JPH0675517B2 - 還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は還元型ニコチンアミド補酵素の新規な定量方法
に関する。詳しくは尿，血清等の生体液中に存在する還
元型ニコチンアミド補酵素を高精度で定量することが可
能な還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法である。

〔従来の技術及び問題点〕 還元型ニコチンアミド補酵素の定量は生体液中の物質の
定量に一般に応用されている。例えば、生体液中に含有
される胆汁酸を定量する方法として該胆料酸と酸化型ニ
コチンアミド補酵素を脱水素酵素によって反応させ、生
成する還元型ニコチンアミド補酵素を定量し、該量によ
り胆汁酸の量を推定する方法が知られている。また還元
型ニコチンアミド補酵素の定量は生体液中にに含有され
るポリアミンの測定にも応用することが可能である。即
ち、ポリアミンを酸化酵素により酸化してアミノアルキ
ルアルデヒドに変換し、該アルデヒドを酸化型ニコチン
アミド補酵素と脱水素酵素によって反応させ、生成する
還元型ニコチンアミド補酵素を定量してポリアミンの量
を推定する方法である。

従来、かかる還元型ニコチンアミド補酵素の定量は、試
料液にジアホラーゼ等の電子伝達系とテトラゾリウム塩
とよりなるテトラゾリウム系発色剤を作用させ、生成し
たホルマザンの発色度合いを測定することにより行われ
ている。

しかしながら、この定量方法は生成したホルマザンの測
定用器具（セル，試験管等）への沈着，凝集により呈色
安定性に乏しいという問題を有する。また、ホルマザン
の沈着による測定用器具の汚染という問題をも有する。
さらに、水溶液中での反応の場合、ホルマザンが難溶性
のため、反応により生成したホルマザンの吸光度から算
出された見かけ上の分子吸光係数は、ホルマザンの理論
分子吸光係数に対して著しく小さく、また測定条件によ
り変動し易いという問題をも有している。

従来、テトラゾリウム系発色剤を使用した還元型ニコチ
ンアミド補酵素の定量におけるこれらの問題を解消する
ため種々の工夫がなされている。

例えば、分子吸光係数を上げる方法としてテトラゾリウ
ム系発色剤を作用させる試料液のPHをアルカリ側（PH8
〜10）に調整し、且つ、ホルマザンの分散剤としてノニ
オン系界面活性剤0.01〜0.1程度又は牛血清アルブミン
0.1％程度を添加してホルマザンの生成反応を出来るだ
け起こし易くする方法が一般的である。

また、生成したホルマザンの沈着防止のための方法とし
て反応系の中にゼラチン等を添加する方法がある。

以上の方法により、前記した問題点はある程度解決でき
るが、未だ改善の余地がある。しかも、試料液が尿，血
清等の生体液の場合には前記した問題に加えて更に下記
の問題を有する。即ち、試料液が生体液である場合、試
料中の還元性物質、例えばアスコルビン酸，ビリルビ
ン，尿酸，還元型グルタチオン等によりテトラゾリウム
塩が還元され、還元型ニコチンアミド補酵素以外からの
ホルマザンが生成されるため、ブランク値が高く、しか
も変動し、測定に大きな誤差を与えるという問題を生じ
る。

かかる問題は、前記した従来の方法によってほとんど解
決することができない。

従って、呈色安定性が高く、生成するホルマザンが高い
分子吸光係数を示し、且つ還元物質によるブランク値の
上昇が少なく、還元型ニコチンアミド補酵素を正確に定
量する方法の開発が望まれていた。

〔問題点を解決する為の手段〕

本発明者らは、還元型ニコチンアミド補酵素を含有する
試料液にテトラゾリウム系発色剤を作用させ、生成した
ホルマザンを比色定量する方法における上記課題を達成
すべく、鋭意研究を重ねた結果、テトラゾリウム系発色
剤を特定のPHで且つ特定量のノニオン系界面活性剤の存
在下に該試料液に作用させることにより、かかる目的を
全て達成し得ることを見い出し本発明を完成した。

本発明は還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液
にテトラゾリウム系発色剤を作用さて、その発色の度合
により該還元型ニコチンアミド補酵素を定量する方法に
おいて、該試料液のPHが４〜７で且つノニオン系界面活
性剤0.3〜10重量％の存在下にテトラゾリウム系発色剤
を作用させることを特徴とする還元型ニコチンアミド補
酵素の定量方法である。

本発明において、測定の対象となる還元型ニコチンアミ
ド補酵素とは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（以下NADHと略す）又は還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドフオスフエート（以下NADPHと略
す）があげられる。本発明の方法が良好に適用される試
料液中の還元型ニコチンアミド補酵素の濃度は、反応条
件等により多少異なり、一概に限定できないが、通常は
0.001mM〜50mMの範囲が好適である。

本発明の方法が適用される還元型ニコチンアミド補酵素
を含有する試料液は特に制限されないが、特に生体液中
に還元型ニコチンアミド補酵素を含む試料液に対して顕
著な効果を発揮する。かかる試料液を具体的に例示すれ
ば、胆汁酸が含有する血清，尿，胆汁等の生体液に３α
−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（以下３
α−HSDと略す）と酸化型ニコチンアミド補酵素とを作
用させて得られる還元型ニコチンアミド補酵素を含有す
る試料液，尿，血清等の生体液中のポリアミンをポリア
ミン酸化酵素により酸化してアミノアルキルアルデヒド
に変換し、該アミノアルキルアルデヒドに酸化型ニコチ
ンアミド補酵素とを脱水素酵素を作用させて得られる還
元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液等が挙げら
れる。上記の還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試
料液の製造方法は公知の条件が特に制限なく採用され
る。

本発明において、テトラゾリウム系発色剤は、テトラゾ
リウム塩と電子伝達系とよりなる。テトラゾリウム塩と
してはモノテトラゾリウム塩，ジテトラゾリウム塩のい
かなるテトラゾリウム塩でもよい。例えば、３−（Ｐ−
ヨードフエニル）−２−（Ｐ−ニトロフエニル）−５−
フエニル−2H・テトラゾリウムクロライド（以下INT
と略す）ニトロテトラゾリウムブルー（Nitro−TB），
ネオテトラゾリウムブルー（Neo−TB），テトラゾリウ
ムブルー（TB），テトラニトロテトラゾリウムブルー
（TNTB）等のテトラゾリウム塩があげられる。そのう
ち、反応のPH等により異なるが、好ましくはモノテトラ
ゾリウム塩として、INT,ジテトラゾリウム塩としてノト
ロテトラゾリウムブルーがあげられる。また、テトラゾ
リウム塩の濃度は反応条件等により異なるが、通常は0.
1mM〜50mMが用いられる。また、電子伝達系は、テトラ
ゾリウム塩に還元型ニコチンアミド補酵素の水素を授受
させて共鳴構造をもたらせ、これをホルマザン色素に変
換せしめるものである。かかる電子伝達系としては、ジ
アホラーゼ,1−メトキシフエナジンメトサルフエイト
（１−メトキシPMS）等があるが、好ましくはジアホラ
ーゼを用いる方法がよい。この際のジアホラーゼ量は反
応条件等により異なるが通常0.1u〜50u程度が用いられ
る。

本発明の方法は上記した還元型ニコチンアミド補酵素を
含む試料液に、該試料液のPHが４〜７、好ましくはPH5
〜6.5で且つノニオン系界面活性剤0.3〜10重量％、この
詩句は0.5〜２重量％の存在下でテトラゾリウム系発色
剤を作用させることを特徴とする。即ち、テトラゾリウ
ム系発色剤を作用させる際の試料液のPHが４より低い場
合には、還元型ニコチンアミド補酵素が不安定になると
同時に十分な発色を示さない。また、PHが７より高い場
合には発色は十分に起こるが同時に試料中の還元性物質
によるテトラゾリウム塩の還元反応が急激に強くなり、
正確な定量が困難となる。又、ノニオン系界面活性剤の
濃度が0.3重量％よりも低い場合には、ホルマザンの十
分な分子吸光係数が得られず、さらにホルマザンの沈着
や凝集が起こる。逆に、ノニオン系界面活性剤の濃度が
10重量％よりも高い場合には、ホルマザンの十分な分子
吸光係数が得られるが試料中の還元性物質のテトラゾリ
ウム塩の還元反応も同時に進行し、正確な定量は困難で
ある。

前記した試料液のPHはいかなる方法で調整してもよい
が、好ましくは緩衝液により調整する方法がよい。緩衝
液としてはPH4〜７に緩衝作用のあるいかなる緩衝液を
用いてもよい。例えば、アミノ酸系の緩衝液またはグツ
ド系緩衝液の中のメス緩衝液、ビストリス緩衝液、ピペ
ス緩衝液等が好適である。また、PHの範囲としてはPH4
〜７の範囲内で決めればよいが電子伝達系のジアホラー
ゼ等の安定性を考えればPH5〜6.5が特に好ましい。さら
に緩衝液の濃度は反応液のPHを安定に調整できれば特に
制限はないが通常は0.1M〜1.0Mが良い。

本発明におけるノニオン系界面活性剤は反応を阻害しな
いノニオン系界面活性剤であれば特に制限はないが、生
成したホルマザンの安定化，生成したホルマザンの分子
吸光係数の大きさ，生体試料中からの沈殿等の析出防止
効果などの点で、上記ノニオン系界面活性剤としてポリ
オキシエチレンアルキルアリルエーテル，ポリオキシエ
チレンスチレン化フェノール等が好適に使用される。例
えば、エマルゲン935（商品名），ペネロールＮ−100N/
C（商品名），ペネロールSP−24（商品名），エマルジ
エツト25（商品名），トリトンＸ−100（商品名）等が
あげられる。ノニオン系界面活性剤の濃度は、前記した
ように反応時0.3〜10重量％の濃度においてその効果は
認められる。しかし、好ましくは0.5〜6.0重量％のノニ
オン系界面活性剤を存在させるとよい。

本発明において、試料液中の還元型ニコチンアミド補酵
素を定量する場合、還元型ニコチンアミド補酵素を生成
する反応および生成した還元型ニコチンアミド補酵素を
本発明により定量する反応を同時に進行させてもよく、
また、これら反応を２段階又は多段階反応として各反応
に適した条件下で反応させても良い。還元型ニコチンア
ミド補酵素を生成する反応と還元型ニコチンアミド補酵
素を定量する反応とを同時に行う具体例として、ポリア
ミンを含む試料液にポリアミンを酸化する酸化酵素を作
用させてアルミアルキルアルデヒドに変換し、該試料液
に酸化型ニコチンアミド補酵素，脱水素酵素，テトラゾ
リウム系発色剤，本発明における所定量のノニオン界面
活性剤を添加すると共にPHを４〜７に調整する方法が挙
げられる。かかる反応のPHにおいて効果的に脱水素反応
を行うため酵素として好適な脱水素酵素を例示すれば、
本願出願人による昭和62年４月４日出願のω−アミノア
ルキルアルデヒドデヒドロゲナーゼが挙げられる。上記
酵素は、下記の理化学的性質を有する。

作用：酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド又は酸化
型ニコチンアミドジヌクレオチドフオスフエイトの存在
下で４−アミノブタナールに作用し、４−アミノ酪酸と
還元型ニコチンアミドジヌクレオトド又は還元型ニコチ
ンアミドジヌクレオチドフオスフエイトを生成する。

基質特異性：酸化型ニコチンアミド補酵素として酸化
型ニコチンアミドジヌクレオチド及び酸化型ニコチンア
ミドジヌクレオチドフオスフエイトに対して作用し、ω
−アミノアルキルアルデヒドとして、４−アミノブタナ
ール及び５−アミノペンタナールに対して作用する。

至適PH:PH7.7〜8.3 PH安定性:5℃にて24時間保存した時,PH4.5〜8.5にお
いて90％以上の存在活性を有する。

分子量:102,000±5,000 サブユニツトの分子量:50.000±5,000 サブユニツトの数:2個 上記の４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼは、本酵
素を生産する能力のあるミクロコツカス属に属する細菌
を培養することによって得られる。使用する培地として
はグルコース等の炭素源，ポリペプトン等の窒素源，及
び無機塩類を含有するものであれば特に限定されない。
また、これらの成分の他にプトレツシン，スペルミジ
ン，ジアミノプロパン，又はカルジン等のポリアミンを
含有させることが該酵素の生産性を高める上において有
利である。培養条件としては、培養温度が15〜40℃の範
囲、好ましくは20〜35℃の範囲で培養する方法が好適で
ある。培養時のPH条件は、4.0〜9.0の範囲で、好ましく
はPH5.0〜8.0の範囲が適当である。培養時間は、特に限
定されないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増殖
の後期に達する時間から休止状態に入ってから10時間以
内の範囲が適当である。

培養によって得られた培養物から菌体を分離する方法と
しては、従来から行われている遠心分離法や濾過等の方
法が使用出来るが、遠心分離の方法が好適である。

４−アミノプタナールデヒドロゲナーゼは、通常菌体内
に含まれているため該酵素を菌体から何らかの方法によ
って抽出する必要がある。抽出方法としては、従来から
行われている超音波による菌体破砕、あるいはガラス・
ビーズと共に回転させるダイノミル破砕機による菌体破
砕又は、リゾチーム等の酵素やトルエン等の有機溶媒に
よる細胞膜の破壊等の方法が挙げられる。これらの中か
ら適当な方法を選択して菌体から酵素の抽出を行うこと
により、酵素の採取が出来る。

これらの方法で抽出された粗酵素液から４−アミノブタ
ナールデヒドロゲナーゼをさらに精製する必要性がある
場合は、通常実施されている一般的な酵素の精製手段で
ある硫酸アンモニウム沈殿法，イオン交換カラムクロマ
トフラフイー法，ゲル濾過法，ヒドロキシアパタイト
カラムクロマトフラフイー法，調製用電気泳動法等の方
法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことによっ
て精製を行うことが出来る。

また、４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼの酵素活
性測定方法及び酵素活性値の表示方法は以下の通りであ
る。

光路幅1cmのキユベツト中に10mMのプトレツシン二塩
酸塩を含有する0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン−塩酸緩衝液（PH8.0）を2.5ml分注し、さらに20
μｌ（５ユニツト）のミクロコツカス属由来のプトレツ
シンオキシダーゼを添加混和し30℃下で10分間インキユ
ベイシヨンを行った後、この反応溶液に20mMのNAD水溶
液を0.5mlを加え、次いで50μｌの４−アミノブタナー
ルデヒドロゲナーゼを含有する被検体を添加混和する。
直ちに30℃下で340nmの吸光度の増加速度を測定する。
一分間当りの吸光度の増加量（Ａ）から以下の換算式
（１）を使用して被検体1.0ml当りの４−アミノブタナ
ールデヒドロゲナーゼの酵素活性値を算出する。酵素活
性値の表示は、１分間当り１μmoleのNADHを生成させる
酵素値を１ユニツト（μmole/mm）として表示する。

本発明による４−アミノブタナールデヒドロゲナーゼの
比活性値は、120〜140（ユニット/mg−蛋白質）を示
す。又、ドデシル硫酸ナトリウムの存在、非存在下での
ポリアクリルアミドゲル電気泳動上において両者共に単
一の蛋白質バンドが観測される。

本発明において、使用するノニオン系界面活性剤の添加
時期は還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試料液を
調製する前処理段階から添加しても良いし、該調整され
た試料液に添加してもよい。即ち、テトラゾリウム系発
色剤を作用させる時に試料液中にノニオン系界面活性剤
が0.3〜10重量％存在しておればその添加時期は制限さ
れない。また、本発明において還元型ニコチンアミド補
酵素を含有する試料液のPHが４〜７で且つノニオン系界
面活性剤0.3〜10重量％の存在下にテトラゾリウム系発
色剤を作用させる反応が終結し、ホルマザンが生成した
後にそのPHを４以下に下げて生成したホルマザンを定量
しても安定に測定が可能である。

本発明において、テトラゾリウム系発色剤の発色より還
元型ニコチンアミド補酵素の量を推定する方法は、公知
の比色定量法が特に制限なく採用される。最も一般的な
方法として検量線を用いた方法が挙げられる。

本発明の特徴の一つはPH4〜７という酸性剤で、還元型
ニコチンアミド補酵素をテトラゾリウム系発色剤により
比色定量することである。即ち、PH7以下ではノニオン
系界面活性剤が高濃度存在下でも生体試料中の還元性物
質によるテトラゾリウム系発色剤の還元反応が抑えられ
ているが、PH7以上では生体試料中の還元性物質による
テトラゾリウム系発色の還元反応が急激に進行しはじめ
るのである。この現象はおそらく、通常用いる反応系の
PH（アルカリ側）とは逆に酸性側で発色させることによ
り、テトラゾリウム系発色剤および生体試料中の還元性
物質の双方の酸化還元電位に変化が生じ、生体試料中の
還元性物質によるテトラゾリウム系発色剤の還元反応が
起こらなくなったものと推定される。しかし、これだけ
では還元型ニコチンアミド補酵素のテトラゾリウム系発
色剤による安定且つ正確な定量はできない。

本発明においては、さらに前記条件下でノニオン系界面
活性剤を高濃度（0.3〜10重量％）存在させることによ
り正確な定量を可能とした。即ち、ノニオン系界面活性
剤を前記範囲で使用することにより、生体試料中の還元
性物質によるテトラゾリウム系発色剤の還元反応の進行
はなく、ジアホラーゼ等の電子伝達体を介する還元型ニ
コチンアミド補酵素によるテトラゾリウム系発色剤の還
元反応のみ進行し、且つ生成したホルマザンは高い分子
吸光係数を持つのである。この現象は、ノニオン系界面
活性剤が生成したホルマザンの分散剤としての役割をし
ており、テトラゾリウム塩および生体試料中の還元性物
質の酸化還元電位にはあまり影響していない為と推測さ
れる。

従って、本発明の二つの特徴を組み合わせることによっ
てはじめて、生体試料において還元型ニコチンアミド補
酵素をテトラゾリウム系発色剤により比色定量すること
が可能となるのである。すなわち、本発明は、低いPH条
件下で且つ高濃度のノニオン系界面活性剤を存在させる
ことにより、生体試料中の還元性物質によるテトラゾリ
ウム塩の還元反応を抑えることができるためブランク値
が低く、しかも生成したホルマザンの分子吸光係数が高
いため、感度のよい定量が可能である。

また、本発明の方法によれば、生体試料中の還元性物質
によるテトラゾリウム塩の還元反応がないため、広い濃
度範囲にわたりテトラゾリウム塩を使用することが可能
である。

本発明において高濃度ノニオン系界面活性剤の添加は、
生体液中より析出沈殿する変性タンパク質等の沈殿に対
しても溶解性があり、かかる物質を含む試料液中に存在
する還元型ニコチンアミド補酵素の定量方法として非常
に優れた方法である。

本発明により還元型ニコチンアミド補酵素のテトラゾリ
ウム系発色剤による定量が安定で、正確に、しかも高感
度で又測定装置や器具を汚染することなく可能となった
ので自動分析装置への適用も十分可能である。

本発明により将来、日常の臨床検査において還元型ニコ
チンアミド補酵素のテトラゾリウム系発色剤を用いた定
量方法が広く普及するものと考えられる。従って本発明
の臨床検査分野への貢献度は非常に大きいものと期待さ
れる。

〔実施例〕

以下実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するの
が本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 下記組成の試薬を用い、下記方法により得られた吸光度
の測定値とその測定値に対応する還元型ニコチンアミド
補酵素濃度の関係を第２表に示す。

ａ）試薬 アルコルビン酸オキシダーゼ 45u （東洋醸造（株）社製） エマルゲン935 0.4g （花王石ケン（株）社製） 0.4M−トリス−塩酸緩衝液（PH7.8）にて全量を10mlと
したもの。

試薬２ ニトロテトラゾリウムブルー 5.0mg （同仁化学研究所（株）社製） ジアホラーゼ 80u （オリエンタル酵母（株）社製） 0.6Mメス緩衝液（PH6）（同仁化学研究所（株）にて全
量を20mlとしたもの。

試薬３ IM塩酸溶液 ｂ）測定法 還元型ニコチンアミド補酵素を200μmole/l含有する尿
試料を調製した。一方同じ尿に還元型ニコチンアミド補
酵素の代わりに精製水を添加したものも調製した。それ
ぞれの試料を精製水を用いて希釈系列を作成した。次に
第１表に示す様に操作した。この希釈系列溶液をそれぞ
れ0.5mlずつ分取し、試薬１を0.5ml添加混和後37℃20分
反応させた。その後試薬２を0.5ml添加混和してPHを6.0
に調整して37℃５分間テトラゾリウム係発色剤を作用さ
せた後、1mole/l塩酸水溶液を0.5ml添加混和後波長530n
mの吸光度を測定した。

第２表より作成した検量線を第１図に示す。第１図から
還元型ニコチンアミド補酵素濃度と得られる吸光度の関
係は200μmole/lの濃度まで直線関係が得られ、これよ
り還元型ニコチンアミド補酵素の比色定量が可能である
ことがわかる。

実施例２ 尿中の還元型ニコチンアミド補酵素の定量還元型ニコチ
ンアミド補酵素を30μmole/l,60μmole/l,120μmole/l
含有する尿試料を調製した。一方同じ尿に還元型ニコチ
ンアミド補酵素の代わりに精製水を添加したものもそれ
ぞれ調製した。

上記試料を実施例１と同様な方法により吸光度Esおよび
Ebを得た。さららに標準液として30μＭの還元型ニコチ
ンアミド補酵素水溶液及び盲検体として精製水を用い前
記Es及びEbの測定方法と同様な方法により吸光度をそれ
ぞれ測定した。かかる標準液について得られた吸光度を
それぞれEst及びEst′とし盲検体について得られた吸光
度をそれぞれEH₂O及びEH′₂Oとする。

上記方法によって得られた測定値により下記式を用いて
試料中の還元型ニコチンアミド補酵素量を計算して求め
た。

上記測定操作を３種類の尿検体について５回ずつ行ない
その結果を第３表に示した。この結果より本発明の方法
が良好な再現性を示すことがわかる。

第３表から本発明の方法は尿中の還元型ニコチンアミド
補酵素量を正確に測定できることがわかる。

実施例３ 還元型ニコチンアミド補酵素を120μmole/l含有する尿
試料を調製した。一方同じ尿に還元型ニコチンアミド補
酵素の代わりに精製水を添加したものもそれぞれ調製し
た。上記試料を実施例１と同様な方法により吸光度Esお
よびEbを得た。ただし実施例１に示す試薬１中のノニオ
ン系界面活性剤エマルゲン935の濃度は発色反応時第４
表に示す濃度になる様それぞれ調製した。得られた吸光
度より次式に従って尿中還元型ニコチンアミド補酵素濃
度を計算した。

上記測定を同じ条件下でそれぞれ５回測定しその時の結
果を第４表に示した。また得られた吸光度からそれぞれ
の条件下でのホルマザンの分子吸光係数を計算した。そ
の結果も合わせて第４表に示した。

以上のことより本発明は還元型ニコチンアミド補酵素の
定量法として非常に安定でかつ正確にまた十分な分子吸
光係数が得られることから高濃度に定量できることが判
明した。

比較例１ 比較例として実施例３においてノニオン系界面活性剤エ
マルゲン935濃度が0.3重量％以下の場合と10重量％以上
の場合の結果を第５表に示した。

以上のことからノニオン系界面活性剤エマルゲン935濃
度が0.3重量％以下では得られた分子吸光係数が小さく
感度が低くなりしかも測定値も非常にバラツキがあるこ
とがわかる。また10重量％以上でも感度は十分にあるが
測定値のバラツキが大きくなり、還元型ニコチンアミド
補酵素の定量方法としては不適当であることが判明し
た。

実施例４ 下記組成の試薬を用い、還元型ニコチンアミド補酵素を
本発明により定量するに際し、還元性物質の定量値に対
する影響を調べ第６表に示した。

ａ）試薬 試薬１ 0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）10mlにアルコルビン
酸オキシダーゼ40uを溶解したもの。

試薬２ ニトロテトラゾリウムブルー 1.5mg （同仁化学研究所（株）社製） ジアホラーゼ 40u （オリエンタル酵母（株）社製） エマルゲン935 0.4g 以上のものを0.2Mメス緩衝液20mlに溶解したもの。

ｂ）測定法 既知濃度の還元型ニコチンアミド補酵素と各還元性物質
を含有する溶液を等濃度の還元型ニコチンアミド補酵素
を含有する溶液で希釈し、還元型ニコチンアミド濃度が
等しく、各還元性物質の濃度の異なる希釈系列を用意し
た。同様に還元型ニコチンアミド補酵素の代わりに精製
水を用いたものの希釈系列も用意した。該試料を日立70
50自動分析装置を用い、還元型ニコチンアミド補酵素を
定量し、各還元性物質の影響をみた。

試料を20μｌサンプリングし第１試薬として試薬１を各
100μｌ分注させ、37℃５分反応後、第２試薬として試
薬２を各250μｌ分注させ、主波長700nmとし還元型ニコ
チンアミド補酵素濃度を求めた。この時の盲検様試料と
しては生理食塩水を用いた。試料として還元型ニコチン
アミド補酵素を含有する試料を用いた時の得られた吸光
度をA₁とし、試料として還元型ニコチンアミド補酵素を
含有しない試料を用いた時の吸光度すなわちブランク上
昇をA₂とした。また得られた吸光度からの濃度換算は、
あらかじめ盲検用として生理食塩水，標準液として50μ
mole/l還元型ニコチンアミド補酵素を含有する生理食塩
水を用いそれぞれの吸光度を測定しておいた。この時の
50μmole/l還元型ニコチンアミド補酵素の吸光度は0.04
75であった。各吸光度からの濃度換算は次式によって行
なった。

その結果を第６表に示した。

第６表よりアスコルビン酸においてわずかにブランク上
昇が認められるが、その他の還元性物質の影響は認めら
れない。還元型ニコチンアミド補酵素の分析値（C₁-
C₂）としてはいずれの還元性物質の影響も受けていない
ことがわかった。またホルマザンの呈色安定性にも非常
に優れ、自動分析装置のセル等への汚染や沈着はまった
く認められなかった。

実施例５ 実施例１と同様に尿中の還元型ニコチンアミド補酵素の
定量を行った。還元型ニコチンアミド補酵素濃度として
は60μmole/lとし対照検体としては精製水を添加したも
のを用い、それぞれについて530nmの吸光度EsおよびEb
を得た。還元型ニコチンアミド濃度は次式により算出し
た。

同じ測定をそれぞれ５回繰り返し、その再現性を求め
た。但し発色反応時のPHは第７表に示すPHとなる様に調
製した。その結果を第７表に示した。

以上のことからPH7.9ではブランク上昇のために測定値
のバラツキが大きくPH3.5では感度が低くバラツキの原
因となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるNADH濃度と本発明の方法を使
用して得られる吸光度の関係を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】還元型ニコチンアミド補酵素を含有する試
   料液にテトラゾリウム系発色剤を作用させて、その発色
   の度合により該還元型ニコチンアミド補酵素を定量する
   方法において、該試料液のPHが４〜７で且つノニオン系
   界面活性剤0.3〜10重量％の存在下にテトラゾリウム系
   発色剤を作用させることを特徴とする還元型ニコチンア
   ミド補酵素の定量方法。