JPH055480B2 - - Google Patents
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- JPH055480B2 JPH055480B2 JP60191523A JP19152385A JPH055480B2 JP H055480 B2 JPH055480 B2 JP H055480B2 JP 60191523 A JP60191523 A JP 60191523A JP 19152385 A JP19152385 A JP 19152385A JP H055480 B2 JPH055480 B2 JP H055480B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘ
プチユロン酸−７−リン酸シンターゼ（以下
「DS」と記す）が組込まれている組換えDNAを
有するコリネ型細菌及びそれを用いるＬ−トリプ
トフアンの製造法に関する。 従来の技術 DSは、ホスホエノールピルビン酸とエリスロ
ース４−リン酸よりの３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプチユロン酸−７−リン酸（以下
「DAHP」と記す）の合成を触媒する酵素であ
り、DAHPは、コリスミ酸を経由してフエニル
アラニン、チロシン又はトリプトフアンに変換さ
れる。コリネ型細菌では、DS活性は、最終生産
物であるフエニルアラニンとチロシンによる相乗
的な阻害を受けることが知られており、Ｌ−トリ
プトフアン生産菌を育種する場合、この阻害の解
除した強力なDS活性を保持する株を選択するこ
とが重要である。 一方、組換えDNA法を用いて、コリネ型細菌
におけるＬ−トリプトフアン生産菌を育種するこ
とは、特開昭59−156292で報告されているが、
DSをコードする遺伝子が組込まれたものではな
い。また、DSをコードする遺伝子を含有する組
換えDNAを有するコリネ型細菌において、Ｌ−
フエニルアラニンあるいはＬ−チロシン生産菌を
育種した例は、特願昭59−245700で報告されてい
るがＬ−トリプトフアン生産菌を育種した例は無
い。 即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸
生産菌に属するDNA供与菌より得られ、第１図
あるいは第２図中挿入遺伝子部分の制限酵素地図
で表現される３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
チユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含む
DNA断片、あるいは該断片を短縮化することに
よつて得られる３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘ
プチユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含
むDNA断片が、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラスミ
ドに接続されて、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌に属するDNA受容菌に導入されて得られる
Ｌ−トリプトフアン生産能を有する微生物を培養
し、培養液中に蓄積されたＬ−トリプトフアンを
採取することを特徴とするＬ−トリプトフアンの
製造法である。さらに本願発明は、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌に属するDNA供与菌が
ｍ−フルオロフエニルアラニン耐性であることを
特徴とする前記のＬ−トリプトフアンの製造法で
ある。 発明が解決しようとする問題点 この発明は、Ｌ−トリプトフアンの生産性がよ
り高い微生物を得ること、及びそれによつてＬ−
トリプトフアンのより効率のよい製造法を見い出
すことにある。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現しDSをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換え
DNAを有するコリネ型細菌を分離することに成
功し、得られたコリネ型細菌がＬ−トリプトフア
ンの高い生産性を有することを見い出した。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bacteria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない稈菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。 【表】 エ
【表】 ニアフイラム
本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 DS遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌の
DS遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura
Biochem，Biophys.Acta 72，619，（1963）の方
法が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断
する。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得る
プラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のDS欠損変異株を形
質転換せしめ、DS生成活性を保有するにいたつ
た菌株を単離し、これによりDS遺伝子を分離で
きる。 また、同様の組換えDNAを用いてコリネ型細
菌の野生株を形質転換せしめ、DS活性に阻害効
果を有する芳香族アミノ酸のアンタゴニストなど
に耐性を保持するにいたつた菌株を単離し、これ
よりDS遺伝子を分離することも可能である。 芳香族アミノ酸のアンタゴニストの例として
は、ｏ−フルオロフエニルアラニン、ｍ−フルオ
ロフエニルアラニン、ｐ−フルオロフエニルアラ
ニン、ｐ−アミノフエニルアラニン、β−３−チ
エニルアラニン、３−アミノチロシン、チロシン
ヒドロキサメート、５−メチルトリプトフアン等
がある。 DNA供与菌としては、前記の芳香族アミノ酸
アンタゴニスト耐性などの変異を付与することに
より、芳香族アミノ酸またはその前駆体の生合成
活性が高まつたような変異株を用いれば更によ
い。 ここにいう芳香族アミノ酸の前駆体とは
DAHP3−デヒドロキナ酸、３−デヒドロシキミ
酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノ
ールピルビルシキミ酸−３−リン酸、コリズミン
酸、プレフエン酸、フエニルピルビン酸、アント
ラニル酸、インドール３−グリセロールリン酸な
どをいう。 このような変異株の例としては米国特許
3660235、米国特許3759970、特開昭56−64793等
に記載されている。 DS遺伝子として、野性型のものを用いること
ができるし、更に変異株の遺伝子を用いることも
できる。変異株遺伝子として、フエニルアラニン
とチロシンによる相乗阻害の程度が軽減された
DSをコードするように変異されたものが特に好
ましい。 変異型の遺伝子を得るには、DNA供与菌を変
異処理してもよいし、DS遺伝子をベクタープラ
スミドに挿入後、得られた組換えDNAをDNA受
容菌に導入し得られた形質転換株を変異処理して
も良い。更に、上記組換えDNA自体を生体外で
変異処理しても、変異型遺伝子を得ることもでき
る。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pHM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同 上 (5) pAJ 1844 同 上 (6) pCG １ 特開昭57−134500参照 (7) pCG ２ 特開昭58−35197参照 (8) pCG ４ 特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同 上 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酵素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.，Biol.，
53，159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274 398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代わりに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フイコール、ブル
ロニツクF68（セルバ社）などの添加によつて
DNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結
果が得られる。 Ｌ−トリプトフアン生産菌として、野生株ある
いはDS欠損株を宿主として形質転換した株を用
いることができるが、以下に示すような宿主を用
いればよりＬ−トリプトフアンの生産性が高い菌
株が得られることがある。 即ち、ブレビバクテリウム属のフエニルアラニ
ン、チロシンを要求し、５−メチルトリプトフア
ンに耐性を有する変異株（I.Shiio，H.Sato，M.
Nakagawa，Agric.Biol.Chem.36，2315
（1972））、ブレビバクテリウム属のフエニルアラ
ニンを要求し、ｍ−フルオロフエニルアラニン、
５−フルオロトリプトフアンに耐性を有する変異
株（I.Shiio，S.Sugimoto，M.Nakagawa，、
Agric.Biol.Chem.，39，627（1975））、ブレビバク
テリウム属のチロシンを要求し、５−フルオロト
リプトフアン、アザセリンに耐性を有する変異
株、コリネバクテリウム属のフエニルアラニン、
チロシンを要求し、５−メチルトリプトフアン、
４−メチルトリプトフアン、６−フルオロトリプ
トフアン、トリプトフアンヒドロキサメート、ｐ
−フルオロフエニルアラニン、チロシンヒドロキ
サメート、フエニルアラニンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株（H.Hagino，K.
Nakayama，、Agric.Biol.Chem.，39，345
（1975））等がある。 このようにして得られたＬ−トリプトフアン生
産能を有するコリネ型細菌を培養してＬ−トリプ
トフアンを生成蓄積せしめる方法は、従来コリネ
型細菌によるＬ−トリプトフアンの製造のために
使用されていた方法と特に大きく違う点はない。
即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機
微量栄養素を含有する通常のものである。炭素源
としては、グルコース、シユクロース、ラクトー
ス等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエ
イ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アン
モニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その
他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 実施例 (1) DS遺伝子を含む染色体DNAの調製 染色体DNAの調製源としては、フエニルアラ
ニンによるDSの阻害が解除したことによつて、
フエニルアラニンアナログであるｍ−フルオロフ
エニルアラニンに対して抵抗性を有するに到つた
フエニルアラニン生産菌ブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムAJ 11957（FERM−P6673）
を用いた。 この菌を１のCMG培地（ペプトン１ｇ／dl、
酵母エキス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl、及
びNaCl0.5／dlを含み、PH7.2に調整したもの）に
植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得
た。 (2) ベクターDNAの調整 ベクターとしてpAJ 1844（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調整し
た。 まずpAJ 1844をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12037（FERM BP−577）を100mlのCMG培地
に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養したの
ち、リゾチームSDS処理により溶菌させ、30000
×ｇ，30分の超遠心により上清を得た。フエノー
ル処理ののち、２容のエタノールを加えてDNA
を沈澱回収した。これを少量のTEN緩衝液
（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl，1mM
EDTA（PH8.0））に溶解後、アガロースゲル電気
泳動にかけ分離後、切り出してpAJ 1844プラス
ミドDNA約15μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇと(2)で得たプラス
ミドDNA5μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst
１でそれぞれを37℃に１時間保持し、切断した。
65℃に10分間加熱した後、両反応液を混合し、
ATP及びジチオスレイトール存在下、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼによつて10℃に24時間保
持しDNA鎖を連結せしめた。ついで反応液を、
65℃にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。 (4) DS遺伝子のクローニング DNA受容菌としては、ｍ−フルオロフエニル
アラニン感受性のブレビバクテリウム・ラクトフ
エルメンタムAJ12036（FERM Ｐ−7559，
FERM BP−734）を用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ，10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調整したDNA10μｇを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終密度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませるために室
温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現のため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をPH7.0のプロトプラスト再生培
地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留
水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、
MgCl2・6H2O8.1ｇ、CaCl2・2H2O2.2ｇ、ペプ
トン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Difco社）１ｇ、K2HPO4０，２ｇ、コハク酸ナ
トリウム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコ
ール3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約25000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
をｍ−フルオロフエニルアラニン500μｇ／mlを
含む最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモ
ニウム、0.3％尿素、0.1％りん酸二水素カリウ
ム、0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イ
オン、2ppmマンガンイオン、200μｇ／サイア
ミン塩酸塩、50μｇ／ビオチン、クロラムフエ
ニコール10μｇ／ml、PH7.0、寒天1.8％）にレプ
リカし、クロラムフエニコール耐性でかつｍ−フ
ルオロフエニルアラニン耐性の菌株５株を得た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、全ての株でベ
クターのpAJ 1844よりも明らかに大きなプラス
ミドが検出された。 ５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制
限酵素Pst １で切断するとその内の４株には共通
な6.7kbのDNA挿入断片が認められた。 また、他の１株には、3.7kb、3.0kb、1.7kb、
1.6kb、1.4kb、1.3kb、0.8kb、0.7kb、0.4kbの９
個のDNA挿入断片が認められた。ベクターpAJ
1844のPst １切断点に、前者の6.7kbのPst １断
片を有する組換えプラスミドをpAR−２と名付
け、後者の９個のPst 1DNA断片を有する組換え
プラスミドをpAR−１と名付け、pAR−１を保
持する株をAJ 12181（FERM−Ｐ 7948）、pAR
−２を保持する株をAJ 12182（FERM Ｐ−7947，
FERM BP−917）と名付けた。尚pAR−２は第
１図に示す制限酵素地図を有する。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出されたDNA断片を含む組換えプラス
ミド上にｍ−フルオロフエニルアラニン抵抗性を
付与する遺伝子が存在することを確認するためこ
のプラスミドDNApAR−１とpAR−２を用い、
ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ
12036を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ50個を釣り上げｍ−フルオロフエニル
アラニンに対する感受性をテストしたところ、こ
れらのいずれにも耐性が付与されており、上記の
プラスミド上に、ｍ−フルオロフエニルアラニン
抵抗性を付与する遺伝子が存在することが明らか
となつた。 (7) 形質転換株のDS活性 被検株をフエニルアラニン生産培地（グルコー
ス130ｇ、（NH4）2SO410ｇ、KH2PO4１ｇ、
MgSO4・7H2O1ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸３ml、
大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml、FeSO4・
7H2O10mg、MnSO4・4H2O10mg、ビチオン50μ
ｇ、サイアミン塩酸塩2000μｇ及びCaCO350ｇを
水１に含む。PH7.0）20mlで30℃にて15時間培
養した菌体より、超音波処理により、溶菌液を調
製し、これを32000×ｇ、20分間遠心分離して上
清を得た。この上清を粗酵素液として用い、
50mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、0.5mMホス
ホエノールピルビン酸、0.5mMエリスロース−
４−リン酸から成る1.0mlの反応液中で30℃、10
分間反応させ、反応終了後0.2mlのトリクロロ酢
酸を加え酵素を失活させる。変性蛋白を遠心除去
後、得られた上清0.25mlに0.25mlの0.025M過ヨウ
素酸を加え、37℃で30分間インキユベートする。
これに0.5mlの２％亜砒酸ナトリウムを加え酸化
反応を停止後、2.0mlの0.3％２−チオバルビツー
ル酸を加え100℃で８分間加熱する。反応液の
549nmの吸光度を測定し、DAHPの分子吸光係
数4.5×104（Jensen，R.A.and Nester，E.W.，J.
Biol，Chem241，3365（1966））を使用して酵素
活性を求めた。また、反応液中にフエニルアラニ
ン、チロシンのいずれか、或いはその両者を
1mMづつ添加した時の活性も測定し、無添加時
を100％として表示した。第１表に測定結果を示
す。 【表】 得られた組換プラスミドが導入されることによ
り、DS活性は2.6〜1.4倍に増大し、各アミノ酸に
よる活性阻害パターンも、野性株型から変異株型
に変化しており、pAR−１，pAR−２にコード
されたｍ−フルオロフエニルアラニン耐性遺伝子
は、DS遺伝子であることは明らかである。また、
pAR−１とpAR−２の有するPst １断片が全く
異なることにより、DS活性を有する蛋白質をコ
ードする遺伝子は２種類以上存在すると考えられ
る。 (8) DS遺伝子のサブクローニング pAR−１を制限酵素Pst １で切断し、65℃、
10分間加熱した後、ATP及びジチオスレイトー
ル存在下でT4フアージ由来のDNAリガーゼによ
つて４℃に一晩放置しDNA鎖を連結せしめた。
ついで反応液を65℃にて10分間加熱し、反応液に
２倍容のエタノールを加えて連結されたDNAの
沈澱を採取した。これに少量のTEN緩衝液を加
え形質転換に用いた。 (4)で示した形質転換方法を用いてブレビバクテ
リウム・ラクトフエルメンタムAJ 12036を形質
転換した。30℃で２週間クロラムフエニコール
3μｇ／mlを含む再生培地で再生させた後、ｍ−
フルオロフエニルアラニン500μｇ／mlを含む最
少培地にレプリカし、クロラムフエニコール耐性
でかつｍ−フルオロフエニルアラニン耐性となつ
た株を多数得た。これらの株のいくつかが、
pAR−１より小型のプラスミド群を有していた。
このうちの最も小型化したプラスミドをpAR−
112と名付け、pAR−112を有する株をAJ 12183
（FERM−Ｐ 7946）と名付けた。尚pAR−112
は、第２図に示す制限酵素地図を有する。 (9) 形質転換株のトリプトフアン生産能 上記のpAR−112を用い、ｍ−フルオロフエニ
ルアラニン及び５−フルオロトリプトフアン耐性
株ブレビバクテリウラ・ラクトフエルメンタム
M247を(4)で述べた方法により形質転換し、クロ
ラムフエニコール耐性を指標として形質転換株を
選択した。かくして得られたFERM Ｐ−8414，
FERM BP−918、AJ 12251を培養し、トリプト
フアン生産能を調べたところ第２表に示す結果を
得た。 培養はトリプトフアン生産培地（グルコース
130ｇ、（NH4）2SO425ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸３
ml、KH2PO4１ｇ、MnSO4・7H2O10mg、
MgSO4・7H2O1ｇ、ｄ−ビチオン50μｇ、サイア
ミン塩酸塩2000μｇ、メチオニン400mg、チロシ
ン650mg、大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml、
CaCO350ｇを水１に含む、PH6.5。）20mlを500
mlの坂口フラスコに入れたものに被検菌株を植え
つけ、30℃にて72時間、振盪下に行なつた。培養
後、遠心上清中のＬ−トリプトフアンをロイコノ
ストツク・メセントロイデス（Leuconostoc
mesentoroides）ATCC 8042を定量菌株として
用いるバイオアツセイ法によつて求めた。 【表】 尚、M247を得るためには寄託されたFERM
Ｐ−8414AJ 12251より宿主細胞を損うことなく
宿主細胞中の複合プラスミドを除去することが可
能である。即ち、プラスミドは宿主より自然に失
なわれることもあるし、「除去」操作によつて除
くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−405
（1972））。他の除去操作の例は以下の通りである。
AJ 12195をCMG液体培地に接種し、37℃で一晩
培養（高温処理）後、培養液を適当に希釈し、ク
ロラムフエニコールを含有し又は含有しない
CMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間培養
する。かくしてクロラムフエニコール感受性株と
して分離される株がM247である。
プチユロン酸−７−リン酸シンターゼ（以下
「DS」と記す）が組込まれている組換えDNAを
有するコリネ型細菌及びそれを用いるＬ−トリプ
トフアンの製造法に関する。 従来の技術 DSは、ホスホエノールピルビン酸とエリスロ
ース４−リン酸よりの３−デオキシ−Ｄ−アラビ
ノ−ヘプチユロン酸−７−リン酸（以下
「DAHP」と記す）の合成を触媒する酵素であ
り、DAHPは、コリスミ酸を経由してフエニル
アラニン、チロシン又はトリプトフアンに変換さ
れる。コリネ型細菌では、DS活性は、最終生産
物であるフエニルアラニンとチロシンによる相乗
的な阻害を受けることが知られており、Ｌ−トリ
プトフアン生産菌を育種する場合、この阻害の解
除した強力なDS活性を保持する株を選択するこ
とが重要である。 一方、組換えDNA法を用いて、コリネ型細菌
におけるＬ−トリプトフアン生産菌を育種するこ
とは、特開昭59−156292で報告されているが、
DSをコードする遺伝子が組込まれたものではな
い。また、DSをコードする遺伝子を含有する組
換えDNAを有するコリネ型細菌において、Ｌ−
フエニルアラニンあるいはＬ−チロシン生産菌を
育種した例は、特願昭59−245700で報告されてい
るがＬ−トリプトフアン生産菌を育種した例は無
い。 即ち本願発明は、コリネホルム・グルタミン酸
生産菌に属するDNA供与菌より得られ、第１図
あるいは第２図中挿入遺伝子部分の制限酵素地図
で表現される３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプ
チユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含む
DNA断片、あるいは該断片を短縮化することに
よつて得られる３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘ
プチユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含
むDNA断片が、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラスミ
ドに接続されて、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌に属するDNA受容菌に導入されて得られる
Ｌ−トリプトフアン生産能を有する微生物を培養
し、培養液中に蓄積されたＬ−トリプトフアンを
採取することを特徴とするＬ−トリプトフアンの
製造法である。さらに本願発明は、コリネホル
ム・グルタミン酸生産菌に属するDNA供与菌が
ｍ−フルオロフエニルアラニン耐性であることを
特徴とする前記のＬ−トリプトフアンの製造法で
ある。 発明が解決しようとする問題点 この発明は、Ｌ−トリプトフアンの生産性がよ
り高い微生物を得ること、及びそれによつてＬ−
トリプトフアンのより効率のよい製造法を見い出
すことにある。 問題点を解決するための手段 本発明者等は、叙上の問題点を解決するため研
究の結果、コリネ型細菌細胞内で発現しDSをコ
ードする遺伝子がコリネ型細菌細胞内で増殖しう
るプラスミドベクターに接続されている組換え
DNAを有するコリネ型細菌を分離することに成
功し、得られたコリネ型細菌がＬ−トリプトフア
ンの高い生産性を有することを見い出した。 本発明にいうコリネ型細菌（Coryneform
bacteria）は、バージース・マニユアル・オブ・
デターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bargeys Manual of Determinative
Bacteriology）第８版599頁（1974）に定義され
ている一群の微生物であり、好気性、グラム陽
性、非抗酸性、胞子形成能を有しない稈菌であ
る。このようなコリネ型細菌のうち特に以下に述
べるようなコリネ型グルタミン酸生産性細菌が本
発明においては、最も好ましいものである。 コリネ型グルタミン酸生産性細菌の野性株の例
としては次のようなものがあげられる。 【表】 エ
【表】 ニアフイラム
本発明のコリネ型グルタミン酸生産性細菌には
上記のようなグルタミン酸生産性を有する野性株
のほかにグルタミン酸生産性を有するまたはグル
タミン酸生産性を失つた変異株も含まれる。 DS遺伝子を単離する方法は、コリネ型細菌の
DS遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝
子を抽出し（例えばH.Saito and K.Miura
Biochem，Biophys.Acta 72，619，（1963）の方
法が使用できる。）、これを適当な制限酵素で切断
する。ついで、コリネ型細菌細胞内で増殖し得る
プラスミドベクターに接続し、得られた組換え
DNAを用いてコリネ型細菌のDS欠損変異株を形
質転換せしめ、DS生成活性を保有するにいたつ
た菌株を単離し、これによりDS遺伝子を分離で
きる。 また、同様の組換えDNAを用いてコリネ型細
菌の野生株を形質転換せしめ、DS活性に阻害効
果を有する芳香族アミノ酸のアンタゴニストなど
に耐性を保持するにいたつた菌株を単離し、これ
よりDS遺伝子を分離することも可能である。 芳香族アミノ酸のアンタゴニストの例として
は、ｏ−フルオロフエニルアラニン、ｍ−フルオ
ロフエニルアラニン、ｐ−フルオロフエニルアラ
ニン、ｐ−アミノフエニルアラニン、β−３−チ
エニルアラニン、３−アミノチロシン、チロシン
ヒドロキサメート、５−メチルトリプトフアン等
がある。 DNA供与菌としては、前記の芳香族アミノ酸
アンタゴニスト耐性などの変異を付与することに
より、芳香族アミノ酸またはその前駆体の生合成
活性が高まつたような変異株を用いれば更によ
い。 ここにいう芳香族アミノ酸の前駆体とは
DAHP3−デヒドロキナ酸、３−デヒドロシキミ
酸、シキミ酸、シキミ酸−３−リン酸、５−エノ
ールピルビルシキミ酸−３−リン酸、コリズミン
酸、プレフエン酸、フエニルピルビン酸、アント
ラニル酸、インドール３−グリセロールリン酸な
どをいう。 このような変異株の例としては米国特許
3660235、米国特許3759970、特開昭56−64793等
に記載されている。 DS遺伝子として、野性型のものを用いること
ができるし、更に変異株の遺伝子を用いることも
できる。変異株遺伝子として、フエニルアラニン
とチロシンによる相乗阻害の程度が軽減された
DSをコードするように変異されたものが特に好
ましい。 変異型の遺伝子を得るには、DNA供与菌を変
異処理してもよいし、DS遺伝子をベクタープラ
スミドに挿入後、得られた組換えDNAをDNA受
容菌に導入し得られた形質転換株を変異処理して
も良い。更に、上記組換えDNA自体を生体外で
変異処理しても、変異型遺伝子を得ることもでき
る。 染色体遺伝子を切断するために、切断反応時間
等を調節して切断の程度を調節すれば、巾広い種
類の制限酵素が使用できる。 本発明にて使用されるプラスミドベクターは、
コリネ型細菌細胞内において増殖し得るものであ
ればどのようなものでも良い。具体的に例示すれ
ば、以下のものがあげられる。 (1) pAM 330 特開昭58−67699参照 (2) pHM 1519 特開昭58−77895参照 (3) pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4) pAJ 611 同 上 (5) pAJ 1844 同 上 (6) pCG １ 特開昭57−134500参照 (7) pCG ２ 特開昭58−35197参照 (8) pCG ４ 特開昭57−183799参照 (9) pCG 11 同 上 プラスミドベクターDNAの開裂は、当該DNA
を一箇所で切断する制限酵素を用いて切断する
か、複数部位を切断する制限酵素を用いて部分的
に切断することにより行う。 ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際
に用いられた制限酵素により切断され、または染
色体DNA切断フラグメント及び切断されたベク
ターDNAのそれぞれの両端に相補的な塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドを接続せしめて、つ
いでプラスミドベクターと染色体DNAフラグメ
ントとのライゲーシヨン反応に付される。 このようにして得られた、染色体DNAとベク
タープラスミドとの組換えDNAをコリネ型細菌
に属する受容菌へ導入するには、エシエリヒア・
コリＫ−12について報告されている様な
（Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.，Biol.，
53，159（1970）受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してDNAの透過性を増す方法、またはバチル
ス・ズブチリスについて報告されている様
（Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.
E.，Gene，１，153（1977））細胞がDNAを取り
込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテン
トセル）に導入する方法により可能である。ある
いは、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵
母について知られている様に（Chang，S.and
Choen，S.N.，Molec.Gen.，Genet.，168．111
（1979）；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and
Hopwood，O.A.，Nature，274 398（1978）；
Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75 1929（1978））、
DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り込
むプロトプラストまたはスフエロプラストにして
プラスミドをDNA受容菌に導入することも可能
である。 プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチ
リスにおいて使用されている方法でも充分高い頻
度を得ることができるし、特開昭57−183799に記
載されたコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属のプロトプラストにポリエチレングリ
コールまたはポリビニルアルコールと二価金属イ
オンとの存在下にDNAをとり込ませる方法も当
然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポ
リビニルアルコールの代わりに、カルボキシメチ
ルセルロース、デキストラン、フイコール、ブル
ロニツクF68（セルバ社）などの添加によつて
DNAのとり込みを促進させる方法でも同等の結
果が得られる。 Ｌ−トリプトフアン生産菌として、野生株ある
いはDS欠損株を宿主として形質転換した株を用
いることができるが、以下に示すような宿主を用
いればよりＬ−トリプトフアンの生産性が高い菌
株が得られることがある。 即ち、ブレビバクテリウム属のフエニルアラニ
ン、チロシンを要求し、５−メチルトリプトフア
ンに耐性を有する変異株（I.Shiio，H.Sato，M.
Nakagawa，Agric.Biol.Chem.36，2315
（1972））、ブレビバクテリウム属のフエニルアラ
ニンを要求し、ｍ−フルオロフエニルアラニン、
５−フルオロトリプトフアンに耐性を有する変異
株（I.Shiio，S.Sugimoto，M.Nakagawa，、
Agric.Biol.Chem.，39，627（1975））、ブレビバク
テリウム属のチロシンを要求し、５−フルオロト
リプトフアン、アザセリンに耐性を有する変異
株、コリネバクテリウム属のフエニルアラニン、
チロシンを要求し、５−メチルトリプトフアン、
４−メチルトリプトフアン、６−フルオロトリプ
トフアン、トリプトフアンヒドロキサメート、ｐ
−フルオロフエニルアラニン、チロシンヒドロキ
サメート、フエニルアラニンヒドロキサメートに
耐性を有する変異株（H.Hagino，K.
Nakayama，、Agric.Biol.Chem.，39，345
（1975））等がある。 このようにして得られたＬ−トリプトフアン生
産能を有するコリネ型細菌を培養してＬ−トリプ
トフアンを生成蓄積せしめる方法は、従来コリネ
型細菌によるＬ−トリプトフアンの製造のために
使用されていた方法と特に大きく違う点はない。
即ち、培地としては、炭素源、窒素源、無機イオ
ン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機
微量栄養素を含有する通常のものである。炭素源
としては、グルコース、シユクロース、ラクトー
ス等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエ
イ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アン
モニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その
他が使用できる。 培養は好気的条件下で培地のPH及び温度を適宜
調節しつつ、実質的にＬ−トリプトフアンの生産
蓄積が停止するまで行なわれる。 実施例 (1) DS遺伝子を含む染色体DNAの調製 染色体DNAの調製源としては、フエニルアラ
ニンによるDSの阻害が解除したことによつて、
フエニルアラニンアナログであるｍ−フルオロフ
エニルアラニンに対して抵抗性を有するに到つた
フエニルアラニン生産菌ブレビバクテリウム・ラ
クトフエルメンタムAJ 11957（FERM−P6673）
を用いた。 この菌を１のCMG培地（ペプトン１ｇ／dl、
酵母エキス１ｇ／dl、グルコース0.5ｇ／dl、及
びNaCl0.5／dlを含み、PH7.2に調整したもの）に
植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。 この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたの
ち、通常のフエノール処理法により、染色体
DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを得
た。 (2) ベクターDNAの調整 ベクターとしてpAJ 1844（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調整し
た。 まずpAJ 1844をプラスミドとして保有するブ
レビバクテリウム・ラクトフエルメンタム
AJ12037（FERM BP−577）を100mlのCMG培地
に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養したの
ち、リゾチームSDS処理により溶菌させ、30000
×ｇ，30分の超遠心により上清を得た。フエノー
ル処理ののち、２容のエタノールを加えてDNA
を沈澱回収した。これを少量のTEN緩衝液
（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl，1mM
EDTA（PH8.0））に溶解後、アガロースゲル電気
泳動にかけ分離後、切り出してpAJ 1844プラス
ミドDNA約15μｇを得た。 (3) 染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇと(2)で得たプラス
ミドDNA5μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst
１でそれぞれを37℃に１時間保持し、切断した。
65℃に10分間加熱した後、両反応液を混合し、
ATP及びジチオスレイトール存在下、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼによつて10℃に24時間保
持しDNA鎖を連結せしめた。ついで反応液を、
65℃にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノ
ールを加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。 (4) DS遺伝子のクローニング DNA受容菌としては、ｍ−フルオロフエニル
アラニン感受性のブレビバクテリウム・ラクトフ
エルメンタムAJ12036（FERM Ｐ−7559，
FERM BP−734）を用いた。 形質転換の方法としては、プロトプラストトラ
ンスフオーメーシヨン法を用いた。まず、菌株を
５mlのCMG液体培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンＧを0.6ユニツト／ml添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地（PH
6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリゾチ
ームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時間プ
ロトプラスト化を図つた。6000×ｇ，10分間遠心
分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し0.5ml
のSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調整したDNA10μｇを
5mM EDTA存在下で混合し、ポリエチレングリ
コールを最終密度が30％になる様に添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませるために室
温に２分間放置した。このプロトプラストを
SMMP培地１mlで洗浄後、SMMP培地１mlに再
懸濁し、形質発現のため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をPH7.0のプロトプラスト再生培
地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留
水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン12ｇ、KCl0.5ｇ、グルコース10ｇ、
MgCl2・6H2O8.1ｇ、CaCl2・2H2O2.2ｇ、ペプ
トン４ｇ、粉末酵母エキス４ｇ、カザミノ酸
（Difco社）１ｇ、K2HPO4０，２ｇ、コハク酸ナ
トリウム135ｇ、寒天８ｇ及びクロラムフエニコ
ール3μｇ／mlを含む。 30℃で２週間培養後、約25000個のクロラムフ
エニコール耐性コロニーが出現してきたのでこれ
をｍ−フルオロフエニルアラニン500μｇ／mlを
含む最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモ
ニウム、0.3％尿素、0.1％りん酸二水素カリウ
ム、0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イ
オン、2ppmマンガンイオン、200μｇ／サイア
ミン塩酸塩、50μｇ／ビオチン、クロラムフエ
ニコール10μｇ／ml、PH7.0、寒天1.8％）にレプ
リカし、クロラムフエニコール耐性でかつｍ−フ
ルオロフエニルアラニン耐性の菌株５株を得た。 (5) 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液
を調製し、アガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドDNAを検出したところ、全ての株でベ
クターのpAJ 1844よりも明らかに大きなプラス
ミドが検出された。 ５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制
限酵素Pst １で切断するとその内の４株には共通
な6.7kbのDNA挿入断片が認められた。 また、他の１株には、3.7kb、3.0kb、1.7kb、
1.6kb、1.4kb、1.3kb、0.8kb、0.7kb、0.4kbの９
個のDNA挿入断片が認められた。ベクターpAJ
1844のPst １切断点に、前者の6.7kbのPst １断
片を有する組換えプラスミドをpAR−２と名付
け、後者の９個のPst 1DNA断片を有する組換え
プラスミドをpAR−１と名付け、pAR−１を保
持する株をAJ 12181（FERM−Ｐ 7948）、pAR
−２を保持する株をAJ 12182（FERM Ｐ−7947，
FERM BP−917）と名付けた。尚pAR−２は第
１図に示す制限酵素地図を有する。 (6) 再トランスホーメーシヨン (5)で検出されたDNA断片を含む組換えプラス
ミド上にｍ−フルオロフエニルアラニン抵抗性を
付与する遺伝子が存在することを確認するためこ
のプラスミドDNApAR−１とpAR−２を用い、
ブレビバクテリウム・ラクトフエルメンタムAJ
12036を再度、形質転換した。 生じたクロラムフエニコール耐性コロニーのう
ちそれぞれ50個を釣り上げｍ−フルオロフエニル
アラニンに対する感受性をテストしたところ、こ
れらのいずれにも耐性が付与されており、上記の
プラスミド上に、ｍ−フルオロフエニルアラニン
抵抗性を付与する遺伝子が存在することが明らか
となつた。 (7) 形質転換株のDS活性 被検株をフエニルアラニン生産培地（グルコー
ス130ｇ、（NH4）2SO410ｇ、KH2PO4１ｇ、
MgSO4・7H2O1ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸３ml、
大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml、FeSO4・
7H2O10mg、MnSO4・4H2O10mg、ビチオン50μ
ｇ、サイアミン塩酸塩2000μｇ及びCaCO350ｇを
水１に含む。PH7.0）20mlで30℃にて15時間培
養した菌体より、超音波処理により、溶菌液を調
製し、これを32000×ｇ、20分間遠心分離して上
清を得た。この上清を粗酵素液として用い、
50mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.5）、0.5mMホス
ホエノールピルビン酸、0.5mMエリスロース−
４−リン酸から成る1.0mlの反応液中で30℃、10
分間反応させ、反応終了後0.2mlのトリクロロ酢
酸を加え酵素を失活させる。変性蛋白を遠心除去
後、得られた上清0.25mlに0.25mlの0.025M過ヨウ
素酸を加え、37℃で30分間インキユベートする。
これに0.5mlの２％亜砒酸ナトリウムを加え酸化
反応を停止後、2.0mlの0.3％２−チオバルビツー
ル酸を加え100℃で８分間加熱する。反応液の
549nmの吸光度を測定し、DAHPの分子吸光係
数4.5×104（Jensen，R.A.and Nester，E.W.，J.
Biol，Chem241，3365（1966））を使用して酵素
活性を求めた。また、反応液中にフエニルアラニ
ン、チロシンのいずれか、或いはその両者を
1mMづつ添加した時の活性も測定し、無添加時
を100％として表示した。第１表に測定結果を示
す。 【表】 得られた組換プラスミドが導入されることによ
り、DS活性は2.6〜1.4倍に増大し、各アミノ酸に
よる活性阻害パターンも、野性株型から変異株型
に変化しており、pAR−１，pAR−２にコード
されたｍ−フルオロフエニルアラニン耐性遺伝子
は、DS遺伝子であることは明らかである。また、
pAR−１とpAR−２の有するPst １断片が全く
異なることにより、DS活性を有する蛋白質をコ
ードする遺伝子は２種類以上存在すると考えられ
る。 (8) DS遺伝子のサブクローニング pAR−１を制限酵素Pst １で切断し、65℃、
10分間加熱した後、ATP及びジチオスレイトー
ル存在下でT4フアージ由来のDNAリガーゼによ
つて４℃に一晩放置しDNA鎖を連結せしめた。
ついで反応液を65℃にて10分間加熱し、反応液に
２倍容のエタノールを加えて連結されたDNAの
沈澱を採取した。これに少量のTEN緩衝液を加
え形質転換に用いた。 (4)で示した形質転換方法を用いてブレビバクテ
リウム・ラクトフエルメンタムAJ 12036を形質
転換した。30℃で２週間クロラムフエニコール
3μｇ／mlを含む再生培地で再生させた後、ｍ−
フルオロフエニルアラニン500μｇ／mlを含む最
少培地にレプリカし、クロラムフエニコール耐性
でかつｍ−フルオロフエニルアラニン耐性となつ
た株を多数得た。これらの株のいくつかが、
pAR−１より小型のプラスミド群を有していた。
このうちの最も小型化したプラスミドをpAR−
112と名付け、pAR−112を有する株をAJ 12183
（FERM−Ｐ 7946）と名付けた。尚pAR−112
は、第２図に示す制限酵素地図を有する。 (9) 形質転換株のトリプトフアン生産能 上記のpAR−112を用い、ｍ−フルオロフエニ
ルアラニン及び５−フルオロトリプトフアン耐性
株ブレビバクテリウラ・ラクトフエルメンタム
M247を(4)で述べた方法により形質転換し、クロ
ラムフエニコール耐性を指標として形質転換株を
選択した。かくして得られたFERM Ｐ−8414，
FERM BP−918、AJ 12251を培養し、トリプト
フアン生産能を調べたところ第２表に示す結果を
得た。 培養はトリプトフアン生産培地（グルコース
130ｇ、（NH4）2SO425ｇ、フマル酸12ｇ、酢酸３
ml、KH2PO4１ｇ、MnSO4・7H2O10mg、
MgSO4・7H2O1ｇ、ｄ−ビチオン50μｇ、サイア
ミン塩酸塩2000μｇ、メチオニン400mg、チロシ
ン650mg、大豆蛋白酸加水分解液「味液」50ml、
CaCO350ｇを水１に含む、PH6.5。）20mlを500
mlの坂口フラスコに入れたものに被検菌株を植え
つけ、30℃にて72時間、振盪下に行なつた。培養
後、遠心上清中のＬ−トリプトフアンをロイコノ
ストツク・メセントロイデス（Leuconostoc
mesentoroides）ATCC 8042を定量菌株として
用いるバイオアツセイ法によつて求めた。 【表】 尚、M247を得るためには寄託されたFERM
Ｐ−8414AJ 12251より宿主細胞を損うことなく
宿主細胞中の複合プラスミドを除去することが可
能である。即ち、プラスミドは宿主より自然に失
なわれることもあるし、「除去」操作によつて除
くこともできる（Bact.Rev.，36，p361−405
（1972））。他の除去操作の例は以下の通りである。
AJ 12195をCMG液体培地に接種し、37℃で一晩
培養（高温処理）後、培養液を適当に希釈し、ク
ロラムフエニコールを含有し又は含有しない
CMG寒天培地に塗布し、30℃で１〜３日間培養
する。かくしてクロラムフエニコール感受性株と
して分離される株がM247である。
第１図はpAR−２の制限酵素地図を示す。第
２図はpAR−112の制限酵素地図を示す。
２図はpAR−112の制限酵素地図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られ、下記の制限酵素地図で
表現される３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチ
ユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含む
DNA断片、あるいは該断片を短縮化することに
よつて得られる３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘ
プチユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含
むDNA断片が、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラスミ
ドに接続されて、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌に属するDNA受容菌に導入されて得られる
Ｌ−トリプトフアン生産能を有する微生物を培養
し、培養液中に蓄積されたＬ−トリプトフアンを
採取することを特徴とするＬ−トリプトフアンの
製造法。 ２ コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌より得られ、下記の制限酵素地図で
表現される３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプチ
ユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含む
DNA断片、あるいは該断片を短縮化することに
よつて得られる３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘ
プチユロン酸−７−リン酸シンターゼ遺伝子を含
むDNA断片が、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌の菌体内で自律複製できるベクタープラスミ
ドに接続されて、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌に属するDNA受容菌に導入されて得られる
Ｌ−トリプトフアン生産能を有する微生物を培養
し、培養液中に蓄積されたＬ−トリプトフアンを
採取することを特徴とするＬ−トリプトフアンの
製造法。 ３ コリネホルム・グルタミン酸生産菌に属する
DNA供与菌がｍ−フルオロフエニルアラニン耐
性であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
あるいは第２項記載のＬ−トリプトフアンの製造
法。 ４ 特許請求の範囲第１項あるいは第２項記載の
DNA断片にコードされる３−デオキシ−Ｄ−ア
ラビノ−ヘプチユロン酸−７−リン酸シンターゼ
が、Ｌ−チロシンおよびＬ−フエニルアラニンに
よる相乗的フイードバツク阻害が解除されたもの
であることを特徴とする特許請求の範囲第１項あ
るいは第２項記載のＬ−トリプトフアンの製造
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191523A JPS6251980A (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
| DE8585114713T DE3576523D1 (de) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Rekombinante dna enthaltende coryneformbakterien und verfahren zur herstellung von aromatischen aminosaeuren unter verwendung dieser bakterien. |
| EP85114713A EP0183175B1 (en) | 1984-11-20 | 1985-11-19 | Coryneform bacteria carrying recombinant dna and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
| US07/316,961 US4968609A (en) | 1984-11-20 | 1989-02-28 | Coryneform bacteria carrying recombinant DNA and a process for producing aromatic amino acids using said bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60191523A JPS6251980A (ja) | 1985-08-30 | 1985-08-30 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6251980A JPS6251980A (ja) | 1987-03-06 |
| JPH055480B2 true JPH055480B2 (ja) | 1993-01-22 |
Family
ID=16276078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60191523A Granted JPS6251980A (ja) | 1984-11-20 | 1985-08-30 | 発酵法によるｌ―トリプトファンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6251980A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2656300B2 (ja) * | 1988-04-18 | 1997-09-24 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
| JP2967996B2 (ja) | 1989-06-06 | 1999-10-25 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―トリプトファンの製造法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58103398A (ja) * | 1981-10-09 | 1983-06-20 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 微生物遺伝子、プラスミド、および芳香族アミノ酸の微生物による製造法 |
| JPS59156292A (ja) * | 1983-02-17 | 1984-09-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | トリプトフアンの製造法 |
| JPS59196098A (ja) * | 1983-04-23 | 1984-11-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 |
-
1985
- 1985-08-30 JP JP60191523A patent/JPS6251980A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6251980A (ja) | 1987-03-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |