JPH0672B2 - 発酵法によるｌ―フェニルアラニンまたはｌ―チロシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ―フェニルアラニンまたはｌ―チロシンの製造法Info
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- JPH0672B2 JPH0672B2 JP59245700A JP24570084A JPH0672B2 JP H0672 B2 JPH0672 B2 JP H0672B2 JP 59245700 A JP59245700 A JP 59245700A JP 24570084 A JP24570084 A JP 24570084A JP H0672 B2 JPH0672 B2 JP H0672B2
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−７−リン酸シンターゼ（以下「ＤＳ」と記す）が
組込まれている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌及び
それを用いるＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の製造法に関する。
ン酸−７−リン酸シンターゼ（以下「ＤＳ」と記す）が
組込まれている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌及び
それを用いるＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の製造法に関する。
従来の技術 ＤＳは、ホスホエノールピルピン酸とエリスロース４−
リン酸よりの３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−７−リン酸（以下「ＤＡＨＰ」と記す）の合成を
触媒する酵素であり、ＤＡＨＰは、コリスミ酸を経由し
てフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンに変
換される。コリネ型細菌では、ＤＳ活性は、最終生産物
であるフエニルアラニンとチロシンによる相乗的な阻害
を受けることが知られており、芳香族アミノ酸生産菌を
育種する場合、この阻害の解除した強力なＤＳ活性を保
持する株を選択することが重要である。
リン酸よりの３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−７−リン酸（以下「ＤＡＨＰ」と記す）の合成を
触媒する酵素であり、ＤＡＨＰは、コリスミ酸を経由し
てフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンに変
換される。コリネ型細菌では、ＤＳ活性は、最終生産物
であるフエニルアラニンとチロシンによる相乗的な阻害
を受けることが知られており、芳香族アミノ酸生産菌を
育種する場合、この阻害の解除した強力なＤＳ活性を保
持する株を選択することが重要である。
一方、組換えＤＮＡ法によりこれら芳香族アミノ酸生産
菌を育種することは、いくつか知られているが（例えば
特開昭５７−２０８９９４、特開昭５７−７１３９７、
特開昭５８−８９１９４、特開昭５８−１３４９９４
等）、コリネ型細菌のＤＳをコードする遺伝子（以下
「ＤＳ遺伝子」と記す）が組込まれたものではない。
菌を育種することは、いくつか知られているが（例えば
特開昭５７−２０８９９４、特開昭５７−７１３９７、
特開昭５８−８９１９４、特開昭５８−１３４９９４
等）、コリネ型細菌のＤＳをコードする遺伝子（以下
「ＤＳ遺伝子」と記す）が組込まれたものではない。
発明が解決しようとする問題点 この発明は、Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の生産性がより高い微生物を得ること、及びそれによつ
てＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンのより効率
のよい製造法を見い出すことにある。
の生産性がより高い微生物を得ること、及びそれによつ
てＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンのより効率
のよい製造法を見い出すことにある。
問題点を解決するための手段 本発明者は、叙上の問題点を解決するため研究の結果、
コリネ型細菌細胞内で発現しＤＳをコードする遺伝子が
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドベクターに
接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を分
離することに成功し、得られたコリネ型細菌がＬ−フェ
ニルアラニンまたはＬ−チロシンの高い生産性を有する
ことを見い出した。
コリネ型細菌細胞内で発現しＤＳをコードする遺伝子が
コリネ型細菌細胞内で増殖しうるプラスミドベクターに
接続されている組換えＤＮＡを有するコリネ型細菌を分
離することに成功し、得られたコリネ型細菌がＬ−フェ
ニルアラニンまたはＬ−チロシンの高い生産性を有する
ことを見い出した。
即ち本願発明は、コリネ型細菌に属するＤＮＡ供与菌よ
り得られ、第１図あるいは第２図中挿入遺伝子部分の制
限酵素地図で表現される３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプチュロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律複製できるベ
クタープラスミドに接続されて、コリネ型細菌に属する
ＤＮＡ受容菌に導入されて得られるＬ−フェニルアラニ
ンまたはＬ−チロシン生産能を有する微生物を培養し、
培養液中に蓄積されたＬ−フェニルアラニンまたはＬ−
チロシンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラ
ニンまたはＬ−チロシンの製造法である。
り得られ、第１図あるいは第２図中挿入遺伝子部分の制
限酵素地図で表現される３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−
ヘプチュロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片が、コリネ型細菌の菌体内で自律複製できるベ
クタープラスミドに接続されて、コリネ型細菌に属する
ＤＮＡ受容菌に導入されて得られるＬ−フェニルアラニ
ンまたはＬ−チロシン生産能を有する微生物を培養し、
培養液中に蓄積されたＬ−フェニルアラニンまたはＬ−
チロシンを採取することを特徴とするＬ−フェニルアラ
ニンまたはＬ−チロシンの製造法である。
さらに本願発明は、コリネ型細菌に属するＤＮＡ供与菌
及び／またはＤＮＡ受容菌がｍ−フルオロフェニルアラ
ニン耐性であることを特徴とする前記のＬ−フェニルア
ラニンまたはＬ−チロシンの製造法である。
及び／またはＤＮＡ受容菌がｍ−フルオロフェニルアラ
ニン耐性であることを特徴とする前記のＬ−フェニルア
ラニンまたはＬ−チロシンの製造法である。
本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform bacteria）
は、バージース・マニュアル・オブ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinat
ive Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義
されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、
非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌である。このよう
なコリネ型細菌のうち特に以下に述べるようなコリネ型
グルタミン酸生産性細菌が本発明においては、最も好ま
しいものである。
は、バージース・マニュアル・オブ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー（Bargeys Manual of Determinat
ive Bacteriology）第８版５９９頁（１９７４）に定義
されている一群の微生物であり、好気性、グラム陽性、
非抗酸性、胞子形成能を有しない桿菌である。このよう
なコリネ型細菌のうち特に以下に述べるようなコリネ型
グルタミン酸生産性細菌が本発明においては、最も好ま
しいものである。
コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野生株の例としては
次のようなものがあげられる。
次のようなものがあげられる。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ
１４０２０ ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ
１４０６６ ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ
１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ
１３８２５ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ
１３８２６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ
１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ
１５８０６ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ
１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １
３０３２，１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ
１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ
１７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ
１５３５４ 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には上記のよ
うなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタ
ミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失っ
た変異株も含まれる。
１４０２０ ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ＡＴＣＣ
１４０６６ ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ＡＴＣＣ
１４０６８ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＴＣＣ
１３８６９ ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ
１３８２５ ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ
１３８２６ ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ
１９２４０ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ
１５８０６ コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ
１５９９１ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １
３０３２，１３０６０ コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ
１５９９０ コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ
１７９６５ ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ
１５３５４ 本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には上記のよ
うなグルタミン酸生産性を有する野性株のほかにグルタ
ミン酸生産性を有するまたはグルタミン酸生産性を失っ
た変異株も含まれる。
ＤＳ遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌のＤＳ遺伝
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し（例
えばバイオケミカル・エ・バイオフィジカ・アクタ（Bi
ochem.Biophys.Acta）７２巻、６１９頁、１９６３年の
方法が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断す
る。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプラスミ
ドベクターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコ
リネ型細菌のＤＳ欠損変異株を形質転換せしめ、ＤＳ生
成活性を保有するにいたつた菌株を単離し、これよりＤ
Ｓ遺伝子を分離できる。
子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽出し（例
えばバイオケミカル・エ・バイオフィジカ・アクタ（Bi
ochem.Biophys.Acta）７２巻、６１９頁、１９６３年の
方法が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断す
る。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得るプラスミ
ドベクターに接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてコ
リネ型細菌のＤＳ欠損変異株を形質転換せしめ、ＤＳ生
成活性を保有するにいたつた菌株を単離し、これよりＤ
Ｓ遺伝子を分離できる。
また、同様の組換えＤＮＡを用いてコリネ型細菌の野生
株の形質転換せしめ、ＤＳ活性に阻害効果を有する芳香
族アミノ酸のアンタゴニストなどに耐性を保持するにい
たつ菌株を単離し、これよりＤＳ遺伝子を分離すること
も可能である。
株の形質転換せしめ、ＤＳ活性に阻害効果を有する芳香
族アミノ酸のアンタゴニストなどに耐性を保持するにい
たつ菌株を単離し、これよりＤＳ遺伝子を分離すること
も可能である。
芳香族アミノ酸のアンタゴニストの例としては、ｏ−フ
ルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニルアラニ
ン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニ
ルアラニン、β−３−チエニルアラニン、３−アミノチ
ロシン、チロシンヒドロキサメート、５−メチルトリプ
トファン等がある。
ルオロフェニルアラニン、ｍ−フルオロフェニルアラニ
ン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニ
ルアラニン、β−３−チエニルアラニン、３−アミノチ
ロシン、チロシンヒドロキサメート、５−メチルトリプ
トファン等がある。
ＤＮＡ供与菌としては、前記の芳香族アミノ酸アンタゴ
ニスト耐性などの変異を付与することにより、Ｌ−フェ
ニルアラニンまたはＬ−チロシンまたはその前駆体の生
合成活性が高まったような変異株を用いれば更によい。
ニスト耐性などの変異を付与することにより、Ｌ−フェ
ニルアラニンまたはＬ−チロシンまたはその前駆体の生
合成活性が高まったような変異株を用いれば更によい。
ここにいうＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの
前駆体とはＤＡＨＰ３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ
シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノ
ールピルビルシキミ酸−３−リン酸、コリズミン酸、プ
レフェン酸、フェニルピルピン酸などをいう。
前駆体とはＤＡＨＰ３−デヒドロキナ酸、３−デヒドロ
シキミ酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノ
ールピルビルシキミ酸−３−リン酸、コリズミン酸、プ
レフェン酸、フェニルピルピン酸などをいう。
このような変異株の例としては先に述べた米国特許３，
６６０，２３５、米国特許３，７５９，９７０、特開昭
５６−６４７９３等に記載されている。
６６０，２３５、米国特許３，７５９，９７０、特開昭
５６−６４７９３等に記載されている。
ＤＳ遺伝子として、野性型のものを用いることができる
し、更に変異株の遺伝子を用いることもできる。変異株
遺伝子として、フェニルアラニンとチロシンによる相乗
阻害の程度が軽減されたＤＳをコードするように変異さ
れたものが特に好ましい。
し、更に変異株の遺伝子を用いることもできる。変異株
遺伝子として、フェニルアラニンとチロシンによる相乗
阻害の程度が軽減されたＤＳをコードするように変異さ
れたものが特に好ましい。
変異型の遺伝子を得るには、ＤＮＡ供与菌を変異処理し
てもよいし、ＤＳ遺伝子をベクタープラスミドに挿入
後、得られた組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入し得ら
れた形質転換株を変異処理しても良い。更に、上記組換
えＤＮＡ自体を生体外で変異処理しても、変異型遺伝子
を得ることもできる。
てもよいし、ＤＳ遺伝子をベクタープラスミドに挿入
後、得られた組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入し得ら
れた形質転換株を変異処理しても良い。更に、上記組換
えＤＮＡ自体を生体外で変異処理しても、変異型遺伝子
を得ることもできる。
染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間等を調節
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。
して切断の程度を調節すれば、巾広い種類の制限酵素が
使用できる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあげ
られる。
(1) ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９参照 (2) ｐＡＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５参照 (3) ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００参照 (4) ｐＡＪ ６１１ 同 上 (5) ｐＡＪ １８４４ 同 上 (6) ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００参照 (7) ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７参照 (8) ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９参照 (9) ｐＣＧ １１ 同 上 プラスミドベクターＤＮＡの開裂は、当該ＤＮＡを一箇
所で切断する制限酵素を用いて切断するか、複数部位を
切断する制限酵素を用いて部分的に切断することにより
行う。
所で切断する制限酵素を用いて切断するか、複数部位を
切断する制限酵素を用いて部分的に切断することにより
行う。
ベクターＤＮＡは、染色体遺伝子を切断した際に用いら
れた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続しせめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライゲーション反応に付される。
れた制限酵素により切断され、または染色体ＤＮＡ切断
フラグメント及び切断されたベクターＤＮＡのそれぞれ
の両端に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を接続しせめて、ついでプラスミドベクターと染色体Ｄ
ＮＡフラグメントとのライゲーション反応に付される。
このようにして得られた、染色体ＤＮＡとベクタープ
ラスミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容
菌へ導入するには、エシェリヒア・コリＫ−１２につい
て報告されている様なジャーナル・オブ・モレキュラー
バイオロジー（J.Mol.,Biol.,）５３巻，１５９頁，１
９７０年）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮ
Ａの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスに
ついて報告されている様に（ジーン（Ｇｅｎｅ），１
巻，１５３頁，１９７７年細胞がＤＮＡを取り込み得る
様になる増殖段階（いわゆるコンビテントセル）に導入
する方法により可能である。あるいは、バチルス・ズブ
チリス、放射菌類および酵母について知られている様に
（モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Molec.Gen.,Genet.）１６８巻，１１１頁，１９７９
年；ネイチャー（Natuer），２７４巻，３９８頁，１９
７８年；プロスィーティング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスUSA（Proc.Natl.Acad.Sei・US
A），７５巻，１９２９頁，１９７８年、ＤＮＡ受容菌
を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプロトプラスト
またはスフェロプラストにしてプラスミドをＤＮＡ受容
菌に導入することも可能である。
ラスミドとの組換えＤＮＡをコリネ型細菌に属する受容
菌へ導入するには、エシェリヒア・コリＫ−１２につい
て報告されている様なジャーナル・オブ・モレキュラー
バイオロジー（J.Mol.,Biol.,）５３巻，１５９頁，１
９７０年）受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮ
Ａの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブチリスに
ついて報告されている様に（ジーン（Ｇｅｎｅ），１
巻，１５３頁，１９７７年細胞がＤＮＡを取り込み得る
様になる増殖段階（いわゆるコンビテントセル）に導入
する方法により可能である。あるいは、バチルス・ズブ
チリス、放射菌類および酵母について知られている様に
（モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス
（Molec.Gen.,Genet.）１６８巻，１１１頁，１９７９
年；ネイチャー（Natuer），２７４巻，３９８頁，１９
７８年；プロスィーティング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンスUSA（Proc.Natl.Acad.Sei・US
A），７５巻，１９２９頁，１９７８年、ＤＮＡ受容菌
を、プラスミドＤＮＡを容易に取り込むプロトプラスト
またはスフェロプラストにしてプラスミドをＤＮＡ受容
菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込
ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニッ
クＦ６８（セルバ社）などの添加によつてＤＮＡのとり
込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭５７−１８３７９９に記載されたコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属のプロト
プラストにポリエチレングリコールまたはポリビニルア
ルコールと二価金属イオンとの存在下にＤＮＡをとり込
ませる方法も当然利用できる。ポリエチレングリコール
またはポリビニルアルコールの代りに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フィコール、ブルロニッ
クＦ６８（セルバ社）などの添加によつてＤＮＡのとり
込みを促進させる方法でも同等の結果が得られる。
Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン生産菌とし
て、野生株あるいはＤＳ欠損株を宿主として形質転換し
た株を用いることができるが、以下に示すように宿主を
用いればよりＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の生産性が高い菌株が得られることがある。
て、野生株あるいはＤＳ欠損株を宿主として形質転換し
た株を用いることができるが、以下に示すように宿主を
用いればよりＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の生産性が高い菌株が得られることがある。
チロシンの場合 コリネバクテリウム属のフェニルアラニンを要求し３−
アミノチロシン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フ
ルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株日本農芸化学会誌（Agric.Biol.Che
m.），３７巻，２０１３頁，（１９７３），ブレビバク
テリウム属のｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示
す変異株日本農芸化学会誌（Agric.Biol.Chem.），３７
巻，２３２７頁，１９７３年等がある。
アミノチロシン、ｐ−アミノフェニルアラニン、ｐ−フ
ルオロフェニルアラニン、チロシンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株日本農芸化学会誌（Agric.Biol.Che
m.），３７巻，２０１３頁，（１９７３），ブレビバク
テリウム属のｍ−フルオロフェニルアラニンに耐性を示
す変異株日本農芸化学会誌（Agric.Biol.Chem.），３７
巻，２３２７頁，１９７３年等がある。
フェニルアラニンの場合 プレビバクテリウム属のｍ−フルオロフェニルアラニン
耐性を有する変異株日本農芸化学会誌（Agric.Biol.Che
m.），３７巻，２３２７頁，１９７３年）、ブレビバク
テリウム属のチロシン、メチオニンを要求し５−メチル
トリプトファン、ｐ−フルオロフェニルアラニンに耐性
を有する変異株（特開昭４９−１１６２９４）、ブレビ
バクテリウム属のチロシン、メチオニンを要求し、５−
メチルトリプトファン、ｐ−フルオロフェニルアラニン
耐性、デコイニン感受性を有する変異株（特開昭５６−
６４７９３）コリネバクテリウム属のチロシンを要求
し、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニ
ルアラニンに耐性を有する変異株（日本農芸化学会誌
（Agric.Biol.Chem.，３８巻，１５７頁，１９７４年）
等がある。
耐性を有する変異株日本農芸化学会誌（Agric.Biol.Che
m.），３７巻，２３２７頁，１９７３年）、ブレビバク
テリウム属のチロシン、メチオニンを要求し５−メチル
トリプトファン、ｐ−フルオロフェニルアラニンに耐性
を有する変異株（特開昭４９−１１６２９４）、ブレビ
バクテリウム属のチロシン、メチオニンを要求し、５−
メチルトリプトファン、ｐ−フルオロフェニルアラニン
耐性、デコイニン感受性を有する変異株（特開昭５６−
６４７９３）コリネバクテリウム属のチロシンを要求
し、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−アミノフェニ
ルアラニンに耐性を有する変異株（日本農芸化学会誌
（Agric.Biol.Chem.，３８巻，１５７頁，１９７４年）
等がある。
ＤＳ遺伝子のほかに、以下の遺伝子が挿入されていれば
Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの生産性がよ
り高くなることが多い。
Ｌ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの生産性がよ
り高くなることが多い。
これらの遺伝子としては、３−デヒドロキナ酸シンター
ゼ酸遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝
子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、シキミ酸キナー
ゼ遺伝子、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
シンターゼ遺伝子、コリズミ酸シンターゼ遺伝子等があ
げられる。
ゼ酸遺伝子、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝
子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、シキミ酸キナー
ゼ遺伝子、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸
シンターゼ遺伝子、コリズミ酸シンターゼ遺伝子等があ
げられる。
またフェニルアラニン又はチロシン生産菌を得ようとす
るときは、プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子、プレフ
ェン酸トランスアミナーゼ、プレチロシンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子
等がＤＳ遺伝子のほかに挿入されていることが望まし
い。
るときは、プレフェン酸デヒドラターゼ遺伝子、プレフ
ェン酸トランスアミナーゼ、プレチロシンデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子、チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子
等がＤＳ遺伝子のほかに挿入されていることが望まし
い。
このようにして得られたＬ−フェニルアラニンまたはＬ
−チロシン生産能を有するコリネ型細菌を培養してＬ−
フェニルアラニンまたはＬ−チロシンを生産蓄積せしめ
る方法は、従来コリネ型細菌によるＬ−フェニルアラニ
ンまたはＬ−チロシンの製造のために使用されていた方
法と特に大きく違う点はない。即ち、培地としては、炭
素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、
ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものであ
る。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラク
トース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエ
イ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニア
ガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用でき
る。
−チロシン生産能を有するコリネ型細菌を培養してＬ−
フェニルアラニンまたはＬ−チロシンを生産蓄積せしめ
る方法は、従来コリネ型細菌によるＬ−フェニルアラニ
ンまたはＬ−チロシンの製造のために使用されていた方
法と特に大きく違う点はない。即ち、培地としては、炭
素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、
ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものであ
る。炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラク
トース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエ
イ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニア
ガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用でき
る。
培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の生産蓄積が停止するまで行なわれる。
つ、実質的にＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の生産蓄積が停止するまで行なわれる。
実施例 (1) ＤＳ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調製 染色体ＤＮＡの調製源としては、フェニルアラニンによ
るＤＳの阻害が解除したことによって、フェニルアラニ
ンアナログであるｍ−フルオロフェニルアラニンに対し
て抵抗性を有するに到ったフェニルアラニン生産菌ブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ１９５７（FE
RM−Ｐ６６７３）を用いた。
るＤＳの阻害が解除したことによって、フェニルアラニ
ンアナログであるｍ−フルオロフェニルアラニンに対し
て抵抗性を有するに到ったフェニルアラニン生産菌ブレ
ビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ１９５７（FE
RM−Ｐ６６７３）を用いた。
この菌を１のＣＭＧ培地（ペプトン１ｇ／dl、酵母エ
キス１ｇ／dl、グルコース０．５ｇ／dl、及びＮａＣｌ
０．５ｇ／dlを含み、pH７．２に調整したもの）に植菌
し、３０℃で約３時間振盪培着を行ない、対数増殖期の
菌体を集めた。
キス１ｇ／dl、グルコース０．５ｇ／dl、及びＮａＣｌ
０．５ｇ／dlを含み、pH７．２に調整したもの）に植菌
し、３０℃で約３時間振盪培着を行ない、対数増殖期の
菌体を集めた。
この菌体をリゾチール・ＳＤＳで溶菌させたのち、通常
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製
し、最終的に３．５mgのＤＮＡを得た。
のフェノール処理法により、染色体ＤＮＡを抽出精製
し、最終的に３．５mgのＤＮＡを得た。
(2) ベクターＤＮＡの調製 ベクターとしてpAJ１８４４（分子量５．４メガダルト
ン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。
ン）を用い、そのＤＮＡを次の様にして調製した。
まずpAJ１８４４をプラスミドとして保有するプレビバ
クテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12037（FERMBP-57
7）を１００mlのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理によ
り溶菌させ、３０，０００×ｇ，３０分の超遠心により
上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタノール
を加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少量のＴＥＮ緩
衝液（２０ｍＭトリス塩酸基、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ（pH８．０））に溶解後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844プラスミ
ドＤＮＡ約１５μｇを得た。
クテリウム・ラクトフェルメンタムAJ12037（FERMBP-57
7）を１００mlのＣＭＧ培地に接種し、３０℃で対数増
殖期後期まで培養したのち、リゾチームＳＤＳ処理によ
り溶菌させ、３０，０００×ｇ，３０分の超遠心により
上清を得た。フェノール処理ののち、２容のエタノール
を加えてＤＮＡを沈澱回収した。これを少量のＴＥＮ緩
衝液（２０ｍＭトリス塩酸基、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１
ｍＭ ＥＤＴＡ（pH８．０））に溶解後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ分離後、切り出してpAJ1844プラスミ
ドＤＮＡ約１５μｇを得た。
(3) 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体ＤＮＡ１０μｇと(2)で得たプラスミド
ＤＮＡ５μｇとを制限エンドヌクアーゼＰａｔＩでそれ
ぞ３７℃に１時間保持し、切断した。６５℃に１０分間
加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼに
よって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ鎖を連結せしめ
た。ついで反応液を、６５℃にて５分間加熱し、反応液
に２倍容のエタノールを加えて連結されたＤＮＡの沈澱
を採取した。
ＤＮＡ５μｇとを制限エンドヌクアーゼＰａｔＩでそれ
ぞ３７℃に１時間保持し、切断した。６５℃に１０分間
加熱した後、両反応液を混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトール存在下、Ｔ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼに
よって１０℃に２４時間保持しＤＮＡ鎖を連結せしめ
た。ついで反応液を、６５℃にて５分間加熱し、反応液
に２倍容のエタノールを加えて連結されたＤＮＡの沈澱
を採取した。
(4) ＤＳ遺伝子クローニング ＤＮＡ受容菌としては、ｍ−フルオロフェニルアラニン
感受性のプレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ
12036（ＦＥＲＭ Ｐ−７５５９，ＦＥＲＭ ＢＰ−７
３４）を用いた。
感受性のプレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムAJ
12036（ＦＥＲＭ Ｐ−７５５９，ＦＥＲＭ ＢＰ−７
３４）を用いた。
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた、まず、菌株を５mlのＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニット／ml添加後、さらに１．５時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍシュー
クロース、２０ｍＭマレイン酸、２０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄｉｆｃｏ）からな
るＳＭＭＰ培地（pH６．５）０．５mlで洗浄した。次い
で１０mg／mlのリゾチームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し
３０℃で２０時間プロトプラスト化を図った。６０００
×ｇ，１０分間遠心分離後、プロトプラストをＳＭＭＰ
で洗浄し０．５mlのＳＭＭＰに再度懸濁した。この様に
して得られたプロトプラストと(3)で調製したＤＮＡ１
０μｇを５ｍＭ ＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチン
レングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加した
後、ＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるために室温
に２分間放置した。このプロトプラストをＳＭＭＰ培地
１mlで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１mlに再懸濁し、形質発現
のため、３０℃で２時間培養した。この培養液をpH７．
０のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラ
スト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン１２ｇ、ＫＣｌ０．５ｇ、グコース
１０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ８．１ｇ、ＣａＣｌ２・
２Ｈ２Ｏ２．２ｇ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４
ｇ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ
４０．２ｇ、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８ｇ及
びクロラムフェニコール３μg/mlを含む。
ーメーション法を用いた、まず、菌株を５mlのＣＭＧ液
体培地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを
０．６ユニット／ml添加後、さらに１．５時間振盪培養
し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５Ｍシュー
クロース、２０ｍＭマレイン酸、２０ｍＭ塩化マグネシ
ウム、３．５％ペナッセイブロス（Ｄｉｆｃｏ）からな
るＳＭＭＰ培地（pH６．５）０．５mlで洗浄した。次い
で１０mg／mlのリゾチームを含むＳＭＭＰ培地に懸濁し
３０℃で２０時間プロトプラスト化を図った。６０００
×ｇ，１０分間遠心分離後、プロトプラストをＳＭＭＰ
で洗浄し０．５mlのＳＭＭＰに再度懸濁した。この様に
して得られたプロトプラストと(3)で調製したＤＮＡ１
０μｇを５ｍＭ ＥＤＴＡ存在下で混合し、ポリエチン
レングリコールを最終濃度が３０％になる様に添加した
後、ＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるために室温
に２分間放置した。このプロトプラストをＳＭＭＰ培地
１mlで洗浄後、ＳＭＭＰ培地１mlに再懸濁し、形質発現
のため、３０℃で２時間培養した。この培養液をpH７．
０のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプラ
スト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン１２ｇ、ＫＣｌ０．５ｇ、グコース
１０ｇ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ８．１ｇ、ＣａＣｌ２・
２Ｈ２Ｏ２．２ｇ、ペプトン４ｇ、粉末酵母エキス４
ｇ、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社）１ｇ、Ｋ２ＨＰＯ
４０．２ｇ、コハク酸ナトリウム１３５ｇ、寒天８ｇ及
びクロラムフェニコール３μg/mlを含む。
３０℃で２週間培養後、約２５０００個のクロラムフェ
ニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをｍ−フ
ルオロフェニルアラニン５００μg/mlを含む最少培地
（２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、０．３％尿
素、０．１％りん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マ
グネシウム７水塩、２ppm鉄イオン、２ppmマンガンイオ
ン、２００μｇ／サイアミン塩酸塩、５０μｇ／ビ
オチン、クロラムフェニコール１０μg/ml、pH７．０、
寒天１．８％）にレプリカし、クロラムフェニコール耐
性でかつｍ−フルオロフェニルアラニン耐性の菌株５株
を得た。
ニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれをｍ−フ
ルオロフェニルアラニン５００μg/mlを含む最少培地
（２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、０．３％尿
素、０．１％りん酸二水素カリウム、０．０４％硫酸マ
グネシウム７水塩、２ppm鉄イオン、２ppmマンガンイオ
ン、２００μｇ／サイアミン塩酸塩、５０μｇ／ビ
オチン、クロラムフェニコール１０μg/ml、pH７．０、
寒天１．８％）にレプリカし、クロラムフェニコール耐
性でかつｍ−フルオロフェニルアラニン耐性の菌株５株
を得た。
(5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液を調製
し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドＤＮ
Ａを検出したところ、全ての株でベクターのpAJ１８４
４よりも明らかに大きなプラスミドが検出された。
し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドＤＮ
Ａを検出したところ、全ての株でベクターのpAJ１８４
４よりも明らかに大きなプラスミドが検出された。
５株のブラスミドをそれぞれ組換えに用いた制限酵素Ps
tＩで切断するとその内の４株には共通な６．７kbのＤ
ＮＡ挿入断片が認められた。
tＩで切断するとその内の４株には共通な６．７kbのＤ
ＮＡ挿入断片が認められた。
また、他の１株には、３．７kb、３．０kb、１．７kb、
１．６kb、１．４kb、１．３kb、０．８kb、０．７kb、
０．４kbの９個のＤＮＡ挿入断片が認められた。ベクタ
ーpAJ１８４４のPatＩ切断点に、前者の６．７kbのPat
Ｉ断片を有する組換えプラスミドをpAR−２と名付け、
後者の９個のPatＩＤＮＡ断片を有する組換えプラスミ
ドをpAR−１と名付け、pAR−１を保持する株をAJ12181
（FERM-P７９４８）、pAR−２を保持する株をAJ12182
（ＦＥＲＭ Ｐ−７９４７，ＦＥＲＭ ＢＰ−９１７）
と名付けた。尚pAR−２は第１図に示す制限酵素地図を
有する。
１．６kb、１．４kb、１．３kb、０．８kb、０．７kb、
０．４kbの９個のＤＮＡ挿入断片が認められた。ベクタ
ーpAJ１８４４のPatＩ切断点に、前者の６．７kbのPat
Ｉ断片を有する組換えプラスミドをpAR−２と名付け、
後者の９個のPatＩＤＮＡ断片を有する組換えプラスミ
ドをpAR−１と名付け、pAR−１を保持する株をAJ12181
（FERM-P７９４８）、pAR−２を保持する株をAJ12182
（ＦＥＲＭ Ｐ−７９４７，ＦＥＲＭ ＢＰ−９１７）
と名付けた。尚pAR−２は第１図に示す制限酵素地図を
有する。
(6) 再トランスホーメーション (5)で検出されたＤＮＡ断片を含む組換えプラスミド上
にｍ−フルオロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝
子が存在することを確認するためこのプラスミドＤＮＡ
pAR−１とpAR−２を用い、ブレビバクレチウム・ラク
トフェルメンタムＡＪ１２０３６を再度、形質転換し
た。
にｍ−フルオロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝
子が存在することを確認するためこのプラスミドＤＮＡ
pAR−１とpAR−２を用い、ブレビバクレチウム・ラク
トフェルメンタムＡＪ１２０３６を再度、形質転換し
た。
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ５０個を釣り上げｍ−フルオロフェニルアラニンに対
する感受性をテストしたところ、これらのいずれも耐性
が付与されており、上記のプラスミド上に、ｍ−フルオ
ロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝子が存在する
ことが明らかとなつた。
れ５０個を釣り上げｍ−フルオロフェニルアラニンに対
する感受性をテストしたところ、これらのいずれも耐性
が付与されており、上記のプラスミド上に、ｍ−フルオ
ロフェニルアラニン抵抗性を付与する遺伝子が存在する
ことが明らかとなつた。
(7) 形質転換株のＤＳ活性 被検株をフェニルアラニン生産培地（グルコース１３０
ｇ、（NH４）２SO４１０ｇ，KHＰ２PO４１ｇ，MgSO４・
７ＨＰ２Ｏ１ｇ，フマル酸１２ｇ、酢酸３ml、大豆蛋白
酸加水分解液「味液」５０ml，FeSO４・７Ｈ２Ｏ１０m
g，MnSO４・４Ｈ２Ｏ１０mg、ビオチン５０μｇ、サイ
アミン塩酸塩２０００μｇ及びCaCO３５０ｇを水１に
含む。pH７．０）２０mlで３０℃にて１５時間培養した
菌体より、超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
３２０００×ｇ，２０分間遠心分離して上清を得た。こ
の上清を粗酵素液として用い、５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（pH７．５）、０．５ｍＭホスホエノールピルビン
酸、０．５ｍＭエリスロース−４−リン酸から成る１．
０mlの反応液中で３０℃、１０分間反応させ、反応終了
後０．２mlのトリクロロ酢酸を加え酵素を失活させる。
変性蛋白を遠心除去後、得られた上清０．２５mlに０．
２５mlの０．０２５Ｍ過ヨウ素酸を加え、３７℃で３０
分間インキュベートする。これに０．５mlの２％亜砒酸
ナトリウムを加え酸化反応を停止後、２．０mlの０．３
％２−チオバルビツール酸を加え１００℃で８分間加熱
する。反応液の５７９ｎｍの吸光度を測定し、ＤＡＨＰ
の分子吸光係数４．５×１０４（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），２４１
巻，３３６５頁，１９６６年）を使用して酵素活性を求
めた。また、反応液中にフェニルアラニン，チロシンの
いずれか、或いはその両者を１ｍＭづつ添加した時の活
性も測定し、無添加時を１００％として表示した。第１
表に測定結果を示す。
ｇ、（NH４）２SO４１０ｇ，KHＰ２PO４１ｇ，MgSO４・
７ＨＰ２Ｏ１ｇ，フマル酸１２ｇ、酢酸３ml、大豆蛋白
酸加水分解液「味液」５０ml，FeSO４・７Ｈ２Ｏ１０m
g，MnSO４・４Ｈ２Ｏ１０mg、ビオチン５０μｇ、サイ
アミン塩酸塩２０００μｇ及びCaCO３５０ｇを水１に
含む。pH７．０）２０mlで３０℃にて１５時間培養した
菌体より、超音波処理により、溶菌液を調製し、これを
３２０００×ｇ，２０分間遠心分離して上清を得た。こ
の上清を粗酵素液として用い、５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（pH７．５）、０．５ｍＭホスホエノールピルビン
酸、０．５ｍＭエリスロース−４−リン酸から成る１．
０mlの反応液中で３０℃、１０分間反応させ、反応終了
後０．２mlのトリクロロ酢酸を加え酵素を失活させる。
変性蛋白を遠心除去後、得られた上清０．２５mlに０．
２５mlの０．０２５Ｍ過ヨウ素酸を加え、３７℃で３０
分間インキュベートする。これに０．５mlの２％亜砒酸
ナトリウムを加え酸化反応を停止後、２．０mlの０．３
％２−チオバルビツール酸を加え１００℃で８分間加熱
する。反応液の５７９ｎｍの吸光度を測定し、ＤＡＨＰ
の分子吸光係数４．５×１０４（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），２４１
巻，３３６５頁，１９６６年）を使用して酵素活性を求
めた。また、反応液中にフェニルアラニン，チロシンの
いずれか、或いはその両者を１ｍＭづつ添加した時の活
性も測定し、無添加時を１００％として表示した。第１
表に測定結果を示す。
得られた組換プラスミドが導入されることにより、ＤＳ
活性は２．６〜１４倍に増大し、各アミノ酸による活性
阻害パターンも、野性株型から変異株型に変化してお
り、pAR−１，pAR−２にコードされたｍ−フルオロフェ
ニルアラニン耐性遺伝子は、ＤＳ遺伝子であることは明
らかである。また、pAR−１とpAR−２の有するPst Ｉ
断片が全く異なることより、ＤＳ活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子は２種類以上存在すると考えられる。
活性は２．６〜１４倍に増大し、各アミノ酸による活性
阻害パターンも、野性株型から変異株型に変化してお
り、pAR−１，pAR−２にコードされたｍ−フルオロフェ
ニルアラニン耐性遺伝子は、ＤＳ遺伝子であることは明
らかである。また、pAR−１とpAR−２の有するPst Ｉ
断片が全く異なることより、ＤＳ活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子は２種類以上存在すると考えられる。
(8) ＤＳ遺伝子のサブクローニング pAR−１を制限酵素PstＩで切断し、６５℃、１０分間加
熱した後、ATP及びジチオスレイトール存在下でＴ４フ
ァージ由来のＤＮＡリガーゼによつて４℃に一晩放置し
ＤＮＡ鎖を連結せしめた。ついで反応を６５℃にて１０
分間加熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結
されたＤＮＡの沈澱を採取した。これに少量のＴＥＮ緩
衝液を加え形質転換に用いた。
熱した後、ATP及びジチオスレイトール存在下でＴ４フ
ァージ由来のＤＮＡリガーゼによつて４℃に一晩放置し
ＤＮＡ鎖を連結せしめた。ついで反応を６５℃にて１０
分間加熱し、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結
されたＤＮＡの沈澱を採取した。これに少量のＴＥＮ緩
衝液を加え形質転換に用いた。
(4)で示した形質転換方法を用いてブレビバクテリウム
・ラクトフェルメンタムAJ12036を形質転換した。３０
℃で２週間クロラムフェニコール３μg/mlを含む再生培
地で再生させた後、ｍ−フルオロフェニルアラニン５０
０μg/mlを含む最少培地にレプリカし、クロラムフェニ
コール耐性でかつｍ−フルオロフェニルアラニン耐性と
なつた株を多数得た。これらの株のいくつかが、pAR-1
より小型のプラスミド群を有していた。このうちの最も
小型化したプラスミドをpAR-112と名付け、pAR-112を有
する株をAJ12183（FERM-p７９４６）と名付けた。尚pAR
-112は、第２図に示す制限酵素地図を有する。
・ラクトフェルメンタムAJ12036を形質転換した。３０
℃で２週間クロラムフェニコール３μg/mlを含む再生培
地で再生させた後、ｍ−フルオロフェニルアラニン５０
０μg/mlを含む最少培地にレプリカし、クロラムフェニ
コール耐性でかつｍ−フルオロフェニルアラニン耐性と
なつた株を多数得た。これらの株のいくつかが、pAR-1
より小型のプラスミド群を有していた。このうちの最も
小型化したプラスミドをpAR-112と名付け、pAR-112を有
する株をAJ12183（FERM-p７９４６）と名付けた。尚pAR
-112は、第２図に示す制限酵素地図を有する。
(9) 各形質転換株のフェニルアラニン及びチロシンの
生産能 上記のpAR-1を用い、ｍ−フルオロフェニルアラニン耐
性株ブレビバクテリウム・ラクトフェニルメンタムAJ12
184を(4)で述べた方法により形質転換し、クロラムフェ
ニコール耐性を指標として形質転換株を選択した。かく
して得られたAJ12185（ＦＥＲＭ Ｐ−７９４５，ＢＰ
−９１６Ｄ及び上記のAJ12036，AJ12181，AJ12182，AJ1
2183を培養し、フェニルアランニン及びチロシンの生産
能を調べたところ、第２表に示す結果を得た。
生産能 上記のpAR-1を用い、ｍ−フルオロフェニルアラニン耐
性株ブレビバクテリウム・ラクトフェニルメンタムAJ12
184を(4)で述べた方法により形質転換し、クロラムフェ
ニコール耐性を指標として形質転換株を選択した。かく
して得られたAJ12185（ＦＥＲＭ Ｐ−７９４５，ＢＰ
−９１６Ｄ及び上記のAJ12036，AJ12181，AJ12182，AJ1
2183を培養し、フェニルアランニン及びチロシンの生産
能を調べたところ、第２表に示す結果を得た。
培養は(7)で述べたフェニルアラニン生産培地２０mlを
５００mlの肩付フラスコに入れたものに被検菌株を植え
つけ、３０℃にて７２時間、振盪下に行なった。培養
後、６Ｎの水酸化カリウム溶液２mlを添加し析出したＬ
−チロシンを溶解させ遠心上清中のＬ−フェニルアラニ
ン及びＬ−チロシンを液体クロマトグラフィーにより定
量した。
５００mlの肩付フラスコに入れたものに被検菌株を植え
つけ、３０℃にて７２時間、振盪下に行なった。培養
後、６Ｎの水酸化カリウム溶液２mlを添加し析出したＬ
−チロシンを溶解させ遠心上清中のＬ−フェニルアラニ
ン及びＬ−チロシンを液体クロマトグラフィーにより定
量した。
尚、AJ12184を得るためには寄託されたAJ12185より宿主
細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを除去
することが可能である。即ち、プラスミドは宿主より自
然に失なわれることもあるし、「除去」操作によって除
くこともできる（バクテリオロジカルデビュー（Bact.R
ev.），３６巻，３６１〜４０５頁，１９７２年）。他
の除去操作の例は以下の通りである。AJ12185をＣＭＧ
液体培地に接種し、３７℃で一晩培養（高温処理）後、
培養液を適当に希釈し、クロラムフェニコールを含有し
又は含有しないＣＭＧ寒天培地に塗布し、３０℃で１〜
３日間培養する。かくしてクロラムフェニコール感受性
株として分離される株がAJ12184である。
細胞を損うことなく宿主細胞中の複合プラスミドを除去
することが可能である。即ち、プラスミドは宿主より自
然に失なわれることもあるし、「除去」操作によって除
くこともできる（バクテリオロジカルデビュー（Bact.R
ev.），３６巻，３６１〜４０５頁，１９７２年）。他
の除去操作の例は以下の通りである。AJ12185をＣＭＧ
液体培地に接種し、３７℃で一晩培養（高温処理）後、
培養液を適当に希釈し、クロラムフェニコールを含有し
又は含有しないＣＭＧ寒天培地に塗布し、３０℃で１〜
３日間培養する。かくしてクロラムフェニコール感受性
株として分離される株がAJ12184である。
第１図はプラスミドpAR-2の制限酵素地図である。第２
図はプラスミドpAR-112の制御酵素地図である。各図
中、 はpAJ1844， は挿入遺伝子；Ｅ，Ｐ，Ｓ，ＢはそれぞれEcoRI，Pst
I，SalI，BamHIを示す。
図はプラスミドpAR-112の制御酵素地図である。各図
中、 はpAJ1844， は挿入遺伝子；Ｅ，Ｐ，Ｓ，ＢはそれぞれEcoRI，Pst
I，SalI，BamHIを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） 審査官 平田 和男
Claims (4)
- 【請求項１】コリネ型細菌に属するＤＮＡ供与菌より得
られ制限酵素地図Ｉで表現される３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−ヘプチュロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片、又はコリネ型細菌に属するＤＮＡ供
与菌より得られ制限酵素地図ＩＩで表現される３−デオ
キシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチュロン酸−７−リン酸シン
ターゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が、コリネ型細菌の菌体
内で自律複製できるベクタープラスミドに接続されて、
コリネ型細菌に属するＤＮＡ受容菌に導入されて得られ
るＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン生産能を有
する微生物を培養し、培養液中に蓄積されたＬ−フェニ
ルアラニンまたはＬ−チロシンを採取することを特徴と
するＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシンの製造
法。 - 【請求項２】コリネ型細菌に属するＤＮＡ供与菌がｍ−
フルオロフェニルアラニン耐性であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載のＬ−フェニルアラニンまた
はＬ−チロシンの製造法。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ断片に
コードされる３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチュロ
ン酸−７−リン酸シンターゼが、Ｌ−チロシンおよびＬ
−フェニルアラニンによる相乗的フイードバック阻害が
解除されたものであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載のＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の製造法。 - 【請求項４】コリネ型細菌に属するＤＮＡ受容菌がｍ−
フルオロフェニルアラニン耐性であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項ないし第３項記載のＬ−フェニル
アラニンまたはＬ−チロシンの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59245700A JPH0672B2 (ja) | 1984-11-20 | 1984-11-20 | 発酵法によるｌ―フェニルアラニンまたはｌ―チロシンの製造法 |
| DE8585114713T DE3576523D1 (de) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Rekombinante dna enthaltende coryneformbakterien und verfahren zur herstellung von aromatischen aminosaeuren unter verwendung dieser bakterien. |
| EP85114713A EP0183175B1 (en) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Coryneform bacteria carrying recombinant dna and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
| US07/316,961 US4968609A (en) | 1984-11-20 | 1989-02-28 | Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59245700A JPH0672B2 (ja) | 1984-11-20 | 1984-11-20 | 発酵法によるｌ―フェニルアラニンまたはｌ―チロシンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61124375A JPS61124375A (ja) | 1986-06-12 |
| JPH0672B2 true JPH0672B2 (ja) | 1994-01-05 |
Family
ID=17137504
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59245700A Expired - Lifetime JPH0672B2 (ja) | 1984-11-20 | 1984-11-20 | 発酵法によるｌ―フェニルアラニンまたはｌ―チロシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0672B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009153382A (ja) | 2006-03-30 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co Inc | メタノール資化性細菌を用いたカルボン酸の製造法 |
| US12077786B2 (en) * | 2018-02-02 | 2024-09-03 | Lonza Ltd | Methods of cell selection and modifying cell metabolism |
-
1984
- 1984-11-20 JP JP59245700A patent/JPH0672B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61124375A (ja) | 1986-06-12 |
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