JPH02276595A

JPH02276595A - 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物

Info

Publication number: JPH02276595A
Application number: JP1098443A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Ueda; 成植田; Shinji Tanno; 眞志丹野; Hideo Misaki; 美崎　英生
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1989-04-18
Filing date: 1989-04-18
Publication date: 1990-11-13
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: EP0393624A2; JP2811319B2; EP0393624A3; US5286627A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は胆汁酸、特に生体試料中の胆汁酸の高感度測定
法に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

血清等の生体試料中の胆汁酸を測定することは、肝機能
検査として、あるいは黄痘、胆石症の成立機序の解明な
どとして重要である。

従来、コール酸、デオキシコール酸やケノデオキシコー
ル酸などを含む胆汁酸の測定法としては種々の方法が報
告されているが、近年臨床検査には、一般に３α−ハイ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ及び１つの補酵素
としてニコチンアデニンジヌクレオチド類（以下ＮＡＤ
類という）又はニコチンアデニンジヌクレオチドホスフ
ェート類（以下ＮＡＩＩＰ類という）を反応させて、胆
汁酸量に比例して生成する還元型ＮＡＤ類（以下Ｎへ旧
１類という）又は還元型ＮＡＤＰ類（以下Ｎへ口門１類
という）を測定する方法（特公昭５９−１３１９７号）
が使用されている。しかしながら、この方法はビリルビ
ンの影響を受は易いために予め胆汁酸の分離が必要であ
る、多量の検体が必要である、また感度が低いという欠
点があった。そのため高感度発色剤を使用する工夫もな
されているが〔第３３回日本臨床病理学会総会抄録、１
２３頁（１９８６）及び第３４回向抄録、１２４頁（１
９８７）　）　、これも本質的な解決とはなっていない
。

また、他の方法として、生成した３−オキソステロイド
を更に３−オキソ−Δ４−ステロイドデヒドロゲナーゼ
の作用により３Δ４−ステロイドとし、ホルマザン色素
を従来の２倍量生成させるキットも市販されているが、
これも感度がたかだか２倍になったにすぎない。

更にまた、胆汁酸の量に比例して生成されるＮＡ口■又
はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　１１を酵素的サイクリング反応を利
用して高感度に測定する方法が報告されている（特公昭
６３−３６７５８号）。しかし、この方法も、ＮＡＡｌ
Ｉ３たはＮＡ口門１を酵素ザイクリング反応によって増
幅させるためには、残存している過剰のＮＡＤ又はＮ＾
叶をアルカリ加温処理によって分解除去しなければなら
ないため操作が煩雑であり、臨床検査のような多検体を
処理する場合には不利なるを免れなかった。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において、本発明者は鋭意研究を行った結果
、次の新しい事実を見出した。

胆汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応に
おいて、一般の微生物由来のステロイドデヒドロゲナー
ゼはＮへ口類を補酵素とするが、ＮＡＤＰ類を補酵素と
しないか又はごくわずかしか働かない。しかし、シュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属するＰｓｅ
ｕｄｏｍｕｎａｓｓｐ、　Ｂ−０８３１（ＦＢＲＭ　ｔ
ｌＰ−２３７６）由来の市１ｋ（７）　３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ〔東洋醋造■製、「酵素
カタ［１グ」、５３頁、カタログＮαＴ−２７３はＮＡ
口類及びＮＡｌ類を共に補酵素とする。

そして、当該ステロイドデヒドロゲナーゼを使用し、Ｎ
ＡＤ類（又はＮへ口Ｐ類）を補酵素として胆汁酸からオ
キソ胆汁酸を生成させる反応系となし、かつ当該補酵素
と異なるＮＡＯＰ類（又はＮ＾口類）を共存させて、胆
汁酸とオキソ胆汁酸の間の可逆的サイクリング反応を行
わせると、ＮＡｌ類（又はＮへ旧’ＩＩ類）の生成量が
時間の経過と共に直線的に増加し、しがもその増加速度
は胆汁酸の量に比例する。

本発明は、斯かる新知見に基いて完成されたもので、胆
汁酸含有被検体に、 ■　ＮＡｌ類又はＮＡＧ類を補酵素とし、少な（とも胆
汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をな
すステロイドデヒドロゲナーゼ、 ■　胆汁酸の量に比較して過剰ｍの八。

■　Ｂ１又は／及びＢ２ ■　胆汁酸及びＡ１に作用せず、Ｂ、→口、の反応を形
成する第２のデヒドロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナ
ーゼの基質、を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（式中、Ａ
、はＮ＾ＯＰ類又はＮへ口類、Ａ２はＡ、の還元型生成
物、Ｂ１は八、がＮＡＤＰ類のときは還元型ＮＡＤ類、
ＡｔがＮＡＯ類のときは還元型ＮＡｌ類、口、は口、の
酸化型生成物、０＊−０，は口、を補酵素として口、を
生成する酵素反応を示す）で表わされるサイクリング反
応を形成せしめ、該反応によって生成されるＡ１の量を
測定することを特徴とする胆汁酸の高感度測定法を提供
するものである。

更に本発明は、この胆汁酸の高感度測定法に使用する次
の成分■〜■ ■　ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ頚を補酵素とし、少なくとも
胆汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応を
なすステロイドデヒドロゲナーゼ、 ■　胆汁酸の量に比較して過剰量のＡ１■　Ｂ、又は／
及びＢ。

■　胆汁酸及びＡ１に作用せず、ロ、→口、の反応を形
成する第２のデヒドロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナ
ーゼの基質、を含有する胆汁酸測定用組成物を提供するものである。

本発明において、ステロイドデヒドロゲナーゼとしては
上記要件を具備するものであれば何れのものでも使用で
きるが、その具体例としては、市販のシュードモナスｓ
ｐ、ロー０８３１（Ｐｓｅｕｄ、ｓｐ、）　、由来の３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（３（ｘ＝
ｌｌＳ口）、７α−１１３口、１２α−１１３口等が挙
げられる。

また、Ａ、及びＢ、で示されるＮＡｕ）類及びＮへ〇類
としては、例えばニコチンアデニンジヌクレオチドホス
フェ−）　（Ｎへ旧］）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）および
ニコチン“ｒミドヒボキサンチンジヌクレオチドホスフ
ェート（テ゛アミノＮＡ叶）　；およびニコチンアデニ
ンジヌクレオチド（Ｎへ〇）、了セチルピリジン°ｒデ
ニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＩＪ　）　Ｊよびニ
コチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デアミノ
ＮＡ口）が挙げられる。この＾、及び８．は異なるもの
であることが必要であり、＾、がＮＡＤＰ頚のときはＢ
１として還元型Ｎへ〇類を、またＡｔがＮ＾口類のとき
は口、として還元型Ｎ＾口Ｐ類妻使用する。

Ａｔの量は被検体中の胆汁酸の里に比較して過剰量であ
ることが必要であり、特に胆汁酸の２０〜１０．０００
倍モルが好ましい。口、の間はＡ１より少ない量である
ことが必要であり、−般にはＡ１の１／１００モル以下
が好ましい。

Ｂ、の代りに８．を用いてもよい。

第２のデヒドロゲナーゼ及びその基質としては、例えば
、ＬがＮＡ３類のときは、アルコールデヒドロゲナーゼ
（［ＥＣ１，１，１，ｌ）とエタノール、グリセロール
デヒドロゲナーゼ（ＢＣ１，１，１，６）　（ロ、Ｃｏ１１由来）とグリ
セロール、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＢＣ１，１，１，８）　（ウサギ筋肉出来）とＬ−グ
リセロール−３−リン酸、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（
ＢＣ１，１，１，３７）　　（ブタ心筋、ウシ心筋由来
）とＬ−リンゴ酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロ
ゲナーゼ（［ＥＣ１，２，１，１２）　　（ウサギ骨格
筋、肝、酵母、［Ｅ、Ｃｏ１１由来）とＤ−グリセロア
ルデヒドリン酸とリン酸、Ｂ、がＮ人口Ｐ類のときは、
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナｉゼ（ＢＣ１，１
，ｌ、　４９）　（酵母由来）とグルコース−６−リン
酸、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｉｃ　１．１．
１．４２）　（酵母、ブタ心筋由来）とイソクエン酸、
グリオキシル酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣ１，２，１，１
７）　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏｘａｌａｔｉｃｕｓ
由来）とＣｏ＾とグリオキシル酸、ホスホグルコン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１゜１、４４）　（ラット肝
、ビール酵母、口、Ｃｏ１１由来）と６−ホスホ−Ｄ−
グルコン酸、グリセロアルデヒドリン酸デヒドロゲナー
ゼ（ｔＩＣ１，２，１゜１３）（植物葉緑体由来）とＤ
−グリセロアルデヒド−３−リン酸とリン酸、ベンズア
ルデヒドテヒドロゲー１−一−ｔ’（ＥＣ１，２，１，
７）（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｓ由来）とベンズアルデヒド等が挙げられる。

本発明の胆汁酸測定用組成物は、各成分の濃度が、八、
は例えＪｆｏ、０５〜１００　ｍＭ、好ましくは２〜３
０ｍＭ５Ｂ＋又は／及びｌ］２１ｊＡ、（Ｄ使用ｌに比
べて１／１００モル以下として適宜使用すればよく、例
えば０．０５〜５００μ舖、好ましくは５〜５０μＭ、
ステロイドデヒドロゲナーゼは例えば０．０５〜１００
　Ｕ／ｒｎｌｌ、好ましくは１〜５０　Ｕ／ｒＩｄｌ、
第２のデヒドロゲナーゼはＢ２に対するＫｍの２０倍以
上になるように調製すればよく、例えば１〜１００　Ｕ
／ｒｎｅ。

またこの第２のデヒドロゲナーゼの基質は０．５〜５０
００μＭ１好ましくは５０〜１０００μＭを用いればよ
く、さらにこれ以上の過剰量を用いてもよい。

また本発明に使用できるステロイドデヒドロゲナーゼに
関しては、例えば補酵素としてＮＡＧ類好ま°しくはＮ
Ａ口、およびＮＡＩＩＰ類好ましくはＮＡＤＰを用いて
、基質となるコール酸などの胆汁酸試薬に対する反応性
を有するものであればよく、これらの補酵素と基質を用
いることにより確認できるものである。市ｌｋのステロ
イドデヒドロゲナーゼ、例えば３ｔＸ）１ｓＤ　　［東
洋醸造■製、［酵素カタログ１．５３頁、カタログＮａ
Ｔ−２７］について、ＮＡｌ１とコール酸による反応の
場合のＫｍ値は各々２．９Ｘ　１０−’Ｍ　、　３Ｘ　
１０−’Ｍであり、またＮＡｌ】とコール酸の場合のに
ｍ値は各々１．ｌｄＸ　Ｉ　０間、６．２　Ｘ　１０−
５Ｍテある。ｔ　タＮへＩ３−ｄ：　タハＮＡＤＰとコ
ール酸による正反応の至適、Ｉ＋はいずれも９．５付近
であり、Ｎ八旧１またはＮ八旧１とオキソコール酸によ
る逆反応の至適ｌ１１１はいずれも５．５付近である性
質を示す。この両反応において、各補酵素に対するＫｍ
値に基づき、両音間の至適ＰＨの間のｐＨ条件を適宜調
整して正反応／逆反応の反応速度比が１に近づくように
ｐｉ＋条件を設定すればよい。また同様に使用できる３
α−８３口としては、例えばラット肝、前立腺曲乗のＢ
Ｃ１，１，１，５０［Ｊ、ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅ
ｍ、、　　８．　４ｌ−４６（１９７７）］’の３ａ−
１１３口が挙げられこれらの酵素は、適宜単独または祝
用してもよい。

さらに正反応／逆反応の反応速度比を１に近づけるため
に、いずれか一方の反応速度が遅い系について、その反
応を行う補助的な試薬系、例えばｐＨ条件の設定により
正反応速度を遅らせた場合には正反応を行う別のステロ
イドデヒドロゲナーゼを添加してもよく、又逆反応速度
が遅い場合にはその逆反応を行う別のステロイドデヒド
ロゲナーゼを添加してもよい。このような別のステロイ
ドデヒドロゲナーゼとしては、Ｎ＾口類又はＮＡＩＩＰ
類のいずれか一方に実質的に補酵素して作用するもので
あって、例えば胆汁酸に対してＮ＾口類又はＮＡＤＰ類
にて正反応を示すか、又はオ：トソ胆汁酸に対してＮＡ
ｌ類又はＮＡｕ）１１類にて逆反応を示すものであれば
よく、公知の酵素リストより適宜選択使用でき、例示す
ればＮＡｌ類に特異的であるバチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）　　［特
開昭５４−１５７８９４号公報〕、シュードモナス・テ
ストステロニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　ｔｅｓｔｏ
ｓｔｅｒｏｎｉ）　　（Ｊ、口、［’、、２２７゜３７
−５２（１９５７）　）由来の３α−１１３口が挙げら
れる。

このようにして調製された本発明の組成物または測定法
により、被検液中の胆汁酸量を測定するに、成分■〜■
を含有する上記試薬に被検液０．００１〜０．５　ｄを
加え、約３７℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間
後の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分
後の１分間または３分後と８分後の５分間にふける生成
された＾２の量をその吸収波長による吸光度により測定
すればよく、例えばＡ、がＮＡ口■、Ｎ＾口ｐＨの場合
は３４０　ｎｍの吸光度による吸光値を求めればよく、
その差から簡便に胆汁酸の量を測定する。またＡ１の爪
の測定においてステロイドデヒドロゲナーゼの量をＩＯ
Ｕ／−以上の濃度として用いることにより１分間当り少
なくとも胆汁酸の量に比べてサイクル数に基づく高感度
にて測定でき、かつ２点間の吸光度を測定するために被
検液のブランク測定を省略でき、レイトアッセイによる
簡便な測定をなし得る。さらに＾２測定に当り、吸光度
測定の代りに、生成された八。

を公知の測定法、例えばジアホラーゼ及びテトラゾリウ
ム塩やレザズリンを使用して測定してもよい。

〔発明の効果〕

叙上の如く、本発明は、酵素的サイクリング反応を組合
せることによって感度を増大することができ、その結果
、少量の検体で迅速かつ正確に被検体中の胆汁酸を測定
することができる。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれによって何ら限定されるものではない。

実施例１く試薬〉４０ｍＭ　　グＩＪ　シン−ＮａＵＩＩ（ｐＨ１０，０
）５ｍＭＮ＾口Ｐ２０μＭ　　　ＮＡＡｌ１、４Ｍ　　エタノール３００／ｍｇ　　アルコールデヒドロゲナーゼ（オリエ
ンタル酵母社製）１００／−３ａ　−ＩＩＳ口（Ｐｓｅｕｄ、　ｓｐ、由
来、東洋醸造社製）０．２　％　　　ト　リ　ト　ンＸ−１００く操作〉上記試薬１ｒｎｌを石英キュベツトにとり、これに２Ｍ
ｍｏｌｅのコール酸を加え、生成されたＮＡＤＰＨにつ
いて３４００ｍにおけるタイムコースを測定した。な右
対照としてコール酸を添加しないものを用いた。

その結果は第１表に示す通りであった。

以下余白その結果少なくとも１０分間の反応における測定結果と
して、３４Ｑｎｍにおける吸光度が直線的に増加した。

このときのサイクリング率（倍率）は次式により算出し
た。

サイクリング率（１７分）＝Ｌ　　　　　　　　　　６．２２　　　　　　　’１ｔ
：反応時間（分） ΔＡｓ：コール酸を添加した反応液の時間しにふける３
　４　ｕ　ｃＩｍＯＪ吸光度変化（ｍＡｂｓ　）へへ、：対照の反応液の時間ｔにおける３ＬＯｎｉの吸
光度変化（ｍＡｂｓ　）６．２２：　ＮＡＤＰＨの３４
０　ｎｍｌ＋−おける分」′・吸光係数（ｃｏ＋　”　
７　ｎｍｏｌｃ）１：反応液全潰（−）２：加えたコール酸の量（ｎｍｏｌｃ　）従って１０分
間反応による感度はコール酸のモル量に比べて約４４倍
と高感度となった。

さらに上記反応液において：ｌα−＋＋ＳＵの量を０〜
２００／艷に変化させ、同様に測定して上記計算式によ
り求めた結果、３　ａ　−１１ｓＬＩの量とサイクリン
グ率（１７分）との関係は第１図に示す通りであった１
、その結果３ｃｒ−８３口の量２０　Ｕ／ｍ１でサイク
リング率は約７回／分となり、また用いる３α−１１３
口の量によりサイクリング率を適宜調製できたものであ
る。

実施例２く試薬〉４０ｍＭ　　グリシン−Ｎａ口ＩＩ（ｐＨｌｏ、０）５
ｍＭＮＡＤＰ２０μＭ　　　ＮＡＡｌ１．４Ｍ　　エタノール３００／−アルコールデヒドロゲナーゼ０．２　％　　
　ト　リ　ト　ンＸ−１００１０１／ｍｇ　　　３　　
ａ　−１１ｓＤく操作〉上記試薬１−を石英キュベツトにとり、０゜０．１．０
，２．０．３．０．４．０．５　ｔｎｌＪのコール酸溶
液ｌＯμｌを添加し、３７℃にて反応を開始させた。反
応開始３分及び４分後の３４０ｎｍにおける吸光度を読
みとり、その差を求めた。

その結果を第２図に示す。第２図から明らかなように、
コール酸量に対する吸光度変化ｍは良好な直線性を示し
た。

実施例３く試薬〉４０ｍＭ　　グリシン−Ｎａ叶（ｐＨｌＯ，Ｏ）５ｍＭ
Ｎ八〇Ｐへ０μＭＮ＾口１１０．２Ｍ　　エタノール０．２　％　　　）　　ＩＪ　　）　　ンＸ−１００４
５１／ｄ　　アルコールデヒドロゲナーゼ２０１１／ｍ
１３　ａ−ＨＳＤく操作〉上記試薬１ｄを石英キュベツトにとり、血清０．２０．
４０．６Ｇ、　８０．１００μｌを添加し、実施例２と
同様に操作した。その結果を第３図に示す。

実施例４実施例２の試薬に１ｍＭになるようにオキザミン酸（Ｌ
口■阻害剤）を添加した。また同様に調製した試薬に、
さらにＰ　ｓ　ｅ　ｕ　ｄ　ｏ　ｍ　ｏ　ｎ　ａ　ｓ・
ｔｅｓｔｓｔａｖｏｎｉ由来の３　ａ−ＩＩｓＤ　ｌ　
ＯＵ／ｒｎｌを追加して調製した。これらの各試薬を石
英キュベツトにとり、以下実施例２と同じ操作を行った
。その結果は第４図のとおりであり、良好な直線性が得
られた。第４図中、−〇−は市販のＰｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｓｐ、Ｂ−０８３１由来の３α−０３口を単独に
て用いた場合を示し、−専一は同３２−）ＩＳＩ）とＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｓｔｅｖｏｎｉ由来の
３α−ＨＳＤとの混合物を用いた場合を示す。

実施例５実施例２の試薬に１ｍ旧こなるようにオキザミン酸を添
加したものを石英キュベツトにとり、プール血清に２５
μ開、５０μ舖及びｌＯＯμ舖になるようにコール酸を
加えた被検体５０μｌを添加し、実施例２と同じ操作を
行った。結果は第２表のとふりであり、回収率は９８．
３〜１０１％であった。

第２表第３表実施例６実施例５と同じプール血清に、グルコース２００ｍｇ／
ｄ１、尿酸１０ｍｇ／ｄ１、ビリルビン２０ｍｇ／ａ又
はアスコルビン酸５　ｍｇ　／　ｄｌｌを添加した被検
体を用い、実施例５と同様に操作した。その結果は′ｇ
Ｊ３表のとおりであり、上記添加物により殆んど影響を
うけなか−」た“。

実施例７実施例２の試薬を用い、実施例２と同様にして、２種類
の血清（５（ｌμりにつき、同時再現性を検討した。そ
の結果を第４表に示す。

第４表実施例８市販の胆汁酸測定試薬（和光純薬工業（株）製、総胆汁酸デストワ：Ｊ−：　Ｎへυ、Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｖｏｎｉ山来３　
ａ　−ＩＩｓＩＩ　。

シアＭＴ−ゼ、ニトロテトラゾリウムブルー含有：血清
中の胆汁酸２００μ！を用い、こｔＮ：ｈｉ酵素ＮＡＤ
　、！＝　３　ａ−１１ｓＤを３７℃テｌ。

分間正確に作用せしめ、生成したＮ＾旧１をジアホラー
ゼを介してニトロデトラゾリウムブルーを還元し、赤紫
色のジホルマザンを生１＆、せしめ、この赤紫色の吸光
度を波長５６０　ｎｍにて測定＜ＢＳ　）　して血清２
００μ！中の総胆汁酸の含量を求め、測定に当り、波長
５６０　ｎｍにおける、検体ブランクの吸光度Ｕｓｅを
求め各吸光度に基づ＜Ｏｓ　　１ｌｓｓの値に相当する
総胆汁酸量を検量線から算出する）と下記の本発明方法
による試薬（血清５０μ！使用）を用い、１７種類の血
清について胆汁酸を測定した。

く本発明方法〉４０ｍＭグリシン−ＮａＯＩＩ（ｐＨｌｏ、ｏ）　、５
ｍＭＮ八〇Ｐへ２０μ絹ＲＡＤＩＩ、０．０１％エタノ
ール、２０　Ｕ　／　ｍｌ　３　ａ−ＩＩＳＤ　（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ。

Ｂ−０８３１由来市販品）、０．２％トリ）ンＸ−１０
０，４５Ｕ／ｄアルコールデヒドロゲナーゼからなる試
薬１−を石英セル内にとり、３７℃、２分間予備加温し
、血清５０μｌを添加し、よく攪拌し、３７℃にて加温
し、血清添加後２分から５分までの３分間の３４ｔｌｎ
ｍにおける吸光度変化を測定した（Δ口、）。

な右検体の代りに水を添加したものを試薬ブランクとし
て（ΔＬ　）　％　標ｔ（Ｉｔ液とし′Ｃ１ＯμＭグリ
ココール酸（和光純薬工業■製、総胆汁酸テストワコー
の試薬に添付されていたものを５倍希釈した）　５０μ
ｌを用いて同様の操作を行った（ΔＥ、ｔ、　）。

本測定における検体中の胆汁酸濃度（μＭ）は下記式にて求めた。

胆汁酸濃度（μＭ）＝その結果、第５表に示す通りであった。

さらにこの第５表に基づき、市販の胆汁酸測定試薬と本
発明方法の試薬との相関関係を求めた結果を第５図に示
すもので、市販の胆汁酸測定試薬においては検体量が２
００μｌと多いに比較して本発明では５０μｌで測定で
き、かつ検体量が少なくても測定における吸光値をみる
と約４倍の値を示しているもので高感度化されたもので
あった。

実施例９く試薬〉１００　ｍＭ　　ＰＩＰＢＳ−Ｎａ０１１（ｐ１１７．
５）５　ｍＭ　　アセチ」しＨＡ口（アセチルピリジン
アデニンジヌクレオチド）５０ｍＭ　　　Ｎへ〇Ｐ０．２ｍＭ　　グルコース−６−リン酸５ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃ１＊　　（塩化マグネシウム）Ｑ、２ｔｌ／ｒｎ！、
　　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（酵母由
来、シグマ社製）２５０／ｍｌ！　　　　３　　ａ　　−Ｈ３口く操作〉上記試薬１ｒｎｌを石英キュベツトにとリコール酸を加
え生成されたアセチルＮ＾旧１に基づく３６ＳＯｍの吸
光度変化より０．２．４．６．８．　Ｉ　Ｏｎｍｏ　ｌ
のコール酸を定量することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明における３α−１１ＳＯＩ、）ｌとサイ
クリング率の関係を示す図面。第２図はコール酸量に対する３４０ｎｍにおけるレイト
アッセイの結果を示す図面。第３図は血清量に対する３４０ｎｍにおけるレイトアッ
セイの結果を示す図面。第４図は血清におけるコール酸の定量結果を示す図面。第５図は本発明の組成物と市販の胆汁酸測定試薬との相
関図を示す図面である。以　　上第図第図血清１（７Ｊｆ）第図コール酸（ｎ　ｍｏｊｅ）第図コール酸（ｎ　ｍｏｊｅ）手続補正書（自発）平成２年５月２日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示平成１年特許願第９８４４３号２、発明の名称胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物３、補正をす
る者事件との関係　　　出願人名称東洋醸造株式会社４、代理人住　所　東京都中央区日本橋人形町１丁目３番６号（〒
１０３）６、　補正の対象明細書の「特許請求の範囲」及び「発明の詳細な説明」
の欄７、　補正の内容（１）明細書の「特許請求の範囲」を別紙の如く訂正す
る。（２）明細書中、第５頁第８行及び第１１頁第４〜５行「ニコチンアデニンジヌクレオチド」とあるを「ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド」と訂正する。（３）　　同第５頁第９〜１０行及び第１０頁第１９行
〜最下行「ニコチンアデニンジヌクレオチドホスフェート」とあ
るを「ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート
」と訂正する。（４）同第６頁第６〜７行「３−Δ４−ステロイド」とあるを「３−オキソーΔ４−ステロイド」と訂正する。（５）同第１３頁第１９行〜最下行「０．５〜５０００μＭ１好ましくは５０〜１０００μ
Ｍ」とあるを「例えば０．０５〜５０ｍＭ、好ましくは０．５〜３０
１１１ＭＪと訂正する。（６）同第１６頁第１４〜１５行「加え、約３７℃の温度にて」とあるを［加え、例えば
ｐｔｔｓ〜１０にて約３７℃の温度で」と訂正する。（７）同第２８頁第２行「血清中の胆汁酸」とあるを「血清」と訂正する。特許請求の範囲１、胆汁酸含有被検体に、 ■　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
ト類（以下Ｎ＾叶類という）及びニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド類（以下ＮＡＧ類という）を補酵素と
し、少なくとも胆汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成
する可逆反応をなすステロイドデヒドロゲナーゼ、 ■　胆汁酸の量に比較して過剰量の＾１■　Ｂ１又は／
及びＢ。 ■　胆汁酸及びＡ１に作用せず、Ｂｓ→Ｂ、の反応を形
成する第２のデヒドロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナ
ーゼの基質、を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式（式中、Ａ
１はＮＡＤＰ類又はＮＡｏ類、Ａ、はＡ、の還元型生成
物、Ｂ１はＡ、がＮＡＤＰ類のときは還元型ＮＡＧ類、
Ａ、がＮＡＧ類のときは還元型ＮＡＤＰ類、Ｂ、はＢ＋
の酸化型生成物、日、−Ｂ、はＢ、を補酵素としてＢ、
を生成する酵素反応を示す）で表わされるサイクリング反応を形成せしめ、該反応に
よって生成されるＡ、の量を測定することを特徴とする
胆汁酸の高感度測定法。２、　　Ｎ＾叶類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンア
デニンジヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ
）およびニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド
ホスフェート（デアミノＮＡ口Ｐ）からなる群より選ば
れるものである請求項１記載の測定法。３、　　ＮＡＧ類が、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＧ）、アセチルピリジンアデニンジヌクレ
オチド（アセチルＮＡＤ）　＃よびニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチド（デアミハＡＤ）からなる群
より選ばれるものである請求項１記載の測定法。４、　ステロイドデヒドロゲナーゼが３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項１８己載の測
定法。５、　ステロイドデヒドロゲナーゼが７α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項１冨己載の測
定法。６、　ステロイドデヒドロゲナーゼが１２α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼである請求項１記載の測
定法。７、　８＋又は／及びＢ、の量が、Ａ、の量の１／　１
００モル以下である請求項１記載の測定法。８、Ａ、の量が、胆汁酸の２０〜１００００倍モルであ
る請求項１記載の測定法。９、　次の成分■〜■ ■　ＮＡ叶類及びＮＡＤ類を補酵素とし、少なくとも胆
汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応をな
すステロイドデヒドロゲナーゼ、■　胆汁酸の量に比較
して過剰量のＡｔ■　８１又は／及び８゜ ■　胆汁酸及びＡ１に作用せず、Ｂ、−Ｂ１の反応を形
成する第２のデヒドロゲナーゼ及び第２のデヒドロゲナ
ーゼの基質、を含有することを特徴とする胆汁酸測定用組成物。

Claims

【特許請求の範囲】１、胆汁酸含有被検体に、（１）ニコチンアデニンジヌクレオチドホスフェート類
（以下ＮＡＤＰ類という）及びニコチンアデニンジヌク
レオチド類（以下ＮＡＤ類という）を補酵素とし、少な
くとも胆汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆
反応をなすステロイドデヒドロゲナーゼ、（２）胆汁酸の量に比較して過剰量のＡ＿１（３）Ｂ＿
１又は／及びＢ＿２（４）胆汁酸及びＡ＿１に作用せず、Ｂ＿２→Ｂ＿１の
反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び第２のデヒ
ドロゲナーゼの基質、を含有する試薬を作用せしめて、次の反応式▲数式、化
学式、表等があります▼ （式中、Ａ＿１はＮＡＤＰ類又はＮＡＤ類、Ａ＿２はＡ
＿１の還元型生成物、Ｂ＿１はＡ＿１がＮＡＤＰ類のと
きは還元型ＮＡＤ類、Ａ＿１がＮＡＤ類のときは還元型
ＮＡＤＰ類、Ｂ＿２はＢ＿１の酸化型生成物、Ｂ＿２→
Ｂ＿１はＢ＿２を補酵素としてＢ＿１を生成する酵素反
応を示す）で表わされるサイクリング反応を形成せしめ、該反応に
よって生成されるＡ＿２の量を測定することを特徴とす
る胆汁酸の高感度測定法。２、ＮＡＤＰ類が、ニコチンアデニンジヌクレオチドホ
スフェート（ＮＡＤＰ）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチドホスフェート（アセチルＮＡＤＰ）および
ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドホスフェ
ート（デアミノＮＡＤＰ）からなる群より選ばれるもの
である請求項１記載の測定法。３、ＮＡＤ類が、ニコチンアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセ
チルＮＡＤ）およびニコチンアミドヒポキサンチンジヌ
クレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる群より選ばれる
ものである請求項１記載の測定法。４、ステロイドデヒドロゲナーゼが３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼである請求項１記載の測定法
。５、ステロイドデヒドロゲナーゼが７α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼである請求項１記載の測定法
。６、ステロイドデヒドロゲナーゼが１２α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼである請求項１記載の測定
法。７、Ｂ＿１又は／及びＢ＿２の量が、Ａ＿１の量の１／
１００モル以下である請求項１記載の測定法。８、Ａ＿１の量が、胆汁酸の２０〜１００００倍モルで
ある請求項１記載の測定法。９、次の成分（１）〜（４）（１）ＮＡＤＰ類及びＮＡＤ類を補酵素とし、少なくと
も胆汁酸を基質としてオキソ胆汁酸を生成する可逆反応
をなすステロイドデヒドロゲナーゼ、（２）胆汁酸の量に比較して過剰量のＡ＿１（３）Ｂ＿
１又は／及びＢ＿２、（４）胆汁酸及びＡ＿１に作用せず、Ｂ＿２→Ｂ＿１の
反応を形成する第２のデヒドロゲナーゼ及び第２のデヒ
ドロゲナーゼの基質、を含有することを特徴とする胆汁酸測定用組成物。