JPH0673478B2 - Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物 - Google Patents
Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物Info
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- JPH0673478B2 JPH0673478B2 JP2305439A JP30543990A JPH0673478B2 JP H0673478 B2 JPH0673478 B2 JP H0673478B2 JP 2305439 A JP2305439 A JP 2305439A JP 30543990 A JP30543990 A JP 30543990A JP H0673478 B2 JPH0673478 B2 JP H0673478B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はＬ−カルニチン、特に生体試料中のＬ−カルニ
チンの高感度測定法およびＬ−カルニチン測定用組成物
に関する。
チンの高感度測定法およびＬ−カルニチン測定用組成物
に関する。
［従来の技術］ Ｌ−カルニチンは、長鎖遊離脂肪酸が細胞内でβ酸化を
受ける際に前提となるミトコンドリア膜の通過を媒介す
る必須の物質とされており、その欠乏が起こると、脂質
代謝ばかりでなく種々の代謝にも異常が生じ得る。特
に、カルニチンに依存度の高いエネルギーの消費が活発
でカルニチンの生産能を欠く骨格筋や心筋に障害が出現
し易いとされている。これまで、カルニチン代謝の先天
性異常による病態への関心が主であったが、最近では、
腎不全・透析患者などにおける二次的カルニチン代謝異
常も問題となっている。また筋、心筋疾患、透析患者な
どカルニチン欠損が考えられる病態に対し、薬剤として
カルニチンを投与する試みもなされている。このよう
に、カルニチンは既に病態の解析、治療など臨床的なレ
ベルにおけるアプローチが必要とされているが、また臨
床分野での適当な定量法が開発されていない。
受ける際に前提となるミトコンドリア膜の通過を媒介す
る必須の物質とされており、その欠乏が起こると、脂質
代謝ばかりでなく種々の代謝にも異常が生じ得る。特
に、カルニチンに依存度の高いエネルギーの消費が活発
でカルニチンの生産能を欠く骨格筋や心筋に障害が出現
し易いとされている。これまで、カルニチン代謝の先天
性異常による病態への関心が主であったが、最近では、
腎不全・透析患者などにおける二次的カルニチン代謝異
常も問題となっている。また筋、心筋疾患、透析患者な
どカルニチン欠損が考えられる病態に対し、薬剤として
カルニチンを投与する試みもなされている。このよう
に、カルニチンは既に病態の解析、治療など臨床的なレ
ベルにおけるアプローチが必要とされているが、また臨
床分野での適当な定量法が開発されていない。
従来、Ｌ−カルニチンの測定法としては、Ｌ−カルニチ
ンおよびアセチルCoAにカルニチンアセチルトランスフ
ェラーゼ（CAT）を作用させ、遊離したCoASHと5,5′−
ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（DTNB）との反応によ
り生成するチオフェノレートイオンを比色定量する方法
（DTNB法）〔J.Biol.Chem.,238,2509（1963）、J.Lipid
Research,5,184〜187（1964）、臨床病理,36（11）,12
96〜1302（1988）〕、Ｌ−カルニチンおよび14C又は3H
標識アセチルCoAにCATを作用させて放射標識アセチル−
Ｌ−カルニチンとCoACHを生成する反応において放射活
性を測定するラジオアイソトープ法〔Clin.Chim.Acta,3
7,235〜243（1972）、J.Lipid Research,17,277〜281
（1976）、日本栄養・食糧学会誌,41（５）,389〜395
（1988）〕、Ｌ−カルニチンおよびNADにＬ−カルニチ
ンデヒドロゲナーゼを作用させて３−デヒドロカルニチ
ンとNADHを生成する反応において紫外部におけるNADHの
増加を測定するカルニチンデヒドロゲナーゼ法〔Europe
an J.Biochem.,6,196〜201（1968）、同,10,56〜60（19
69）、Fresenius Z.Anal.Chem.,320（３）,285〜289（1
985）〕、Ｌ−カルニチンおよびアセチルCoAにCATを作
用させ、生成したCoAにＮ−｛ｐ−（２−ベンズイミダ
ゾリル）−フェニル｝−マレイミド（BIPM）を作用さ
せ、生成したCoA−BIPMの蛍光強度を測定する蛍光法
〔厚生省神経病患研61年度研報,315〜318（1986）〕な
どが知られている。
ンおよびアセチルCoAにカルニチンアセチルトランスフ
ェラーゼ（CAT）を作用させ、遊離したCoASHと5,5′−
ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（DTNB）との反応によ
り生成するチオフェノレートイオンを比色定量する方法
（DTNB法）〔J.Biol.Chem.,238,2509（1963）、J.Lipid
Research,5,184〜187（1964）、臨床病理,36（11）,12
96〜1302（1988）〕、Ｌ−カルニチンおよび14C又は3H
標識アセチルCoAにCATを作用させて放射標識アセチル−
Ｌ−カルニチンとCoACHを生成する反応において放射活
性を測定するラジオアイソトープ法〔Clin.Chim.Acta,3
7,235〜243（1972）、J.Lipid Research,17,277〜281
（1976）、日本栄養・食糧学会誌,41（５）,389〜395
（1988）〕、Ｌ−カルニチンおよびNADにＬ−カルニチ
ンデヒドロゲナーゼを作用させて３−デヒドロカルニチ
ンとNADHを生成する反応において紫外部におけるNADHの
増加を測定するカルニチンデヒドロゲナーゼ法〔Europe
an J.Biochem.,6,196〜201（1968）、同,10,56〜60（19
69）、Fresenius Z.Anal.Chem.,320（３）,285〜289（1
985）〕、Ｌ−カルニチンおよびアセチルCoAにCATを作
用させ、生成したCoAにＮ−｛ｐ−（２−ベンズイミダ
ゾリル）−フェニル｝−マレイミド（BIPM）を作用さ
せ、生成したCoA−BIPMの蛍光強度を測定する蛍光法
〔厚生省神経病患研61年度研報,315〜318（1986）〕な
どが知られている。
［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、DTNB法や蛍光法は、血清中のＬ−カルニ
チン測定を行う際に、除蛋白操作を行う必要があるなど
操作が煩雑であり、ラジオアイソートープ法は、感度お
よび特異性において優れた方法ではあるが、測定にラジ
オアイソトープを用いるために特殊な施設を要するとい
う問題があった。
チン測定を行う際に、除蛋白操作を行う必要があるなど
操作が煩雑であり、ラジオアイソートープ法は、感度お
よび特異性において優れた方法ではあるが、測定にラジ
オアイソトープを用いるために特殊な施設を要するとい
う問題があった。
また、カルニチンデヒドロゲナーゼ法は、NADHの340nm
における分子吸光係数がε＝6.22（cm2/μmol）と小さ
いために、例えばカルニチン欠損症〔Neurology,25,16
〜24（1975）〕の患者の血清カルニチン量を測定するこ
とは困難であり、また血清中に含まれる脱水素酵素、例
えば乳酸脱水素酵素などによって生成されたNADHが減少
し、測定上の誤差が生じるなどの問題があった。
における分子吸光係数がε＝6.22（cm2/μmol）と小さ
いために、例えばカルニチン欠損症〔Neurology,25,16
〜24（1975）〕の患者の血清カルニチン量を測定するこ
とは困難であり、また血清中に含まれる脱水素酵素、例
えば乳酸脱水素酵素などによって生成されたNADHが減少
し、測定上の誤差が生じるなどの問題があった。
そこで、本発明者らはＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ
を用いた酵素反応において生成されるホルマザンを定量
することによりＬ−カルニチン量を測定する方法を開発
し、先に出願した（特願平１−196550号）。
を用いた酵素反応において生成されるホルマザンを定量
することによりＬ−カルニチン量を測定する方法を開発
し、先に出願した（特願平１−196550号）。
しかしながら、この方法も、被検者が、成人の如く比較
的に多量の被検体となる血清を得られる場合には充分な
感度で測定することができるが、被検者は新生児、特に
未熟児の場合には得られる血清量は高々20μｌであり、
他の検査も同時に行う場合にはＬ−カルニチン測定に供
せられる血清量は数μｌしかないために、低濃度のＬ−
カルニチンを測定することは困難であるという問題があ
った。
的に多量の被検体となる血清を得られる場合には充分な
感度で測定することができるが、被検者は新生児、特に
未熟児の場合には得られる血清量は高々20μｌであり、
他の検査も同時に行う場合にはＬ−カルニチン測定に供
せられる血清量は数μｌしかないために、低濃度のＬ−
カルニチンを測定することは困難であるという問題があ
った。
そこで、除蛋白などの煩雑な前処理や特別な施設を要す
ることなく、低カルニチン値を示しやすい未熟児の極微
量な血清中のＬ−カルニチン量をも充分な感度で測定す
ることができる方法の開発が望まれていた。
ることなく、低カルニチン値を示しやすい未熟児の極微
量な血清中のＬ−カルニチン量をも充分な感度で測定す
ることができる方法の開発が望まれていた。
［課題を解決するための手段］ 斯かる実情において本発明者らはＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼ（EC 1.1.1.108）を用いる反応系に着目し鋭
意研究した結果、Ｌ−カルニチンを基質としてデヒドロ
カルニチンを生成する可逆反応において、NAD類を補酵
素としてＬ−カルニチンからデヒドロカルニチンを生成
させる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量のNA
DH類を共存させて、Ｌ−カルニチンとデヒドロカルニチ
ンを間の可逆的サイクリング反応を行えば、NADH類の生
成量が時間経過と共に直線的に増加し、しかもその増加
速度がＬ−カルニチン又はデヒドロカルニチンの量と比
例することを見出した。
ロゲナーゼ（EC 1.1.1.108）を用いる反応系に着目し鋭
意研究した結果、Ｌ−カルニチンを基質としてデヒドロ
カルニチンを生成する可逆反応において、NAD類を補酵
素としてＬ−カルニチンからデヒドロカルニチンを生成
させる反応系となし、かつ当該補酵素と異なる少量のNA
DH類を共存させて、Ｌ−カルニチンとデヒドロカルニチ
ンを間の可逆的サイクリング反応を行えば、NADH類の生
成量が時間経過と共に直線的に増加し、しかもその増加
速度がＬ−カルニチン又はデヒドロカルニチンの量と比
例することを見出した。
本発明者らは更に研究を進めた結果、先の酵素サイクリ
ング反応を実施するに当り、NAD類およびNADH類の２種
類の補酵素の１つに、チオニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類（以下チオNAD類という）又は還元型チオN
AD類（以下チオNADH類という）を使用して、NADH類の極
大吸収波長（340nm付近）とチオNADHの極大吸収波長（4
00nm付近）の差異に基づき、どちらか一方の補酵素の変
化量を定量することにより、Ｌ−カルニチン又はデヒド
ロカルニチンの定量を正確に行うことができることを見
出し、本発明を完成した。
ング反応を実施するに当り、NAD類およびNADH類の２種
類の補酵素の１つに、チオニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド類（以下チオNAD類という）又は還元型チオN
AD類（以下チオNADH類という）を使用して、NADH類の極
大吸収波長（340nm付近）とチオNADHの極大吸収波長（4
00nm付近）の差異に基づき、どちらか一方の補酵素の変
化量を定量することにより、Ｌ−カルニチン又はデヒド
ロカルニチンの定量を正確に行うことができることを見
出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、被検体に、次の成分〜 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下
チオNAD類という）とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下NAD類という）とを補酵素とし、少なく
ともＬ−カルニチンを基質としてデヒドロカルニチンを
生成する可逆反応をなすＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼ A1 B1 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNAD類又はNAD類を示し、A2はA1の還元
型生成物を示し、B1はA1がチオNAD類のときは還元型NAD
類を、A1がNAD類のときは還元型チオNAD類を示し、B2は
B1の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応
を形成せしめ、該反応によって変化するA2又はB1の量を
測定することを特徴とするＬ−カルニチンの高感度測定
法、並びに上記、およびを含有することを特徴と
するＬ−カルニチン測定用組成物を提供するものであ
る。
チオNAD類という）とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下NAD類という）とを補酵素とし、少なく
ともＬ−カルニチンを基質としてデヒドロカルニチンを
生成する可逆反応をなすＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼ A1 B1 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNAD類又はNAD類を示し、A2はA1の還元
型生成物を示し、B1はA1がチオNAD類のときは還元型NAD
類を、A1がNAD類のときは還元型チオNAD類を示し、B2は
B1の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応
を形成せしめ、該反応によって変化するA2又はB1の量を
測定することを特徴とするＬ−カルニチンの高感度測定
法、並びに上記、およびを含有することを特徴と
するＬ−カルニチン測定用組成物を提供するものであ
る。
本発明において、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼとし
ては、上記要件を具備するものであれば何れのものでも
使用できるが、その具体例としては、シュードモナス・
アエルギノーサA7244〔Pseudomonas aeruginosa A7244
（NCTC）;European J.Biochem.,6,196〜201（1968）、
同誌,10,56〜60（1969）〕、シュードモナス・プチダIF
P206〔Pseudomonas putida IFP206;Arch.Microbial.,11
6,213〜220（1978）、Biochimicaet Biophysica Acta.,
957,335〜339（1988）〕、シュードモナス・プチダATCC
17633〔Pseudomonas putida ATCC17633;Fresenius'Z.An
al.Chem.,320,285〜289（1985）〕、キサントモナス・
トランスルッセンスIFO13558〔Xanthomonas translucen
s IFO13558;Agric Biol.Chem.,52,851〜852（198
8）〕、アルカリゲネス・エスピーNo.981（Alcaligenes
sp.No.981;東洋醸造社製、特願平１−267919号明細書）
等由来のものが挙げられる。これらの中で、特にアルカ
リゲネス・エスピーNo.981由来のＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼが、水溶液中での安定性に優れているため好
ましい。
ては、上記要件を具備するものであれば何れのものでも
使用できるが、その具体例としては、シュードモナス・
アエルギノーサA7244〔Pseudomonas aeruginosa A7244
（NCTC）;European J.Biochem.,6,196〜201（1968）、
同誌,10,56〜60（1969）〕、シュードモナス・プチダIF
P206〔Pseudomonas putida IFP206;Arch.Microbial.,11
6,213〜220（1978）、Biochimicaet Biophysica Acta.,
957,335〜339（1988）〕、シュードモナス・プチダATCC
17633〔Pseudomonas putida ATCC17633;Fresenius'Z.An
al.Chem.,320,285〜289（1985）〕、キサントモナス・
トランスルッセンスIFO13558〔Xanthomonas translucen
s IFO13558;Agric Biol.Chem.,52,851〜852（198
8）〕、アルカリゲネス・エスピーNo.981（Alcaligenes
sp.No.981;東洋醸造社製、特願平１−267919号明細書）
等由来のものが挙げられる。これらの中で、特にアルカ
リゲネス・エスピーNo.981由来のＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼが、水溶液中での安定性に優れているため好
ましい。
アルカリゲネス・エスピーNo.981は、新規なＬ−カルニ
チンデヒドロゲナーゼであり、例えば本発明者らが奈良
県五条市のジャガイモ畑の土壌より分離したアルカリゲ
ネス属菌No.981菌株が産生するものである。
チンデヒドロゲナーゼであり、例えば本発明者らが奈良
県五条市のジャガイモ畑の土壌より分離したアルカリゲ
ネス属菌No.981菌株が産生するものである。
このアルカリゲネス属菌No.981菌株の菌学的性質を以下
に示す。
に示す。
（ａ）形態的特徴 普通寒天培地上、18〜24時間、28〜30℃で培養し、観察
した所見は次の通りである。
した所見は次の通りである。
端の丸いまっすぐ又はやや曲った桿状細菌で、単独、二
連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。大きさは0.4
〜0.6×1.2〜205μｍで周毛で運動する。多形性なし。
連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。大きさは0.4
〜0.6×1.2〜205μｍで周毛で運動する。多形性なし。
（ｂ）各培地における生育状態 各培地上で、18〜24時間、28〜30℃で培養し、観察した
所見は次の通りである。
所見は次の通りである。
普通寒天斜面培地 生育良好で線状（filiform）に生育する。湿潤で光沢を
有する。黄土色を呈するが、可溶性色素は産生しない。
有する。黄土色を呈するが、可溶性色素は産生しない。
普通寒天平面培地 円形、丘状（convex）、全縁の集落を形成する。表面は
滑らかで湿潤。黄土色ないし淡黄土色を呈する。可溶性
色素は産生しない。
滑らかで湿潤。黄土色ないし淡黄土色を呈する。可溶性
色素は産生しない。
液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁する。長時間（40時間以上）培養
では菌膜を形成する。
では菌膜を形成する。
BCPミルク培地 ４〜５日後、アルカリになる。
（ｃ）生理的性質〔＋：陽性，（＋）：弱陽性，−：陰
性〕 グラム染色 − KOH反応 ＋ カプセル形成 − 抗酸性染色 − OFテスト（Hugh−Leifson） 変化なし OFテスト（Ｎ源にNH4H2PO4） Ｏ（酸化） 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 41℃ − 37℃ ＋ 15℃ ＋ 耐塩性 ０％ ＋ ５％ ＋ ７％ − 生育pH 4.6 − 5.4 ＋ 8.9 ＋ 9.8 − ゲラチンの分解 − 澱粉の分解 − カゼインの分解 − エスクリンの分解 − セルロースの分解 − チロシンの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ LV反応 − ウレアーゼ産生（SSR） − ウレアーゼ産生（Chris） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（K2HPO4） − アセトイン産生（NaCl） − MRテスト − 硝酸塩還元テスト ガス検出 ＋ NO2 -の検出 − NO3 -の検出 − シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 （＋） プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース （＋） セロビオース − ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン （＋） イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール − マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）ラムノース − Ｄ−リボース − サリシン − Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 − サッカロース − トレハロース ＋ キシロース − ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積 − （ｄ）炭素源の利用性 炭素源5g、NaCl5g、MgSO4・7H2O0.2g、NH4H2PO41.0gお
よび蒸留水１を含む液体培地（pH7.0）での各炭素源
の利用性を試験した結果は次の通りである。
性〕 グラム染色 − KOH反応 ＋ カプセル形成 − 抗酸性染色 − OFテスト（Hugh−Leifson） 変化なし OFテスト（Ｎ源にNH4H2PO4） Ｏ（酸化） 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 41℃ − 37℃ ＋ 15℃ ＋ 耐塩性 ０％ ＋ ５％ ＋ ７％ − 生育pH 4.6 − 5.4 ＋ 8.9 ＋ 9.8 − ゲラチンの分解 − 澱粉の分解 − カゼインの分解 − エスクリンの分解 − セルロースの分解 − チロシンの分解 − カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ LV反応 − ウレアーゼ産生（SSR） − ウレアーゼ産生（Chris） − インドール産生 − 硫化水素産生（酢酸鉛紙で検出） − アセトイン産生（K2HPO4） − アセトイン産生（NaCl） − MRテスト − 硝酸塩還元テスト ガス検出 ＋ NO2 -の検出 − NO3 -の検出 − シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 （＋） プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 ＋ マロン酸塩 ＋ プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 ＋ コハク酸塩 ＋ グルコースよりガスの産生 − 各種糖類より酸の産生 アドニトール − Ｌ（＋）アラビノース （＋） セロビオース − ヅルシトール − メソ・エリスリトール − フラクトース − ガラクトース ＋ グルコース ＋ グリセリン （＋） イノシトール − イヌリン − ラクトース − マルトース − マンニトール − マンノース ＋ メレジトース − メリビオース − ラフィノース − Ｌ（＋）ラムノース − Ｄ−リボース − サリシン − Ｌ−ソルボース − ソルビトール − 澱粉 − サッカロース − トレハロース ＋ キシロース − ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積 − （ｄ）炭素源の利用性 炭素源5g、NaCl5g、MgSO4・7H2O0.2g、NH4H2PO41.0gお
よび蒸留水１を含む液体培地（pH7.0）での各炭素源
の利用性を試験した結果は次の通りである。
グルコース ＋ Ｌ（＋）アラビノース − フラクトース ＋ マンニトール − マンノース ＋ グルコネート ＋ アセテート ＋ アジペート − ピメレート ＋ スベレート ＋ タートレート ＋ 以上の通り、本菌株の主性状は、グラム陰性の桿状細菌
で、周毛で運動し、カタラーゼおよびオキシダーゼを産
生し、ペプトンを含む培地（Hugh−Leifson）ではグル
コースより酸を産生しないが、グルコースを酸化的に分
解し、酸を産生する。芽胞は形成せず、多形性なく、好
気性である。
で、周毛で運動し、カタラーゼおよびオキシダーゼを産
生し、ペプトンを含む培地（Hugh−Leifson）ではグル
コースより酸を産生しないが、グルコースを酸化的に分
解し、酸を産生する。芽胞は形成せず、多形性なく、好
気性である。
グラム陰性桿菌で、好気性であり、周毛で運動する菌属
は、アルカリゲネス属、クロモバクテリウム属およびフ
ラボバクテリウム属の３属である。クロモバクテリウム
属は紫色、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生す
るが、本菌株は色素を産生しないことから判断してアル
カリゲネス属に属する菌株であることは明らかである。
は、アルカリゲネス属、クロモバクテリウム属およびフ
ラボバクテリウム属の３属である。クロモバクテリウム
属は紫色、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生す
るが、本菌株は色素を産生しないことから判断してアル
カリゲネス属に属する菌株であることは明らかである。
そこで、本菌株がアルカリゲネス属のどの属に属するか
を同定するため、Bergey's Manual of Systematic Bact
eriology,Vol.1（1984）に記載されている３菌種、即ち
Alcaligenes faecalis（以下、「Ｆ」と略記することが
ある）、Alcaligenes denitrificans subsp.denitrific
ans（以下、「Ｄ」と略記することがある）およびAlcal
igenes denitrificans subsp.xylosoxidans（以下、
「Ｘ」と略記することがある」と対比した結果は、次の
通りである。
を同定するため、Bergey's Manual of Systematic Bact
eriology,Vol.1（1984）に記載されている３菌種、即ち
Alcaligenes faecalis（以下、「Ｆ」と略記することが
ある）、Alcaligenes denitrificans subsp.denitrific
ans（以下、「Ｄ」と略記することがある）およびAlcal
igenes denitrificans subsp.xylosoxidans（以下、
「Ｘ」と略記することがある」と対比した結果は、次の
通りである。
尚、以下における「＋」は90％以上の陽性率、「−」は
90％以上の陰性率、「ｄ」は「＋」および「−」のどち
らでもないことを示す。
90％以上の陰性率、「ｄ」は「＋」および「−」のどち
らでもないことを示す。
Ｆ Ｄ Ｘ 本菌 オキシダーゼ産生 ＋ ＋ ＋ ＋ 硝酸塩還元 − ＋ ＋ ＋ 亜硝酸塩還元 ＋ ＋ ＋ ＋ ゲラチンの分解 − − − − OF培地での酸産生 キシロース − − ＋ − グルコース − − ＋ − ペプトン不含培地での酸産生 キシロース ＋ − グルコース ＋ ＋ 炭素源の利用性 グルコース − − ＋ ＋ Ｌ（＋）アラビノース − − − − フラクトース − − ｄ ＋ マンニトール − − − − マンノース − − ｄ ＋ グルコネート − ＋ ＋ ＋ アセテート ＋ ＋ ＋ ＋ 以上対比した結果によれば、本菌株No.981の諸性状はAl
caligenes subsp.xylosoxidansと一致した点が多いが、
OF培地での酸産生能およびキシロースより酸を産生しな
い点での性状が異なる。
caligenes subsp.xylosoxidansと一致した点が多いが、
OF培地での酸産生能およびキシロースより酸を産生しな
い点での性状が異なる。
よって、本菌株を公知のものと区別するため、アルカリ
ゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）No.981と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研
菌寄第2570号（FERM BP−2570）として寄託した。
ゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）No.981と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研
菌寄第2570号（FERM BP−2570）として寄託した。
また、A1およびB2は、チオNAD類又はNAD類を示すが、こ
のうちチオNAD類としては、例えばチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチド等が、NAD類として
は、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセ
チルNAD）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレ
オチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
（デアミノNAD）等が挙げられる。
のうちチオNAD類としては、例えばチオニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（チオNAD）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチド等が、NAD類として
は、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NA
D）、アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセ
チルNAD）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレ
オチド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
（デアミノNAD）等が挙げられる。
本発明においては、A1がチオNAD類である場合はB1がNAD
H類であり、またA1がNAD類である場合はB1がチオNADH類
であり、少なくとも一方がチオ型補酵素であることが必
要である。
H類であり、またA1がNAD類である場合はB1がチオNADH類
であり、少なくとも一方がチオ型補酵素であることが必
要である。
A1およびB1の量は、被検体中のＬ−カルニチンの量に比
較して過剰量であり、またＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼのA1およびB1それぞれに対するKm値に比較しても過
剰量であることが必要であり、特にカルニチン量の20〜
10000倍モルが好ましい。
較して過剰量であり、またＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼのA1およびB1それぞれに対するKm値に比較しても過
剰量であることが必要であり、特にカルニチン量の20〜
10000倍モルが好ましい。
本発明のＬ−カルニチン測定用組成物においては、A1お
よびB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mMが好まし
く、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの濃度は５〜200U
/ml、特に10〜150U/mlが好ましいが、これ以上の量を用
いることもできる。
よびB1の濃度は0.02〜100mM、特に0.05〜30mMが好まし
く、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの濃度は５〜200U
/ml、特に10〜150U/mlが好ましいが、これ以上の量を用
いることもできる。
本発明のＬ−カルニチン測定用組成物の調製にあたっ
て、使用できるＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼに関し
ては、例えば補酵素として好ましくはNAD又はチオNADを
用いて、基質となるＬ−カルニチンに対する反応性を有
するものであればよく、これらの補酵素と基質とを用い
ることにより確認できるものである。例えば、アルカリ
ゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）No.981の生産す
るＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（東洋醸造社製）
は、Ｌ−カルニチンを基質とした場合、100mMトリス塩
酸緩衝液（pH9.0）においては、補酵素にチオNADを用い
た時のNADを用いた時に対する相対活性は15％程度であ
る。また、同様の条件下でＬ−カルニチン、NADおよび
チオNADに対するKm値はそれぞれ9.3mM、0.14mMおよび0.
40mMである。
て、使用できるＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼに関し
ては、例えば補酵素として好ましくはNAD又はチオNADを
用いて、基質となるＬ−カルニチンに対する反応性を有
するものであればよく、これらの補酵素と基質とを用い
ることにより確認できるものである。例えば、アルカリ
ゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）No.981の生産す
るＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ（東洋醸造社製）
は、Ｌ−カルニチンを基質とした場合、100mMトリス塩
酸緩衝液（pH9.0）においては、補酵素にチオNADを用い
た時のNADを用いた時に対する相対活性は15％程度であ
る。また、同様の条件下でＬ−カルニチン、NADおよび
チオNADに対するKm値はそれぞれ9.3mM、0.14mMおよび0.
40mMである。
反応液組成については、使用するＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考慮して２種の
補酵素を適宜選択し、その後正反応と逆反応の至適pHの
間のpH条件を適宜調整して、正反応／逆反応の反応速度
比が１に近づくようにpH条件を設定すればよい。
ロゲナーゼの各補酵素間の相対活性等を考慮して２種の
補酵素を適宜選択し、その後正反応と逆反応の至適pHの
間のpH条件を適宜調整して、正反応／逆反応の反応速度
比が１に近づくようにpH条件を設定すればよい。
尚、本発明においてＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼは
単独で用いても、また適宜２種以上を組合せて用いても
よい。
単独で用いても、また適宜２種以上を組合せて用いても
よい。
斯くして調製された本発明のＬ−カルニチン測定用組成
物を用いて被検体中のＬ−カルニチン量を測定するに
は、例えば上記成分〜を含有する組成物に被検体0.
001〜0.5mlを加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開
始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３
分後と４分後の１分間又は３分後と８分後の５分間にお
ける生成されたA2の量又は消費されたB1の量を、それぞ
れの吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定すれば
よい。また同様に、反応開始後、一定時間後（例えば10
分後）に酵素反応を停止させ、しかる後に吸光度の変化
を測定してもよい。例えば、A2がチオNADH、B1がNADHの
場合、A2の生成を400nmの吸光度〔分子吸光係数:11200M
-1cm-1（Methods in Enzymology vol.55 P.261（197
9）〕の増加により測定するか、あるいはB1の消費を340
nmの吸光度〔分子吸光係数:6220M-1cm-1〕の減少により
測定し、既知濃度のＬ−カルニチンを用いて測定したと
きの値と比較すれば、被検液中のＬ−カルニチンをリア
ルタイムで算出することができる。
物を用いて被検体中のＬ−カルニチン量を測定するに
は、例えば上記成分〜を含有する組成物に被検体0.
001〜0.5mlを加え、約37℃の温度にて反応させ、反応開
始一定時間後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３
分後と４分後の１分間又は３分後と８分後の５分間にお
ける生成されたA2の量又は消費されたB1の量を、それぞ
れの吸収波長に基づく吸光度の変化によって測定すれば
よい。また同様に、反応開始後、一定時間後（例えば10
分後）に酵素反応を停止させ、しかる後に吸光度の変化
を測定してもよい。例えば、A2がチオNADH、B1がNADHの
場合、A2の生成を400nmの吸光度〔分子吸光係数:11200M
-1cm-1（Methods in Enzymology vol.55 P.261（197
9）〕の増加により測定するか、あるいはB1の消費を340
nmの吸光度〔分子吸光係数:6220M-1cm-1〕の減少により
測定し、既知濃度のＬ−カルニチンを用いて測定したと
きの値と比較すれば、被検液中のＬ−カルニチンをリア
ルタイムで算出することができる。
また、本発明定量法は、被検液中のＬ−カルニチンその
ものを酵素サイクリング反応に導くものであり、被検液
中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液のブラン
ク測定を省略することができ、レイトアッセイによる簡
便な測定をなし得る。
ものを酵素サイクリング反応に導くものであり、被検液
中の共存物質の影響を受けにくいため、被検液のブラン
ク測定を省略することができ、レイトアッセイによる簡
便な測定をなし得る。
尚、本発明においてはA2又はB1の測定に当り、吸光度測
定の代わりに他の公知酵素測定法を使用して定量を行う
こともできる。
定の代わりに他の公知酵素測定法を使用して定量を行う
こともできる。
また、本発明によれば、遊離のＬ−カルニチンだけでな
く、アセチルカルニチン等のアシルカルニチンを加水分
解することにより遊離されてくるＬ−カルニチンも測定
することができる。例えば、被験液に存在するＬ−カル
ニチンのみを測定する場合には、被験液を加水分解処理
することなく、そのまま本発明の反応系を利用してＬ−
カルニチン量を測定すればよく、Ｌ−カルニチンおよび
アシルカルニチンの総カルニチン量を測定する場合に
は、被験液を加水分解した後、測定すればよい。逆に、
アシルカルニチン量のみを測定する場合には、加水分解
した後の被験液のＬ−カルニチン量から加水分解しない
被験液のＬ−カルニチン量を差引くことにより、アシル
カルニチン量を測定することができる。
く、アセチルカルニチン等のアシルカルニチンを加水分
解することにより遊離されてくるＬ−カルニチンも測定
することができる。例えば、被験液に存在するＬ−カル
ニチンのみを測定する場合には、被験液を加水分解処理
することなく、そのまま本発明の反応系を利用してＬ−
カルニチン量を測定すればよく、Ｌ−カルニチンおよび
アシルカルニチンの総カルニチン量を測定する場合に
は、被験液を加水分解した後、測定すればよい。逆に、
アシルカルニチン量のみを測定する場合には、加水分解
した後の被験液のＬ−カルニチン量から加水分解しない
被験液のＬ−カルニチン量を差引くことにより、アシル
カルニチン量を測定することができる。
さらに、Ｌ−カルニチンを生成又は消費する反応系に関
する基質又はそれに作用する酵素活性を測定することも
できる。この反応系としては、例えば次の反応式 にて例示される基質の定量又はそれに作用する酵素活性
の測定が挙げられる。
する基質又はそれに作用する酵素活性を測定することも
できる。この反応系としては、例えば次の反応式 にて例示される基質の定量又はそれに作用する酵素活性
の測定が挙げられる。
［発明の効果］ 前記の如く、本発明は還元型の吸収波長の異なる補酵素
を用いるための測定誤差が生じず、また、被検体中の遊
離のＬ−カルニチン量のみならず総カルニチン量および
アシルカルニチン量を、少量の検体で迅速かつ正確に定
量することができる。
を用いるための測定誤差が生じず、また、被検体中の遊
離のＬ−カルニチン量のみならず総カルニチン量および
アシルカルニチン量を、少量の検体で迅速かつ正確に定
量することができる。
［実施例］ 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれによって何ら限定されるものではない。
明はこれによって何ら限定されるものではない。
参考例１ アルカリゲネス・エスピーNo.981の培養： DL−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、KH2PO40.2
％、K2HPO40.4％、MgSO4・7H2O0.05％、FeSO4・7H2O0.0
02％およびMnSO4・nH2O0.001％を含む液体倍地（pH7.
0）100mlを、500ml容三角フラスコに分注し、120℃で20
分間加熱滅菌した後、これにアルカリゲネス・エスピー
No.981の１白金耳を接種し、28℃で120r.p.m.の振とう
培養器で40時間培養して種母95ml（酵素活性1.2U/ml）
を得た。
％、K2HPO40.4％、MgSO4・7H2O0.05％、FeSO4・7H2O0.0
02％およびMnSO4・nH2O0.001％を含む液体倍地（pH7.
0）100mlを、500ml容三角フラスコに分注し、120℃で20
分間加熱滅菌した後、これにアルカリゲネス・エスピー
No.981の１白金耳を接種し、28℃で120r.p.m.の振とう
培養器で40時間培養して種母95ml（酵素活性1.2U/ml）
を得た。
一方、DL−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、酵母エ
キス（極東製薬社製）0.1％、K2HPO40.054％、KH2PO40.
746％、MgSO4・7H2O0.05％、CaCl2・2H2O0.002％、FeSO
4・7H2O0.002％、MnSO4・nH2O0.002％およびディスフォ
ームCB442（日本油脂社製）1ml/を含む液体培地（pH
7.0）20を、30容ジャーファーメンターに仕込み、
加熱滅菌した後、これに前記で得た種母90mlを移植し、
培養温度28℃、通気量20／分、内圧0.4kg/cm2、撹拌
速度200r.p.m.で27時間通気撹拌培養し、培養物19
（酵素活性3.0U/ml）を得た。
キス（極東製薬社製）0.1％、K2HPO40.054％、KH2PO40.
746％、MgSO4・7H2O0.05％、CaCl2・2H2O0.002％、FeSO
4・7H2O0.002％、MnSO4・nH2O0.002％およびディスフォ
ームCB442（日本油脂社製）1ml/を含む液体培地（pH
7.0）20を、30容ジャーファーメンターに仕込み、
加熱滅菌した後、これに前記で得た種母90mlを移植し、
培養温度28℃、通気量20／分、内圧0.4kg/cm2、撹拌
速度200r.p.m.で27時間通気撹拌培養し、培養物19
（酵素活性3.0U/ml）を得た。
参考例２ 酵素の分離精製： 参考例１で得た培養物19を遠心分離で集菌し、これに
0.1％リゾチームおよび15mMエチレンジアミン四酢酸ジ
ナトリウム塩（EDTA・2Na）を含む40Mmトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）５を加え、37℃で１時間可溶化処理し
た。処理液を遠心分離して沈殿物を除去し、上清4500ml
（比活性10.3U/ml）を得た。この上清に硫安1100gを溶
解し、生じた沈殿物を遠心分離して除去し、得られた上
清に再び硫安700gを溶解した。この処理液を遠心分離し
て得た沈殿物を40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）500mlで
溶解した溶液（比活性84.1U/ml）を40mMトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た酵素
液を40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE
−セファロースCL−6B（ファルマシア社製）200mlのカ
ラムに通し、0.1M KClを含む40mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0）１を流した後、次いで0.3M KClを含む40mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、酵素液300ml（比活性
120.5U/ml）を得た。得られた酵素液を40mMトリス塩酸
緩衝液（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た
酵素液を40mMトリス塩酸緩衝液で緩衝化したハイドロキ
シルアパタイト（KOKEN社製）100mlのカラムに通し、40
mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）200mlを流した後、2mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）100mlで溶出し、酵素液100ml（比
活性331U/ml）を得た。得られた酵素液を20mMリン酸緩
衝液（pH7.5）５に対して透析し、酵素液95ml（比活
性331U/ml、回収率67.8％）を得た。
0.1％リゾチームおよび15mMエチレンジアミン四酢酸ジ
ナトリウム塩（EDTA・2Na）を含む40Mmトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）５を加え、37℃で１時間可溶化処理し
た。処理液を遠心分離して沈殿物を除去し、上清4500ml
（比活性10.3U/ml）を得た。この上清に硫安1100gを溶
解し、生じた沈殿物を遠心分離して除去し、得られた上
清に再び硫安700gを溶解した。この処理液を遠心分離し
て得た沈殿物を40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）500mlで
溶解した溶液（比活性84.1U/ml）を40mMトリス塩酸緩衝
液（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た酵素
液を40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE
−セファロースCL−6B（ファルマシア社製）200mlのカ
ラムに通し、0.1M KClを含む40mMトリス塩酸緩衝液（pH
8.0）１を流した後、次いで0.3M KClを含む40mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0）で溶出し、酵素液300ml（比活性
120.5U/ml）を得た。得られた酵素液を40mMトリス塩酸
緩衝液（pH8.0）10に対して透析した。透析して得た
酵素液を40mMトリス塩酸緩衝液で緩衝化したハイドロキ
シルアパタイト（KOKEN社製）100mlのカラムに通し、40
mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）200mlを流した後、2mMリ
ン酸緩衝液（pH7.0）100mlで溶出し、酵素液100ml（比
活性331U/ml）を得た。得られた酵素液を20mMリン酸緩
衝液（pH7.5）５に対して透析し、酵素液95ml（比活
性331U/ml、回収率67.8％）を得た。
本精製Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ中のNADHオキシ
ダーゼ活性は0.0001U/ml以下であった。
ダーゼ活性は0.0001U/ml以下であった。
以上の如くして得られたＬ−カルニチンデヒドロゲノー
ゼの性状は以下の通りである。
ゼの性状は以下の通りである。
（１）酵素作用 下記式に示すように、少なくともＬ−カルニチンおよび
NADから３−デヒドロカルニチンおよびNADHを生成する
反応を触媒する。
NADから３−デヒドロカルニチンおよびNADHを生成する
反応を触媒する。
（２）基質特異性 Ｌ−カルニチン 100％ コリン ０ グリシンベタイン ０ グルコース ０ リジン ０ （３）分子量 51000±6000 トーソー社製TSKゲルG3000W（0.7×５×60cm）による
値。溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）。標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用。
値。溶出液;0.2M NaCl含有0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）。標準品はオリエンタル酵母社製の次の分子量マー
カーを使用。
M.W.12,400 チトクロムＣ M.W.32,000 アデニレイトキナーゼ M.W.67,000 エノラーゼ M.W.142,000 ラクテートデヒドロゲナーゼ M.W.290,000 グルタメートデヒドロゲナーゼ （４）等電点 pH5.3±0.6 キャリアアンフォライトを用いる焦点電気泳動法により
４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各分
画の酵素活性を測定した。
４℃、700Vの定電圧で40時間通電した後、分画し、各分
画の酵素活性を測定した。
（５）Km値 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）、 5Uジアフォラーゼ（東洋醸造社製）、 0.025％NBT（和光純薬工業社製）、 １％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエー
ト（和光純薬工業社製） および50mM L−カルニチン を含む反応溶液中でNADの濃度を変化させて、NADに対す
るKm値を測定した結果では、0.141mMという値を示し
た。
ト（和光純薬工業社製） および50mM L−カルニチン を含む反応溶液中でNADの濃度を変化させて、NADに対す
るKm値を測定した結果では、0.141mMという値を示し
た。
一方、前記反応液中で50mM L−カルニチンの代わりに1m
M NADを添加し、Ｌ−カルニチンの濃度を変化させてＬ
−カルニチンに対するKm値を測定した結果では、9.3mM
という値を示した。
M NADを添加し、Ｌ−カルニチンの濃度を変化させてＬ
−カルニチンに対するKm値を測定した結果では、9.3mM
という値を示した。
（６）熱安定性 本酵素液（1.00U/ml）を20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.
0）で調製し、１時間の加熱処理後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果、酵素活性は
少なくとも45℃までは安定であった。
0）で調製し、１時間の加熱処理後、その残存活性を後
記の酵素活性測定法に従って測定した結果、酵素活性は
少なくとも45℃までは安定であった。
（７）至適温度 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0）を用い、後記の酵素活
性測定法に従い、35、40、45、50、55および60℃の各温
度で10分間反応後、0.1N塩酸2mlで反応を停止し、波長5
50nmで吸光度を測定した相対値の結果、50℃付近で最大
の活性を有している。
性測定法に従い、35、40、45、50、55および60℃の各温
度で10分間反応後、0.1N塩酸2mlで反応を停止し、波長5
50nmで吸光度を測定した相対値の結果、50℃付近で最大
の活性を有している。
（８）pH安定性 本酵素（1U/ml）を40mMの酢酸緩衝液（pH5.6〜6.0）、
リン酸緩衝液（pH6.0〜8.0）、トリス塩酸緩衝液（pH9.
0〜10.0）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（p
H9.0〜10.0）の各緩衝で調製し、45℃で30分間加熱処理
した後、その残存活性を後記の酵素活性測定法に従って
測定した結果、pH8.0〜9.0の範囲で95以上の活性を保持
している。
リン酸緩衝液（pH6.0〜8.0）、トリス塩酸緩衝液（pH9.
0〜10.0）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（p
H9.0〜10.0）の各緩衝で調製し、45℃で30分間加熱処理
した後、その残存活性を後記の酵素活性測定法に従って
測定した結果、pH8.0〜9.0の範囲で95以上の活性を保持
している。
（９）至適pH 後記の酵素活性測定法に従い、反応液中の100mMトリス
塩酸緩衝液に代えて100mMのリン酸緩衝液（pH6.5〜7.
5）、トリス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.0）およびグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜10.0）の各緩衝液
を用い、37℃で10分間反応の後に、0.1N塩酸で反応を停
止し、波長550nmの吸光度を測定した相対値の結果、pH
9.0付近で最大の活性を示す。
塩酸緩衝液に代えて100mMのリン酸緩衝液（pH6.5〜7.
5）、トリス塩酸緩衝液（pH8.0〜9.0）およびグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0〜10.0）の各緩衝液
を用い、37℃で10分間反応の後に、0.1N塩酸で反応を停
止し、波長550nmの吸光度を測定した相対値の結果、pH
9.0付近で最大の活性を示す。
（10）水溶液中における長期保存安定性 上記のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼに0.05mM NADを
添加したものを用いて、50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.
0）中で、10U/mlになるように調製し、５℃における２
週間の保存安定性を測定した。その結果、１週間後の残
存活性が96％で、２週間後の残存活性は82％であり、格
段に安定性の良い性質を有している。
添加したものを用いて、50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.
0）中で、10U/mlになるように調製し、５℃における２
週間の保存安定性を測定した。その結果、１週間後の残
存活性が96％で、２週間後の残存活性は82％であり、格
段に安定性の良い性質を有している。
（11）Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの酵素活性測定
法 反応液組成 50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0） 1mM NAD 5Uジアフォラーゼ（東洋醸造社製） 0.025％NBT（和光純薬工業社製） 100mM塩化カリウム 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬工業社製） 100mM L−カルニチン（シグマ社製） 酵素活性測定法 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イン
キュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02mlを添
加して撹拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後
に、0.1N塩酸2.0mlを添加して撹拌し、反応を停止し
て、A550nmを測定して吸光度A1を求める。上記反応液よ
りＬ−カルニチンを除いた反応液を用いて同様の測定を
行い、その吸光度A0を求める。
法 反応液組成 50mMトリス塩酸緩衝液（pH9.0） 1mM NAD 5Uジアフォラーゼ（東洋醸造社製） 0.025％NBT（和光純薬工業社製） 100mM塩化カリウム 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬工業社製） 100mM L−カルニチン（シグマ社製） 酵素活性測定法 上記の反応液1mlを小試験管に入れ、37℃で５分間イン
キュベートした後に、適当に希釈した酵素液0.02mlを添
加して撹拌し、反応を開始する。正確に10分間反応の後
に、0.1N塩酸2.0mlを添加して撹拌し、反応を停止し
て、A550nmを測定して吸光度A1を求める。上記反応液よ
りＬ−カルニチンを除いた反応液を用いて同様の測定を
行い、その吸光度A0を求める。
計算式 21.7:分子吸光係数cm2/μmol Z:希釈倍数 実施例１ ＜試薬＞ 100mMトリス塩酸緩衝液（pH9.5） 5mMチオNAD（三共社製） 0.2mM NADH（オリエンタル酵母社製） 92U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で得
たもの） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、30、40
および50μＭのＬ−カルニチン溶液をそれぞれ0.05ml添
加し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と
５分目の400nmにおける吸光度を読みとり、その差を求
めた。その結果を図１に示す。図１から明らかなよう
に、Ｌ−カルニチン量に対する吸光度変化量は良好な直
線性を示した。
たもの） ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、０、10、20、30、40
および50μＭのＬ−カルニチン溶液をそれぞれ0.05ml添
加し、37℃にて反応を開始させた。反応開始後３分目と
５分目の400nmにおける吸光度を読みとり、その差を求
めた。その結果を図１に示す。図１から明らかなよう
に、Ｌ−カルニチン量に対する吸光度変化量は良好な直
線性を示した。
実施例２ ＜試薬＞ 40mMグリシン・NaOH緩衝液（pH10.0） 5mMチオNAD（三共社製） 0.5mM NADH（オリエンタル酵母社製） 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬社製） 120U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で
得たもの） 2mMオキザミン酸 ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、５段階に希釈した正
常血清各々50μｌを添加し、37℃にて反応を開始させ
た。反応開始後１分目と６分目の400nmにおける吸光度
を読みとり、その差を求めた。その結果を図２に示す。
ート（和光純薬社製） 120U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で
得たもの） 2mMオキザミン酸 ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、５段階に希釈した正
常血清各々50μｌを添加し、37℃にて反応を開始させ
た。反応開始後１分目と６分目の400nmにおける吸光度
を読みとり、その差を求めた。その結果を図２に示す。
また、別に50μML−カルニチン溶液50μｌを用い同様の
操作を行い、上記正常血清中のＬ−カルニチン量を算出
したところ、54.3μＭであった。
操作を行い、上記正常血清中のＬ−カルニチン量を算出
したところ、54.3μＭであった。
実施例３ ＜試薬＞ 40mMグリシン・NaOH緩衝液（pH10.0） 5mMチオNAD（三共社製） 0.5mM NADH（オチエンタル酵母社製） 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬社製） 120U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で
得たもの） 2mMオキザミン酸 ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、実施例２に用いた正
常血清に10、20および50μＭになるようにＬ−カルニチ
ンを加えた被検体50μｌを添加し、実施例２と同様の操
作を行った。結果は表１の如くであり、回収率は97.0〜
102.0％であった。
ート（和光純薬社製） 120U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で
得たもの） 2mMオキザミン酸 ＜操作＞ 上記試薬1mlをキュベットにとり、実施例２に用いた正
常血清に10、20および50μＭになるようにＬ−カルニチ
ンを加えた被検体50μｌを添加し、実施例２と同様の操
作を行った。結果は表１の如くであり、回収率は97.0〜
102.0％であった。
実施例４ ＜試薬＞ 40mMグリシン・NaOH緩衝液（pH10.0） 5mMチオNAD（三共社製） 0.2mM NADH（オリエンタル酵母社製） 0.5％ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエ
ート（和光純薬社製） 100U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で
得たもの） 2mMオキザミン酸 ＜操作＞ 血清0.05mlに2Mトリス塩酸緩衝液0.025mlおよび1NKOH0.
025mlを加え、血清中のアシルカルニチンを加水分解す
るために37℃、１時間放置し、その後2.5N HCl 0.05ml
を加え中和したものを総カルニチン測定用検体とした。
また、同様の血清0.05mlに生理食塩水0.1mlを加えたも
のを遊離カルニチン測定用検体とした。
ート（和光純薬社製） 100U/ml L−カルニチンデヒドロゲナーゼ（参考例２で
得たもの） 2mMオキザミン酸 ＜操作＞ 血清0.05mlに2Mトリス塩酸緩衝液0.025mlおよび1NKOH0.
025mlを加え、血清中のアシルカルニチンを加水分解す
るために37℃、１時間放置し、その後2.5N HCl 0.05ml
を加え中和したものを総カルニチン測定用検体とした。
また、同様の血清0.05mlに生理食塩水0.1mlを加えたも
のを遊離カルニチン測定用検体とした。
上記試薬1mlをキュベットにとり、上述の２種類の検体
をそれぞれ0.05mlずつ添加し、37℃にて反応を開始させ
た。反応開始後１分目と６分目の400nmにおける吸光度
を読みとり、その差を求めた。
をそれぞれ0.05mlずつ添加し、37℃にて反応を開始させ
た。反応開始後１分目と６分目の400nmにおける吸光度
を読みとり、その差を求めた。
既知濃度のＬ−カルニチンについて同様の操作を行い、
得られた値から総カルニチン量および遊離カルニチン量
を算出し、また総カルニチン量と遊離カルニチン量との
差からアシルカルニチン量を求めた。
得られた値から総カルニチン量および遊離カルニチン量
を算出し、また総カルニチン量と遊離カルニチン量との
差からアシルカルニチン量を求めた。
３種類の血清について得られた結果を表２に示す。
図１は実施例１における、Ｌ−カルニチン量に対する40
0nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図２は実施例１における、血清量に対する400nmにおけ
るレイトアッセイの結果を示す図面である。
0nmにおけるレイトアッセイの結果を示す図面である。 図２は実施例１における、血清量に対する400nmにおけ
るレイトアッセイの結果を示す図面である。
Claims (5)
- 【請求項１】被検体に、次の成分〜 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下
チオNAD類という）とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下NAD類という）とを補酵素とし、少なく
ともＬ−カルニチンを基質としてデヒドロカルニチンを
生成する可逆反応をなすＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼ A1 B1 を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式 （式中、A1はチオNAD類又はNAD類を示し、A2はA1の還元
型生成物を示し、B1はA1がチオNAD類のときは還元型NAD
類を、A1がNAD類のときは還元型チオNAD類を示し、B2は
B1の酸化型生成物を示す） で表されるサイクリング反応を形成せしめ、該反応によ
って変化するA2又はB1の量を測定することを特徴とする
Ｌ−カルニチンの高感度測定法。 - 【請求項２】Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼが、アル
カリゲネス属由来のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼで
ある請求項１記載のＬ−カルニチンの高感度測定法。 - 【請求項３】NAD類が、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド（NAD）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチド（アセチルNAD）、アセチルピリジンヒポキサン
チンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポキサンチ
ンジヌクレオチド（デアミノNAD）からなる群より選ば
れるものである請求項１記載のＬ−カルニチンの高感度
測定法。 - 【請求項４】チオNAD類が、チオニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド（チオNAD）又はチオニコチンアミド
ヒポキサンチンジヌクレオチドである請求項１記載のＬ
−カルニチンの高感度測定法。 - 【請求項５】次の成分〜 チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下
チオNAD類という）とニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド類（以下NAD類という）とを補酵素とし、少なく
ともＬ−カルニチンを基質としてデヒドロカルニチンを
生成する可逆反応をなすＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼ A1（A1はチオNAD類又はNAD類を示す） B1（B1はA1がチオNAD類のときは還元型NAD類を、A1が
NAD類のときは還元型チオNAD類を示す） を含有することを特徴とするＬ−カルニチン測定用組成
物。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2305439A JPH0673478B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-11-09 | Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物 |
| DE69119791T DE69119791T2 (de) | 1990-01-11 | 1991-01-11 | Hochempfindliche Bestimmungsmethode für L-Carnitin und Zusammensetzung für einen Reagenziensatz |
| EP91300201A EP0437373B1 (en) | 1990-01-11 | 1991-01-11 | High sensitive assay method of L-carnitine and composition for an assay |
| US07/640,117 US5266463A (en) | 1990-01-11 | 1991-01-11 | Highly sensitive assay method for L-carnitine and composition for practicing same |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-4063 | 1990-01-11 | ||
| JP406390 | 1990-01-11 | ||
| JP2305439A JPH0673478B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-11-09 | Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH0673478B2 true JPH0673478B2 (ja) | 1994-09-21 |
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ID=26337779
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2305439A Expired - Fee Related JPH0673478B2 (ja) | 1990-01-11 | 1990-11-09 | Ｌ―カルニチンの高感度測定法および測定用組成物 |
Country Status (4)
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| EP (1) | EP0437373B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0673478B2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| IT1242173B (it) * | 1989-12-01 | 1994-02-16 | Toyo Jozo Kk | Metodo di analisi quantitativa altamente sensibile di acidi biliari e composizione per la analisi quantitativa. |
| JP2684238B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1997-12-03 | 旭化成工業株式会社 | アシルカルニチンエステラーゼ及びその製造法 |
| WO1993012254A1 (fr) * | 1991-12-12 | 1993-06-24 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Procede et composition pour detecter avec une grande sensibilite l'acide d-3-hydroxybutyrique ou l'acide diacetique |
| US5872008A (en) * | 1996-02-09 | 1999-02-16 | Bair; Glenn O. | Methods for diagnosing pre-menstrual syndrome |
| US6586661B1 (en) * | 1997-06-12 | 2003-07-01 | North Carolina State University | Regulation of quinolate phosphoribosyl transferase expression by transformation with a tobacco quinolate phosphoribosyl transferase nucleic acid |
| AU2001248129A1 (en) * | 2000-04-17 | 2001-10-30 | Befa Handelsgesellschaft M.B.H. | Method for determining the concentration of carnitine in fluids |
| US6867012B2 (en) * | 2000-12-05 | 2005-03-15 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Determination method of biological component and reagent kit used therefor |
| NZ564025A (en) * | 2005-05-11 | 2012-03-30 | Vector Tobacco Inc | Reduced risk tobacco products and methods of making same |
| JP5891537B2 (ja) | 2014-07-07 | 2016-03-23 | Smc株式会社 | 管継手 |
| JP7446875B2 (ja) * | 2020-03-16 | 2024-03-11 | オリエンタル酵母工業株式会社 | Ｌ－カルニチン測定方法及びｌ－カルニチン測定キット |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CS164231B2 (ja) * | 1972-09-28 | 1975-11-07 | ||
| FR2398046A1 (fr) * | 1977-07-18 | 1979-02-16 | Inst Francais Du Petrole | Synthese enzymatique de la l-carnitine |
| GB2059421A (en) * | 1979-10-03 | 1981-04-23 | Self C H | Assay method and reagents therefor |
| JPS59192095A (ja) * | 1983-04-13 | 1984-10-31 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−カルニチンの製造法 |
| FR2596865B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1989-09-01 | Elf Aquitaine | Nouveau procede et dispositif pour le dosage de la carnitine |
-
1990
- 1990-11-09 JP JP2305439A patent/JPH0673478B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-01-11 EP EP91300201A patent/EP0437373B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-11 DE DE69119791T patent/DE69119791T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-01-11 US US07/640,117 patent/US5266463A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
| US5266463A (en) | 1993-11-30 |
| EP0437373A1 (en) | 1991-07-17 |
| DE69119791D1 (de) | 1996-07-04 |
| DE69119791T2 (de) | 1996-12-12 |
| JPH03251196A (ja) | 1991-11-08 |
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