JPH0678786A - Ｌｅｃａｍ−１と反応するモノクローナル抗体及びｌｅｃａｍ−１の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＬＥＣＡＭ−１のみを感度よく検出するため
の抗体及び測定方法を提供する。 【構成】 精製したｒＬＥＣ−ＩｇＧを雄のアルメニア
ハムスター（６〜１０周齢）に対して５日隔で４回免疫
した。最終免疫の２日後に免疫したハムスターのリンパ
節細胞を取り出し、マウスの骨髄腫細胞（ＰＡＩ）と混
合し、細胞融合させた。融合した細胞は洗浄後、ＣＯ₂
インキュベーター（５％ＣＯ₂、３７℃）中で培養し、
ＨＡＴ培地中で増殖させて、リンパ節細胞と骨髄腫細胞
からなるハイブリドーマのスクリーニングを行なった。
こうしてヒトＬＥＣＡＭ−１にも反応するラットＬＥＣ
ＡＭ−１に対するモノクローナル抗体を作製した。この
抗体を不溶化担体へ固相化し、サンドイッチＥＬＩＳＡ
を行うことによりヒトＬＥＣＡＭ−１を感度よく検出す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＬＥＣＡＭ−１（Ｌ−
セレクチン）を認識するモノクローナル抗体及びＬＥＣ
ＡＭ−１を認識するモノクローナル抗体又はポリクロー
ナル抗体を使用したイムノアッセイによる可溶性ＬＥＣ
ＡＭ−１の測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞接着は個体の発生や分化にとって必
須の現象であるのみならず、細胞間の情報伝達や免疫系
にも重要な役割を演じていることが明らかにされてき
た。細胞表面に存在し、細胞接着に関与する一連の分子
が細胞接着分子であり、ＬＥＣＡＭ−１もこのような細
胞接着分子の一つである。ＬＥＣＡＭ−１はヒトのリン
パ球表面に存在し、リンパ球のリンパ節に対する特異的
接着に関与していると考えられることから、いわゆるリ
ンパ球ホーミングレセプターである可能性が指摘されて
いる。

【０００３】ＬＥＣＡＭ−１はリンパ球の他、好中球や
単球上にも発現されており、炎症部位への細胞の移動に
関与していることが明らかにされている。又、刺激によ
ってＬＥＣＡＭ−１が細胞表面上から放出されることが
知られている。従って、血中におけるＬＥＣＡＭ−１の
濃度を精度よく定量的に測定することにより生体内にお
ける炎症の有無及び炎症症状のモニタリングを行なうこ
とができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、血中に
放出されるＬＥＣＡＭ−１は非常に微量であり、しかも
生体中には類似の構造を持った蛋白質がいくつか知られ
ていることから、これらの類似蛋白質と区別してＬＥＣ
ＡＭ−１のみを特異的に感度よく検出することは困難で
あった。

【０００５】従って、本発明は、ＬＥＣＡＭ−１のみを
感度よく検出するための抗体及び測定方法を提供するこ
とを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段及び作用】本発明のＬＥＣ
ＡＭ−１のみを感度よく検出するための抗体は、ラット
ＬＥＣＡＭ−１に対する抗体であって、ヒトＬＥＣＡＭ
−１との交叉反応性を有することを特徴とするモノクロ
ーナル抗体にある。

【０００７】本発明のＬＥＣＡＭ−１のみを感度よく検
出するための測定方法は、ＬＥＣＡＭ−１を認識するモ
ノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いること
を特徴とするイムノアッセイによる可溶性ＬＥＣＡＭ−
１の測定方法にある。ここで「ラットＬＥＣＡＭ−１に
対する抗体」とは、ラットＬＥＣＡＭ−１を抗原として
生体内で産生させた抗体を意味する。また、「ヒトＬＥ
ＣＡＭ−１との交叉反応性を有する」とは、ヒトＬＥＣ
ＡＭ−１以外のＬＥＣＡＭ−１を抗原として生体内で産
生させた抗体がヒトＬＥＣＡＭ−１と反応性を有するこ
とを意味する。従って、本発明のモノクローナル抗体
は、ラットＬＥＣＡＭ−１に対する抗体であって、ヒト
ＬＥＣＡＭ−１を測定するために用いることができる。

【０００８】ヒト及びマウスのＬＥＣＡＭ−１に対する
モノクローナル抗体は従来より知られており、例えば、
ヒトのＬＥＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体につ
いては、キシモトらにより１９９０年３月発行のプロナ
ス・アカド・ソサイ・ユー・エス・エイ［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ］の第８７巻，第２
２４４頁〜第２２４８頁に「ヒト末梢リンパ節ホーミン
グレセプターの同定。急速に減少調節される接着分子
［Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａ
ｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｈ
ｏｍｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ａ ｒａｐｉｄｌｙ
ｄｏｗｎーｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅ］」なる題名で、そしてマウスのＬＥＣ
ＡＭ−１に対するモノクローナル抗体については、ミッ
チェル（Ｍｉｃｈａｅｌ）らにより１９８３年発行のネ
ーチャー［Ｎａｔｕｒｅ］の第３０４巻，第３０頁〜第
３４頁に「リンパ球の臓器特異的ホーミングに関与する
細胞表面上の分子［Ａ ｃｅｌｌーｓｕｒｆａｃｅ ｍ
ｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｏｒｇａｎ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｏｍｉｎｇ ｏｆ ｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｅｓ］」なる題名で記載されているが、本発明
者等は、新たにラットＬＥＣＡＭ−１に対するモノクロ
ーナル抗体を作製し、その中からヒトＬＥＣＡＭ−１と
反応し、しかも互いに異なる抗原決定基を認識するクロ
ーン２種を後述するようにして得ることができた。本発
明のモノクローナル抗体は、ヒトとラットのＬＥＣＡＭ
−１分子を同一の抗体で比較できる点で優れている。

【０００９】次に、ＬＥＣＡＭ−１の測定方法について
説明する。ＬＥＣＡＭ−１を免疫学的に検出するために
はまずＬＥＣＡＭ−１に対する抗体を作製する。抗体
は、上述した本発明によるラットＬＥＣＡＭ−１に対す
る抗体であっても、また、従来公知のヒトまたはマウス
ＬＥＣＡＭ−１に対する抗体のいずれであってもよい。

【００１０】試薬の作製に用いられる抗体としてはＬＥ
ＣＡＭ−１を動物に免疫して得られるポリクローナル抗
体と、マウス等に免疫した後、免疫動物の脾臓細胞及び
同種動物のミエローマ細胞を融合させたハイブリドーマ
により産生される単一の特異性をもったモノクローナル
抗体がある。免疫学的測定法としてはどちらの抗体も使
用可能であるが、ポリクローナル抗体の場合、免疫原を
完全に精製することは困難であり、そのため抗体作製後
に吸収操作を行なうことによって免疫原以外の物質に対
する反応性を除く必要がある。一方モノクローナル抗体
の場合、単一の抗原決定基を認識するため高い特異性を
確保することができる半面、後述するいわゆるサンドイ
ッチ法ＥＩＡの場合、第１抗体と標識抗体の２種類の抗
体によって測定しようとする抗原をはさむ必要があるた
め、異なる抗原決定基を認識する抗体をそれぞれ作製す
る必要がある。モノクローナル抗体の作製法としては例
えばケーラー及びミルステインらの方法を用いることが
できる。

【００１１】血清中のＬＥＣＡＭ−１を測定する方法と
しては、免疫学的な測定法、例えば、放射免疫測定法
（ＲＩＡ）や酵素免疫測定法（ＥＩＡ）が考えられる
が、ＥＩＡの場合、測定に特別の施設を要さず、又放射
性廃棄物の扱いが問題にならないことから、より好まし
い。ここで、抗体測定のための固相を用いるＥＩＡは、
エリザ（ＥＬＩＳＡ）と呼ばれるが、このうちサンドイ
ッチ法ＥＬＩＳＡについては、例えば、１９９０年７月
１５日発行の通堂らによるザ・ジャーナル・オブ・イム
ノロジー［Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ］第１４５巻，第５９９頁〜第６０８頁，第
２号に「ＩＬ−２レセプターβ鎖（ｐ７０）ｃＤＮＡに
コードされた膜型及び可溶型分子のリガンド結合能［Ｔ
ＨＥ ＩＬ−２ ＲＥＣＥＰＴＯＲ βーｃｈａｉｎ
（ｐ７０） Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｂｉｌ
ｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡーＥｎｃｏｄｉｎｇ
Ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ Ｆｏｒ
ｍｓ］」なる題名で記載されている。

【００１２】本発明のラットＬＥＣＡＭ−１を認識する
モノクローナル抗体の製造方法の例及び酵素免疫測定法
によりＬＥＣＡＭ−１の濃度を定量する方法の例につい
て以下に詳細に説明する。 １）抗原蛋白の作製 ラットＬＥＣＡＭ−１のｃＤＮＡは 渡邊等によりクロ
ーニングされている。例えば、１９９２年発行のバイオ
ケミカ・オブ・バイオフィジカ・アクタ第１１３１巻
［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ．１１３１］第３２１頁〜第３２４頁に「ラ
ットＬＥＣＡＭ−１ｃＤＮＡのシークエンスおよびその
発現［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ ｏｆａ ｒａｔ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ＬＥＣＡＭ−
１］」なる題名にて記載されている。

【００１３】抗原として用いるＬＥＣＡＭ−１は通常の
遺伝子工学的手法により作製することができるが、ラッ
トＬＥＣＡＭ−１と他の蛋白質との融合蛋白質を用いる
こともできる。例えばアルフォ［Ａｒｕｆｆｏ］等によ
って、１９９０年６月２９日発行のセル［Ｃｅｌｌ］第
６１巻，第１３０３頁〜第１３１３頁に「ＣＤ４４は細
胞表面上の主要なヒアルロン酸レセプターである［ＣＤ
４４ Ｉｓ ｔｈｅＰｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｅｌｌ Ｓ
ｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒＨｙａｌｕｒ
ｏｎａｔｅ］」なる題名にて記載された方法によって作
製されたラットＬＥＣＡＭ−１−ＩｇＧ融合蛋白質でも
よい。

【００１４】 ２）ラットＬＥＣＡＭ−１融合蛋白質による免疫 アルメニアンハムスターに免疫して得ることができる。
その際、免疫計画及び免疫原、例えば、リコンビナント
ラットＬＥＣＡＭ−１−ＩｇＧ融合蛋白質（ｒＬＥＣ−
ＩｇＧ）の濃度は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ
球が形成されるよう選ばれるべきである。

【００１５】例えば、ハムスターに５０μｇのｒＬＥＣ
−ＩｇＧを５日間間隔で足蹠に３回免疫の後、さらに３
０μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に、融合の
ために膝窩リンパ節細胞を取り出す。 ３）細胞融合 上記のごとく免疫したハムスターのリンパ節細胞を無菌
的に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。これ
らのリンパ節細胞は適当な系のマウスの骨髄腫細胞と適
当な融合促進剤の使用により細胞融合させる。細胞融合
は融合促進剤の使用によるほか、電気融合などによって
も行なうことができる。好ましい融合促進剤としては、
例えば、平均分子量１，０００〜４，０００のポリエチ
レングリコールを使用することができるが、この分野で
知られている他の融合促進剤を用いることもできる。

【００１６】４）融合した細胞の選択 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合のリンパ節細胞、未融合の骨髄腫細胞、融合したハイ
ブリドーマ細胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持
しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるの
に十分な時間（約１週間）培養する。培地は未融合のマ
ウス骨髄腫細胞を支持しないもの（例えばＨＡＴ培地）
が使用される。この選択培地中では、未融合の骨髄腫細
胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍性細胞な
ので、ある一定期間後（１週間後）死滅する。これらに
対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍性と、脾
臓細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中で生存でき
る。

【００１７】 ５）各容器中の抗ラットＬＥＣＡＭ−１抗体の確認 このようにしてハイブリドーマ細胞が検出された後、そ
の培養上清を採取し、ラットＬＥＣＡＭ−１に対する抗
体についてラットＬＥＣＡＭ−１遺伝子導入細胞株に対
する反応性（フローサイトメトリーを用いる）でスクリ
ーニングし、ラットＬＥＣＡＭ−１に対する抗体を産生
するハイブリドーマ細胞を選別することができる。

【００１８】６）目的の抗体を産生するハイブリドーマ
細胞のクローン化 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は異な
った２つの方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によれば、ハイブリドーマ細胞はヌードマウスの
腹腔に注射することができる。一定時間後の宿主動物の
血液中及び腹水中より、そのハイブリドーマ細胞の産生
するモノクローナル抗体を得ることができる。

【００１９】７）モノクローナル抗体の分離、精製 ハイブリドーマ培養上清もしくは宿主動物の血液中及び
腹水中のモノクローナル抗体は、塩析、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過等の技術を組み合わせること
により精製することができる。あるいはプロテインＡな
どのイムノグロブリンに親和性を有する物質を用いたア
フィニティークロマトグラフィーによっても精製するこ
とができる。

【００２０】８）抗体感作マイクロプレートの作製 精製したモノクローナル抗体を適当な緩衝液で希釈し、
例えば、９６穴マイクロプレートに添加して、固相化し
た後、マイクロプレートの未結合部分を適当な蛋白質で
ブロッキングする。抗体の希釈液としてはリン酸塩緩衝
液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液などが挙げられる。

【００２１】抗体としては、上記のごとく作製・精製し
たラットＬＥＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の
みでなく、従来公知のヒトあるいはマウスのＬＥＣＡＭ
−１に対するモノクローナル抗体であってもよく、ポリ
クローナル抗体であってもよい。濃度としては１ｕｇ／
ｍｌ〜１００ｕｇ／ｍｌが好ましい。

【００２２】ブロッキングに用いられる蛋白質として
は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の他にゲラチン、カ
ゼイン、スキムミルク等が挙げられる。抗体を固相化す
る不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポ
リカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の
プラスチックや、ガラスといった水に不溶の物質が挙げ
られる。この不溶性支持体の形態は、例えばスティッ
ク、ビーズあるいは試験管状のものなどが挙げられる。
この支持体への担持は単なる物理的吸着でもよく、化学
的な結合でもよい。

【００２３】９）標識抗体の作製 標識抗体としてはＬＥＣＡＭ−１に対するポリクローナ
ル抗体あるいはモノクローナル抗体であって、固相化し
た抗体とは抗原認識部位の異なる抗体が用いられる。標
識は酵素標識、アイソトープ標識等、一般に用いられて
いる標識が使用できる。

【００２４】酵素標識の場合の酵素としては、ペルオキ
シダーゼ、βーＤ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオ
キシダーゼ、キモトリプシノーゲン、プロカルボキシペ
プチダーゼ、グリセルアルデヒドー３リン酸脱水素酵
素、アミラーゼ、ホスホリラーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、Ｄーナーゼ、Ｐーナーゼ等を挙げることができ
る。また、抗体にビオチンを標識して反応させた後、ア
ビジン標識酵素を反応させることによって感度を上昇さ
せることもできる。ビオチンはアビジンと親和性に優れ
るため、アビジンが多量につき、従って、増幅される。
抗体の形状としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の他、Ｆ
（ａｂ）’２分画、Ｆａｂ分画等であってもよい。

【００２５】１０）測定方法 上記のようにして得られた抗体固相化マイクロプレート
と被検液とを反応させ、これに上記のようにして得られ
た酵素標識抗体を処理させ、これを従来公知のいずれか
のＥＩＡ法によって測定することによって被検液のＬＥ
ＣＡＭ−１を検出することができる。

【００２６】

【実施例】以上説明した本発明の構成・作用を一層明ら
かにするために、以下に本発明の好適な実施例を説明す
る。 １．抗ラットＬＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体の作製 精製したｒＬＥＣ−ＩｇＧを雄のアルメニアハムスター
（６〜１０周齢）に対して５日隔で４回免疫した。初回
の免疫はＰＢＳに溶解した５０μｇのリコンビナント融
合蛋白質を等量のフロイントの完全アジュバント（Ｃｏ
ｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕｎｄ’ｓ ａｊｕｖａｎｔ）と混
合し、そのエマルジョンを、足蹠に皮下注射した。２回
目、３回目は同様に５０μｇのリコンビナント融合蛋白
質を同じく足蹠に皮下注射した。最終免疫は３０μｇの
リコンビナント融合蛋白質をＰＢＳ溶液のまま足蹠に皮
下注射した。最終免疫の２日後に免疫したハムスターの
リンパ節細胞を取り出し、細胞融合に用いた。

【００２７】免疫したハムスターのリンパ節細胞と、マ
ウスの骨髄腫細胞（ＰＡＩ）を約２：１〜５：１の割合
で混合した。５０％ポリエチレングリコール液１ｍｌを
滴下し１分間室温で撹拌した。さらに撹拌を続けながら
２〜５分間かけて徐々にＲＰＭＩ １６４０培地５〜１
０ｍｌを加えた。融合した細胞は洗浄後、ＣＯ₂インキ
ュベーター（５％ＣＯ₂、３７℃）中で培養し、ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地（ＨＡ
Ｔ培地）で培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増殖させ
て、リンパ節細胞と骨髄腫細胞からなるハイブリドーマ
のスクリーニングを行なった。ハイブリドーマの培養上
清中の抗体は、ラットＬＥＣＡＭ−１ｃＤＮＡ導入細胞
株の染色特性により検出した。

【００２８】採取した培養上清１００ｍｌに等量の飽和
硫安を加え、ＩｇＧを含む画分を沈澱させ、１０ｍｌの
２６ｍＭ塩化ナトリウム加１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ８．０）で溶解せしめた後、同緩衝液で一晩
透析を行った。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロー
スカラム３０ｍｌに展開し、２００ｍｌ容量の同緩衝液
で、同カラムに未吸着画分であるＩｇＧを分取した。こ
のＩｇＧ画分は更に、減圧下透析チューブ中で、タンパ
ク濃度１ｍｇ／ｍｌに濃縮した後生理的トリス塩酸緩衝
液（ＴＢＳ）で一晩透析を行った。

【００２９】ここで得られたラットＬＥＣＡＭ−１に対
するモノクローナル抗体２クローン（ＨＲＬ３及びＨＲ
Ｌ４）がそれぞれ異なる抗原決定基を認識していること
をフローサイトメトリーを用いて確認した。即ち、あら
かじめモノクローナル抗体で処理したリンパ球にビオチ
ン化モノクローナル抗体を反応させ、さらに蛍光色素
（ＦＩＴＣ）を標識したストレプトアビジンを反応させ
てみた。このフローサイトメトリーのヒストグラムを図
１に示す。横軸は蛍光強度を示し、縦軸は細胞数を示
す。図１において、（ａ）はリンパ球にビオチン化ＨＲ
Ｌ３を反応させ、蛍光色素（ＦＩＴＣ）を標識したスト
レプトアビジンを反応させたもの、（ｂ）は予めＨＲＬ
３で処理したリンパ球にビオチン化ＨＲＬ３を反応さ
せ、蛍光色素（ＦＩＴＣ）を標識したストレプトアビジ
ンを反応させたもの、（ｃ）は予めＨＲＬ４で処理した
リンパ球にビオチン化ＨＲＬ３を反応させ、蛍光色素
（ＦＩＴＣ）を標識したストレプトアビジンを反応させ
たもの、また（ｄ）はリンパ球にビオチン化ＨＲＬ４を
反応させ、蛍光色素（ＦＩＴＣ）を標識したストレプト
アビジンを反応させたもの、（ｅ）は、予めＨＲＬ３で
処理したリンパ球にビオチン化ＨＲＬ４を反応させ、蛍
光色素（ＦＩＴＣ）を標識したストレプトアビジンを反
応させたもの、（ｆ）は、予めＨＲＬ４で処理したリン
パ球にビオチン化ＨＲＬ４を反応させ、蛍光色素（ＦＩ
ＴＣ）を標識したストレプトアビジンを反応させたもの
をそれぞれ示す。（ａ）及び（ｄ）を比較すると、蛍光
色素で標識されたビオチン化ＨＲＬ３とビオチン化ＨＲ
Ｌ４とはそれぞれ異なる染色パターンを認識しており、
（ａ）及び（ｂ）を比較すると、ＨＲＬ３を処理した後
にビオチン化ＨＲＬ３（即ち、蛍光色素が標識される）
を反応させると、先に蛍光色素が標識されないＨＲＬ３
がＨＲＬ３の認識部位に反応し、後に蛍光色素が標識さ
れるビオチン化ＨＲＬ３が反応するため、（ｂ）は
（ａ）と染色パターンが異なるが、（ａ）及び（ｃ）を
比較すると、先に蛍光色素が標識されないＨＲＬ４が反
応しても、ＨＲＬ３の反応する抗原認識部位はＨＲＬ４
と異なるため、ビオチン化ＨＲＬ３はＨＲＬ３の認識部
位に反応し、（ｃ）は（ａ）と同様な染色パターンを示
す。同様に、（ｄ）及び（ｅ）を比較すると、先に蛍光
色素が標識されないＨＲＬ３が反応しても、ＨＲＬ４の
反応する抗原認識部位はＨＲＬ３と異なるため、ビオチ
ン化ＨＲＬ４はＨＲＬ４の認識部位に反応し、（ｅ）は
（ｄ）と同様な染色パターンを示し、（ｄ）及び（ｆ）
を比較すると、ＨＲＬ４を処理した後にビオチン化ＨＲ
Ｌ４（即ち、蛍光色素が標識される）を反応させると、
先に蛍光色素が標識されないＨＲＬ４がＨＲＬ４の認識
部位に反応し、後に蛍光色素が標識されるビオチン化Ｈ
ＲＬ４が反応するため、（ｆ）は（ｄ）と染色パターン
が異なっている。従って、モノクローナル抗体２クーロ
ンＨＲＬ３とＨＲＬ４とが認識する抗原決定基は異なる
ことがわかる。即ち、サンドイッチ法においてクロスブ
ロッキングがない。

【００３０】 ２．不溶化単体への固相化による試薬の作製 まず、上記で調製したクローンＨＲＬ３を生理的トリス
塩酸緩衝液（ＴＢＳ）に溶解し、２０ｕｇ／ｍｌの溶液
を調製した。この液５０ｕｌをマイクロタイタープレー
ト（住友ベークライト株式会社製スミロンＨプレート）
の各ウエルに分注し、４℃で一晩放置してマイクロプレ
ート壁面にモノクローナル抗体を吸着させた後、ＴＢＳ
で３回洗浄した。さらに３％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）加ＴＢＳ２００ｕｌを各ウエルに添加して室温で１
〜２時間放置反応させ、マイクロプレート壁面のうち、
モノクローナル抗体が吸着しなかった部分をＢＳＡで被
覆する。こうしてマイクロプレート型試薬を完成させ
た。

【００３１】 ３．ビオチン（ＢＩＯＴＩＮ）標識抗体の作製 １で調製したクローンＨＲＬ４を０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ８．５）に溶解し、２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製
した。この溶液にＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアース
社）の０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）溶液（３０ｍ
ｇ／ｍｌ）をモノクローナル抗体１００ｍｇにつき５０
ｕｌ加えて室温で２時間撹拌した後、リン酸塩緩衝塩化
ナトリウム液（ＰＢＳ）に透析した。

【００３２】 ４．ＥＬＩＳＡ法によるヒトＬＥＣＡＭ−１の測定 １）検体及び標準品の調製 血清等の検体をそのまま、あるいは１％ＢＳＡ加ＴＢＳ
で希釈し、この液を検体溶液とした。同様にｒＬＥＣ−
ＩｇＧを１％ＢＳＡ加ＴＢＳで段階希釈し、この液を標
準溶液とした。

【００３３】２）マイクロプレート型試薬と検体溶液及
び標準溶液中のＬＥＣＡＭ−１との反応 ２にて作製したマイクロプレート型試薬中のブロック用
緩衝液（３％ＢＳＡ加ＴＢＳ）を取り除いた後、０．１
％ツイーン２０加ＴＢＳで３回洗浄し、同緩衝液をよく
取り除き、１）で調製した検体を一穴に１００ｕｌずつ
分注した。

【００３４】同時に１）で調製した標準溶液を一穴に１
００ｕｌずつ分注し、室温で１時間静置反応させた後、
０．１％ツイーン２０加ＴＢＳで３回洗浄し同緩衝液を
よく取り除いた。 ３）マイクロプレート型試薬とＬＥＣＡＭ−１結合物へ
のビオチン標識モノクローナル抗体の結合 ３で調製したビオチン標識モノクローナル抗体を１％Ｂ
ＳＡ加ＴＢＳで希釈し、３ｕｇ／ｍｌの濃度に調製し、
この液を２）で抗原抗体反応させたマイクロプレートに
一穴につき５０ｕｌずつ分注する。室温で１時間静置反
応させた後、０．１％ツイーン２０加ＴＢＳで３回洗浄
し、同緩衝液をよく取り除いた。

【００３５】４）ビオチン標識モノクローナル抗体への
ストレプトアビジンーβーＤーガラクトシダーゼの結合 ＴＡＧＯ社ストレプトアビジンーβーＤーガラクトシダ
ーゼ［ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−β−Ｄ−ｇａｌａｃ
ｔｏｓｉｄａｓｅ］を０．１％ＢＳＡ、２０ｍＭ塩化ナ
トリウム加２０ｍＭヘペス［Ｈｅｐｅｓ］緩衝液（ｐＨ
７．０）で３００倍に希釈し、この液を３）でビオチン
標識モノクローナル抗体を反応させたマイクロプレート
に一穴につき５０ｕｌずつ分注した。室温で１時間静置
反応させた後、０．１％ツイーン２０加ＴＢＳで３回洗
浄し同緩衝液をよく取り除いた。

【００３６】５）発色反応 シグマ社製４ーメチルーウンベリフェリルーβーＤーガ
ラクトピラノサイド［４−ｍｅｔｈｙｌ−ｕｍｂｅｌｌ
ｉｆｅｒｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓ
ｉｄｅ］をジメチルホルムアミドに溶解し、１０ｍｇ／
ｍｌの溶液を調製した。この液を０．１％ＢＳＡ、１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム及び１００ｍＭ塩化ナトリウム加１
０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で１００培希釈
し、ストレプトアビジンーβーＤーガラクトシダーゼを
結合させたマイクロプレートに一穴につき５０ｕｌずつ
分注した。室温で１０分間静置反応させた後２Ｍ炭酸ナ
トリウム溶液を一穴につき１００ｕｌずつ分注し、βー
Ｄーガラクトシダーゼの酵素活性を停止させた。

【００３７】こうしてマイクロプレートの各穴に生じた
蛍光の強度は、蛍光光度計を用いて励起波長を３５５ｎ
ｍに設定し、４６０ｎｍにおける蛍光強度を測定するこ
とによって検出した。ｒＬＥＣ−ＩｇＧを標準品として
測定した場合の蛍光強度を表１に、この表の濃度を片対
数グラフの対数側に、蛍光強度を正規側にプロットした
標準曲線を図２に示す。図２から明らかなように、ＬＥ
ＣＡＭ−１濃度と蛍光強度とは相関関係があり、従っ
て、測定した蛍光強度からＬＥＣＡＭ−１濃度を精度よ
く測定することが可能である。

【００３８】

【表１】

【００３９】また、上述の試薬及び測定法により、実際
に正常人、慢性リウマチ関節炎（ＲＡ）患者を含めた血
管炎患者の血清を測定した結果を図３に示す。図３に示
すように、正常人と比較して炎症性疾患の患者において
測定値が顕著に高値であることが分かる。そして、患者
のうちでも症状が重いほど測定値が高値になっている。
従って、本実施例の試薬を用い、本実施例の測定方法を
実施すれば、臨床現場でも用意に炎症の有無及び炎症の
程度の変化を知ることができる。

【００４０】上記実施例によれば、ＬＥＣＡＭ−１を認
識するモノクローナル抗体を用い、イムノアッセイによ
りＬＥＣＡＭ−１を感度よく検出することができた。従
って、生体内における炎症の有無及び炎症症状のモニタ
リングを行なうことができる。

【００４１】尚、上記実施例では、ラットＬＥＣＡＭ−
１に対する抗体を用いたが、ヒトＬＥＣＡＭ−１を認識
するヒトやマウスのＬＥＣＡＭ−１をも同等に用いるこ
とができる。また、上記実施例では、モノクローナル抗
体を用いたが、ポリクローナル抗体でもよい。

【００４２】さらに、上記実施例では、ＥＩＡによって
測定したが、物理化学的な方法でもよく、また、放射免
疫測定法（ＲＩＡ）でもよい。以上本発明の実施例につ
いて説明したが、本発明はこうした実施例に何等限定さ
れるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲にお
いて、種々なる態様で実施し得ることは勿論である。

【００４３】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明の抗ラット
ＬＥＣＡＭ−１モノクローナル抗体及びＬＥＣＡＭ−１
の測定方法によれば、簡便で高感度な血中ＬＥＣＡＭ−
１の測定が可能となり、生体内における炎症の有無及び
炎症の程度の推移の把握が可能になるという優れた効果
を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】モノクローナル抗体２クローンの認識する抗原
決定基の違いを確認するフローサイトメトリーでのヒス
トグラムである。

【図２】本実施例のＬＥＣＡＭ−１測定方法によるリコ
ンビナントＬＥＣＡＭ−１−ＩｇＧ融合蛋白質を倍々希
釈したものを測定したときの標準曲線を示すグラフであ
る。

【図３】正常人及び炎症性疾患患者群におけるＬＥＣＡ
Ｍ−１測定値を示す分布図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラットＬＥＣＡＭ−１に対する抗体であ
   って、ヒトＬＥＣＡＭ−１との交叉反応性を有すること
   を特徴とするモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ＬＥＣＡＭ−１を認識するモノクローナ
   ル抗体又はポリクローナル抗体を用いることを特徴とす
   る、イムノアッセイによる可溶性ＬＥＣＡＭ−１の測定
   方法。