JPH0675509B2

JPH0675509B2 - ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉｉｉ▼ｂ

Info

Publication number: JPH0675509B2
Application number: JP60271128A
Authority: JP
Inventors: 洋滝口; 時雄谷; 潤大隅; 秀比古古川; 寿典大峰
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1985-10-23
Filing date: 1985-12-02
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: JPS62175173A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼIIIB（本発明によつ
て明らかにされた新規ヒト・膵臓エラスターゼをヒト・
膵臓エラスターゼIIIBと命名する。）、それをコードす
る塩基配列を含有するDNA、それで形質転換せしめた宿
主および該宿主を用いるヒト・膵臓エラスターゼIIIBの
製造法に関する。

エラスターゼは、セリン・プロテアーゼの１種であり、
繊維状の不溶性蛋白質であるエラスチンを加水分解する
酵素である。エラスチンは、硬蛋白質の１種で、高等動
物の結合組織、腱、大動脈外皮、頸索を構成しており、
ペプシン、トリプシンによりわずかに分解される。

Balo′らは、動物硬化症の研究途上で、血管壁のエラス
チン繊維の分解を認め、1949年、その分解酵素の存在を
推定した〔Balo′,J.and Banga,I.:Schweiz Z.Pathol.B
acteriol.,12,350（1949）〕。つづいて、Bangaは、195
2年、エラスチンを特異的に分解する酵素を、膵臓のな
かに発見し、結晶状に取り出し、エラスターゼと命名し
た〔Banga,I.:Acta Physiol.Acad.Sci.Hung.,３,317（1
952）〕。

エラスターゼは、ヒト、猿、猫、兎等ほとんどの動物の
膵臓に存在することが確認されており、その含量はヒト
が3.1mg/膵臓ｇ、牛が2.2mg/g、ラットが10.2mg/g程度
である。ヒトのエラスターゼ活性と、年令との関係が認
められており、男40才以上、女60才以上では膵臓および
血漿中のエラスターゼ活性が著しく低下していた〔Loev
en,W.A.,and Maureen M.Baldwin.:Gerontologia,17,170
（1971）〕。

動物硬化症の患者の場合、膵臓のエラスターゼの活性
は、健常人のそれより著しく低下しているか、または、
消失していた〔Balo′,J.,and Banga,I.:Nature,178,31
0（1956）〕。なお、エラスターゼはエラスチンを酵素
的に分解するだけでなく、その生合成をも促進すること
が、その後の研究で明らかとなつてきた。

ラツト、兎などを用いて、エラスターゼの薬理作用が研
究されており、以下のような効果が明らかとなつた。

１）動脈壁への脂質およびカルシウムの沈着抑制作用２）動脈壁のコレステロールおよびカルシウムの除去作
用３）変性エラスチンに対する選択的分解作用４）動脈壁弾力線維の新生促進作用５）血清脂質低下作用６）リポ蛋白代謝改善作用以上の研究をもとに行つた臨床研究において、エラスタ
ーゼを経口投与した結果、以下のような効果が明らかと
なつた。

１）動脈壁の弾力性・伸展性の回復作用２）血清脂質異常の改善作用３）リポ蛋白代謝の改善作用上記の研究には、ブタの膵臓より抽出精製したエラスタ
ーゼが用いられた。しかし、ブタエラスターゼをヒトに
投与した場合、それはヒトにとつて異種タンパク質であ
るから、抗体産生が生じ、患者への再度の投与はアナフ
イラキシーをおこす危険性がある（特開昭59−1118
0）。従つてヒトに投与する場合は、ヒトエラスターゼ
を用いるのが好ましい。しかし、ヒトエラスターゼを十
分量入手することは極めて困難であつた。そこで、本発
明者らは組換えDNA技術を用いて、ヒトの膵臓のエラス
ターゼIIIB遺伝子をクローニングし、得られた組換えDN
A分子を宿主に移入して、ヒト・膵臓エラスターゼIIIB
遺伝子を発現せしめ、目的とするエラスターゼIIIBを得
ることのできる技術の開発研究を行つた結果、本発明を
完成するにいたつた。

現在、２種のヒト・膵臓エラスターゼの存在は、すで
に、知られているが、その特性付けは、いまだ十分には
おこなわれておらず、そのうちの１種のアミノ酸配列
は、そのプロ部分の12個および本体のわずか４個が明ら
かにされている〔C.Largman et al;Biochim.Biophys.Ac
ta,623,208（1980）〕のみで、その構造は、現在までま
つたく不明であつた。ところが、本発明者らにより、こ
れらのアミノ酸配列のすべておよびそのDNA配列のすべ
てが明らかにされるに至つた（特願昭60−72308号、同6
0−91986号、同60−163964号）。ところで、今回本発明
により明らかとなつたアミノ酸配列は、上述の如く、明
らかにされたアミノ酸配列とは異なり、本発明がまつた
くの新規物質に係るものであることが明らかである。

すなわち、本発明は、ヒト・膵臓エラスターゼIIIBをコ
ードする塩基配列を含有するDNA、該DNAを用いて形質転
換せしめた宿主、および該DNAで形質転換せしめた宿主
を培養することによるヒト・膵臓エラスターゼIIIBの製
造法を提供するものである。

本発明は一般式（Ｎ）−Val Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Se
r Trp Pro TrP Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser
Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Al
a Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser
Ser Ser Arg Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr As
p Arg Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro
Ile Asn Ser Gly Asp Leu Phe Val His Pro Leu Trp As
n Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu
Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Va
l Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu
Pro Asn Glu Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Ar
g Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln
Glu Ala leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys Se
r Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr
Met Val Cys Ala Gly Gly Asp Ile Arg Ser Gly Cys As
n Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu
Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Va
l Ser Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr
Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Gl
u Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）（Ｉ）で表わされるアミノ酸配列で示される、ヒト・膵臓エラ
スターゼIIIBに関する。そして式中、（Ｎ）−末端には
水素原子、Met、あるいはプロおよびプレ部分として（Ｎ）−Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Le
u Val Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser
Arg Pro Ser Ser Arg−（Ｃ）の一部または全部を有していてもよい。

特に、一般式（５′）−GTT GTC AAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC
AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AG
C GGA AGC TTC TAC CAC ACC TGT GGC GGT AGC CTC ATC
GCC CCC GAC TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TC
G AGC TCC CGG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGC GAG TAC
GAC CGT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CC
C ATC AAC TCT GGG GAC CTC TTT GTG CAT CCA CTC TGG
AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CT
C ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAC GCC
GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCG GCT GGT GAC ATC CT
T CCC AAC GAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC
CGT CTC TAT ACC AAC GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CA
G GAG GCC CTG CTG CCG GTG GTG GAC TAT GAA CAC TGC
TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC TCC GTG AAG AAG AC
C ATG GTG TGT GCT GGA GGG GAC ATC CGC TCC GGC TGC
AAT GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GA
G GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAT GGC GTG ACC AGC TTT
GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC ACC CGC AGG AAG CCC AC
G GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATT GAC TGG ATT
GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC−Ｘ（３′）（II）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す）で表わされる塩
基配列またはそれと同効の塩基配列を含有するDNAであ
る。

上記DNA（II）は、その５′末端にATG、または（５′）−ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC
CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TC
T CGC CCT TCC AGC CGC−（３′）の一部または全部を有していてもよい。

DNA（II）の５′末端にATGを有するときには、下記のポリペプチド（III）（Ｎ）−Val Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Se
r Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser
Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Al
a Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser
Ser Ser Arg Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr As
p Arg Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro
Ile Asn Ser Gly Asp Len Phe Val His Pro Leu Trp As
n Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu
Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Va
l Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu
Pro Asn Glu Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Ar
g Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln
Glu Ala Leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys Se
r Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr
Met Val Cys Ala Gly Gly Asp Ile Arg Ser Gly Cys As
n Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu
Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Va
l Ser Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr
Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Gl
u Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）に加えて、（III）のＮ末端にMetを有するポリペプチド
をコードする。

DNA（II）の５′末端に（５′）−ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC
CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TC
T CGC CCT TCC AGC CGC−（３′）を有するときには、ポリペプチド（III）を加えて（II
I）のＮ末端に（Ｎ）−Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Le
u Val Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser
Arg Pro Ser Ser Arg−（Ｃ）を有するポリペプチドをコードする。

式（II）で表わされる塩基配列またはそれと同効の塩基
配列を含有する本発明のDNAは、たとえば以下に示す
（イ）〜（ニ）のステツプにより製造することができ
る。

（イ）ヒトの膵臓より、mRNAを分離する。

（ロ）このmRNAおよび逆転写酵素を用いてcDNAバンクを
作製する。

（ハ）作製したcDNAバンクから、たとえば、ブタエラス
ターゼI cDNAをプローブに用い、目的とするヒトエラス
ターゼIIIBをコードするcDNAを含有するプラスミドを単
離する。

（ニ）このプラスミドから目的とするクローン化DNAを
切り出す。

膵臓のRNA抽出にあたつては、グアニジン・チオシアネ
ート・ホツト・フエノール法、グアニジン・チオシアネ
ート・塩化セシウム法なども採用しうるがグアニジン・
チオシアネート−グアニジン・塩酸法が以下の点で、上
述２法より優れている。（１）操作が簡単である。
（２）抽出・回収率が高い。（３）比較的大量の臓器か
らの抽出が可能である。（４）DNAが混入してこない。
（５）RNAの分解が少ない。

真核細胞の細胞質に存在するmRNAの多くは、その３′末
端にポリＡ配列をもつことが知られているので、この特
徴を利用して、オリゴ（dT）セルロースのカラムにmRNA
を吸着せしめて、つぎに、これを溶出して精製する。

得られたmRNAを鋳型として、逆転写酵素を用いて相補的
二重鎖DNAを合成するが、その方法としてはS1ヌクレア
ーゼ法〔Efstratiadis,A.et al.:Cell,７,279（197
6）〕、Land法〔Land,H.et al.:Nucleic Acids Res.,
９,2251（1981）〕、Okayama−Berg法〔Okayama,H.and
P.Berg:Mol.Cell.Biol.,２,161（1982）〕、O.Joon Yoo
法〔O.Joon Yoo,et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,10
49（1982）〕などを採用しうるが、本発明の目的には、
Okayama−Berg法が好適であつた。

つぎに、得られた組換えプラスミドを大腸菌、たとえば
RR1株に導入して形質転換させる。テトラサイクリン耐
性あるいはアンピシリン耐性を、指標として、組換え体
を選択することができる。

得られた組換え体のなかから、エラスターゼIIIBをコー
ドするDNAを含有するクローンを選択するためには、32P
でラベルしたブタエラスターゼＩ（特開昭60−207583）
cDNAをプローブに用いるコロニーハイブリダイゼーシヨ
ン法を用いた。

選択されたクローンに含有される塩基配列の決定は、フ
アージM13を用いたジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止の方法〔Messing,J.ら:Nucleic Acids Res.,９,309
（1981）〕およびMaxam−Gilbert法〔Maxam,A.M.and Gi
lbert,W.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560（1977）〕で
実施しうるが、本発明ではジデオキシヌクレオチド合成
鎖停止の方法を採用し、ヒト・膵臓エラスターゼIIIBを
完全にコードするDNAを有するクローンを決定した。

つぎに、得られたクローンからエラスターゼIIIB遺伝子
をきり出し、これを適当な発現ベクターにつないで、適
当な宿主に導入して発現せしめることができる。

プロモーターとして、大腸菌においては、トリプトフア
ン（trp）プロモーター、ラクトース（lac）プロモータ
ー、トリプトフアン・ラクトース（tac）プロモーター
リポプロテイン（lpp）プロモーター、バクテリオフア
ージ由来のラムダ（λ）P_Lプロモーター、ポリペプチド
鎖伸長因子Tu（tufB）プロモーターなどを使用しうる。

宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母などの
微生物のほか、動物細胞を採用しうる。

本発明の大腸菌のDNAを宿主に、形質転換、導入する方
法としては、Hanahanの方法〔Hanahan,D.:J.Mol.Biol.,
166,557（1983）〕、塩化カルシウム法〔Dagert,M.and
S.D.Ehrlich:Gene,６,23（1979）〕、低pH法〔高木康敬
編著：遺伝子操作マニユアル,p.49,講談社サイエンテイ
フイク（1982）〕等を採用しうる。本発明においては、
Hanahanの方法が好適であつた。

このようにして得た宿主（組換え体）を、公知の培地で
培養し、培養物の中に、一般式（Ｎ）−Val Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Se
r Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser
Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Al
a Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser
Ser Ser Arg Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr As
p Arg Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro
Ile Asn Ser Gly Asp Leu Phe Val His Pro Leu Trp As
n Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu
Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Va
l Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu
Pro Asn Glu Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Ar
g Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln
Glu Ala Leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys Se
r Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr
Met Val Cys Ala Gly Gly Asp Ile Arg Ser Gly Cys As
n Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu
Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Va
l Ser Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr
Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Gl
u Glu Thr Ile Ala Ser His−（Ｃ）で表わされるペプチドまたはその同効物質を生成蓄積せ
しめ、これを採取することにより本発明の目的を達する
ことができる。

培地としては、グルコース、カザミノ酸などからなる培
地、例えば、M9培地〔Miller,J.:Experiments in Molec
ular Genetics,431〜433（Cold Spring Harbor Lab.,Ne
w York（1972））〕が挙げられる。

組換え体の培養は、通常、15〜43℃で、３〜24時間行
い、必要に応じて、通気や攪拌を加えることができる。
なお、動物細胞を宿主とする場合には、３〜10日間の培
養を必要とする。

培養後は、組換え体細胞を、公知の方法、例えば遠心分
離等で集める。宿主として、枯草菌、酵母、動物細胞な
どを用いる場合、ベクターの選択によつては、生産され
たエラスターゼIIIBは細胞外に出て、上澄液に含まれ
る。

一方、大腸菌を宿主とした場合、生産されたエラスター
ゼIIIBは、不溶性の蛋白として、その細胞内のinclusio
n bodyに含まれる場合が多い。この場合は、菌体を破壊
して遠心分離することにより、生産されたエラスターゼ
IIIBは沈澱物として得られる。

菌体の破壊の方法としては、超音波処理、リゾチーム処
理、凍結融解処理等を採用することができる。該上澄液
または沈澱物からのエラスターゼの単離は、通常知られ
ている蛋白質の精製方法により実施しうる。

本発明により製造されるヒト・膵臓エラスターゼIIIB
は、ヒト膵液より抽出精製したエラスターゼと同等の生
物学的活性を示し、これと同様の目的に、同様の用法に
より使用することができる。

以下に実施例を挙げて本発明により具体的に説明する
が、これらは本発明の範囲を制限するものではない。

実施例（１）ヒト膵臓よりのmRNAの分離 5.5gのヒト膵臓（剖検試料）をグアニジンチオシアネー
ト溶液（4Mのグアニジンチオシアネート,1％のサルコシ
ル,20mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）,25mMのクエ
ン酸ナトリウム（pH7.0）,100mMの２−メルカプトエタ
ノール,0.1％のアンチフオームＡ）中でポリトロンによ
つて破壊、変性した後、遠心して上澄みを得た。これに
0.025倍量の1M酢酸および0.75倍量のエタノールを加
え、−20℃で数時間冷却した後、遠心処理によつて沈澱
を得た。次にこの沈澱をグアニジンンハイドロクロライ
ド溶液（7.5Mのグアニジンハイドロクロライド,25mMの
クエン酸ナトリウム（pH7.0）,5mMのジチオスレイトー
ル（DTT）に懸濁し、0.025倍量の1M酢酸および0.5倍量
のエタノールを加え、−20℃で数時間冷却した後、遠心
処理を行つた。ここで得られた沈澱をグアニジンハイド
ロクロライド溶液に再懸濁し、酢酸、エタノールを加
え、−20℃に冷却した後、遠心処理で沈澱を集めた。次
に、この沈澱をエタノールで数回洗い、混在しているグ
アニジンハイドロクロライドを除き、蒸留水に溶かした
後にエタノールでRNAを沈澱させた。遠心分離により沈
澱を集め、53.9mgのRNAを得た。

こうして得たRNAを高塩溶液（0.5MのNaCl）,20mMのTris
−HCl（pH7.5）,1mMのEDTA,0.1％のドデシル硫酸ナトリ
ウム（SDS））中でオリゴ（dT）セルロースカラムに吸
着させた後、ポリ（Ａ）を含むmRNAを溶出溶液（10mMの
Tris−HCl（pH7.5）,1mMのEDTA,0.05％のSDS）で溶出さ
せ、255μｇのmRNAを得た。

（２）cDNAバンクの作製 cDNAバンクの作製は、Okayama−Berg法に従つて行つ
た。すなわち、５μｇのmRNA及び24ユニツトの逆転写酵
素を20μｌの反応液〔50mMのTris−HCl（pH8.3）,8mMの
MgCl₂,30mMのKCl,0.3mMのDTT,2mMのdATP,2mMのdGTP,2mM
のdCTP,2mMのdTTP,10μCiのα−32P−dCTP,1.4μｇのベ
クター・プライマーDNA（PL−Phar maciaより購入）〕
中で、42℃,60分反応させた。

２μｌの0.25M EDTAと１μｌの10％SDSを加えて反応を
止めた後、20μｌのフエノール・クロロフオルムで除蛋
白を行つた。遠心した後、水層をとり、20μｌの4M酢酸
アンモニウムと80μｌのエタノールを加え、−70℃,15
分間冷却した。次いで、遠心して沈澱を集め75％エタノ
ールで沈澱を洗つた後、減圧乾燥した。

沈澱を15μｌのターミナルトランスフエラーゼ反応液
（140mMのカコジル酸カリウム、30mMのTris−HCl（pH6.
8）,1mMの塩化コバルト、0.5mMのDTT,0.2μｇのpolyA,1
00mMのdCTP）に溶かした。

37℃で３分間反応液をあたためた後、18ユニツトのター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼを加
え、５分間反応させた。次に、１μｌの0.25M EDTA及び
0.5μｌの10％SDSを加え反応をとめた後、フエノール・
クロロフオルムで除蛋白を行つた。反応液を遠心後、水
層をとり、15μｌの4M酢酸アンモニウム、60μｌのエタ
ノールを加えよく混合した。−70℃に15分間おいた後、
遠心して沈澱を集めた。

沈澱を10μｌの制限酵素用緩衝液（50mMのNaCl,10mMのT
ris−HCl（pH7.5）,10mMのMgCl₂,1mMのDTT）に溶かし、
2.5ユニツトの制限酵素HindIIIを加え、37℃で約１時間
消化した。つぎに、フエノール・クロロフオルムで除蛋
白後、エタノール沈澱を行つた。−70℃で15分間冷却し
た後、遠心によつて沈澱を集め、10μｌのTE（10mMのTr
is−HCl（pH7.5）,1mMのEDTA）に溶かした。

次に、上記試料の１μｌをオリゴdG付きリンカー（PL−
Pharmaciaより購入）10ngを加えた反応液（10mMのTris
−HCl（pH7.5）,1mMのEDTA,100mMのNaCl）に加え、65℃
で５分間加熱し、次いで42℃で30分間保温した。

氷中で反応液を冷却した後、10μｌの10倍リガーゼ緩衝
液（10mMのATP、660mMのTris−HCl（pH7.5）,66mMのMgC
l₂,100mMのDTT）、78μｌの蒸留水、８ユニツトのT4DNA
リガーゼを加え、12℃で一晩保温した。

次に、10μｌの1MのKCl,1ユニツトのリボヌクレアーゼ
H,33ユニツトのDNAポリメラーゼI,4ユニツトのT4DNAリ
ガーゼ、0.5μｌのヌクレオチド溶液（20mMのdATP,20mM
のdGTP,20mMのdCTP,20mMのdTTP）、0.1μｌの50μg/μ
ｌ牛血清アルブミン（BSA）を加え、12℃で１時間、つ
いで25℃で１時間保温した。

この反応液を、５倍に希釈した後、ただちにHanahanの
方法〔Hanahan.D.:J.Mol.Biol.,166,557（1983）〕によ
つて、大腸菌RR1株を形質転換し、ヒト膵臓cDNAバンク
を作製した。

（３）ヒト膵臓エラスターゼIIIB cDNAを含有する組換
え菌の分離上述のヒト膵臓cDNAバンクのうち4700株の組換え菌のDN
Aを、Grunstein.M.and Hogness,D.S.の方法〔Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,72,3961（1975）〕によつてニトロセ
ルロースフイルター上に固着した。

一方、ブタ膵臓エラスターゼI cDNA断片を制限酵素Pst1
によつて切り出し、ニツクトランスレーシヨン法〔Rigb
y,P.W.et al.J.Mol.Biol.,113,237（1977）〕によつて3
2Pで標識した。このDNA断片をプローブとして、40％の
ホルムアミド、５倍濃度の0.15M塩化ナトリウムおよび
0.015Mクエン酸ナトリウム溶液（SSC）、0.1％BSA 0.1
％フイコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.5％のSD
S、10mMのリン酸ナトリウム、100μg/mlのサケ精子DNA
の溶液中で、35℃にて、フイルター上に固着させたDNA
と会合させた。その後、オートラジオグラフイーを行
い、上記プローブと反応する10株の菌株を得た。これら
10株のうち１株に含まれるプラスミドのcDNA領域の塩基
配列を決定したところ、先に明らかにされたヒト・膵臓
エラスターゼをコードするcDNAの塩基配列（特願昭60−
72308号，特願昭60−91986号，特願昭60−163964号）と
は異なる塩基配列が得られた。このcDNAをCL1と命名し
た。

（４）CL1のコードするアミノ酸配列とヒト・膵臓エラ
スターゼIIIB CL1には、270アミノ酸をコードしうる唯一のオープンリ
ーデイングフレームが存在していた。その塩基配列から
確定したアミノ酸配列は、トリプシン、キモトリプシン
とは30％程度の相同性しか示さないが、ブタ膵臓エラス
ターゼ１とは50％程度の高い相同性を示した。また、ト
リプシン、キモトリプシン等のセリンプロテアーゼに共
通して見出される活性中心付近のアミノ酸配列（Gly−A
sp−Ser−Gly−Gly−Pro）が、同一の領域に存在してい
た。また、セリンプロテアーゼに特徴的な電荷リレーに
関与する45番目のヒスチジン残基、95番目のアスパラギ
ン酸残基、189番目のセリン残基も存在していた。

さらに、エラスターゼにおいて基質と結合するポケツト
を形成するカルボキシル末端付近のアミノ酸配列は、CL
1がコードするそれとブタエラスターゼＩとの間でよく
似ており、しかもその基質結合ポケツトに特徴的な211
番目のバリン残基、223番目のトレオニン残基が、CL1に
よつてコードされるアミノ酸配列にも存在していた。第
１表にCL1の塩基配列および、それによつてコードされ
るアミノ酸配列を示す。

CL1によつてコードされる蛋白質のアミノ酸組成は、Lar
gmanらによつて報告されているヒト膵臓エラスターゼＩ
のアミノ酸組成〔Largman.C.et al.Biochemistry 15,
2491（1976）〕と一見類似しているが、詳細な点におい
ても明らかに異なり、また分子量も異なつていた。

CL1によつてコードされるヒト・プレプロエラスターゼI
IIBはＮ末から28番目のアミノ酸であるアルギニン残基
のＣ末側がトリプシンにより切断され、活性型のヒト・
エラスターゼIIIBが生じる。

CL1によつてコードされるヒト・プレプロエラスターゼI
IIBと、先に見出されたCL2（特願昭60−72308号）にコ
ードされるヒト・プレプロエラスターゼIIIAとのアミノ
酸配列の相同性は93.3％、両者のコーデイングフレーム
内での塩基配列の相同性は95.3％であり、たがいに近縁
の蛋白質であるが、明らかに異なる。CL1に対応するmRN
Aの発現量は、ヒト膵臓内においては、CL2に対応するmR
NAの発現量の約10％である。

CL1は、ヒトエラスターゼIIIBmRNAから逆転写酵素によ
つて合成された完全長のcDNAであるので、このcDNA配列
を適当な発現ベクターに移すことで、大腸菌、枯草菌、
酵母、動物細胞などを宿主として、ヒト膵臓エラスター
ゼIIIBを大量生産できる。

（５）動物細胞を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIBの生
産発現プラスミドpsv2−CL1の構築動物細胞を宿主としてヒトエラスターゼIIIBcDNAを発現
させるため、図１に示す手順によつてcDNAと発現用ベク
ターとを連結した。発現用ベクターには、sv40のプロモ
ーター、エンハンサー、ポリＡシグナル、small T anti
gen遺伝子の介在配列（イントロン）を含むpsv2プラス
ミドを使用した。

ベクターとcDNAが転写方向に関して順の向きに連結した
クローンを各種の制限酵素の切断パターンにより選択
し、動物細胞（COS1細胞）ヘリン酸カルシウム法により
導入（トランスフエクシヨン）とした。

COS1細胞への発現プラスミドpsv2−CL1の導入リン酸カルシウム法によるトランスフエクシヨンはGrah
amとVan Der Ebの方法に従つた〔Virology52,456（1973）〕。

トランスフエクシヨンに使用するCOS1細胞は直径10cmの
シヤーレに１×10⁶細胞をまき、10％牛胎児血清を含む
ダルベツコ変法イーグル培地で一晩培養した。次に、30
0μｇのpsv2−CL1プラスミドを12.55mlの滅菌蒸留水に
懸濁し、0.75mlの2.5MCaCl₂を加えよく混合した後に、
ピペツトを用いて溶液中に泡をたてながら、1.5mlの10
×HeBS溶液（210mMのHEPES、1.37MのNaCl、4.7mMのKC
1、10.6mMのNa₂HPO₄、55.5mMのブドウ糖、pH7.05）を滴
下してDNAとリン酸カルシウムの沈澱を形成させた。30
分間室温で放置して沈澱を熟成させた後、この1mlを、
予じめ10％牛胎児血清を含む新鮮な培地に置換したCOS1
細胞へシヤーレ１枚あたりに加え、つづいて、これを37
℃、５％CO₂存在下にて12時間培養した後、培養液を捨
て、牛胎児血清を含まない新しいダルベツコ変法イーグ
ル培地に置換し、更に37℃、５％CO₂存在下にて、48時
間培養した。なお、ここで得られた、トランスフエクシ
ヨンしたCOS1細胞は、ヒトエラスターゼIIIB mRNAが発
現していることの確認、及び培養上清中のエラスターゼ
活性の測定に供される。

COS1細胞からのmRNA抽出トランスフエクシヨンしたCOS1細胞中に発現プラスミド
から転写されたヒトエラスターゼIIIBmRNAが存在してい
ることを確認するため、以下のように、COS1細胞からmR
NAを抽出してノーザンブロツトハイブリダイゼーシヨン
をおこなつた。

48時間培養後のCOS1細胞に、シヤーレ１枚あたり、1ml
のグアニジンチオシアネート溶液（4Mのグアニジンチオ
シアネート、１％のサルコシル、20mMのエチレンジアミ
ン四酢酸、25mMのクエン酸ナトリウム（pH7.0）、100mM
の２−メルカプトエタノール、0.1％のアンチフオーム
Ａ）を加え、細胞を融解した。次に、この溶液を21ゲー
ジの注射針に数回通して高分子DNAを低分子化した後、
5.7Mの塩化セシウム、0.1Mのエチレンジアミン四酢酸溶
液の上に重層し、日立RPS40スウイングロータ−を用い
て、30000rpm、20℃、17時間遠心した。ここで得られた
RNA沈殿を少量のエタノールで洗い、300μｌの蒸留水に
溶解した。

次に、分離した全RNAとAvivとLederの方法〔Proc.Natl.
Acad.Sci.USA69,1408（1972）〕に従つてオリゴdTセル
ロースカラムにかけ、数μｇのmRNAを精製した。精製し
たmRNAの半量を使用してThomasの方法〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA77,5201（1980）〕を用いてノーザンブロツト
ハイブリダイゼーシヨンをおこなつた。プローブには、
ニツクトランスレーシヨン法〔Rigby,P.W.et al.J.Mol.
Biol.113,237（1977）〕によつて32P標識したヒトエラ
スターゼIIIBcDNAを用いた。ハイブリダイゼーシヨンの
結果、psv2−CL1をトランスフエクシヨンしたCOS1細胞
のmRNAのみにプローブとハイブリダイズする大きさ約1.
8kbの強いバンドと、大きさ約1.0kbの弱いバンドが検出
された。

psv2−CL1が転写された場合、ベクターに含まれるポリ
Ａシグナルで転写が終結すると1.8kbの大きさのmRNAが
生じ、cDNAに含まれるポリＡシグナルで転写が終結する
と1.0kbのmRNAが生じると推定される。ノーザンブロツ
トハイブリダイゼーシヨンによつて得られた結果はそれ
らの推定値と一致した。したがつて、COS1細胞中でpsv2
−CL1はSV40のプロモーターを使用して多量に発現し、
転写された大部分のmRNAはcDNAに含まれているポリＡシ
グナルでは終結せずにベクターに含まれているポリＡシ
グナルで終結していることが明らかとなつた。

培地上清中のエラスターゼ活性 psv2に組み込んだヒトエラスターゼIIIBcDNAはシグナル
ペプチド領域を保持しているので、発現されるエラスタ
ーゼは培地中へプロエラスターゼとして分泌されること
が期待される。そこで、48時間培養後の培養液中のエラ
スターゼ活性を測定した。エラスターゼ活性の測定は、
Biethらの合成基質を用いた方法〔Front.Matrix.Biol.
６,1（1978）〕に従つた。

1mlの培養上清に200μｌの1MのTris−HCl（pH8.5）と50
μｌの10mg/mlのトリプシンを加え、25℃で15分間保温
することによつてプロエラスターゼの活性化処理を行つ
た後、50μｌのダイズトリプシンインヒビター溶液（10
mg/ml）および10.4μｌのＮ−メチルピロリドンに溶解
した125mMスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−
Ｌ−アラニン−ｐ−ニトロアニリド（Suc−Ala−Ala−A
la−pNA）を加えた。この反応液を37℃で１時間保温し
た後、その410nmの吸光度を測定した。

psv2−CL1をトランスフエクシヨンしたCOS1細胞の培養
液を用いて測定した結果、トリプシンによる活性化処理
をした場合にのみ、培養液中にエラスターゼ活性が認め
られ、COS1細胞のよつてヒトエラスターゼIIIBが生産さ
れたことが示された。

psv2−CL1をCOS1細胞へ導入した本実施例においてはヒ
トエラスターゼIIIBの生産は短期的（transient expres
sion）であるが、psv2−CL1プラスミドに適当な選択マ
ーカー（例えば、neo遺伝子、dihydrofolate reductase
遺伝子など）を連結してCHO細胞等に導入すれば、長期
間にわたりヒトエラスターゼIIIBを生産可能な細胞株を
得ることができる。

（６）枯草菌を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIBの生産発現ベクターの構築発現ベクターの構築法は図２に示した。すなわち、ヒト
エラスターゼIIIBのcDNAがクローン化されているプラス
ミドPCL1を、制限酵素HindIIIとBglIIで切断し、ヒトエ
ラスターゼIIIBcDNAの一部を含む712塩基対のDNA断片を
アガロースゲル電気泳動によつて単離した。本DNA断片
に、枯草菌α−アミラーゼのシグナルペプチドの一部な
らびにエラスターゼIIIBのアミノ末端側の24個のアミノ
酸をコードする、85塩基対からなる合成オリゴヌクレオ
チド（図３）をT4DNAリガーゼにて結合させた後、アガ
ロースゲル電気泳動にて、797塩基対のDNA断片を分離し
た。

一方、枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子がクローニングさ
れているプラスミドPTUB228（K.Ohmura,T.Shiroza,K.Na
kamura,A.Nakayama,K.Yamane,K.Yoda,M.Yamasaki,and
G.Tamura:J.Biochem.95,87〜93（1984）を制限酵素Hind
IIIで切断して、α−アミラーゼのプロモーターおよび
シグナルペプチドの一部を含む428塩基対のDNA断片、お
よび複製開始点を含む5100塩基対のDNA断片を、それぞ
れ1.2％のアガロースゲル電気泳動にて単離した。428塩
基対のDNA断片はさらに制限酵素HpaIIにて、また、5100
塩基対のDNA断片は制限酵素BclIにて切断したる後、1.2
％のアガロースゲル電気泳動にてそれぞれ385塩基対、
および4173塩基対のDNA断片を単離した。上記の３種のD
NA断片をT4DNAリガーゼにて結合させたのち、常法によ
り枯草菌207−25株（m₁₆₃ hsrM recE4 amyE07 aroI906l
euA8 lys21;Marburg株由来）のプロトプラスト中に取り
込ませ、再生を行つたのち、カナマイシン10μg/ml含有
培地にて培養し、本培地上にて生育可能な形質転換株を
得た。目的の組み換え体は、図３に示す85塩基対のDNA
をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーシヨン法
にて得られた陽性のクローンよりプラスミドを分離し、
そのDNAの塩基配列を調べる事により分離した。こうし
て取得したクローンの１つをpHAM001と命名した。

生産物の確認前述のエラスターゼIIIBの発現ベクター、pHAM001を導
入した枯草菌207−25株は、50μg/mlのカナマイシンを
含むLG培地１（１あたり、Bacto Tryptone（Difc
o）10g,Bacto Yeast Extract（Difco）5g,NaCl5g,Gluco
se2g,pH7.0）にて、35℃で48時間往復振とう培養した。

培養終了後、培養液は４℃に冷却したのち、3.000×G/5
分の遠心分離にて菌体を除いた後、55％飽和となるよう
に硫酸アンモニウムを加え、４℃で12時間攪拌した。本
操作によつて生じた不溶物を8,000×G/20分の遠心操作
にて沈澱させたのち、上清を除き、沈澱物を20mlの50mM
Tris−HCl（pH8.0）に溶解した。本溶液を、500mlの50
mM Tris−HCl（pH8.0）に対して16時間透析し、不溶性
物質を8,000×G/20分の遠心分離にて除いた。この透析
内液を粗エラスターゼIIIB液として以下の検定に用い
た。

試料のエラスターゼ活性は、下記の方法にて測定した。
すなわち、合成基質Ｎ−carbobenzoxy−Ｌ−alanine−
ｐ−nitrophenyl ester（sigma）を50mM Tris−HCl（pH
8.0）に溶解して0.1mM溶液とする。この基質液0.25mlに
対して、エラスターゼ試料液0.25mlを添加し、37℃にて
30分間反応させたのち、410nmの吸光度を測定した。同
時に、試料液にエラスターゼの阻害剤であるエラスタチ
ナールもしくはα−１−アンチトリブシンを終濃度0.1m
g/mlとなるように加えて、その活性に対する阻害度を測
定した。プロモーター部と正しく結合したプラスミドを
導入した207−25株では、その吸光度が、対照液と比較
して、0.24上昇し、エラスターゼ活性を検出しえた。本
エラスターゼ活性は上述の２種の阻害剤によつて抑えら
れることも同時に確認された。

なお、本実施例にて使用した制限酵素や他の酵素の反応
は酵素購入時に添加されている説明書に記載された緩衝
液および反応条件に従つた。

（７）大腸菌を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIBの生産ヒトエラスターゼIIIBのcDNAがクローン化されているプ
ラスミドPCL1を制限酵素EcoRI及びBglIIで切断し、ヒト
エラスターゼIIIBのcDNAを含む1640bpのDNA断片を分
離した。これを制限酵素Fnu4HIで部分切断し、つづいて
S1ヌクレアーゼで処理して、１本鎖部分を平滑末端とし
て788bpのDNA断片を得た。別に、プラスミドpuc8を制限
酵素SmaIで切断し、ホスフアターゼ処理してラクトース
オペロンのプロモーター、オペレーター領域と、β−ガ
ラクトシダーゼの一部を含むDNA断片を分離した。

上記二種類のDNA断片をT4DNAリガーゼを含む30μｌの溶
液（66mMのTris−HCl（pH7.6）,6.6mMのMgcl₂,10mMのDT
T,1mMのATP,2.5ユニツトのT4DNAリガーゼ）中で６℃、7
2時間保温し、両DNA断片を連結させた（図４）。

こうして構築したヒトエラスターゼ発現プラスミドをpH
EX102と命名した。各種大腸菌をpHEX102にて形質転換し
て、ヒトエラスターゼを生産しうる菌株を得た。

この方法によつて発現されるヒトエラスターゼは、下記
の如く成熟ヒトエラスターゼのＮ末端に８個のβ−ガラ
クトシダーゼ由来のアミノ酸が結合した融合蛋白にな
る。

ヒトエラスターゼ発現プラスミドpHEX102中のエラスタ
ーゼ遺伝子の５′末端付近のDNA塩基配列とアミノ酸配
列を下に示す。

以上のようにして得たエラスターゼ発現プラスミドを含
む菌株を、2XTY−アンピシリン培地（1.6％のバクトト
リプトン、１％のイーストエキストラクト、0.5％のNaC
l、50μg/mlのアンピシリン）に接種し、37℃、15時間
培養した。培養後、培養液を遠心して菌体を集め、2.4
×10⁸細胞相当量の菌体を15μｌのSDS溶液（２％のSD
S、５％の２−メルカプトエタノール、10％のグリセリ
ン、60mMのTris−HCl（pH6.8））に懸濁し、100℃３分
間加熱した後、Laemmliらの方法〔Nature,227 680（19
70）〕に従つてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
し、生産されている蛋白を解析した。

結果はYA21株において多量にエラスターゼ融合蛋白が生
産されていた。エラスターゼ融合蛋白の生産高はYA21株
が生産している全蛋白の30％に相当していた。X984株に
おいても比較的多量のエラスターゼ融合蛋白が生産され
ていたが、生産高はYA21株の半分以下であつた。その他
２株の大腸菌（HB101株およびMC4100株）におけるエラ
スターゼ融合蛋白の生産量は著しく低かつた。

エラスターゼ融合蛋白は菌体内でinclusion bodyを形成
しているので比較的容易に精製することができた。すな
わち、YA21/pHEX102の培養液１より、inclusion body
を形成している菌体が6.6gが得られた。得られた菌体6.
6gを、Lysozyme0.2mg/mlおよびデオキシコール酸1mg/ml
を含む50mMのトリス−HCl緩衝液（pH8.0）中で処理して
溶菌させた。未破壊の菌体を、低速遠心分離（1500Xg,1
0分間）にて除いた後、高速遠心分離（11000Xg、20分
間）にてinclusion bodyを沈澱として得た。このinclus
ion bodyにはまだ菌体断片が多量に含まれているので、
トライトンＸ−100 5mg/mlを含む50mMトリス−HCl緩衝
液に懸濁した後、高速遠心分離（11000Xg、20分間）に
より洗浄した。洗浄後、inclusion bodyは少量のトリス
−HCl緩衝液中に懸濁して４℃で保存した。

この様にして精製することにより350mgのinclusion bod
yが得られ、これは約50％のエラスターゼIIIB融合蛋白
を含有している。またYA21/pHEX102で生産されたinclus
ion bodyがエラスターゼ融合蛋白であることは、immuno
blotting法にて確認した。

上述のように、大腸菌にて生産されたエラスターゼの大
部分は、inclusion bodyとなり菌体の不溶性画分に存在
しているが、一部は可溶性であり酵素活性をも保持した
状態で存在している。本酵素活性の検出は以下のように
して行つた。

エラスターゼIIIB発現プラスミドを導入した大腸菌X984
株を2XTY−アンピシリン培地１にて37℃で15時間振と
う培養した。培養終了後、菌体を3,000XG/5分の遠心分
離にて集め、20mlの緩衝液Ａ（50mM Tris−HCl,1mM EDT
A,50mM NaClpH8.0）に懸濁し、リゾチームを10mg加えた
のち５℃で20分間保温した。その後、デオキシコール酸
を最終濃度1mg/mlとなるように加え、20℃に加温し、さ
らにデオキシリボヌクレアーゼを最終濃度0.1mg/mlとな
るように加えたのちポリトロンホモジエナイザー処理に
て菌体を破砕した。こうして得た溶菌液を80,000XG/40
分の遠心分離にかけ、菌体断片を除いたのち、セフアデ
ツクスＧ−75カラムクロマトグラフイーにかけた。エラ
スターゼ活性画分はさらに抗体アフイニテイークロマト
グラフイーにて精製した。その後、0.1mg/mlとなるよう
にトリプシンを加えて25℃で５分間保温し、次いで0.1m
g/mlとなるようにダイズトリプシンインヒビターを加え
てプロエラスターゼを活性化したものを粗エラスターゼ
IIIB試料液として以下の検定に用いた。

試料のエラスターゼ活性は、下記の方法にて測定した。
すなわち、合成基質Ｎ−Carbobenzoxy−Ｌ−alanine−
ｐ−nitrophenyl ester（Sigma）を50mM Tris−HCl（pH
8.0）に溶解して0.1mM溶液とする。この基質液0.25mlに
対して、エラスターゼ試料液0.25mlを添加し、37℃にて
30分間反応させたのち、410nmの吸光度を測定したとこ
ろ、その吸光度が0.36上昇し、エラスターゼ活性を検出
しえた。同時に、試料液に、エラスターゼの阻害剤であ
るエラスタチナールもしくはα−１−アンチトリプシン
を終濃度0.1mg/mlとなるように加えたところ、その活性
が、これらにより阻害されることを確認した。

（８）酵母を用いたヒト膵臓エラスターゼIIIBの生産酵母を宿主とする場合も、大腸菌、枯草菌および動物細
胞の場合と同様に、ヒト膵臓エラスターゼIIIBのcDNA
を、常法にて、適当なる発現ベクターに連結して、宿主
細胞に移入し、それを発現させることができ、その培養
物中にエラスターゼ活性の存在を確認することができ
た。

「組換えDNA実験指針」に記載されているS.cerevisiae
を宿主とすることができるが、具体的には、同S288C株
などが好適であつた。一方、ベクターとしては、YEp13
などが好適であつた。また、プロモーターとしては、ア
ルコール脱水素酵素遺伝子をコードするADH1遺伝子など
が好適であつた。

【図面の簡単な説明】

図１はpsv2−CL1プラスミド構築の手順を示す。psv2−
βグロビンはpsv2ベクターにβ−グロビンのcDNAが挿入
されているプラスミドであり、PCL1はOkayama−Bergベ
クターにヒトエラスターゼIIIBcDNAが挿入されているプ
ラスミドである。S1ヌクレアーゼ等の反応は“モレキユ
ラークローニング”〔Maniatis,T.et al.（ed）“Molec
ular cloning"Cold Spring Harbor Lab（1982）〕に記
載の方法に従つた。太矢印はsv40由来のプロモーターを
示し、細矢印は転写の方向を示す。ＨはHindIII、ＢはB
glII、ＰはPstIを示す。図２はpHAM001プラスミド構築の手順を示す。pTUB228
は、枯草菌の複製開始点を持つたベクターに、枯草菌の
α−アミラーゼ遺伝子がクローン化されているプラスミ
ドである。斜線の領域は、ヒトエラスターゼIIIBcDNAを
示し、太矢印はα−アミラーゼのプロモーターを示す。図３は枯草菌α−アミラーゼ遺伝子の、シグナルペプチ
ド領域、および成熟ヒト・エラスターゼIIIBのアミノ末
端側に対応するcDNAを含む85塩基対の合成DNAを示す。図４はpHEX102プラスミド構築の手順を示す。斜線の領
域は、ヒトエラスターゼIIIBcDNAを示し、太矢印はラク
トース・プロモーター・オペレーターを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 37/547 ＡＢＸ 8314−4ＣＣ１２Ｎ 9/66 9359−4Ｂ (72)発明者古川秀比古東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内 (72)発明者大峰寿典東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｎ）−Val Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Tyr Se
r Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Gln Tyr Glu Lys Ser
Gly Ser Phe Tyr His Thr Cys Gly Gly Ser Leu Ile Al
a Pro Asp Trp Val Val Thr Ala Gly His Cys Ile Ser
Ser Ser Arg Thr Tyr Gln Val Val Leu Gly Glu Tyr As
p Arg Ala Val Lys Glu Gly Pro Glu Gln Val Ile Pro
Ile Asn Ser Gly Asp Leu Phe Val His Pro Leu Trp As
n Arg Ser Cys Val Ala Cys Gly Asn Asp Ile Ala Leu
Ile Lys Leu Ser Arg Ser Ala Gln Leu Gly Asp Ala Va
l Gln Leu Ala Ser Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ile Leu
Pro Asn Glu Thr Pro Cys Tyr Ile Thr Gly Trp Gly Ar
g Leu Tyr Thr Asn Gly Pro Leu Pro Asp Lys Leu Gln
Glu Ala Leu Leu Pro Val Val Asp Tyr Glu His Cys Se
r Arg Trp Asn Trp Trp Gly Ser Ser Val Lys Lys Thr
Met Val Cys Ala Gly Gly Asp Ile Arg Ser Gly Cys As
n Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Asn Cys Pro Thr Glu
Asp Gly Gly Trp Gln Val His Gly Val Thr Ser Phe Va
l Ser Ala Phe Gly Cys Asn Thr Arg Arg Lys Pro Thr
Val Phe Thr Arg Val Ser Ala Phe Ile Asp Trp Ile Gl
u Glu Thr Ile Ala Ser His-（Ｃ）で表されるヒト・膵臓エラスターゼIIIBをコードするDN
A。
【請求項２】（Ｎ）−末端が水素原子、Met、あるいは
プレおよびプロ部分として（Ｎ）‐Met Met Leu Arg Leu Leu Ser Ser Leu Leu Le
u Val Ala Val Ala Ser Gly Tyr Gly Pro Pro Ser Ser
Arg Pro Ser Ser Arg-（Ｃ）の一部または全部を有するヒト・膵臓エラスターゼIIIB
をコードする特許請求の範囲第１項記載のDNA。
【請求項３】一般式（５′）‐GTT GTC AAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC
AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AG
C GGA AGC TTC TAC CAC ACC TGT GGC GGT AGC CTC ATC
GCC CCC GAC TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TC
G AGC TCC CGG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGC GAG TAC
GAC CGT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CC
C ATC AAC TCT GGG GAC CTC TTT GTG CAT CCA CTC TGG
AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CT
C ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAC GCC
GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCG GCT GGT GAC ATC CT
T CCC AAC GAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC
CGT CTC TAT ACC AAC GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CA
G GAG GCC CTG CTG CCG GTG GTG GAC TAT GAA CAC TGC
TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC TCC GTG AAG AAG AC
C ATG GTG TGT GCT GGA GGG GAC ATC CGC TCC GGC TGC
AAT GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GA
G GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAT GGC GTG ACC AGC TTT
GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC ACC CGC AGG AAG CCC AC
G GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATT GAC TGG ATT
GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC-X（３′）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す。）で表される塩
基配列を含有することを特徴とする特許請求の範囲第１
項または第２項記載のDNA。
【請求項４】５′末端にATG、あるいは（５′）‐ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC
CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TC
T CGC CCT TCC AGC CGC-（３′）の一部または全部を有することを特徴とする特許請求の
範囲第３項記載のDNA。
【請求項５】以下に記述した（イ）〜（ニ）を含むこと
を特徴とする一般式（５′）‐GTT GTC AAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC
AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AG
C GGA AGC TTC TAC CAC ACC TGT GGC GGT AGC CTC ATC
GCC CCC GAC TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TC
G AGC TCC CGG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGC GAG TAC
GAC CGT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CC
C ATC AAC TCT GGG GAC CTC TTT GTG CAT CCA CTC TGG
AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CT
C ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAC GCC
GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCG GCT GGT GAC ATC CT
T CCC AAC GAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC
CGT CTC TAT ACC AAC GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CA
G GAG GCC CTG CTG CCG GTG GTG GAC TAT GAA CAC TGC
TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC TCC GTG AAG AAG AC
C ATG GTG TGT GCT GGA GGG GAC ATC CGC TCC GGC TGC
AAT GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GA
G GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAT GGC GTG ACC AGC TTT
GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC ACC CGC AGG AAG CCC AC
G GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATT GAC TGG ATT
GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC-X（３′）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す。）で表される塩
基配列を含有するDNAの製造法。（イ）ヒトの膵臓より、mRNAを分離する。（ロ）このmRNAおよび逆転写酵素を用いてcDNAバンクを
作製する。（ハ）作製したcDNAバンクからプローブを用いてヒトエ
ラスターゼIIIBをコードするcDNAを含有するプラスミド
を単離する。（ニ）このプラスミドから目的とするクローン化DNAを
切り出す。
【請求項６】５′末端にATG、あるいは（５′）‐ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC
CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TC
T CGC CCT TCC AGC CGC-（３′）の一部または全部を有することを特徴とする特許請求の
範囲第５項記載のDNAの製造法。
【請求項７】一般式（５′）‐GTT GTC AAT GGT GAG GAT GCG GTC CCC TAC
AGC TGG CCC TGG CAG GTT TCC CTG CAG TAT GAG AAA AG
C GGA AGC TTC TAC CAC ACC TGT GGC GGT AGC CTC ATC
GCC CCC GAC TGG GTT GTG ACT GCC GGC CAC TGC ATC TC
G AGC TCC CGG ACC TAC CAG GTG GTG TTG GGC GAG TAC
GAC CGT GCT GTG AAG GAG GGC CCC GAG CAG GTG ATC CC
C ATC AAC TCT GGG GAC CTC TTT GTG CAT CCA CTC TGG
AAC CGC TCG TGT GTG GCC TGT GGC AAT GAC ATC GCC CT
C ATC AAG CTC TCA CGC AGC GCC CAG CTG GGA GAC GCC
GTC CAG CTC GCC TCA CTC CCT CCG GCT GGT GAC ATC CT
T CCC AAC GAG ACA CCC TGC TAC ATC ACC GGC TGG GGC
CGT CTC TAT ACC AAC GGG CCA CTC CCA GAC AAG CTG CA
G GAG GCC CTG CTG CCG GTG GTG GAC TAT GAA CAC TGC
TCC AGG TGG AAC TGG TGG GGT TCC TCC GTG AAG AAG AC
C ATG GTG TGT GCT GGA GGG GAC ATC CGC TCC GGC TGC
AAT GGT GAC TCT GGA GGA CCC CTC AAC TGC CCC ACA GA
G GAT GGT GGC TGG CAG GTC CAT GGC GTG ACC AGC TTT
GTT TCT GCC TTT GGC TGC AAC ACC CGC AGG AAG CCC AC
G GTG TTC ACT CGA GTC TCC GCC TTC ATT GAC TGG ATT
GAG GAG ACC ATA GCA AGC CAC-X（３′）（式中、ＸはTAA,TGAまたはTAGを示す。）で表される塩
基配列を含有するDNAで形質転換せしめた宿主。
【請求項８】５′末端にATG、あるいは（５′）‐ATG ATG CTC CGG CTG CTC AGT TCC CTC CTC
CTT GTG GCC GTT GCC TCA GGC TAT GGC CCA CCT TCC TC
T CGC CCT TCC AGC CGC-（３′）の一部または全部を有することを特徴とする特許請求の
範囲第７項記載のDNAで形質転換せしめた宿主。
【請求項９】大腸菌、枯草菌、酵母または動物細胞であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の宿主。