JPH0229311B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0229311B2 JPH0229311B2 JP60120673A JP12067385A JPH0229311B2 JP H0229311 B2 JPH0229311 B2 JP H0229311B2 JP 60120673 A JP60120673 A JP 60120673A JP 12067385 A JP12067385 A JP 12067385A JP H0229311 B2 JPH0229311 B2 JP H0229311B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chitosanase
- chitosan
- enzyme
- hours
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、多糖類のキトサンを分子の内部鎖か
ら任意に分解しうるキトサナーゼの製造法に関
し、詳しくは、キトサンを分解してキトサンオリ
ゴ糖を高収率で得ることができるキトサナーゼの
製造法に関する。 〔技術の背景および従来技術の説明〕 キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得
られる多糖類であつて、セルロースと極めてよく
似た化学構造を有していて、セルロースを構成す
るグルコースの２位の水酸基がアセトアミド基で
置換された２―アセトアミド―２―デオキシ―Ｄ
―グルコース（Ｎ―アセチルグルコサミン）がβ
―１，４結合した直鎖状の多糖類である。 キトサンは、キチンが脱アセチル化されたもの
であつて、Ｄ―グルコサミンがβ―１，４結合し
た直鎖状の多糖類である。 キチンを分解する酵素は、その分子の内部鎖か
ら切断してキチンオリゴ糖を生成するキチナーゼ
と、生成したオリゴ糖からＮ―アセチルグリコサ
ミンを遊離させるβ―Ｎ―アセチルグルコサミニ
ダーゼの存在が知られている。これに対し、キト
サンを分解する酵素については、キトサナーゼが
微生物に存在することは知られているが、β―グ
ルコサミニダーゼについての報告はなく、またキ
トサナーゼによるキトサンの分解機構についても
充分明らかにされていない。 一方において、キトサンの分解産物のキトサン
オリゴ糖、たとえば、キトビオース（GlcN）2、
キトトリオース（GlcN）3、キトテトラオース
（GlcN）4、キトペンタオース（GlcN）5、および
キトヘキサオース（GlcN）6などがアミノ糖（塩
基性の糖）であることから、これらのキトサオリ
ゴ糖を食品添加物（増量剤）、化粧品成分または
医薬品などの広範な用途に利用することが考えら
れ、これらのキトサンオリゴ糖を経済的に製造す
る技術の開発が要望されている。 これまでに報告されている微生物起源のキトサ
ナーゼにおいて、ストレプトマイセス
（Streptomyces sp.）No.６、ペニシリウム・イス
ランデイクム（Penicillium islandicum）および
バチルス（Bacillus sp.）No.99−５が生産するキ
トサナーゼはキトサンを分解してオリゴ糖を生成
することが知られているが、本品のようにキトサ
ンオリゴ糖を著量に生成する酵素についての報告
は見当らない。 本発明者らは、各種重合度のキトサンオリゴ糖
を経済的に生産する技術を開発することを企図し
て、キトサナーゼ生産細菌の検索を行ない、バチ
ルス属に属する細菌の変異株のバチルスNo.７−Ｍ
をキトサンを含む培地に培養すると、キトサンオ
リゴ糖を著量に生産するキトサナーゼを培地に蓄
積することを見出し、これらの知見に基づいて本
発明に到達した。 〔発明の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、酵素活性が高く、キトサンを
分解してキトサンオリゴ糖を効率よく生産しうる
キトサナーゼの製造法を提供することにある。 本発明は、バチルス属に属し、コロイダルキト
サンに作用し、PH５〜11の範囲において安定であ
るキトサナーゼを生産する細菌を培養し、培養物
から前記のキトサナーゼを分解採取することを特
徴とするキトサナーゼの製造法である。 本発明において、バチルス属に属し、コロイダ
ルキトサンに作用し、PH５〜11の範囲において安
定であるキトサナーゼを生産する細菌をコロイダ
ルキトサンを含む培地において培養することがで
き、また前記のキトサナーゼを生産する細菌とし
て、バチルス（Bacillus sp.）No.７−Ｍ〔微工研
菌寄第8139号（FERM Ｐ―8139）〕を用いるこ
とができる。 〔発明の具体的な説明〕 本発明のキトサナーゼは、コロイダルキトサン
に作用し、PH５〜11の範囲において安定であると
いう特徴を有するものであつて、バチルス
（Bacillus）属に属し、キトサナーゼを菌体外に
生産しうる細菌（キトサナーゼ生産菌）をキトサ
ンを含む液体培地で好気的に培養することによつ
て、培地中に蓄積される。培地中のキトサナーゼ
は、菌体を除去した後、上澄液に硫安を加えて蛋
白質成分を塩析し、これをカラムクロマトグラフ
イー、ゲル濾過および限外濾過などの常法によつ
てキトサナーゼを濃縮し、分離精製する。 キトサナーゼ生産菌の培養に使用する液体培地
は、微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、窒素
源および他の無機塩の他に、コロイダルキトサン
を含むことを必要とする。培養は、30℃前後の温
度において、振とう培養または通気攪拌培養など
の好気的条件下に行なわれる。 キトサナーゼ生産菌は、バチルス属に属し、コ
ロイダルキトサンに作用し、PH５〜11の範囲にお
いて安定であるキトサナーゼを生産しうる細菌で
あるならば、いかなるものであつてもこれを使用
することができるが、バチルス（Bacillus sp.）
No.７−Ｍ（微工研菌寄第8139号）を使用するのが
好ましい。 バチルスNo.７―Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯
一の炭素源とする培地に生育しうる細菌として分
離されたバチルス（Bacillus sp.）No.７株を親株
として、この親株をＮ―メチル―N′―ニトロソ
ーＮ―ニトロソグアニジン（NTG）で処理して
突然変異を誘発させ、得られたストレプトマイシ
ン耐性の変異株の中から、高活性のキトサナーゼ
を生産しうるものとして分離された変異株であつ
て、微工研菌寄第8139号（FERM Ｐ―8139）と
して通商産業省微生物工業技術研究所に寄託され
ている。 バチルスNo.７−Ｍの菌学的性質は以下に示され
る。 Ａ 細菌の形態 (1) 細菌の形および大きさ：短桿菌、（肉汁お
よび肉汁寒天斜面培養、37℃、24〜72時間の
培養） (2) 細胞の多形性の有無：無し、 (3) 運動性の有無：有り、 （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） (4) 胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞
子、球状、 〔ドーナー（Dorner）の染色法およびウ
イツツ（Witz）変法〕 (5) グラム染色性：陽性、〔肉汁寒天斜面培養、
37℃、18時間、ヒユツカー（Hucker）の変
法により染色〕 Ｂ 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（37℃、24〜168時間）：
糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白色
のコロニーを形成する。コロニーの表面は凹
凸でやや光沢があり、半透明である。時間の
経過とともに盛上つてくる。色素は生産しな
い。 (2) 肉汁寒天斜面培養（37℃、24〜168時間）：
拡布状に盛上つた乳白色のコロニーを形成す
る。コロニーは凸円形の隆起があり、光沢が
ある。生育は良好で、時間とともに拡がつて
くる。色素は生産しない。 (3) 肉汁液体培養（37℃、24〜168時間）：表面
に膜を形成しない。時間とともに全体的に濁
つてくる。底部に絮状（顆粒状）の沈デンが
形成され、徐々に多くなつてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃、24〜168時
間）： 穿刺線に沿つて生育し、液化する。表面お
よび内部は漏斗状に生育し、液化する。液化
部分は白濁する。 (5) リトマスミルク（37℃、24〜168時間）：２
日後から上部が少しずつ液化し、４日目には
色は完全に変色し、酸性となつた。凝固はし
ない。時間の経過とともに、液化は進み、半
透明になつた。 Ｃ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− （硝酸塩肉汁培地、37℃、24〜120時間） (2) 脱窒反応：− （駒形らの方法、発酵管を使用、37℃、24
〜120時間） (3) MRテスト：＋ （37℃、24〜168時間） (4) VPテスト（アセチルメチルカルビノール
生成試験：＋ （37℃、24〜168時間） (5) インドールの生成：− （37℃、24〜168時間） (6) 硫化水素の生成：− （TSI寒天法、37℃、24〜168時間） (7) デン粉の加水分解：＋ （37℃、24〜168時間） (8) クエン酸の利用 （コーザーの培地、37℃、24〜168時間）：
− （クリステンセンの培地、37℃、24〜168
時間）：＋ (9) 無機窒素源の利用（37℃、24〜168時間） 硝酸塩：未定、 アンモニウム塩：未定、 (10) 色素の生成 （マンニツト・酵母エキス寒天斜面培
地）：− 〔キング（King）Ａ寒天斜面培地〕：− (11) 蛍光の有無：無し (12) ウレアーゼ：＋ （クリステンセン―ウレア寒天培地、37
℃、24〜168時間） (13) オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (14) カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (15) 生育の範囲：（肉汁寒天培地） 温度：未定、 PH：５〜10、 添加食塩濃度：未定、 (16) 酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、37
℃、24〜72時間） (17) Ｏ―Ｆテスト〔ヒユー―ライフソン
（Hugh―Leifson）法、37℃、Ｄ―グルコー
ス〕：発酵的に酸を生成する。
（fermentative） (18) 糖類からの酸およびガスの生成の有無
（37℃、24〜168時間）： 糖 類 酸 ガス Ｄ―グルコース ＋ − Ｄ―マンノース − − Ｄ―ガラクトース − − Ｄ―フラクトース ＋ − Ｌ―アラビノース − − Ｄ―キシロース − − Ｄ―ソルビツト − − Ｄ―マンニツト − − イノシツト − − マルトース ＋ − サツカロース ＋ − ラクトース − − デン粉 ＋ − セルロース − − グリセリン − − 以上の菌学的性質について、バージエイス・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）の第８版（1974年）を検索した
ところ、No.７−Ｍ株はバチルス（Bacillus）属に
属するのが相当であることがわかつた。 本発明によつて得られたキトサナーゼの酵素化
学的性質は以下に示すとおりである。 (1) 作用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意に
β―１，４結合を分解して、主としてキトサン
オリゴ糖（GlcN）o（ｎ＝２〜８）（２量体〜８
量体）を生成する。キトサンオリゴ糖は高速液
体クロマトグラフイーを用いてキトサン分解液
から分離することができる。この分解液におけ
るキトサンの分解度は約45％である。カルボキ
シメチルセルロース（CMC）にも作用し、あ
る程度はこれを分解するが、キチンには全く作
用しない。 (2) 作用温度範囲および最適作用温度： 可溶性キトサンを基質とした場合、80℃まで
作用し、最適作用温度は50℃である。 PH6.0において10分間反応させた場合の温度
と比活性の関係を第１図に示す。 (3) 作用PH範囲および最適PH： PH３〜９の範囲において作用し、最適PHはPH
６である。 １％可溶性キトサン１mlに各PHの緩衝液２ml
および酵素液１mlを加えた反応液を37℃におい
て10分間反応させた場合のPHと酵素の比活性の
関係を第２図に示す。 (4) 熱安定性： 50℃における15分間の保温まで、ほぼ安定
で、60℃における15分間の加熱により、酵素の
約40％が失活し、70℃における15分間の加熱に
より、完全に失活した。 温度と比活性の関係を第３図に示す。 (5) PH安定性： 0.1M緩衝液中で30℃において２時間放置し
た後、残存する酵素活性を測定したが、PH５〜
11の範囲において安定であつた。PH10〜11にお
いて安定であることは、本発明により得られた
キトサナーゼの大きな特徴の一つである。PHと
比活性の関係を第４図に示す。 (6) 阻害剤： 本発明により得られたキトサナーゼは、１×
10-3Mの終濃度のHgCl2、PbCl2、AgNO3およ
びPCMBの存在によりほぼ100％が阻害され
た。 (7) 基質特異性： 種々の基質を使用し、基質の終濃度を0.25％
とした時に、酵素反応液４ml当り酵素蛋白質１
mgによつて１時間後に遊離する全還元糖とヘキ
ソサミンの量（mg／mg蛋白質／時）を測定し
た。その結果が第１表に示される。
ら任意に分解しうるキトサナーゼの製造法に関
し、詳しくは、キトサンを分解してキトサンオリ
ゴ糖を高収率で得ることができるキトサナーゼの
製造法に関する。 〔技術の背景および従来技術の説明〕 キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得
られる多糖類であつて、セルロースと極めてよく
似た化学構造を有していて、セルロースを構成す
るグルコースの２位の水酸基がアセトアミド基で
置換された２―アセトアミド―２―デオキシ―Ｄ
―グルコース（Ｎ―アセチルグルコサミン）がβ
―１，４結合した直鎖状の多糖類である。 キトサンは、キチンが脱アセチル化されたもの
であつて、Ｄ―グルコサミンがβ―１，４結合し
た直鎖状の多糖類である。 キチンを分解する酵素は、その分子の内部鎖か
ら切断してキチンオリゴ糖を生成するキチナーゼ
と、生成したオリゴ糖からＮ―アセチルグリコサ
ミンを遊離させるβ―Ｎ―アセチルグルコサミニ
ダーゼの存在が知られている。これに対し、キト
サンを分解する酵素については、キトサナーゼが
微生物に存在することは知られているが、β―グ
ルコサミニダーゼについての報告はなく、またキ
トサナーゼによるキトサンの分解機構についても
充分明らかにされていない。 一方において、キトサンの分解産物のキトサン
オリゴ糖、たとえば、キトビオース（GlcN）2、
キトトリオース（GlcN）3、キトテトラオース
（GlcN）4、キトペンタオース（GlcN）5、および
キトヘキサオース（GlcN）6などがアミノ糖（塩
基性の糖）であることから、これらのキトサオリ
ゴ糖を食品添加物（増量剤）、化粧品成分または
医薬品などの広範な用途に利用することが考えら
れ、これらのキトサンオリゴ糖を経済的に製造す
る技術の開発が要望されている。 これまでに報告されている微生物起源のキトサ
ナーゼにおいて、ストレプトマイセス
（Streptomyces sp.）No.６、ペニシリウム・イス
ランデイクム（Penicillium islandicum）および
バチルス（Bacillus sp.）No.99−５が生産するキ
トサナーゼはキトサンを分解してオリゴ糖を生成
することが知られているが、本品のようにキトサ
ンオリゴ糖を著量に生成する酵素についての報告
は見当らない。 本発明者らは、各種重合度のキトサンオリゴ糖
を経済的に生産する技術を開発することを企図し
て、キトサナーゼ生産細菌の検索を行ない、バチ
ルス属に属する細菌の変異株のバチルスNo.７−Ｍ
をキトサンを含む培地に培養すると、キトサンオ
リゴ糖を著量に生産するキトサナーゼを培地に蓄
積することを見出し、これらの知見に基づいて本
発明に到達した。 〔発明の目的および発明の要約〕 本発明の目的は、酵素活性が高く、キトサンを
分解してキトサンオリゴ糖を効率よく生産しうる
キトサナーゼの製造法を提供することにある。 本発明は、バチルス属に属し、コロイダルキト
サンに作用し、PH５〜11の範囲において安定であ
るキトサナーゼを生産する細菌を培養し、培養物
から前記のキトサナーゼを分解採取することを特
徴とするキトサナーゼの製造法である。 本発明において、バチルス属に属し、コロイダ
ルキトサンに作用し、PH５〜11の範囲において安
定であるキトサナーゼを生産する細菌をコロイダ
ルキトサンを含む培地において培養することがで
き、また前記のキトサナーゼを生産する細菌とし
て、バチルス（Bacillus sp.）No.７−Ｍ〔微工研
菌寄第8139号（FERM Ｐ―8139）〕を用いるこ
とができる。 〔発明の具体的な説明〕 本発明のキトサナーゼは、コロイダルキトサン
に作用し、PH５〜11の範囲において安定であると
いう特徴を有するものであつて、バチルス
（Bacillus）属に属し、キトサナーゼを菌体外に
生産しうる細菌（キトサナーゼ生産菌）をキトサ
ンを含む液体培地で好気的に培養することによつ
て、培地中に蓄積される。培地中のキトサナーゼ
は、菌体を除去した後、上澄液に硫安を加えて蛋
白質成分を塩析し、これをカラムクロマトグラフ
イー、ゲル濾過および限外濾過などの常法によつ
てキトサナーゼを濃縮し、分離精製する。 キトサナーゼ生産菌の培養に使用する液体培地
は、微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、窒素
源および他の無機塩の他に、コロイダルキトサン
を含むことを必要とする。培養は、30℃前後の温
度において、振とう培養または通気攪拌培養など
の好気的条件下に行なわれる。 キトサナーゼ生産菌は、バチルス属に属し、コ
ロイダルキトサンに作用し、PH５〜11の範囲にお
いて安定であるキトサナーゼを生産しうる細菌で
あるならば、いかなるものであつてもこれを使用
することができるが、バチルス（Bacillus sp.）
No.７−Ｍ（微工研菌寄第8139号）を使用するのが
好ましい。 バチルスNo.７―Ｍは、長崎県南高来郡小浜町雲
仙の原生沼の土壌よりキチンまたはキトサンを唯
一の炭素源とする培地に生育しうる細菌として分
離されたバチルス（Bacillus sp.）No.７株を親株
として、この親株をＮ―メチル―N′―ニトロソ
ーＮ―ニトロソグアニジン（NTG）で処理して
突然変異を誘発させ、得られたストレプトマイシ
ン耐性の変異株の中から、高活性のキトサナーゼ
を生産しうるものとして分離された変異株であつ
て、微工研菌寄第8139号（FERM Ｐ―8139）と
して通商産業省微生物工業技術研究所に寄託され
ている。 バチルスNo.７−Ｍの菌学的性質は以下に示され
る。 Ａ 細菌の形態 (1) 細菌の形および大きさ：短桿菌、（肉汁お
よび肉汁寒天斜面培養、37℃、24〜72時間の
培養） (2) 細胞の多形性の有無：無し、 (3) 運動性の有無：有り、 （肉汁寒天半流動高層穿刺培養） (4) 胞子の有無：有り、内生胞子および裸の胞
子、球状、 〔ドーナー（Dorner）の染色法およびウ
イツツ（Witz）変法〕 (5) グラム染色性：陽性、〔肉汁寒天斜面培養、
37℃、18時間、ヒユツカー（Hucker）の変
法により染色〕 Ｂ 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養（37℃、24〜168時間）：
糸状の周縁を有する円形で、隆起した乳白色
のコロニーを形成する。コロニーの表面は凹
凸でやや光沢があり、半透明である。時間の
経過とともに盛上つてくる。色素は生産しな
い。 (2) 肉汁寒天斜面培養（37℃、24〜168時間）：
拡布状に盛上つた乳白色のコロニーを形成す
る。コロニーは凸円形の隆起があり、光沢が
ある。生育は良好で、時間とともに拡がつて
くる。色素は生産しない。 (3) 肉汁液体培養（37℃、24〜168時間）：表面
に膜を形成しない。時間とともに全体的に濁
つてくる。底部に絮状（顆粒状）の沈デンが
形成され、徐々に多くなつてくる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養（25℃、24〜168時
間）： 穿刺線に沿つて生育し、液化する。表面お
よび内部は漏斗状に生育し、液化する。液化
部分は白濁する。 (5) リトマスミルク（37℃、24〜168時間）：２
日後から上部が少しずつ液化し、４日目には
色は完全に変色し、酸性となつた。凝固はし
ない。時間の経過とともに、液化は進み、半
透明になつた。 Ｃ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− （硝酸塩肉汁培地、37℃、24〜120時間） (2) 脱窒反応：− （駒形らの方法、発酵管を使用、37℃、24
〜120時間） (3) MRテスト：＋ （37℃、24〜168時間） (4) VPテスト（アセチルメチルカルビノール
生成試験：＋ （37℃、24〜168時間） (5) インドールの生成：− （37℃、24〜168時間） (6) 硫化水素の生成：− （TSI寒天法、37℃、24〜168時間） (7) デン粉の加水分解：＋ （37℃、24〜168時間） (8) クエン酸の利用 （コーザーの培地、37℃、24〜168時間）：
− （クリステンセンの培地、37℃、24〜168
時間）：＋ (9) 無機窒素源の利用（37℃、24〜168時間） 硝酸塩：未定、 アンモニウム塩：未定、 (10) 色素の生成 （マンニツト・酵母エキス寒天斜面培
地）：− 〔キング（King）Ａ寒天斜面培地〕：− (11) 蛍光の有無：無し (12) ウレアーゼ：＋ （クリステンセン―ウレア寒天培地、37
℃、24〜168時間） (13) オキシダーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (14) カタラーゼ：＋ （肉汁寒天培地、37℃、24〜48時間） (15) 生育の範囲：（肉汁寒天培地） 温度：未定、 PH：５〜10、 添加食塩濃度：未定、 (16) 酸素に対する態度：好気性 （１％グルコース肉汁高層寒天培地、37
℃、24〜72時間） (17) Ｏ―Ｆテスト〔ヒユー―ライフソン
（Hugh―Leifson）法、37℃、Ｄ―グルコー
ス〕：発酵的に酸を生成する。
（fermentative） (18) 糖類からの酸およびガスの生成の有無
（37℃、24〜168時間）： 糖 類 酸 ガス Ｄ―グルコース ＋ − Ｄ―マンノース − − Ｄ―ガラクトース − − Ｄ―フラクトース ＋ − Ｌ―アラビノース − − Ｄ―キシロース − − Ｄ―ソルビツト − − Ｄ―マンニツト − − イノシツト − − マルトース ＋ − サツカロース ＋ − ラクトース − − デン粉 ＋ − セルロース − − グリセリン − − 以上の菌学的性質について、バージエイス・マ
ニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリ
オロジー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）の第８版（1974年）を検索した
ところ、No.７−Ｍ株はバチルス（Bacillus）属に
属するのが相当であることがわかつた。 本発明によつて得られたキトサナーゼの酵素化
学的性質は以下に示すとおりである。 (1) 作用： キトサンに作用し、分子の内部鎖から任意に
β―１，４結合を分解して、主としてキトサン
オリゴ糖（GlcN）o（ｎ＝２〜８）（２量体〜８
量体）を生成する。キトサンオリゴ糖は高速液
体クロマトグラフイーを用いてキトサン分解液
から分離することができる。この分解液におけ
るキトサンの分解度は約45％である。カルボキ
シメチルセルロース（CMC）にも作用し、あ
る程度はこれを分解するが、キチンには全く作
用しない。 (2) 作用温度範囲および最適作用温度： 可溶性キトサンを基質とした場合、80℃まで
作用し、最適作用温度は50℃である。 PH6.0において10分間反応させた場合の温度
と比活性の関係を第１図に示す。 (3) 作用PH範囲および最適PH： PH３〜９の範囲において作用し、最適PHはPH
６である。 １％可溶性キトサン１mlに各PHの緩衝液２ml
および酵素液１mlを加えた反応液を37℃におい
て10分間反応させた場合のPHと酵素の比活性の
関係を第２図に示す。 (4) 熱安定性： 50℃における15分間の保温まで、ほぼ安定
で、60℃における15分間の加熱により、酵素の
約40％が失活し、70℃における15分間の加熱に
より、完全に失活した。 温度と比活性の関係を第３図に示す。 (5) PH安定性： 0.1M緩衝液中で30℃において２時間放置し
た後、残存する酵素活性を測定したが、PH５〜
11の範囲において安定であつた。PH10〜11にお
いて安定であることは、本発明により得られた
キトサナーゼの大きな特徴の一つである。PHと
比活性の関係を第４図に示す。 (6) 阻害剤： 本発明により得られたキトサナーゼは、１×
10-3Mの終濃度のHgCl2、PbCl2、AgNO3およ
びPCMBの存在によりほぼ100％が阻害され
た。 (7) 基質特異性： 種々の基質を使用し、基質の終濃度を0.25％
とした時に、酵素反応液４ml当り酵素蛋白質１
mgによつて１時間後に遊離する全還元糖とヘキ
ソサミンの量（mg／mg蛋白質／時）を測定し
た。その結果が第１表に示される。
【表】
本発明により得られたキトサナーゼは、コロ
イダルキトサン、可溶性キトサンおよびグライ
コールキトサンをよく分解し、カルボキシメチ
ルセルロース（CMC）も若干分解したが、粉
末キトサンには作用しなかつた。またコロイダ
ルキチン、グライコールキチン、粉末キチンお
よびメチルセルロースは全く分解しなかつた。 (8) 分子量： SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法により
分子量を測定した結果を第７図に示す。第７図
において（〇）は本発明により得られたキトサ
ナーゼの分子量であつて、約41000である。 セフアデツクスＧ―100を用いたゲル濾過法
により分子量を測定した結果を第８図に示す。
第８図において（〇）は本発明により得られた
キトサナーゼの分子量であつて、約30000であ
る。 (9) 酵素力価の測定法： １ｇの粉末キトサン（28メツシユ）を50mlの
0.1M酢酸水溶液に溶解し、0.1M酢酸ナトリウ
ム水溶液でPH6.0に調整した後、0.1M酢酸緩衝
液（PH：6.0）を加えて、全容を100mlにして、
基質の１％可溶性キトサン溶液を調製する。 37℃において５分間プレインキユベートした
基質の１％可溶性キトサン溶液１mlに、同様に
プレインキユベートした酵素液１mlを加え、37
℃において正確に10分間酵素反応を行なわせ
る。その後反応液を３分間煮沸して酵素反応を
停止させ、反応液中に生成した還元糖を定量す
る。 この条件において1μモルのグルコサミンに
相当する還元糖を遊離させる酵素量を、１単位
（unit）のキトサナーゼ活性とする。 以下において本発明を実施例によつてさらに詳
しく説明する。 実施例 １ （種培養の調製） 250ml容三角フラスコに、酵母エキス0.8％、ペ
プトン0.4％、肉エキス0.2％、コロイダルキトサ
ン0.5％を含む液体培地（PH：7.2）50mlを入れ、
常法により殺菌した後、これに予め液体培養した
バチルス（Bacillus sp.）No.７−Ｍ（FERM Ｐ−
8139）を接種し、30℃において、１日間振とう培
養した。 （酵素生産用培養液の調製） ５容三角フラスコ２本に、上記と同一の組成
の液体培地をそれぞれ１ずつ入れ、常法により
殺菌した後、これに上記で得られた種培養液40ml
を接種し、30℃において、４日間振とう培養し
た。培養液を6000r.p.mにおいて遠心分離して、
菌体を除去し、得られた上澄液のキトサナーゼの
活性を前記の酵素力価の測定法によつて測定し
た。上澄液１ml当り0.99単位であつた。 （酵素液の精製） 上記で得られた上澄液を混合し、得られた混合
液1.81に固体硫安1015ｇ（硫安80％飽和に相当
する）を加え、濾過し、得られた沈デン物を蒸留
水に溶解し、177mlとした。この酵素液を蒸留水、
引き続いて、0.02Mリン酸緩衝液（PH：6.0）に
対して透析した後、得られた酵素液を、予め
0.02Mリン酸緩衝液で平衝化したCM−セフアデ
ツクスＣ−50を充填したカラム〔2.6cm（径）×45
cm（長さ）〕に流してキトサナーゼを吸着させた。
ほとんどの不純蛋白質は素通り区分に集まつてい
た。このカラムを0.02Mリン酸緩衝液350mlで洗
浄した後、０〜0.5Mの塩化ナトリウムで直線的
濃度勾配により酵素蛋白質を溶出した。 各フラクシヨンの溶出における塩化ナトリウム
の濃度、280nmにおける吸収および酵素活性を第
９図に示す。第９図において、点線は各フラクシ
ヨンの溶出における塩化ナトリウムの濃度を示
し、（−●−●−）は各フラクシヨンの280nmに
おける吸収を示し、そして（−〇−〇−）は各フ
ラクシヨンのキトサナーゼ活性（単位／ml）を示
す。 このカラムクロマトグラフイーの操作はキトサ
ナーゼの精製に非常に有効で、キトサナーゼ活性
は上澄液のml当り409単位に相当しており、約410
倍に精製されていた。 次にキトサナーゼ活性を示した第218〜240のフ
ラクシヨンを合し、これをダイアフローメンブレ
ンフイルターPM−10（アミコン社製品）を用い
た限外濾過装置で17倍に濃縮し、この濃縮液に、
セフアデツクスＣ−100を用いるゲル濾過を行な
つた。 ゲル濾過によつて得られた各フラクシヨンの
280nmにおける吸収およびキトサナーゼ活性を第
１０図に示す。第１０図において（−●−●−）
は280nmにおける吸収を示し、（−〇−〇−）は
キトサナーゼ活性（単位／ml）を示す。このゲル
濾過によつてキトサナーゼ活性はボイドボリウム
の約1.8倍付近に溶出された。 このゲル濾過のキトサナーゼ活性を示した第50
〜63のフラクシヨンを合し、再びCM−セフアデ
ツクスＣ−50によるカラムクロマトグラフイーを
行なつた。前回と同じ条件で酵素を吸着し、０〜
0.5Mの塩化ナトリウムで直線的濃度勾配により
酵素蛋白質を溶出した。 各フラクシヨンの溶出における塩化ナトリウム
の濃度、280nmにおける吸収および酵素活性を第
５図に示す。第５図において、点線は各フラクシ
ヨンの溶出における塩化ナトリウムの濃度を示
し、（−●−●−）は各フラクシヨンの280nmに
おける吸収を示し、そして（−〇−〇−）は各フ
ラクシヨンのキトサナーゼ活性を示す。第５図に
よると、キトサナーゼは塩化ナトリウム濃度が約
0.25Mのフラクシヨンにおいて出現し、キトサナ
ーゼ活性のピークは蛋白質濃度のピークと完全に
一致し、このキトサナーゼはクロマト的に均一で
あることがわかる。 以上の精製過程における測定値は第２表に示し
たとおりである。
イダルキトサン、可溶性キトサンおよびグライ
コールキトサンをよく分解し、カルボキシメチ
ルセルロース（CMC）も若干分解したが、粉
末キトサンには作用しなかつた。またコロイダ
ルキチン、グライコールキチン、粉末キチンお
よびメチルセルロースは全く分解しなかつた。 (8) 分子量： SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法により
分子量を測定した結果を第７図に示す。第７図
において（〇）は本発明により得られたキトサ
ナーゼの分子量であつて、約41000である。 セフアデツクスＧ―100を用いたゲル濾過法
により分子量を測定した結果を第８図に示す。
第８図において（〇）は本発明により得られた
キトサナーゼの分子量であつて、約30000であ
る。 (9) 酵素力価の測定法： １ｇの粉末キトサン（28メツシユ）を50mlの
0.1M酢酸水溶液に溶解し、0.1M酢酸ナトリウ
ム水溶液でPH6.0に調整した後、0.1M酢酸緩衝
液（PH：6.0）を加えて、全容を100mlにして、
基質の１％可溶性キトサン溶液を調製する。 37℃において５分間プレインキユベートした
基質の１％可溶性キトサン溶液１mlに、同様に
プレインキユベートした酵素液１mlを加え、37
℃において正確に10分間酵素反応を行なわせ
る。その後反応液を３分間煮沸して酵素反応を
停止させ、反応液中に生成した還元糖を定量す
る。 この条件において1μモルのグルコサミンに
相当する還元糖を遊離させる酵素量を、１単位
（unit）のキトサナーゼ活性とする。 以下において本発明を実施例によつてさらに詳
しく説明する。 実施例 １ （種培養の調製） 250ml容三角フラスコに、酵母エキス0.8％、ペ
プトン0.4％、肉エキス0.2％、コロイダルキトサ
ン0.5％を含む液体培地（PH：7.2）50mlを入れ、
常法により殺菌した後、これに予め液体培養した
バチルス（Bacillus sp.）No.７−Ｍ（FERM Ｐ−
8139）を接種し、30℃において、１日間振とう培
養した。 （酵素生産用培養液の調製） ５容三角フラスコ２本に、上記と同一の組成
の液体培地をそれぞれ１ずつ入れ、常法により
殺菌した後、これに上記で得られた種培養液40ml
を接種し、30℃において、４日間振とう培養し
た。培養液を6000r.p.mにおいて遠心分離して、
菌体を除去し、得られた上澄液のキトサナーゼの
活性を前記の酵素力価の測定法によつて測定し
た。上澄液１ml当り0.99単位であつた。 （酵素液の精製） 上記で得られた上澄液を混合し、得られた混合
液1.81に固体硫安1015ｇ（硫安80％飽和に相当
する）を加え、濾過し、得られた沈デン物を蒸留
水に溶解し、177mlとした。この酵素液を蒸留水、
引き続いて、0.02Mリン酸緩衝液（PH：6.0）に
対して透析した後、得られた酵素液を、予め
0.02Mリン酸緩衝液で平衝化したCM−セフアデ
ツクスＣ−50を充填したカラム〔2.6cm（径）×45
cm（長さ）〕に流してキトサナーゼを吸着させた。
ほとんどの不純蛋白質は素通り区分に集まつてい
た。このカラムを0.02Mリン酸緩衝液350mlで洗
浄した後、０〜0.5Mの塩化ナトリウムで直線的
濃度勾配により酵素蛋白質を溶出した。 各フラクシヨンの溶出における塩化ナトリウム
の濃度、280nmにおける吸収および酵素活性を第
９図に示す。第９図において、点線は各フラクシ
ヨンの溶出における塩化ナトリウムの濃度を示
し、（−●−●−）は各フラクシヨンの280nmに
おける吸収を示し、そして（−〇−〇−）は各フ
ラクシヨンのキトサナーゼ活性（単位／ml）を示
す。 このカラムクロマトグラフイーの操作はキトサ
ナーゼの精製に非常に有効で、キトサナーゼ活性
は上澄液のml当り409単位に相当しており、約410
倍に精製されていた。 次にキトサナーゼ活性を示した第218〜240のフ
ラクシヨンを合し、これをダイアフローメンブレ
ンフイルターPM−10（アミコン社製品）を用い
た限外濾過装置で17倍に濃縮し、この濃縮液に、
セフアデツクスＣ−100を用いるゲル濾過を行な
つた。 ゲル濾過によつて得られた各フラクシヨンの
280nmにおける吸収およびキトサナーゼ活性を第
１０図に示す。第１０図において（−●−●−）
は280nmにおける吸収を示し、（−〇−〇−）は
キトサナーゼ活性（単位／ml）を示す。このゲル
濾過によつてキトサナーゼ活性はボイドボリウム
の約1.8倍付近に溶出された。 このゲル濾過のキトサナーゼ活性を示した第50
〜63のフラクシヨンを合し、再びCM−セフアデ
ツクスＣ−50によるカラムクロマトグラフイーを
行なつた。前回と同じ条件で酵素を吸着し、０〜
0.5Mの塩化ナトリウムで直線的濃度勾配により
酵素蛋白質を溶出した。 各フラクシヨンの溶出における塩化ナトリウム
の濃度、280nmにおける吸収および酵素活性を第
５図に示す。第５図において、点線は各フラクシ
ヨンの溶出における塩化ナトリウムの濃度を示
し、（−●−●−）は各フラクシヨンの280nmに
おける吸収を示し、そして（−〇−〇−）は各フ
ラクシヨンのキトサナーゼ活性を示す。第５図に
よると、キトサナーゼは塩化ナトリウム濃度が約
0.25Mのフラクシヨンにおいて出現し、キトサナ
ーゼ活性のピークは蛋白質濃度のピークと完全に
一致し、このキトサナーゼはクロマト的に均一で
あることがわかる。 以上の精製過程における測定値は第２表に示し
たとおりである。
本発明によると、キトサンを分解してキトサン
オリゴ糖を効率よく生産しうるキトサナーゼを生
産することができる。 本発明により得られたキトサナーゼは、酵素活
性が高く、アルカリ性（PH10〜11）においても90
％以上安定である。
オリゴ糖を効率よく生産しうるキトサナーゼを生
産することができる。 本発明により得られたキトサナーゼは、酵素活
性が高く、アルカリ性（PH10〜11）においても90
％以上安定である。
第１図は、本発明により得られたキトサナーゼ
の温度と比活性の関係を示す図表であり、第２図
は、本発明により得られたキトサナーゼのPHと比
活性の関係を示す図表であり、第３図は、本発明
により得られたキトサナーゼの熱安定性を示す図
表であり、第４図は、本発明により得られたキト
サナーゼのPH安定性を示す図表であり、第５図
は、実施例１で得られた酵素液の再クロマトグラ
フイーにおける各フラクシヨンの酵素活性を示す
図表であり、第６図は、実施例１で得られた酵素
液の電気泳動の状態を示す平面図であり、第７図
は、本発明により得られたキトサナーゼのSDS−
ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量を示
す図表であり、第８図は、本発明により得られた
キトサナーゼのセフアデツクスＧ−100によるゲ
ル濾過による分子量を示す図表であり、第９図
は、実施例１で得られた酵素液のCM−セフアデ
ツクスＣ−50のカラムクロマトグラフイーにおけ
る各フラクシヨンのキトサナーゼ活性を示す図表
であり、そして第１０図は、実施例１のセフアデ
ツクスＧ−100によるゲル濾過によつて得られた
各フラクシヨンのキトサナーゼ活性を示す図表で
ある。
の温度と比活性の関係を示す図表であり、第２図
は、本発明により得られたキトサナーゼのPHと比
活性の関係を示す図表であり、第３図は、本発明
により得られたキトサナーゼの熱安定性を示す図
表であり、第４図は、本発明により得られたキト
サナーゼのPH安定性を示す図表であり、第５図
は、実施例１で得られた酵素液の再クロマトグラ
フイーにおける各フラクシヨンの酵素活性を示す
図表であり、第６図は、実施例１で得られた酵素
液の電気泳動の状態を示す平面図であり、第７図
は、本発明により得られたキトサナーゼのSDS−
ポリアクリルアミド電気泳動法による分子量を示
す図表であり、第８図は、本発明により得られた
キトサナーゼのセフアデツクスＧ−100によるゲ
ル濾過による分子量を示す図表であり、第９図
は、実施例１で得られた酵素液のCM−セフアデ
ツクスＣ−50のカラムクロマトグラフイーにおけ
る各フラクシヨンのキトサナーゼ活性を示す図表
であり、そして第１０図は、実施例１のセフアデ
ツクスＧ−100によるゲル濾過によつて得られた
各フラクシヨンのキトサナーゼ活性を示す図表で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バチルス属に属し、コロイダルキトサンに作
用し、PH５〜11の範囲において安定であるキトサ
ナーゼを生産する細菌を培養し、培養物から前記
のキトサナーゼを分離採取することを特徴とする
キトサナーゼの製造法。 ２ 培養を、コロイダルキトサンを含む培地で行
なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載のキトサナーゼの製造法。 ３ バチルス属に属し、コロイダルキトサンに作
用し、PH５〜11の範囲において安定であるキトサ
ナーゼを生産する細菌が、バチルスNo.７―Ｍ（微
工研菌寄第8139号）であることを特徴とする特許
請求の範囲第１項または第２項に記載のキトサナ
ーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12067385A JPS61280277A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | キトサナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12067385A JPS61280277A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | キトサナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280277A JPS61280277A (ja) | 1986-12-10 |
| JPH0229311B2 true JPH0229311B2 (ja) | 1990-06-28 |
Family
ID=14792099
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12067385A Granted JPS61280277A (ja) | 1985-06-05 | 1985-06-05 | キトサナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61280277A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2763112B2 (ja) * | 1988-09-05 | 1998-06-11 | ケイ・アイ化成株式会社 | 水溶性低分子化キトサンおよびその製造法 |
| JPH0675503B2 (ja) * | 1990-05-11 | 1994-09-28 | ヒゲタ醤油株式会社 | 新規キトサナーゼｕｔｋとその製造法及び生産菌 |
| CN102851239B (zh) * | 2012-08-22 | 2013-08-14 | 黄河三角洲京博化工研究院有限公司 | 一株壳聚糖酶生产菌株及应用该菌株生产壳寡糖的方法 |
-
1985
- 1985-06-05 JP JP12067385A patent/JPS61280277A/ja active Granted
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHITIN CHITOSAN AND RELATED ENZYMES=1984 * |
| NATURE NEW BIOLOGY=1973 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61280277A (ja) | 1986-12-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5405759A (en) | Heparitinase, process for producing the same and bacteria producing the same | |
| JP3865801B2 (ja) | 新規なβ−アガラーゼ，その製造方法及びその用途 | |
| JPH0229311B2 (ja) | ||
| JPH0156755B2 (ja) | ||
| JPH0313878B2 (ja) | ||
| JPWO1996016166A1 (ja) | 新規なケラタン硫酸分解酵素 | |
| JPH05320204A (ja) | Ｎ−アセチルキトオリゴ糖の製造法 | |
| JPH0124121B2 (ja) | ||
| JP3544383B2 (ja) | アルカリに安定なサイクロデキストリン グルカノトランスフェラーゼ及びその製造法 | |
| JPH0474358B2 (ja) | ||
| JPH0525847B2 (ja) | ||
| JP2001120266A (ja) | キチナーゼ及びその製造法 | |
| JPH0463674B2 (ja) | ||
| JP2677837B2 (ja) | キトサナーゼ及びその製造方法 | |
| JP3858065B2 (ja) | 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 | |
| JPH02163082A (ja) | キトサナーゼの製造方法 | |
| JPH01104158A (ja) | 甲殻類の殻の処理方法 | |
| JPH02190185A (ja) | ポリガラクトサミン分解酵素ａ−４及びその製造法 | |
| JPH0675503B2 (ja) | 新規キトサナーゼｕｔｋとその製造法及び生産菌 | |
| JPH07184647A (ja) | α−Ｌ−フコシダーゼ、その製造方法およびアルカリジェネス・デニトリフィカンス サブｓｐ． デニトリフィカンス ＫＳＦ−０９０１菌株 | |
| JPH1175827A (ja) | 新規なキトサナーゼ生産菌とキトサナーゼの製造方法 | |
| JPH0761264B2 (ja) | 新規なシクロマルトデキストリナーゼ及びその製造方法 | |
| JPH0383584A (ja) | 新規キトサナーゼ、及びそのキトサナーゼの製造方法、並びにそのキトサナーゼを用いたキトサンオリゴ糖の製造方法 | |
| JP2000157262A (ja) | β−１，３−キシラナーゼ、その産生微生物、製造方法及びその用途 | |
| JPH099962A (ja) | アルギン酸分解酵素とその製造法ならびにアルギン酸分解法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |