシル硫酸塩としては、具体的には
ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、ドデ
シル硫酸カルシウム等を例示できる。ドデシル硫酸ナト
リウムが最も好ましい。アルカリ土類金属ハロゲン化物
としては、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ス
トロンチウム等が挙げられる。塩化カルシウムが最も好
ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】ここで、アルカリ金属ハロゲン化物として
は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等が
例示される。このうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム
が最も好ましい。このアルカリ金属ハロゲン化物は、β
−グルカンの血液成分への吸着抑制作用を有するものと
考えられる。本発明のβ−グルカン測定用前処理剤Ａに
おけるヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸
化物の配合割合は、前記兼用前処理剤とほぼ同じ範囲で
調整でき、アルカリ金属ハロゲン化物は、前処理剤中に
０．０５〜０．５モル／l の範囲で使用される。
は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等が
例示される。このうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム
が最も好ましい。このアルカリ金属ハロゲン化物は、β
−グルカンの血液成分への吸着抑制作用を有するものと
考えられる。本発明のβ−グルカン測定用前処理剤Ａに
おけるヘキサジメトリン化合物およびアルカリ金属水酸
化物の配合割合は、前記兼用前処理剤とほぼ同じ範囲で
調整でき、アルカリ金属ハロゲン化物は、前処理剤中に
０．０５〜０．５モル／l の範囲で使用される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】また、本発明のβ−グルカン測定用前処理
剤Ａは、組成成分として、さらに所望の成分を追加する
ことができ、例えば、前記したアミノまたはイミノ化合
物、ビシン等を前記兼用前処理剤と同じ程度の範囲で使
用することもできる。また、本発明は、前記アルカリ金
属水酸化物を主成分とするβ−グルカン測定用前処理剤
Ｂをも提供する。この前処理剤Ｂには必要に応じて他の
添加物が添加されていてもよい。このような添加物とし
ては、例えば、β−グルカンが血液成分に吸着されてＧ
因子系カスケード反応を抑制するのを防いだり、反応系
を安定化したり、再現性を高める作用を有する物質が挙
げられる。例えば、アルカリ金属ハロゲン化物等が好適
に例示される。本発明の前処理剤は複数の溶液として保
存し、使用時に該溶液を混合してもよい。アルカリ金属
水酸化物とアルカリ土類金属ハロゲン化物及び／または
非イオン性界面活性剤とは混合して長時間保存すると、
沈殿を生じる等の不都合があるので、別々に保存し、前
処理直前または前処理時に混合することが好ましい。特
に、ＫＯＨとＣａＣｌ2 及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
とは別々に保存することが好ましい。
剤Ａは、組成成分として、さらに所望の成分を追加する
ことができ、例えば、前記したアミノまたはイミノ化合
物、ビシン等を前記兼用前処理剤と同じ程度の範囲で使
用することもできる。また、本発明は、前記アルカリ金
属水酸化物を主成分とするβ−グルカン測定用前処理剤
Ｂをも提供する。この前処理剤Ｂには必要に応じて他の
添加物が添加されていてもよい。このような添加物とし
ては、例えば、β−グルカンが血液成分に吸着されてＧ
因子系カスケード反応を抑制するのを防いだり、反応系
を安定化したり、再現性を高める作用を有する物質が挙
げられる。例えば、アルカリ金属ハロゲン化物等が好適
に例示される。本発明の前処理剤は複数の溶液として保
存し、使用時に該溶液を混合してもよい。アルカリ金属
水酸化物とアルカリ土類金属ハロゲン化物及び／または
非イオン性界面活性剤とは混合して長時間保存すると、
沈殿を生じる等の不都合があるので、別々に保存し、前
処理直前または前処理時に混合することが好ましい。特
に、ＫＯＨとＣａＣｌ2 及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
とは別々に保存することが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】リムルス反応を利用して試料中のリムルス
試薬に特異的に反応する物質、即ち、エンドトキシンま
たはβ−グルカンを測定する方法は、本発明の前処理剤
で処理された試料をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートから得られたリムルス試薬と混合して反応させ、基
質の変化を検出することにより行うことができる。前処
理された試料は、遠心分離や中和処理をすることなく、
直接リムルス反応に付すことができる。リムルス反応を
利用する測定法は、リムルス試薬を前処理した試料に加
え、混合液を約３７℃、ｐＨ７〜９で適当な時間反応さ
せ、基質の変化を基質に応じた反応測定手段によって測
定し、予め標準試薬を用いて作成した検量線からβ−グ
ルカンまたはエンドトキシンの試料中の含有量を算出す
ることによって行われる。この場合、エンドトキシンを
測定する場合は、前記兼用前処理剤またはエンドトキシ
ン測定用前処理剤で処理した試料を、少なくともエンド
トキシンと反応するＣ因子系成分を含有したリムルス試
薬と混合、反応させることが必要であり、好ましくは該
リムルス試薬としてエンドトキシンのみと特異的に反応
するものを選択することが極めて好ましい。このような
リムルス試薬としては、Ｃ因子系成分を含有し、Ｇ因子
系成分は、除去もしくは阻害されたものが挙げられる。
試薬に特異的に反応する物質、即ち、エンドトキシンま
たはβ−グルカンを測定する方法は、本発明の前処理剤
で処理された試料をカブトガニ・アメボサイト・ライセ
ートから得られたリムルス試薬と混合して反応させ、基
質の変化を検出することにより行うことができる。前処
理された試料は、遠心分離や中和処理をすることなく、
直接リムルス反応に付すことができる。リムルス反応を
利用する測定法は、リムルス試薬を前処理した試料に加
え、混合液を約３７℃、ｐＨ７〜９で適当な時間反応さ
せ、基質の変化を基質に応じた反応測定手段によって測
定し、予め標準試薬を用いて作成した検量線からβ−グ
ルカンまたはエンドトキシンの試料中の含有量を算出す
ることによって行われる。この場合、エンドトキシンを
測定する場合は、前記兼用前処理剤またはエンドトキシ
ン測定用前処理剤で処理した試料を、少なくともエンド
トキシンと反応するＣ因子系成分を含有したリムルス試
薬と混合、反応させることが必要であり、好ましくは該
リムルス試薬としてエンドトキシンのみと特異的に反応
するものを選択することが極めて好ましい。このような
リムルス試薬としては、Ｃ因子系成分を含有し、Ｇ因子
系成分は、除去もしくは阻害されたものが挙げられる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】従って、エンドトキシンまたはβ−グルカ
ンを測定する際の反応混合液は、Ｇ因子系またはＣ因子
系の至適ｐＨ付近に調整されることが好ましく、通常ｐ
Ｈ７〜９になるように従来公知の緩衝液により所望に調
整される。なお、本発明の前処理で失活した偽陽性因
子、偽陰性因子は、後述の実施例等から活性が再生する
ことはないことが判明している。また、逆に、該前処理
剤で処理された比較的高濃度の塩基性物質を含む被検液
とリムルス試薬との混合において、該前処理剤が該Ｇ因
子系またはＣ因子系中の各成分の反応性に悪影響を与え
ることがないのも該緩衝作用によるものであると考えら
れる。
ンを測定する際の反応混合液は、Ｇ因子系またはＣ因子
系の至適ｐＨ付近に調整されることが好ましく、通常ｐ
Ｈ７〜９になるように従来公知の緩衝液により所望に調
整される。なお、本発明の前処理で失活した偽陽性因
子、偽陰性因子は、後述の実施例等から活性が再生する
ことはないことが判明している。また、逆に、該前処理
剤で処理された比較的高濃度の塩基性物質を含む被検液
とリムルス試薬との混合において、該前処理剤が該Ｇ因
子系またはＣ因子系中の各成分の反応性に悪影響を与え
ることがないのも該緩衝作用によるものであると考えら
れる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６３】実施例１−３：血清へのβ−グルカン添加
回収試験（処理時間） 抗凝固剤を入れないで採血した健常人の血液３mlを４℃
に１時間静置した後、１，０００×ｇ、１０分間遠心分
離して血清を得た。この血清試料１９０μl に１０pgの
実施例１−１と同じβ−グルカン調製品（パキマン）を
含有する水溶液１０μl を添加した後、その５μl をト
キシペットプレート９６Ｆにとり、０. １モル／l のＫ
ＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を加え、３７℃におい
て所定の時間加温保持し、これを被検液とした。
回収試験（処理時間） 抗凝固剤を入れないで採血した健常人の血液３mlを４℃
に１時間静置した後、１，０００×ｇ、１０分間遠心分
離して血清を得た。この血清試料１９０μl に１０pgの
実施例１−１と同じβ−グルカン調製品（パキマン）を
含有する水溶液１０μl を添加した後、その５μl をト
キシペットプレート９６Ｆにとり、０. １モル／l のＫ
ＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を加え、３７℃におい
て所定の時間加温保持し、これを被検液とした。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６４】そして、上記被検液に添加されたβ−グル
カンを実施例１−１の場合と同様の手段により測定し
た。各加温時間についての測定結果を実施例１−１の場
合と同様に表３として示す。
カンを実施例１−１の場合と同様の手段により測定し
た。各加温時間についての測定結果を実施例１−１の場
合と同様に表３として示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７３】従って、真菌感染症患者のＰＲＰを本発明
の前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定すること
によって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断
がきわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正
確に行うことができた。 実施例１−６：真菌感染症患者血清検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例１−３と同
様の方法で採血し、血清検体を調製した。その５μl を
トキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
０. １モル／l ＫＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を加
え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とした。以後
実施例１−１と同様の手段によりＧテストと反応させ、
吸光度を測定した。実施例１−４と同じ既知量のカード
ランを標準試薬として用い、別に作成したの検量線より
上記被検液中のβ−グルカン含量を換算した結果を表６
に示す。
の前処理剤で処理した後にβ−グルカンを測定すること
によって、真菌感染症、とりわけ通常の検査法では診断
がきわめて困難な深在性真菌感染症の診断を迅速かつ正
確に行うことができた。 実施例１−６：真菌感染症患者血清検体の測定 真菌感染症の罹患が疑われる患者から実施例１−３と同
様の方法で採血し、血清検体を調製した。その５μl を
トキシペットプレート９６Ｆの各ウェルにとり、さらに
０. １モル／l ＫＯＨ水溶液〔前処理剤〕２０μl を加
え、３７℃で１０分間加温保持し、被検液とした。以後
実施例１−１と同様の手段によりＧテストと反応させ、
吸光度を測定した。実施例１−４と同じ既知量のカード
ランを標準試薬として用い、別に作成したの検量線より
上記被検液中のβ−グルカン含量を換算した結果を表６
に示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８５】実施例２−３：エンドトキシン測定用発色
合成基質法キット 下記の構成試薬からなる、エンドトキシン測定用発色合
成基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml Ａ液：０．２モル／l ＫＯＨ、０．２％ポリブレン Ｂ液：０．２％トリトンＸ−１００、０．１４％エチレ
ンイミンポリマー、０．０２モル／l ＣａＣｌ2 、０．
０６モル／l ビシン 使用直前にＡ液とＢ液を混合する。 （Ｂ）Ｃ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートからOb
ayashi,T.et al.の方法（前出）に従って調製したＣ因
子系成分と発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ）を含む凍結乾燥品 （Ｃ）Ｃ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準エンドトキシン試薬（凍結乾燥品） 適量 大腸菌０１１１：Ｂ４株由来のエンドトキシン調製調製
品 （Ｅ）標準エンドトキシン試薬溶解用蒸留水（エンドト
キシン・フリー）２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（エンドトキシン・フリ
ー） ２. ０ml （Ｇ）０. １モル／l トリス−塩酸緩衝液調製用蒸留水
（エンドトキシン・フリー） ５. ０ml 実施例３−１：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のポリブレン濃度） 実施例２−１と同様の手段により調製したＰＲＰ試料１
９０μｌにブクリョウ菌 (Poria cocos ) 由来のβ−
グルカン調製品（パキマン）の水溶液（４ｎｇ／ml）１
０μlを加え、よく混合した後、その５μl をβ−グル
カン・フリーのマイクロプレート（トキシペットプレー
ト９６Ｆ、生化学工業（株）販売、商品名）に取り、前
処理剤として０．１モル／l ＫＯＨおよび０．３モル／
l 塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する水溶液に０．０１
〜０．５％（重量／容量）になるようにポリブレンを添
加した水溶液の混液（２０μｌ）を加え、強制エアー循
環式マイクロプレートリーダー（ウェルリーダーＳＫ６
０１、生化学工業（株）販売、商品名）内で３７℃、１
０分間保持した。
合成基質法キット 下記の構成試薬からなる、エンドトキシン測定用発色合
成基質法キット（１００検体用）を作成した。 （Ａ）前処理剤 ２. ０ml Ａ液：０．２モル／l ＫＯＨ、０．２％ポリブレン Ｂ液：０．２％トリトンＸ−１００、０．１４％エチレ
ンイミンポリマー、０．０２モル／l ＣａＣｌ2 、０．
０６モル／l ビシン 使用直前にＡ液とＢ液を混合する。 （Ｂ）Ｃ因子系反応試薬（凍結乾燥品） 適量 タキプレウス・トリデンタツス由来のライセートからOb
ayashi,T.et al.の方法（前出）に従って調製したＣ因
子系成分と発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−ｐＮＡ）を含む凍結乾燥品 （Ｃ）Ｃ因子系反応試薬溶解・反応用緩衝液 ５. ０ml ０. ２モル／l トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０） （Ｄ）標準エンドトキシン試薬（凍結乾燥品） 適量 大腸菌０１１１：Ｂ４株由来のエンドトキシン調製調製
品 （Ｅ）標準エンドトキシン試薬溶解用蒸留水（エンドト
キシン・フリー）２. ０ml （Ｆ）ブランクテスト用蒸留水（エンドトキシン・フリ
ー） ２. ０ml （Ｇ）０. １モル／l トリス−塩酸緩衝液調製用蒸留水
（エンドトキシン・フリー） ５. ０ml 実施例３−１：ＰＲＰへのβ−グルカン添加回収試験
（前処理剤のポリブレン濃度） 実施例２−１と同様の手段により調製したＰＲＰ試料１
９０μｌにブクリョウ菌 (Poria cocos ) 由来のβ−
グルカン調製品（パキマン）の水溶液（４ｎｇ／ml）１
０μlを加え、よく混合した後、その５μl をβ−グル
カン・フリーのマイクロプレート（トキシペットプレー
ト９６Ｆ、生化学工業（株）販売、商品名）に取り、前
処理剤として０．１モル／l ＫＯＨおよび０．３モル／
l 塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する水溶液に０．０１
〜０．５％（重量／容量）になるようにポリブレンを添
加した水溶液の混液（２０μｌ）を加え、強制エアー循
環式マイクロプレートリーダー（ウェルリーダーＳＫ６
０１、生化学工業（株）販売、商品名）内で３７℃、１
０分間保持した。
Claims (17)
- 【請求項１】 生化学反応に対する反応妨害因子を含む
試料の前処理剤であって、ヘキサジメトリン化合物およ
びアルカリ金属水酸化物を含むことを特徴とする前処理
剤。 - 【請求項２】 生化学反応に対する反応妨害因子を含む
試料がリムルス反応に対する反応妨害因子を含む試料で
ある請求項１の前処理剤。 - 【請求項３】 リムルス反応を利用して試料中のエンド
トキシンを測定する際に使用する請求項１の前処理剤で
あって、更に非イオン性界面活性剤もしくは陰イオン界
面活性剤およびアルカリ土類金属ハロゲン化物を含む前
処理剤。 - 【請求項４】 リムルス反応を利用して試料中の（１→
３）−β−Ｄ−グルカンを測定する際に使用する請求項
１の前処理剤であって、更にアルカリ金属ハロゲン化物
を含む前処理剤。 - 【請求項５】 リムルス反応を利用して試料中の（１→
３）−β−Ｄ−グルカンを測定する際に、リムルス反応
に対する反応妨害因子を含む試料をリムルス反応に先立
って処理するために使用する前処理剤であって、アルカ
リ金属水酸化物を主成分とすることを特徴とする前処理
剤。 - 【請求項６】 複数の溶液として保存され、使用時に該
溶液が混合されることを特徴とする請求項１〜５のいず
れか１項に記載の前処理剤。 - 【請求項７】 リムルス反応に対する反応妨害因子を含
む試料中に含まれるリムルス反応によって検出できる物
質を、該反応を利用して検出する際に、リムルス反応に
先立って試料を処理するための前処理方法において、請
求項１〜６のいずれか１項に記載された前処理剤と試料
を混合し、加温することを特徴とする前処理方法。 - 【請求項８】 試料が血液由来の試料である請求項７記
載の前処理方法。 - 【請求項９】 リムルス反応によって検出できる物質が
エンドトキシンであり、前処理剤が請求項３記載の前処
理剤である請求項７記載の前処理方法。 - 【請求項１０】 リムルス反応によって検出できる物質
が（１→３）−β−Ｄ−グルカンであり、前処理剤が請
求項４または５に記載の前処理剤である請求項７記載の
前処理方法。 - 【請求項１１】 リムルス反応を利用して試料中のリム
ルス試薬に特異的に反応する物質を測定する方法であっ
て、試料を請求項７〜１０のいずれか１項の方法で前処
理し、処理後の試料をリムルス試薬と混合して反応さ
せ、基質の変化を検出することを特徴とする測定法。 - 【請求項１２】 少なくとも下記の構成試薬からなるこ
とを特徴とするリムルス試薬に特異的に反応する物質を
測定するための測定用キット。 （Ａ）請求項１〜６の前処理剤からなる群から選択され
る１種以上の前処理剤。 （Ｂ）カブトガニ・アメボサイト・ライセートを原料と
して得られたリムルス試薬。 - 【請求項１３】 （Ｂ）のリムルス試薬が、エンドトキ
シンに特異的に反応するリムルス試薬であり、リムルス
試薬に特異的に反応する物質がエンドトキシンである請
求項１２記載の測定用キット。 - 【請求項１４】 （Ｂ）のリムルス試薬が、（１→３）
−β−Ｄ−グルカンに特異的に反応するリムルス試薬で
あり、リムルス試薬に特異的に反応する物質が（１→
３）−β−Ｄ−グルカンである請求項１２記載の測定用
キット。 - 【請求項１５】 構成試薬として、さらに下記（Ｃ）を
含むことを特徴とする請求項１３記載の測定用キット。 （Ｃ）エンドトキシンの一定量を含む標準試薬。 - 【請求項１６】 構成試薬として、さらに下記（Ｄ）を
含むことを特徴とする請求項１４記載の測定用キット。 （Ｄ）（１→３）−β−Ｄ−グルカンの一定量を含む標
準試薬。 - 【請求項１７】 生体由来の試料中のリムルス試薬に特
異的に反応する物質を請求項１１の測定法で定量し、該
物質の測定値が一定量を超えたときに感染症に罹患した
生体に由来する試料であると判定することを特徴とする
感染症の診断方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10042693A JP3524120B2 (ja) | 1992-05-08 | 1993-04-02 | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 |
| DE69325848T DE69325848T2 (de) | 1992-05-08 | 1993-05-07 | Vorbehandlungsreagenz, Verfahren und Kit und Diagnoseverfahren für Infektionskrankheiten |
| EP93107479A EP0569033B1 (en) | 1992-05-08 | 1993-05-07 | Pretreating reagent, method and kit and method of diagnosing infectious diseases |
| CN93107076A CN1050905C (zh) | 1992-05-08 | 1993-05-08 | 前处理剂、前处理法、用处理试样的测定法和测定用药盒 |
| US08/058,306 US5389547A (en) | 1992-05-08 | 1993-05-10 | Pretreating reagent, pretreatment method, assay with pretreated samples, assay kit and method of diagnosing infectious diseases |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-142010 | 1992-05-08 | ||
| JP14201092 | 1992-05-08 | ||
| JP10042693A JP3524120B2 (ja) | 1992-05-08 | 1993-04-02 | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2004005345A Division JP3614849B2 (ja) | 1992-05-08 | 2004-01-13 | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0670796A true JPH0670796A (ja) | 1994-03-15 |
| JP3524120B2 JP3524120B2 (ja) | 2004-05-10 |
Family
ID=26441462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10042693A Expired - Lifetime JP3524120B2 (ja) | 1992-05-08 | 1993-04-02 | 前処理剤、前処理方法、前処理された試料による測定法、測定用キット及び試料の判定方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5389547A (ja) |
| EP (1) | EP0569033B1 (ja) |
| JP (1) | JP3524120B2 (ja) |
| CN (1) | CN1050905C (ja) |
| DE (1) | DE69325848T2 (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996006858A1 (en) * | 1994-09-01 | 1996-03-07 | Seikagaku Corporation | (1→3)-β-D-GLUCAN-BINDING PROTEIN, ANTIBODY THAT RECOGNIZES THE PROTEIN, AND USE OF THE PROTEIN AND ANTIBODY |
| EP0837330A3 (en) * | 1996-10-21 | 1999-03-24 | Seikagaku Corporation | Limulus reaction-activating substance, method for inactivating the substance and measuring its amount, and method for measuring limulus reaction |
| WO2005062056A1 (ja) * | 2003-12-22 | 2005-07-07 | Seikagaku Corporation | リポアラビノマンナンの測定方法とその応用 |
| WO2006080448A1 (ja) | 2005-01-27 | 2006-08-03 | Seikagaku Corporation | リムルス測定用前処理剤 |
| JP2007501020A (ja) * | 2003-03-17 | 2007-01-25 | チャールズ リバー ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | 微生物夾雑物の検出のための方法および組成物 |
| JP2007121204A (ja) * | 2005-10-31 | 2007-05-17 | Denka Seiken Co Ltd | 塩基性多糖類を含有する免疫測定法用検体処理液組成物及びキット、並びにこれらを用いる免疫測定法 |
| JP2007121205A (ja) * | 2005-10-31 | 2007-05-17 | Denka Seiken Co Ltd | ポリアミンを用いた免疫測定法用検体処理液組成物及びキット、並びにこれらを用いる免疫測定法 |
| WO2014104352A1 (ja) | 2012-12-28 | 2014-07-03 | 生化学工業株式会社 | リムルス試験に付されるアンチトロンビンiii用の前処理剤及び前処理方法 |
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