JPH0676431B2

JPH0676431B2 - 糖エステル誘導体および加水分解酵素活性測定用試薬

Info

Publication number: JPH0676431B2
Application number: JP63150527A
Authority: JP
Inventors: 利夫栗原; 俊幸西尾; 久夫山本; 稔上村; 真一手嶋; 恒男羽生; 重典愛水
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd; Toyobo Co Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd; Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-06-17
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1994-09-28
Anticipated expiration: 2009-09-28
Also published as: EP0346912B1; EP0346912A3; US6162614A; DE68928496D1; JPH01319493A; EP0346912A2; DE68928496T2

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は新規な糖エステル誘導体およびこれを基質とす
るリパーゼまたはエステラーゼの活性測定用試薬に関す
る。

〔従来技術〕

血清、尿、膵液などの体液に含有されるリパーゼ、エス
テラーゼの活性を測定することにより、膵疾患など各種
疾患の診断が行われている。

リパーゼの活性測定法には、たとえば、まずオリーブ油
を基質とする方法がある。この方法には試料とオリーブ
油とを接触させ、遊離する脂肪酸をアルカリ滴定する測
定法と、オリーブ油エマルジョンの温度変化を指標とす
る測定法がある。これらの方法はオリーブ油の原料変動
やエマルジョン調整法の違いで測定値に差が生じたり、
再現性が悪くなる等の問題点がある次にα−ナフチルパルミテイトを基質としたリパーゼ活
性測定法は、基質が難溶解性のため、酵素活性測定に充
分な基質量添加が不可能であったり、基質液の調製法の
違いで測定値に差が生じたり、再現性が悪くなるなどの
問題がある。

また、合成チオエステル2,3−ジメルカプトプロパン−
１−オルトリブチレイト（BALB）を基質としたリパー
ゼ活性測定法は再現性、精度が比較的よく、広く利用さ
れている方法であるが、基質の脂肪酸エステルが短鎖で
あり、リパーゼだけでなくエステラーゼによく加水分解
され、基質の特異性に問題がある。さらに反応停止液を
必要とし、操作の煩雑さや酵素活性測定に最も適当とさ
れている速度分析（レートアッセイ）法を適用すること
ができないといった問題点を有している。

一方、エステラーゼ活性測定法においても、基質の難溶
解性のため、酵素活性測定に充分な基質量添加が不可能
であったり、基質液の調製法の違いで測定値に差が生じ
たり、再現性が悪くなる問題がある。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記従来の基質の有する問題点を解消しようと
するものであり、その第１の目的は、原料変動がなく、
明確な構造を有し、溶解性にも優れた基質として有用な
化合物を提供することであり、第２の目的は再現性、精
度においても優れ、簡便な操作で、速度分析（レートア
ッセイ）法による測定が可能なリパーゼおよびエステラ
ーゼ活性測定用の試薬を提供することである。

〔課題を解決するための手段および作用〕

本発明は、下記(1)および(2)に関するものである。

(1) 一般式（Ｉ）Ｇ〜Ｏ−R₃ （Ｉ）〔式中、Ｇは式（Ａ）または式（Ｂ）で示される基を示す（但し、R₁およびR₂の少なくとも一
方は炭素数１〜30の飽和または不飽和脂肪酸エステル残
基を示し、残された基は水素原子またはアセチル基を示
す。） R₃は式（Ｃ）で表わされる基を示す（但し、Ｘはハロゲン原子を示
し、ｍは０〜４の整数を示し、Ｙは水酸基、アルコキシ
基、カルボキシル基またはスルホン酸基を示し、ｎは０
または１を示し、Ｚはニトロ基またはニトロビニル基を
示す。）で表わされる糖エステル誘導体〔以下、糖エステル誘導
体（Ｉ）という〕。

(2) 基質として前記糖エステル誘導体（Ｉ）を含有す
ることを特徴とするリパーゼまたはエステラーゼ活性測
定用試薬。

即ち、本発明は、非還元性末端グルコースの４位および
／または６位のヒドロキシル基が修飾された置換または
未置換の４−ニトロフェニル−または４−（ニトロビニ
ル）フェニル−α−（またはβ−）グルコシドまたはマ
ルトシドである糖エステル誘導体（Ｉ）、ならびに当該
糖エステル誘導体（Ｉ）を基質として含有してなる試薬
である。

本発明の糖エステル誘導体（Ｉ）の骨格となる糖は、１
〜２個のグルコース単位〔式（Ａ）および式（Ｂ）参
照〕から形成されるグルコースまたはマルトースであ
る。

グルコシドまたはマルトシドの非還元性末端グルコース
の置換基であるR₁およびR₂は同一の基であっても異なる
基であってもよい。R₁またはR₂のいずれかが炭素数５以
上の脂肪酸エステル残基の場合はリパーゼ活性測定の基
質として、R₁およびR₂が共に炭素数５以下の脂肪酸エス
テル残基の場合はエステラーゼ活性測定の基質として用
いることが好ましい。

R₁およびR₂に関して、脂肪酸エステル残基は飽和、不飽
和のいずれでもよく、また直鎖状、分岐鎖状のいずれで
もよい。

このような脂肪酸エステル残基によって形成される脂肪
酸エステルとしてはステアロール酸エステル、アラキド
ン酸エステル、リノレン酸エステル、リノール酸エステ
ル、ソルビン酸エステル、ブラシジン酸エステル、エル
カ酸エステル、セトレイン酸エステル、エライジン酸エ
ステル、オレイン酸エステル、ウンデシレン酸エステ
ル、ヘプタコ酸エステル、ペンタコサン酸エステル、セ
ロチン酸エステル、リグノセリン酸エステル、ベヘン酸
エステル、アラキン酸エステル、ノナデカン酸エステ
ル、ステアリン酸エステル、ヘプタデシル酸エステル、
パルミチン酸エステル、ペンタデシル酸エステル、ミリ
スチン酸エステル、トリデシル酸エステル、ラウリル酸
エステル、ウンデシル酸エステル、カプリン酸エステ
ル、ペラルゴン酸エステル、カプリル酸エステル、エナ
ント酸エステル、カプロン酸エステル、吉草酸エステ
ル、酪酸エステル、プロピオン酸エステル、酢酸エステ
ル、ギ酸エステル、イソクロトン酸エステル、クロトン
酸エステル、アクリル酸エステルなどが例示される。

修飾マルトシドのアグリコンに相当するR₃は前記式
（Ｃ）で表わされる基である。

式（Ｃ）におけるＸに関してハロゲン原子としてはフッ
素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子であり、ｍは
０〜４の整数、好ましくはフッ素原子または塩素原子で
ある式（Ｃ）におけるＹは水酸基、アルコキシ基、カルボキ
シル基またはスルホン酸基を示し、ｎは０または１であ
る。

Ｙに関して、アルコキシ基は直鎖状、分岐状のいずれで
もよく、好ましくは炭素数１〜４の低級アルコキシ基で
あり、具体的にはメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキ
シ、iso−プロポキシ、ｎ−ブトキシ等が例示される。

R₃は還元性末端のグルコースの１位のOH基にα型で結合
していてもよく、β型で結合していてもよい。

式（Ｃ）で表わされる式を有するフェニル基は、換言す
れば置換または未置換の４−ニトロフェノールまたは４
−（ニトロビニル）フェノール残基であり、かかる基を
形成しうるフェノール類としては、たとえば４−ニトロ
フェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２−
フルオロ−４−ニトロフェノール、２−ブロモ−４−ニ
トロフェノール、２−ヨード−４−ニトロフェノール、
2,6−ジクロロ−４−ニトロフェノール、2,6−ジフルオ
ロ−４−ニトロフェノール、2,6−ジブロモ−４−ニト
ロフェノール、2,6−ジヨード−４−ニトロフェノー
ル、2,3−ジフルオロ−４−ニトロフェノール、2,5−ジ
フルオロ−４−ニトロフェノール、2,3,6−トリフルオ
ロ−４−ニトロフェノール、４−（２′−ニトロビニ
ル）フェノール、２−メトキシ−４−（２′−ニトロビ
ニル）フェノール、２−ヒドロキシ−４−（２′−ニト
ロビニル）フェノール、２−フルオロ−４−（２′−ニ
トロビニル）フェノール、２−クロロ−４−（２′−ニ
トロビニル）フェノール、２−ブロモ−４−（２′−ニ
トロビニル）フェノール、２−ヨード−４−（２′−ニ
トロビニル）フェノール、2,6−ジフルオロ−４−
（２′−ニトロビニル）フェノール、2,6−ジクロロ−
４−（２′−ニトロビニル）フェノール、2,6−ジブロ
モ−４−（２′−ニトロビニル）フェノール、2,6−ジ
ヨード−４−（２′−ニトロビニル）フェノールなどが
好適なものとして例示される。

上記、糖エステル誘導体（Ｉ）、即ち修飾置換または未
置換の４−ニトロフェニル−または４−（ニトロビニ
ル）フェニル−α−（またはβ−）グルコシドまたはマ
ルトシドは新規化合物である。このような化合物として
は、たとえば次の化合物が好適なものとして例示され
る。

以下に列挙する化合物に於ける〔〕内は略称である。

(1) ２−フルオロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−オ
レオイル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔オレオイル２
−フルオロ−４−ニトロフェニル−β−グルコピラノシ
ド〕 (2) ４−ニトロフェニル６−Ｏ−パルミトイル−α
−Ｄ−グルコピラノシド〔パルミトイル４−ニトロフ
ェニル−α−グルコピラノシド〕 (3) ４−ニトロフェニル４−Ｏ−アセチル−６−Ｏ
−リノロイル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−α−Ｄ−グルコピラノシド〔４−アセチル−６−
リノロイル−４−ニトロフェニル−α−マルトシド〕 (4) 2,3−ジフルオロ−４−ニトロフェニル−６−Ｏ−
ラウロイル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→
４）−β−Ｄ−グルコピラノシド〔６−ラウロイル 2,
3−ジフルオロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシ
ド〕 (5) ２−メトキシ−４−（２′−ニトロビニル）フェ
ニル６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド
〔アセチル２−メトキシ−４−（ニトロビニル）フェ
ニル−β−グルコピラノシド〕 (6) ４−ニトロフェニル 4,6−Ｏ−ジアセチル−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グル
コピラノシド〔ジアセチル４−ニトロフェニル−α−
マルトシド〕 (7) ２−クロロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−アセ
チル−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド〔アセチル２−
クロロ−４−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド〕 (8) ４−ニトロフェニル６−Ｏ−ペンタノイル−Ｏ
−α−Ｄ−グルコピラノシド〔ペンタノイル４−ニトロ
フェニル−α−グルコピラノシド〕 (9) ４−ニトロフェニル 4,6−Ｏ−ジペンタノイル−
Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド〔ジペンタノイル４−
ニトロフェニル−α−グルコピラノシド〕 (10) ２−フルオロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−ブ
チロイル−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド〔ブチロイル
２−フルオロ−４−ニトロフェニル−β−グルコピラ
ノシド〕本発明の糖エステル誘導体（Ｉ）は、たとえばグルコー
スまたはマルトースの還元性末端にαあるいはβ型に上
記フェノール類（アグリコン）を自体既知の方法でＯ−
グリコシド結合させ、さらに非還元性末端グルコースの
６位および／または４位の水酸基のみをR₁およびR₂に対
応する脂肪酸またはその反応性誘導体にて自体既知の方
法でエステル化させることにより製造される。

ここに、上記フェノール類（アグリコン）をα型に結合
させる方法は、通常、Helferich法〔Methods in Carboh
ydrate Chemistry, Vol. II,p.345 （1963）あるいは、
Bull. Chem. Soc. Jpn.,54, 1985（1981）〕に記載の方
法またはこれに準ずる方法にて行われる。また、β型に
結合させる方法は、ポリアシルグリコシルハライド法
〔Angew.Chem., 86, 173 （1974）参照〕等に記載の方
法またはこれに準じる方法によって行われる。

糖水酸基（非還元性末端グルコースの６位および／また
は４位の水酸基）と前記脂肪酸またはその反応性誘導体
とのエステル化反応としては、通常化学合成法、酵素に
よる合成法が採用されるが、酵素法による選択的な合成
法を用いることが好ましい。その際、好ましくはリパー
ゼが使用される。当該反応に用いられるリパーゼとして
は、糖水酸基と上記脂肪酸によってモノエステルを生成
させる酵素なら如何なるものでもよく、具体的にはシュ
ードモナス（Pseudomonas）属、クロモバクテリウム属
（Chromobacterium）属に属する微生物由来のリパーゼ
が挙げられる。さらに詳しくはシュードモナス・フルオ
レスセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモ
ナス・フラギ（Pseudomonas fragi）、クロモバクテリ
ウム・ビスコスム（Chromobacterium viscosum）などに
由来するリパーゼが挙げられる。これらリパーゼの市販
品としては、リパーゼＰ（天野製薬社製）、リパーゼＢ
（サッポロビール社製）、リパーゼLP（東洋醸造製）な
どがあり、通常これら市販品が使用される。酵素反応
は、通常20〜30℃で行い、反応系に酵素が適当に分散す
るように振盪あるいは撹拌しながら行うのが好ましい。
反応終了後、酵素は濾過することにより除いて再使用す
ることができる。反応溶媒は水性溶媒よりも有機溶媒が
好ましく、乾燥状態の有機溶媒であれば如何なるもので
もよいが、好適には、たとえばアセトン、ジオキサン、
ジエチルエーテル、ピリジン、ヘキサンなどが使用され
る。有機溶媒中での酵素によるエステル化反応は従来多
く知られているが〔たとえば、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 82,3192 （1985）〕、本発明には脂肪酸エス
テルを用いるエステル交換反応を採用することが好まし
い。脂肪酸エステルとしては疎水性の高いエステルが好
ましく、具体的にはビニルエステル、フェニルエステ
ル、トリブチリンエステルあるいはトリクロロエチルエ
ステル等が挙げられる。

4,6位ジエステル体の製造は次のようにして行われる。
即ち、還元性末端を修飾した糖誘導体の非還元性末端の
グルコースの4,6位のみをアセタール化し、他の水酸基
をアシル基以外の保護基で保護し、末端のアセタールを
除くと、一級水酸基である６位と二級水酸基である４位
のジヒドロキシ体を製造することができる。６位の一級
水酸基を上記酵素法によりモノエステル体とした後、化
学合成法により４位をエステル化し、保護基を除くと、
4,6位ジエステル体が製造できる。末端アセタール化
は、たとえばベンズアルデヒド、アセトン等をルイス酸
存在下、反応させることにより、ベンジリデン、イソプ
ロピリデンを4,6位に結合させたアセタール化合物を経
由するものである。アシル基以外の保護基としては、た
とえば、ベンジルエーテル、アリルエーテル、メトキシ
メチルエーテルおよびｐ−ブロモフェナシルエーテル等
が例示される。

本発明の試薬は、前述した通り、基質としての糖エステ
ル誘導体（Ｉ）をα−グルコシダーゼ、グルコアミラー
ゼおよび／またはβ−グルコシダーゼの共存下でリパー
ゼまたはエステラーゼ含有試料を作用させ、遊離するフ
ェノール系化合物を測定することによってリパーゼ、エ
ステラーゼの活性を測定するものである。

従って、本発明の試薬は上記糖エステル誘導体（Ｉ）を
基質として含有するものであり、通常さらにα−グルコ
シダーゼ、グルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼ
を適宜組み合わせた酵素系（追随酵素系）、および必要
に応じてその他の添加剤を含有するものである。

当該測定に用いられるα−グルコシダーゼ、β−グルコ
シダーゼおよびグルコアミラーゼの起源は特に限定され
ない。

たとえば、酵母起源のα−グルコシダーゼ、アーモンド
から得られるβ−グルコシダーゼやリゾプスデレマーか
ら得られるグルコアミラーゼが好適に利用されうる。

なお、たとえば、アグリコンがα型に結合した基質（α
型基質）を用いる場合には、追随酵素系としてはα−グ
ルコシダーゼ単独、またはα−グルコシダーゼ、グルコ
アミラーゼが使用される。アグリコンがβ型に結合した
基質（β型基質）を用いる場合には、追随酵素系として
は、β−グルコシダーゼ単独、またはα−グルコシダー
ゼおよびβ−グルコシダーゼまたはα−グルコシダー
ゼ、グルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼが使用
される。

アグリコンがα型に結合した糖エステル誘導体とアグリ
コンがβ型に結合した糖エステル誘導体との混合物は基
質として使用されうる。

本発明の試薬には、リパーゼおよびエステラーゼの活性
化剤および安定化剤としてコリパーゼ、コール酸塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩等を配合することが好まし
い。

他に、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤等を添加してもよ
い。

なお、リパーゼの測定時にはエステラーゼ阻害剤を、ま
たエステラーゼ測定時にはリパーゼ阻害剤を加えてもよ
い。

本発明の試薬を使用するリパーゼおよびエステラーゼの
活性測定における基質の反応式を４−アセチル−６−リ
ノロイル４−ニトロフェニル−α（またはβ）−マル
トシドを例に挙げて説明する。

(1) ４−アセチル−６−リノロイル４−ニトロフェ
ニル−α−マルトシドを基質とする場合： (2) ４−アセチル−６−リノロイル４−ニトロフェ
ニル−β−マルトシドを基質とする場合：上記反応にて遊離したフェノール系化合物（上記例にお
いては４−ニトロフェノール）を適当な手段により測定
することにより、リパーゼの活性を測定することができ
る。遊離するフェノール系化合物が基質とは異なるスペ
クトル吸収を示す場合には、反応混合物のスペクトルを
直接測定する。基質から遊離したフェノール系化合物が
基質とほぼ同じスペクトル吸収を示す場合には、該フェ
ノール化合物を呈色試薬、たとえば４−アミノアンチピ
リンなどの色原体と過酸化水素とをペルオキシダーゼの
存在下に酸化縮合させ、その発色強度を測定する。

本発明は基質〔糖エステル誘導体（Ｉ）〕と追随酵素を
分離した二液とした試薬および基質と追随酵素を一液化
した試薬としても利用される。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例をもってより具体的に説明する。

実施例１２−フルオロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−オレオイ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成： (1) テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシ
ルブロマイド〔M. Barczai-Martos, Nature, 165, 369
（1950）〕7.66g（18.6ミリモル）、２−フルオロ−
４−ニトロフェノール2.69g（17.12ミリモル）及びトリ
エチルベンジルアンモニウムブロマイド1.8gをクロロホ
ルム60mlに溶解し、激しく撹拌させながら60℃の油浴中
で２規定−水酸化ナトリウム水溶液8.5ml（17ミリモ
ル）を滴下させ、そのまま３時間反応させた。放冷後、
水80mlを加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を乾
燥、濃縮すると6.5gの黄赤色オイルが得られ、メタノー
ル１mlを加えると針状結晶が析出した。さらにエーテル
−メタノール（1:1）混合溶媒で再結晶化すると、白色
針状結晶である２−フルオロ−４−ニトロフェニル−2,
3,4,6−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シドが5.0g得られた。収率60％ (2) 上記生成物3.6g（7.38ミリモル）を無水メタノー
ル80mlに懸濁し、室温で撹拌しながら0.5規定ナトリウ
ムメトキサイド−メタノール溶液4.0ml（2.0ミリモル）
を滴下した。15分間撹拌後、得られた淡黄色溶液に陽イ
オン交換樹脂であるアンバーリスト15（H⁺型）４mlを
加え30分間室温で撹拌した。該交換樹脂を濾過し、メタ
ノールで洗浄し、濾液と洗液を減圧濃縮すると、白色結
晶が得られた。さらに、エタノールにて再結晶を行うこ
とにより白色針状結晶の２−フルオロ−４−ニトロフェ
ニル−β−Ｄ−グルコピラノシド2.28gが得られた。収
率97％ (3) 上記生成物0.32g（１ミリモル）、オレイン酸フェ
ニルエステル1.075g（３ミリモル）およびリパーゼＢ
（サッポロビール株式会社製）30mgをアセトン40mlに懸
濁させ25℃の振盪機にて一日反応させた。

酵素を濾別後、濃縮すると白色蝋状の粗生成物が得ら
れ、これをシリカゲル（メルク社製）カラムクロマトグ
ラフィー（５％メタノール−ジクロメタン）で精製する
と、0.52gの２−フルオロ−４−ニトロフェニル６−
Ｏ−オレオイル−β−Ｄ−グルコピラノシドが得られ
た。収率79％この化合物の理化学的性質を以下に示す。

〔α▲〕²⁴ _Ｄ▼＝−64.9゜（メタノール、ｃ＝0.13） UV＝λ_max 295nm（メタノール）実施例２４−ニトロフェニル６−Ｏ−パルミトイル−α−Ｄ−
グルコピラノシドの合成：市販品である４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラ
ノシド（東京化成工業製）0.3g（１ミリモル）、パルミ
チン酸ビニル0.85g（３ミリモル）およびリパーゼB30mg
をアセトン40mlに懸濁させ、25℃の振盪機にて一日反応
させた。酵素を濾別後、溶媒を濃縮すると白色蝋状の粗
生成物が得られ、これをシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー（５％メタノール−ジクロロメタン）で精製する
と、0.458gの白色蝋状の４−ニトロフェニル６−Ｏ−
パルミトイル−α−Ｄ−グルコピラノシドが得られた。
収率81％この化合物の理化学的性質を以下に示す。

〔α▲〕²⁴ _Ｄ▼＝＋109.1゜（メタノール、ｃ＝0.10） UV＝λ_max 295nm（メタノール）実施例３４−ニトロフェニル４−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−リノ
ロイル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
α−Ｄ−グルコピラノシドの合成： (1) 市販品であるｐ−ニトロフェニル−α−マルトシ
ド0.1g（0.2ミリモル）、（ジメトキシメチル）ベンゼ
ン0.1g（0.65ミリモル）、ジメチルホルムアミド10ml及
びｐ−トルエンスルホン酸−水和物10mgをフラスコに入
れ、ロータリーエバポレーターに取りつけ、60℃の水浴
上で減圧下回転させた。１時間後、減圧下水浴を 100℃
に上げDMFを留去した。得られた粗生成物に炭酸水素ナ
トリウムの水溶液を10ml加え、淡黄色の不溶物（対応す
る4,6−Ｏ−ベンジリデン誘導体）を濾別した。96mg、
収率83％ (2) 上記生成物90mg、メトキシメチルクロライド200m
g、ジイソプロピルエチルアミン10mgをベンゼン30mlに
溶解させ室温６時間撹拌させた。溶媒を濃縮後、粗生成
物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。
得られた精製物をメタノール中、５％パラジウム−カー
ボン触媒下、水添し、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーで生成物を精製すると、対応する4,6−ジヒドロキ
シ体が101mg（無色オイル）得られた。

(3) 上記生成物90mgを実施例１(3)に準じてリパーゼＢ
により対応する６−Ｏ−リノロイル誘導体とした。得ら
れた粗生成物をピリジン−無水酢酸（２ml）に溶解させ
室温で一晩反応させた。得られた粗生成物は溶媒を除い
た後、酢酸５mlに溶解させ、０℃、濃硫酸一滴加え、５
分間撹拌した。中和後濃縮し、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（８％メタノール−ジクロロメタン）で精
製すると、白色蝋状の４−ニトロフェニル４−Ｏ−ア
セチル−６−Ｏ−リノロイル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシドが25mg
得られた。

この化合物の理化学的性質を以下に示す。

〔α▲〕²⁴ _Ｄ▼＝＋61゜（メタノール、ｃ＝0.09） UV:λ_max 295nm（メタノール）実施例４ 2,3−ジフルオロ−４−ニトロフェニル６−Ｏ−ラウ
ロイル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−
β−Ｄ−グルコピラノシドの合成： (1) 実施例１(1)に準じ、マルトシドブロマイド5.0g
（7.1ミリモル）、2,3−ジフルオロ−４−ニトロフェノ
ール2.3g（14ミリモル）、トリエチルベンジルアンモニ
ウムクロライド1.5gをジクロロメタン50mlに溶解し、40
℃の油浴上で激しく撹拌しながら２規定水酸化ナトリウ
ム水溶液3.8ml（7.6ミリモル）を滴下し、５時間反応さ
せた。水100mlを加え、ジクロロメタンで抽出し、有機
層を乾燥、濃縮すると赤褐色オイルが得られた。これを
シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、さら
に、エタノールにて再結晶すると、白色結晶として、2,
3−ジフルオロ−４−ニトロフェニル−Ｏ−パーアセチ
ル−β−マルトシドが3.3g得られた。収率60％ (2) 上記生成物3.0g（3.8ミリモル）を無水メタノール
80mlに懸濁し、室温で撹拌しながら、0.5規定ナトリウ
ムメトキサイド−メタノール溶液3.0ml（1.5ミリモル）
滴下した。15分間撹拌後、淡黄色溶液に陽イオン交換樹
脂であるアンバーリスト15（H⁺型）４mlを加えて、30
分間撹拌した。該交換樹脂を濾過し、メタノールで洗浄
し、濾液と洗液を減圧濃縮すると白色結晶が得られた。
さらにエタノールで再結晶を行うと白色の2,3−ジフル
オロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシドが2.1g得ら
れた。収率90％ (3) 上記生成物0.46g（１ミリモル）、ラウリル酸ビニ
ル0.68g（３ミリモル）およびリパーゼB30mlをジオキサ
ン40mlに懸濁させ、25℃の振盪機にて一日反応させた。
酵素を濾別後、溶媒を濃縮すると、白色蝋状の粗生成物
が得られ、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で精製すると、0.35gの2,3−ジフルオロ−４−ニトロフ
ェニル６−Ｏ−ラウロイル−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラ
ノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシドが得ら
れた。収率50％この化合物の理化学的性質を以下に示す。

〔α▲〕²⁴ _Ｄ▼＝−69.0゜（メタノール、ｃ＝0.10） UV:λ_max 298nm（メタノール）実施例５下記組成の試薬を調製した。

試薬組成A: 50mMグッドバッファー（pH8.5）コール酸ナトリウム 0.1％ β−グルコシダーゼ 100U/ml オレオイル２−フルオロ−４−ニトロフェニル−β−
グルコピラノシド 1mM 試薬組成B: 50mMグッドバッファー（pH8.5）コール酸ナトリウム 0.1％ α−グルコシダーゼ 50U/ml パルミトイル４−ニトロフェニル−α−グルコピラノ
シド 1mM 試薬組成C: 50mMグッドバッファー（pH8.5）コール酸ナトリウム 0.1％ α−グルコシダーゼ 100U/ml ４−アセチル−６−リノロイル４−ニトロフェニル−
α−マルトシド 1mM 試薬組成D: 50mMグッドバッファー（pH8.5）コール酸ナトリウム 0.1％ α−グルコシダーゼ 100U/ml グルコアミラーゼ 10U/ml β−グルコシダーゼ 50U/ml ６−ラウロイル 2,3−ジフルオロ−４−ニトロフェニ
ル−β−マルトシド 1mM これらの試薬を用い、リパーゼ活性を測定した。上記試
薬３mlを 1）膵リパーゼ試薬と 2）血清試料100μｌに
添加し、37℃にて４〜５分間放置した後、400nmにおけ
る吸光度の変化を測定し、１分間あたりの吸光度の変化
（リパーゼ活性の指標となる）を算出した。試薬ブラン
ク値の経時変化および１分間あたりの吸光度の変化を第
１表に示す（ブランクは試料の代わりに水を用いた）。

本発明の試薬Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄはブランク変化も小さく、
試料中のリパーゼ活性測定に十分な測定感度を有してい
る。

実施例６２−メトキシ−４−（２′−ニトロビニル）フェニル
６−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの合成： (1) 実施例１に準じ、テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ
−グルコシルブロマイド2.0g（4.8ミリモル）、Ｏ−バ
ニリン0.9g（5.9ミリモル）及びトリエチルベンジルア
ンモニウムブロマイド0.5gをクロロホルム25mlに溶解
し、激しく撹拌しながら室温にて１規定水酸化ナトリウ
ム水溶液５ml（５ミリモル）を滴下させ、一晩反応させ
た。水50mlを加え、ジクロロメタンで抽出し、有機層を
乾燥、濃縮すると淡黄色のオイルが得られ、放置すると
結晶化した。さらにアセトン−水溶液で再結晶すると、
白色結晶として、２−メトキシ−４−ホルミルフェニル
−2,3,4,6−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシドが1.4g得られた。収率60％ (2) 上記生成物0.96g（２ミリモル）をメタノール50ml
に懸濁させ、室温で撹拌しながら0.5規定ナトリウムメ
トキサイド−メタノール溶液１ml（0.5ミリモル）滴下
した。15分後、アンバーリスト15（H⁺型）２mlを加
え、30分間反応させた。該交換樹脂を濾過し、メタノー
ルで洗浄し、濾液と洗液を減圧濃縮すると白色結晶が得
られた。0.58g、収率92％ (3) 上記生成物0.31g（１ミリモル）を無水エタノール
10mlに懸濁させ、ニトロメタン1.2ml、酢酸0.2ml、酢酸
アンモニウム0.2gを加え、30分間加熱還流させた。放冷
後、淡黄色結晶が析出し、0.3g（収率85％）の２−メト
キシ−４−（２′−ニトロビニル）フェニル−β−Ｄ−
グルコピラノシドが得られた。

(4) 上記生成物0.34g（１ミリモル）、ビニル酢酸0.34
g（４ミリモル）及びリパーゼB30mgをアセトン40mlに懸
濁させ、25℃の振盪機にて一日反応させた。酵素を濾別
し、濃縮し、エタノールで結晶させると淡黄色の２−メ
トキシ−４−（２′−ニトロビニル）フェニル６−Ｏ
−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが200mg得られ
た。収率52％この化合物の理化学的性質を以下に示す。

実施例７下記組成の試薬を調製した。

試薬組成A: 50mMグッドバッファー（pH8.0）コール酸ナトリウム 0.1％ β−グルコシダーゼ 100U/ml アセチル２−メトキシ−４−（ニトロビニル）フェニ
ル−β−グルコピラノシド 1mM 試薬組成B: 50mMグッドバッファー（pH8.0）コール酸ナトリウム 0.1％ α−グルコシダーゼ 100U/ml ジアセチル４−ニトロフェニル−α−マルトシド 1mM 試薬組成Ｃ 50mMグッドバッファー（pH8.0）コール酸ナトリウム 0.1％ β−グルコシダーゼ 100U/ml アセチル２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−グル
コピラノシド 1mM 試薬組成Ｄ 50mMグッドバッファー（pH8.0）コール酸ナトリウム 0.1％ β−グルコシダーゼ 100U/ml ペンタノイル４−ニトロフェニル−α−グルコピラノ
シド 1mM 試薬組成Ｅ 50mMグッドバッファー（pH8.0）コール酸ナトリウム 0.1％ α−グルコシダーゼ 100U/ml ジペンタノイル４−ニトロフェニル−α−グルコピラ
ノシド 1mM 試薬組成Ｆ 50mMグッドバッファー（pH8.0）コール酸ナトリウム 0.1％ β−グルコシダーゼ 100U/ml ブチロイル２−フルオロ−４−ニトロフェニル−β−
グルコピラノシド 1mM これらの試薬を用い、エステラーゼ活性を測定した。上
記試薬３mlを 1）カルボキシエステラーゼ試料と 2）血
清試料100μｌに添加し、37℃にて４〜５分間放置した
後、400nmにおける吸光度の変化を測定し、１分間あた
りの吸光度の変化（エステラーゼ活性の指標となる）を
算出した。試薬ブランク値の経時変化および１分間あた
りの吸光度の変化を第２表に示す（ブランクは試料の代
わりに水を用いた）。

本発明の試薬Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆはブランク変化も
小さく、試料中のエステラーゼ活性測定に十分な測定感
度を有している。

〔効果〕

本発明の基質は、式（Ｉ）におけるR₁および／またはR₂
が特定の脂肪酸エステル残基であるから、構造が明確
で、原料変動が少なく、水溶性に優れているという効果
を有する。

本発明の試薬による測定は自動分析機を用いての連続測
定も可能であり、簡便かつ安価にリパーゼ、エステラー
ゼ活性の測定がなされうる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山本久夫静岡県焼津市岡当目10 サッポロビール株式会社応用開発研究所内 (72)発明者上村稔静岡県焼津市岡当目10 サッポロビール株式会社応用開発研究所内 (72)発明者手嶋真一福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀酵素工場内 (72)発明者羽生恒男福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀酵素工場内 (72)発明者愛水重典福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀酵素工場内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）Ｇ〜Ｏ−R₃ （Ｉ）〔式中、Ｇは式（Ａ）または式（Ｂ）で示される基を示す（但し、R₁およびR₂の少なくとも一
方は炭素数１〜30の飽和または不飽和脂肪酸エステル残
基を示し、残された基は水素原子またはアセチル基を示
す。）、R₃は式（Ｃ）で示される基を示す（但し、Ｘはハロゲン原子を示し、
ｍは０〜４の整数を示し、Ｙは水酸基、アルコキシ基、
カルボキシル基またはスルホン酸基を示し、ｎは０また
は１を示し、Ｚはニトロ基またはニトロビニル基を示
す。）で表わされる糖エステル誘導体。
【請求項２】基質として請求項１に記載の糖エステル誘
導体を含有することを特徴とするリパーゼまたはエステ
ラーゼ活性測定用試薬。