JPH0680935A - 架橋可能な新規コラーゲン誘導体、その製造方法および生体材料の製造へのその応用 - Google Patents

架橋可能な新規コラーゲン誘導体、その製造方法および生体材料の製造へのその応用

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JPH0680935A
JPH0680935A JP5148108A JP14810893A JPH0680935A JP H0680935 A JPH0680935 A JP H0680935A JP 5148108 A JP5148108 A JP 5148108A JP 14810893 A JP14810893 A JP 14810893A JP H0680935 A JPH0680935 A JP H0680935A
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acid
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Christian Gagnieu
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Flamel Technologies SA
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Abstract

(57)【要約】 【目的】再現性のある制御された方法で架橋を施すこと
が可能で、これによって一定の物理化学的、機械的また
は生物学的特性をもった架橋コラーゲンを得ることがで
きる架橋可能な修飾コラーゲンを提供すること。 【構成】架橋可能な修飾コラーゲンであって、水および
／または非プロトン性の極性有機溶媒に可溶であり、シ
ステインまたはその誘導体の残基に担持された遊離の若
しくは置換されたチオール基を有し、前記残基の少なく
とも幾つかはスペーサ化合物を介してコラーゲンに固定
されている架橋可能な修飾コラーゲン。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】本発明は、特に医学（より具体的には外
科）または美容術に適用される製品を得ることが可能な
生体材料の製造に用いることができる、架橋可能な新規
コラーゲン誘導体に関する。
【０００２】これら製品としては、人口皮膚、人工骨、
人工靭帯、人工心臓血管、人工眼球および他の補綴物も
しくはインプラントのような人口組織または人工器官、
或いは、イン・ビボにおける活性成分の放出制御のため
の包接系（埋込み、マイクロスフィア、マイクロカプセ
ル）およびバイオ包接系(bioencapusulation) が挙げら
れ得る。
【０００３】同様の例として挙げられのは、縫合糸また
は埋込み可能な医学的物体を生体適合性とするための被
覆物のような医学的アクセサリー、並びに組織を形成し
または再構築するために用いられる注入可能なコラーゲ
ンの溶液もしくは懸濁液である。
【０００４】上記の夫々の生物医学的適用にとって、再
現性のある制御された方法で、架橋されたコラーゲンの
一定の物理化学的、機械的または生物学的特性を得るこ
とが重要である。コラーゲン（即ち、本発明に従って合
成される広範囲の生成物）の化学的修飾を完全に制御す
ること、及びこれによってもたらされる架橋法の良好な
安定性のみが、所定の適用の仕様書が作製されたときに
明らかになる多くの束縛に対して満足に適合することを
可能とする。
【０００５】本発明は更に、これら架橋可能な新規なコ
ラーゲン誘導体の製造方法に関し、該方法に含まれる新
規な中間体に関し、最後に、問題の架橋可能なコラーゲ
ンから製造された架橋されたコラーゲンに関する。
【０００６】本発明の属する技術分野は、ヒトまたは動
物の身体に接触して配置され又はその中に埋め込まれる
物体を製造するための出発材料として有用であり、また
特に機械的な観点から、生体材料を置換えるために可能
な限り生体材料に似せることができる、生体適合性コラ
ーゲンを基礎とする材料の分野である。意図される適用
は、本質的にヒトの医学または獣医学の分野である。
【０００７】
【先行技術の説明】コラーゲンは、全ての構成レベルの
動物組織に存在する公知のタンパクであり、皮膚および
結合組織の主要なタンパクである。本来的に、コラーゲ
ンは生活環境に対して比較的良く適合した生化学的およ
び物理化学的特徴を有している。
【０００８】本発明に関する限り、コラーゲンの語は、
コラーゲンの性質をもった何れかのペプチド（特にゼラ
チンを含む）を意味する。現在、動物もしくはヒト起源
の異なった等級のコラーゲンが、本質的には生体材料ま
たは化粧品の製造のために世界中で市販されている。
【０００９】入手可能なこの異なった等級のコラーゲン
の性質は、現時点での一般的な用途での適用には充分で
あると考えられる。こうして、これらコラーゲンには、
細胞の付着および増殖のための優れた支持体としての用
途が含まれ、細胞培養培地の製造に有用な価値を有して
いる。
【００１０】その親水性、低免疫原性および止血特性か
らもまた、利点が誘導される。天然のコラーゲンの機械
的性質は、多くの用途に許容され得る。しかしながら、
インプラント及び補綴物のような埋込み可能な医療用物
体の分野においては、商業的に入手可能な天然のコラー
ゲンはその機械的強度およびタンパク分解に対する抵抗
性の点で実質的に不足しいることを認めなければならな
い。
【００１１】事実、如何なるインプラント及び補綴物で
あっても、これら外来の異物を生きた生物体中に導入す
ると拒絶反応が誘導され、炎症反応が生じる。就中、こ
れによってコラゲンを加水分解するコラーゲナーゼの生
成が生じる。その結果、コラーゲンを基礎とする移植片
は、少なくともその機械的強度が劣化する。架橋はコラ
ーゲンの機械的性質の改善を可能とすることが知られて
いる。即ち、コラーゲン鎖の間に形成される多くの共有
結合によって、コラーゲン繊維には非常に高い引張り強
度および剪断強度が与えられる。
【００１２】この科学的な知識に基づいて、コラーゲン
の人工的架橋の可能性を開発するために多くの研究がな
されてきた。こうして、このタンパクを架橋するための
三つの主要なタイプの技術が出現した。
【００１３】第一のタイプの技術は架橋剤を用いた架橋
であり、ここでは結合が形成され得るように、外来分子
（殆どは２官能性）がグラフトされる。最も頻繁に用い
られる架橋剤は次の通りである。
【００１４】・ホルムアルデヒド（メチレン橋を生成す
る）、マロンアルデヒド及び特にグルタルアルデニド
（イミン結合およびアルドール結合による架橋）のよう
な、モノ- 及びジ- アルデヒド類： これらの主な問題
は、その末端 -ＣＨＯ基に起因して刺激性があり、また
該ジアルデヒドの自動重合によって細胞毒性を呈するこ
とである。
【００１５】・ジカルボン酸化合物類： これらはコラ
ーゲンを修飾し、または皮膚をなめすために本質的に用
いられる。また、アミド結合またはエステル結合によっ
て作用する。
【００１６】・ヘキサメチレンジアミンのようなジアミ
ン類： これはアミド結合によってのみ作用する。 ・ヘキサメチレンジイソシアネートを含むジイソシアネ
ート類： これらはアミド結合による架橋のために用い
られる。
【００１７】・塩化ジスルホニル類： これらは鎖内結
合および鎖間結合を形成する。 第二のタイプの技術には、外来化合物のグラフトなし
で、コラーゲン分子の間に共有結合を形成することによ
るネットワークの創製が含まれる。
【００１８】使用される主な方法は次の通りである。 ・放射線照射（紫外線またはガンマ線）： これは、イ
ミン結合およびアルドール結合によって架橋を生じさせ
る多くの酸化的デアミネーションを生成し、同時に、共
有結合の架橋構造を形成できる極めて反応性の高い多く
の遊離ラジカルを生成する。このような方法は、コラー
ゲンに対して低エネルギーの狭い範囲でのみ架橋を起こ
させるが、高エネルギーにおいては、生成物に非常に有
害な加水分解または変性反応をもたらすという不利益を
有している。
【００１９】・脱水（過酷な条件下：減圧で100 ℃以
上）： これはアミド結合およびエステル結合、並びに
分子内および分子間リシノアラニン類の形成を導く。シ
アナミド又はジシクロヘキシルカルボジイミドのような
カルボジイミド類が、使用される試薬として挙げられ得
る。この架橋モードは未だ実験段階にある。
【００２０】・リシルオキシダーゼ（天然の架橋を担う
酵素）に似たタンパクによる酵素的架橋： この方法
は、現時点では未だ研究中である。 ・末端アミノ基の酸化的デアミネーションを誘導し、ア
ルデヒド基を生じる酸化- 還元： これは、共因子（ア
スコルベート、ピリドキサール５−Ｐ）並びにサルファ
イト又はナイトライトと共に、本質的に金属陽イオン
（Ｃｕ2+，Ｆｅ2+，Ａｌ3+）を用いて行なわれる。この
方法は皮革をなめすために非常に広く用いられている。
【００２１】・特にカルボキシルの機能的活性化： こ
れは末端 -ＮＨ2 に対する極めて選択的な反応性を有す
る酸アジドを生成し、アミド結合の形成を導くことがで
きる。この方法で種々の生体材料が製造され得る。
【００２２】第三のタイプの技術は、共重合による架橋
である。この方法では、共有結合によってコラーゲンを
他のポリマーと組合わせ、多少インターロックされたコ
ンホメーションを得る。最も頻繁にコラーゲンと組合わ
されるポリマーは次の通りである。
【００２３】・アクリル誘導体： その毒性は屡々、埋
込みタイプのヒトの医療における適用には適合しない。 ・アクリロニトリル／スチレン混合物： これは実験室
段階の域を出ていない。
【００２４】・ポリウレタン類： これは特になめし皮
革の強化に用いられる。 ・ポリアルコール類：および ・シリコーン類 共重合に含まれる結合は極めて多様であり、夫々のポリ
マーがもっている基に依存する。
【００２５】これら全ての技術は、物理的性質であるか
或いは化学的性質であるかにかかわらず、多くの欠点を
有している。まず第一に、化学的架橋反応は、架橋され
たコラーゲン内に有毒な残基を生じさせる。この残基
は、未消費の試薬の形または一端でのみ反応した二官能
性試薬に由来する遊離の反応基の形であり得る。
【００２６】物理的架橋反応は全て、実行するのが困難
であり再現性に乏しい。一般に、これら二つのタイプの
架橋は、この修飾されたコラーゲンに対する組織細胞の
親和性の部分的または全体的な喪失をもたらす。
【００２７】更に、これらは、コラーゲン溶液からモー
ルド物品を得るために用いることができない。事実、こ
れらのなかで、架橋速度および架橋の程度を制御し得る
ものは在しない。
【００２８】このようなランダムな条件下においては、
意図する用途に適した機械的特性の生成物を与える単純
で経済的な工業的製造方法を設計することはできない。
殆どの場合に、架橋技術が限られた範囲で、コラーゲン
を含む解剖学的な部分または組織に対して用いられてい
るのはこの理由によるものである。
【００２９】例外的に、予備成形されたコラーゲン物体
（本質的には膜またはフェルト）の架橋のために架橋技
術が用いられている。何れにせよ、生体材料としての応
用の広範な他の領域においては、架橋技術は未だ効果的
ではない。
【００３０】生物学的システムにおいて最も普通に遭遇
する架橋構造、即ちジスルフィド結合 -Ｓ−Ｓ- を利用
することが提案されている。「コラーゲンにおけるシス
チン橋の組込み」と題する論文（ F.Schade ＆ H.Zah
n, Angew.Chem.74,904(1962) ）には、 -Ｓ−Ｓ- 橋構
造による架橋を行なう試みにおいて、シスチン誘導体を
スペーサ中間体なしでコラーゲン中に直接的に固定する
ことが記載されている。
【００３１】その研究の簡単な概要において、著者ら
は、ジスルフィド結合によって架橋されたコラーゲンを
得たと主張している。使用された架橋剤は、シスチンの
二つのアミノ基がカルボベンゾキシ型の保護基によって
ブロックされたシスチン誘導体である。
【００３２】コラーゲンにグラフトされた後にジスルフ
ィド橋は還元され、次いで塩基性媒質中において大気中
の酸素（自動架橋因子）で再酸化される。この論文は、
スペーサ化合物を使用することなく、シスチンをコラー
ゲン上に直接グラフト化することを教示する。
【００３３】この最初の論文の20年後、欧州特許出願第
0049469 号は、コラーゲン及びフィブリノーゲンの組み
合わせに基づく包帯を開示している。この文献は、腱か
ら抽出された可溶性コラーゲン中へのチオール基の直接
導入を記載している。該チオール基は、これをコラーゲ
ンに結合するスペーサ化合物なしで、Ｎ- アセチルホモ
システインを介して導入される。
【００３４】
【発明の概要】本発明の一つの目的は、架橋可能な修飾
コラーゲンであって、水および／または非プロトン性の
極性有機溶媒に可溶であり、システインまたはその類縁
体の残基に属する遊離の若しくは置換されたチオール基
を有し、また温和な酸化剤の存在下に前記媒質中におい
てジスルフィド結合の形成により架橋されて、ゲルまた
は架橋生成物を与えることができ、架橋の速度および程
度に対して優れた制御を与える架橋可能な修飾コラーゲ
ンにある。
【００３５】本発明の更なる目的は、ゲル又は架橋され
た生成物に変換され得る「チオール化された」コラーゲ
ンであって、このゲル又は架橋された生成物の架橋密
度、従って機械的強度が、何れかの用途に適するように
予め調節され得る「チオール化された」コラーゲンを提
供することである。
【００３６】本発明の更なる目的は、架橋可能な修飾コ
ラーゲンであって、その可撓性および架橋特性の故に、
例えばモールド又は押出しにより医学的インプラント又
は補綴物のような医療用固体物品を製造するために特に
適した出発物質となる架橋可能な修飾コラーゲンを提供
することである。
【００３７】出願人は、多くの実験および研究を行なっ
た結果、従来技術が直面していた障害の克服に成功し、
少なくとも幾つかのシステイン性残基をスペーサ化合物
を介してコラーゲンに固定することにより、これら目的
および他の目的の達成に成功した。
【００３８】従って本発明は、架橋可能な修飾コラーゲ
ンであって、水および／または非プロトン性の極性有機
溶媒に可溶であり、システインまたはその誘導体の残基
に担持された遊離の若しくは置換されたチオール基を有
し、前記残基の少なくとも幾つかはスペーサ化合物を介
してコラーゲンに固定されている架橋可能な修飾コラー
ゲンに関する。
【００３９】全体的に有利な方法で、本発明の修飾コラ
ーゲンは工業的規模で容易に成形し、容易に取扱うこと
ができる。これによって、非毒性および非免疫原性で、
且つその機械的および生物学的性質が所期の用途に好ま
しく適した、インプラント、補綴物または人工皮膚タイ
プの医療用物品を得ることが可能になる。
【００４０】本発明に関する限り、「架橋可能な」の語
は任意に、大気中の酸素の存在下において、もし適切な
らば、反応には直接は含まれず且つ架橋された生成物中
に取り込まれない酸化剤の如き温和な補助剤の存在下に
おいて、室温で自然に自動酸化されることができる修飾
コラーゲンを意味する。
【００４１】この修飾コラーゲンの優れた生体適合性
は、一部は、遊離の若しくは置換されたチオール基がシ
ステインまたはその類縁体（以下では、任意に「システ
イン性」残基の一般的用語を用いる）、例えばシステイ
ン自身、シスチン、ホモシステイン、ホモシスチン、シ
スタミン及びシステアミンによって担持されることに起
因する。
【００４２】本発明によれば、少なくとも幾つかの「シ
ステイン性」残基がスペーサ化合物を介してコラーゲン
に結合される。夫々のスペーサ化合物は、好ましくは数
個のカルボキシル基を有する。より好ましくは、該スペ
ーサ化合物は、環状無水物を形成できるジカルボン酸か
ら形成された炭素環性の炭化水素ユニットである。問題
のジカルボン酸はコハク酸、グルタル酸、フタル酸、イ
タコン酸およびマレイン酸からなる非限定的化合物群か
ら選択され、コハク酸が特に好ましい。
【００４３】このスペーサ化合物によって、少なくとも
幾つかの「システイン性」残基は、遊離のアルコール基
またはアミノ基を含むコラーゲンアミノ酸上に間接的に
グラフトされることが可能となる。他の「システイン
性」残基は、カルボキシル基を有するアミノ酸（グルタ
ミン酸およびアスパラギン酸）に直接結合する。
【００４４】本発明に従う修飾コラーゲンのチオール基
による置換の程度は、広範囲の値に亘って変化し得る。
この修飾コラーゲンは、温和な酸化性環境におけるチオ
ール基の酸化およびジスルフィド結合の創製によって容
易に架橋された状態に変換される。イン・ビボの生理学
的条件下において、これは溶存酸素での自動酸化または
酵素的酸化によって生じ得る。これに対して、イン・ビ
トロの非生理学的条件下においては、酸化は例えば弱い
塩基性媒質中において、過酸化水素または大気中酸素の
ような、活性量で非毒性である試薬を用いて行なわれ得
る。
【００４５】架橋されたポリマーは、極めて安定で且つ
良好な機械的性質を具備した形で得られ得る。本発明は
更に、新規な生成物として、特に水および／または有機
溶媒に不溶性の架橋されたコラーゲンであって、その鎖
間の架橋構造が、少なくとも一部はコラーゲンに固定さ
れたシステイン性残基から得られるジスルフィド橋によ
って形成され、少なくとも一部はスペーサ化合物を介し
て形成される架橋されたコラーゲンに関する。
【００４６】後者は、上記で説明したものと同じタイプ
であり得る。この架橋されたコラーゲンは、上記で述べ
た自動架橋可能な修飾コラーゲンから得ることができ
る。
【００４７】本発明は更に、水および／または非プロト
ン性の極性有機溶媒に可溶であり、且つ遊離のチオール
基を含む架橋可能な修飾コラーゲンの製造方法に関す
る。この方法は、本質的に出発コラーゲンを反応させる
ことからなる。
【００４８】＜方法Ｉ＞：第一段階においてスペーサ化
合物の前駆体と反応させ、次いで第二段階においてシス
テイン性残基と反応させる。
【００４９】＜方法II＞：或いは、少なくとも一つのシ
ステイン性残基に結合したスペーサ化合物から少なくと
も成る反応サブユニットと反応させる。
【００５０】方法Ｉの連続工程は次の通りである： -ａ1 - 少なくとも一つの非プロトン性の極性有機溶媒
中において、出発コラーゲンを可溶化する工程と、 -ｂ1 - 該可溶化されたコラーゲンをアシル化およびカ
ルボキシル化する工程と、 -ｃ1 - 該コラーゲンの遊離カルボキシル基を活性化す
る工程と、 -ｄ1 - 該活性化されたコラーゲンを、一以上のブロッ
クされたチオール基を含み、適切な場合には一以上のブ
ロックされたカルボキシル基を含むシステイン性残基と
反応させ、所期の修飾コラーゲンの不活性前駆体を得る
工程。
【００５１】本発明に従う方法Ｉを実施する第一モード
においては、遊離の若しくは置換されたチオール基の形
成によって前記不活性前駆体を直接活性化し、所期の修
飾コラーゲンを得る追加の工程 -ｅ1 が具備される。こ
の活性化は、具体的には還元によって行なわれ得る。
【００５２】本発明に従う方法Ｉを実施する第二モード
においては、下記の追加の工程が具備される： -ｅ11- 前記不活性前駆体を、好ましくは酸化によって
間接的に活性化し、鎖間のジスルフィド橋を介して架橋
されたコラーゲンを得る工程と、 -ｆ11- 該架橋されたコラーゲンを、好ましくは還元に
よって、安定化された遊離の若しくは置換されたチオー
ル基を有する修飾コラーゲンに変換する工程。
【００５３】工程ａ1 〜ｄ1 、ｅ1 、ｅ11およびｆ11に
ついては後で詳述する。方法IIを用いる場合、該方法は
本質的に次の連続工程を具備する： -ａ2 - 少なくとも一つの極性有機溶媒中において、出
発コラーゲンを可溶化する工程と、 -ｂ2 - 保護されたチオール基を含んだスペーサ化合物
／システイン性残基サブユニットを調製する工程と、 -ｃ2 - 該サブユニットの遊離カルボキシル基を活性化
する工程と、 -ｄ2 - 前記コラーゲンを該活性化されたサブユニット
と反応させて、所期の修飾コラーゲンの不活性前駆体を
得る工程。
【００５４】後者を得るためには、コラーゲン -ＳＨを
生じるための還元からなる追加の工程ｅ2 を行うことで
十分である。一つの代替え法においては、工程ｄ2 に続
いて工程ｅ21およびｆ21が行なわれ、これらは上記で述
べた工程ｅ11およびｆ11と同じである。
【００５５】工程ａ2 〜ｄ2 、ｅ1 、ｅ21およびｆ21に
ついては後で詳述する。この方法で用いられる出発材料
は、動物またはヒトの何れのタイプのコラーゲンであて
もよいが、好ましくはタイプＩおよび／またはIII 、或
いはタイプIVで、非プロトン性の極性有機溶媒中に可溶
性のものである。テロペプチドは含んでいても含んでい
なくてもよく、変性形（単一鎖）または非変性形（三重
ヘリックス）で用いられる。
【００５６】前記コラーゲンは任意に、例えばそのアミ
ノ基のアシル化（e.g.スクシニル化）によって、或いは
酸（例えばコハク酸）の塩に変換することによって修飾
されたコラーゲンであり得る。
【００５７】出発物質が、一以上のこれら異なったタイ
プのコラーゲンから成り得ることは自明である。工程ａ
1 またはａ2 において、出発コラーゲンはジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ
Ｃ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはN-メチル
ピロリドン（ＮＭＰ）のような非プロトン性の極性有機
溶媒中で可溶化される。
【００５８】この可溶化は、好ましくは可溶化剤を用い
て行なわれる。この可溶化剤は溶媒（例えばメタノー
ル）、或いは好ましくは工程ｂで用いられるものに対応
したカルボン酸であり得る。出発コラーゲンがテロペプ
チドを含むならば、該コラーゲンは、それ自体は公知で
ある適切な予備還元、アルカリ化、酸性化および沈殿処
理を施され得る。この処理の目的は、工程ｂ1 の溶媒中
での前記コラーゲンの溶解性を増大させることである。
【００５９】工程1 は、溶解されたコラーゲンをアシル
化およびカルボキシル化するための工程である。これ
は、好ましくはジカルボン酸の無水物を用いて行なわれ
る。この反応は、ジカルボン酸の末端ＣＯＯＨ基の一つ
が、アミノ酸の遊離のＯＨ基またはＮＨ2 基に対して共
有結合で固定されることを可能にする。最終的に、ペプ
チド鎖は、夫々がジカルボン酸の他の末端カルボキシル
基である遊離のＣＯＯＨ基を有する。
【００６０】反応形は無水物の形をとるから、ジカルボ
ン酸は環状無水物を形成できるものから選択される。少
なくとも４つの酸素原子を含むジカルボン酸が好まし
い。例として、以下の化合物リストが挙げられる：コハ
ク酸、グルタル酸、フタル酸、イタコン酸、シトラコン
酸およびマレイン酸。勿論、このリストは上記酸の全て
のタイプの誘導体をカバーするように拡大されるべきで
ある。
【００６１】コハク酸無水物およびグルタル酸無水物は
特に好ましい。該無水物は、有機塩基、好ましくはトリ
エチルアミンまたはN-メチルモルホリン若しくはN-エチ
ルモルホリンのような三級タイプの有機塩基の存在下
で、溶液中においてコラーゲンと反応されるのが有利で
ある。
【００６２】抽出および洗浄の後、問題のジカルボン酸
で置換されたコラーゲンが回収される。その置換の程度
は、コラーゲンに接触される無水物の比率の関数とし
て、および／または使用した塩基の量の関数として調節
され得る。
【００６３】コラーゲン上の使用可能な反応性基の数を
考慮すると、置換の程度は一般的には、コラーゲンの 1
00アミノ酸当たり約22、好ましくは４〜22のアシル化ア
ミノ酸である。好ましくはコラーゲンの 100アミノ酸当
たり４〜22のアシル基置換度を有するこれらのアシル化
コラーゲン、例えばスクシニル化コラーゲンは、安定な
新規中間帯を構成する。
【００６４】得られた置換コラーゲンは、使用した酸無
水物に関係なく、5.5 -7以上のｐＨの水および非プロト
ン性の極性有機溶媒に可溶である。限定の意図ではなく
例示すれば、コハク酸で置換されたコラーゲンは 2.3未
満のｐＨおよび 5.5を越えるｐＨで水に可溶である。
【００６５】アシル化／カルボキシル化の後、該コラー
ゲンは、約10〜30％（数）のカルボキシル基を有するア
ミノ酸残基を含んでいる。これらは、まず第一には酸無
水物と反応したアミノ酸残基であり、第二には出発コラ
ーゲン中に存在するグルタミン酸およびアスパラギン酸
である。
【００６６】方法IIにおける工程ｂ2 は、反応サブユニ
ット、即ちスペーサ化合物／システイン性残基、または
スペーサ化合物／システイン性残基／スペーサ化合物を
調製することにある。
【００６７】該システイン性残基は好ましくは上記タイ
プのものであり、既述したようなジカルボン酸基、例え
ばジスクシニルシスタミンを夫々の末端に有している。
カルボキシル化コラーゲンのカルボキシル基を活性化す
るための工程ｃ1 と、反応性サブユニットを活性化する
ための工程ｃ2 は、 - カルボン酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物と反応
させて、アシル化コラーゲンまたは反応性サブユニット
の個々の遊離カルボキシル基上に混合酸無水物の形成を
導くか、或いは、 - カルボニルジイミダゾールと反応させることにより行
なうのが有利である。
【００６８】酸塩化物を用いる場合、一般的に、該酸塩
化物はアルキル及び／又はアリールクロロカーボネー
ト、および嵩高いカルボン酸の化物の族から選択され
る。好ましくは、エチルクロロホルメート又は塩化トリ
メチルアセチルが選択される。
【００６９】この活性化は、極性の非プロトン性溶媒
（ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＤＭＡＣ、ＮＭＰまたはこれらの
混合物）中において、好ましくはトリエチルアミン、N-
メチルモルホリン、N-エチルモルホリンのような三級有
機塩基（トリエチルアミンが好ましい）の存在下で行な
われる。
【００７０】カルボニルジイミダゾールの場合、上記の
活性化は、非プロトン性の極性溶媒中（有機塩基なし）
で行なわれる。コラーゲンに関して言えば、この活性化
反応は、工程ｂ1 で導入されたカルボキシル残基のみな
らず、グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシ
ル基（即ち、全体では高度にアシル化されたコラーゲン
のアミノ酸の約30％（数））にも影響を与える。
【００７１】例えばエチルクロロホルメートで活性化さ
れたアシル化コラーゲン（例えばスクシニル化コラーゲ
ン）および活性化されたサブユニットは、新規な反応性
中間体を構成する。
【００７２】工程ｄ1 は活性化されたコラーゲンをブロ
ックされた一以上のチオール基を含む「システイン性」
残基と反応させ、また、工程ｄ2 はコラーゲンを活性化
されたスペーサ化合物／システイン性残基サブユニット
と反応させて、初期の修飾コラーゲンの不活性前駆体を
得ることにある。本発明に関する限り、「システイン
性」残基とは、下記の化１に示す一般式の何れかの化合
物を意味するものとして理解される。
【００７３】
【化１】
【００７４】上記式において、 - Ｒ1 は、ＨまたはＣＯＯＲ´1 である。ここで、Ｒ´
1 は脂肪族および／または芳香族および／または環式炭
化水素鎖、好ましくはアルキル、アルキレン、アリール
またはアラルキレン鎖であり、特に好ましくはメチル、
エチル、アリル鎖である； - Ｒ2 は、任意に硫黄を含む脂肪族および／または芳香
族および／または環式炭化水素鎖であり、好ましくは下
記化２，化３に示す一般式からなる群から選択される；
【００７５】
【化２】 および
【００７６】
【化３】
【００７７】ここで、Ｙは１または２である； - ｘは１または２に等しい；方法Ｉにおいて、置換基Ｒ
2 は、システイン性残基がコラーゲンの活性化されたＣ
ＯＯＨ基と反応するのを防止するように、両者が接触し
たときにシステイン性残基のチオール基を保護する手段
を構成する。本発明の好ましい態様に従えば、方法Ｉに
おいて用いられるシステイン性残基は下記化４に示すシ
ステインジメチルエステル：
【００７８】
【化４】 または、下記化５に示すS-トリフェニルメチルシステイ
ンメチルエステルである。
【００７９】
【化５】 ここで、Φは下記化６に示すフェニル基である。
【００８０】
【化６】
【００８１】システイン性残基またはスペーサ化合物／
システイン性残基サブユニットで置換されたコラーゲン
は、取得が望まれる修飾コラーゲンの不活性前駆体を構
成する。これは新規で安定な反応中間体である。
【００８２】本発明の方法の工程ｅ1 およびｅ2 は、保
護基の脱離によってチオール基を再生することにある。
この脱離は、好ましくはメルカプタン類および／または
還元性塩および／または有機還元性化合物から選択され
る還元剤を用いた還元によって行なわれ得る。
【００８３】前記メルカプタンは、メルカプトエタノー
ル、メルカプト酢酸、メルカプトエチルアミン、ベンジ
ルメルカプタン、チオクレゾールまたはジチオトレイト
ールであり得るが、最後の化合物が特に好ましい。
【００８４】還元性塩としては、例えばナトリウムボロ
ハイドライド又は亜硫酸水素ナトリウムが選択され得
る。有機還元性化合物としては、トリブチルホスフィン
のようなホスフィン類が適している。
【００８５】還元剤の混合物、例えば、メルカプトエタ
ノール／ナトリウムボロハイドライドの組合わせを用い
ることが可能である。この反応は、塩基性または中性の
水性媒質中において、または水の存在下または不存在下
での有機溶媒中もしくは混合有機溶媒中において行なわ
れ得る。これらの還元工程ｅ1 およびｅ2 は、特に、問
題のシステイン性残基のＲ2 基が下記化７で示すタイプ
であるときに行なわれる。
【００８６】
【化７】
【００８７】ここで、Ｙ＝１または２である。工程ｅ11
およびｅ21は、ＤＭＦのような本発明の方法に特徴的な
非プロトン性の有機極性溶媒に基づく反応媒質中におい
て、不活性前駆体を、アルコール溶液（例えばメタノー
ル溶液）中のヨウ素のような酸化剤で酸化することにあ
る。ジスルフィド橋によって架橋されたコラーゲンが得
られる。
【００８８】遊離の若しくは置換されたＳＨ基を含む架
橋可能なコラーゲンを得るためには、この架橋されたコ
ラーゲンを還元するために工程ｆ11またはｆ21が行なわ
れなければならない。
【００８９】この還元は、上記の工程ｅ1 およびｅ2 に
おいて行なわれるタイプのものである。工程ｅ1 および
ｆ1 は、不活性前駆体がＣΦ3 タイプの置換基Ｒ2 を有
するシステイン性残基を含むときに行なわれる。
【００９０】他の特徴に従えば、本発明は水および／ま
たは非プロトン性の極性有機溶媒に不溶性の架橋された
コラーゲンを製造するための方法であって、記述した上
記方法の工程ａ，ｂ，ｃ，ｄおよびｅ11またはｅ21を行
なうことからなる方法に関する。
【００９１】コラーゲン鎖にグラフトされたシステイン
性ＳＨ残基が酸化され、これら分子の間にジスルフィド
橋が与えられる。この反応によって、生理学的媒質に不
溶であり、且つジスルフィド橋を還元できる還元性媒質
中に可溶である三次元ネットワークの形成が導かれる。
【００９２】これら異なった分子の間に形成される結合
の数は、置換度および酸化条件に依存する。架橋の程度
は、得られる架橋生成物の機械的強度および生物学的分
解速度に関連して決定される。
【００９３】本発明による架橋可能なコラーゲンおよび
架橋されたコラーゲンは、容易に代謝されて、動物組織
により代謝産物として認識される化合物を与えることが
できるような生物学的性質をもった分子または誘導体の
みを含んでいる。
【００９４】化学的修飾の間に用いられる試薬は、非毒
性の生成物に変換されることができ、或いは、例えば透
析のような非変性的プロセスによって容易に除去され得
る。還元形の修飾コラーゲンは活性化された残基を含ん
でおらず、また酸化された架橋コラーゲンは未反応のチ
オール基を含み得るのみである。これらの基は、多くの
動物タンパク中に天然に存在するから毒性ではない。
【００９５】酸化プロセスは、毒性の物質や、生きた組
織に対して攻撃的な条件の何れをも必要としない。本発
明は、特に架橋の速度および程度を含む全てのコラーゲ
ン架橋現象を制御できる非常に顕著な可能性を提供す
る。このことは、インプラント、補綴物、コンタクトレ
ンズ等のようなタイプのモールド品または押出し品の製
造に特に有用である。
【００９６】本発明の他の顕著な利点は、コラーゲンの
単位マス当りに導入されるシステイン性残基の数を制御
することによって、機械的性質を調節できることであ
る。また、意図した用途の機能として、並びに機械的強
度および望ましい生物学的分解速度を定めるものとして
作成された仕様書に対応した、架橋生成物のクラスを正
確に狙うことも可能である。
【００９７】本発明による生成物および方法は、一方で
はヒト医学または獣医学における直接的な用途を有し、
他方では生物学の分野における直接的な用途を有する。
ヒト医学または獣医学においては、この製品はインプラ
ント（例えば眼科的インプラント）、補綴物（例えば骨
補綴物）、膜またはフェルトの形態の包帯、人工組織
（表皮、血管、靭帯、骨）、イン・ビボにおける活性成
分の放出制御のための包接系（マイクロスフィア、マイ
クロカプセル）、バイオ包接系、埋込み可能な医療用物
体を生体適合性にするための被覆、または縫合糸であり
得る。これらの製品はまた、骨または軟骨を造るための
材質として用いられ得るように、鉱物質充填材（ヒドロ
キシアパタイト、粉末サンゴ等）を添加され得る。
【００９８】生物学においては、本発明に従う材料は、
二次源細胞培養（膜）および三次元細胞培養（フェル
ト）のための優れた支持体を構成する。本発明に従う架
橋されたコラーゲンは、それ自体として、或いは修飾さ
れた若しくは修飾されない生物学的ポリマーまたは合成
ポリマーとの混合物として使用され得る。
【００９９】本発明に従う生成物の他の価値ある用途
は、接着剤の分野、例えば接着性の物品および／または
生体材料、並びに生物学的もしくは外科的糊に関する。
本発明の更なる利点、変形および適用可能性は、以下の
例から明らかになるであろう。
【０１００】
【実施例】
例１：アテロコラーゲンからの、架橋された形態および
架橋可能な形態のコラーゲン- サクシニル- システイニ
ルの合成（工程ａ1 ないしｄ1 、ｅ11およびｆ11）（方
法Ｉ） ＜工程ａ1 ＞：出発アテロコラーゲンの可溶化 コハク酸32ｇをメタノール 270ｍｌに溶解する。この溶
液に25ｇのアテロコラーゲン（ウシ起源- タイプＩ＋II
I - SAOUC により供給される）を懸濁する。 1時間膨潤
させた後、ＤＭＳＯ 290ｍｌまたはＮＭＰ 375ｍｌを添
加し、20℃で溶解が完了するまで媒体を撹拌する。次い
で、この媒体を45μｍフィルターで濾過し、減圧下（約
0.3 mbar ）でメタノールを留去する。 ＜工程ｂ1 ＞：可溶化コラーゲンの活性化およびカルボ
キシル化 工程ａ1 の最後に得られるメタノール非含有コラーゲン
溶液に無水コハク酸30ｇ（ 300 mmol ）を添加し、次い
で、溶解が完了したときに、新鮮な蒸留トリエチルアミ
ン75ｍｌ（ 538 mmol ）を10分間に亘って滴下により添
加する。外部温度調節システムにより温度を25℃に維持
する。得られた溶液を 3ないし15時間撹拌した後、 2容
積のエチルアセテートを添加することによりサクシニル
化コラーゲンを沈殿させる。次いで、この沈殿物を、ア
セトン 250ｍｌの２つの連続浴で洗浄する。得られた固
体残渣をｐＨ 6.5とした蒸留水 300ｍｌに溶解し、その
後この溶液をｐＨ 2とした蒸留水（ 6Ｎ ＨＣｌを用い
た酸性化）に対して透析する。凍結乾燥の後、アミノ酸
の20％がサクシニル化されたコラーゲン21.5ｇが得られ
る。
【０１０１】サクシニル化の程度は２種の技術によって
測定する： - 酸媒体中でコラーゲンを加水分解した後のコハク酸の
酵素的測定、及び - カルボキシル基の電位差測定。 ＜工程ｃ1 およびｄ1 ＞：サクシニル化アテロコラーゲ
ンの活性化およびS-トリフェニルメチルシステインエチ
ルエステルのグラフト 前工程で得られた20％サクシニル化コラーゲン（全酸性
度 10.54 mmol ） 4ｇを無水ＤＭＦ80ｍｌに溶解する。
完全に溶解した後、激しく撹拌しながらトリエチルアミ
ン1.72ｍｌ（12 mmol ）を添加する。エチルクロロホル
メート1.92ｍｌ（20 mmol ）を滴下により添加する前
に、反応媒体を -5 ℃に冷却する。15分後、サクシニル
化コラーゲンが活性化されて工程ｃ1 が完了する。
【０１０２】工程ｄ1 は、システインメチルエステルを
トリフェニルメタノールおよびBF3エーテラートに（50
℃をこえる温度で）接触させることにより得られるS-ト
リフェニルメチルシステインメチルエステル 7.2ｇ（18
mmol ）を反応媒体に添加することにより開始する。次
いで、反応媒体を 20-25℃で16時間撹拌する。続いて、
形成されたコラーゲン誘導体をエチルアセテート 400ｍ
ｌを添加することにより沈殿させる。ＤＭＦに再溶解
し、エチルアセテートで再沈殿させた後、得られたコラ
ーゲン誘導体をメタノールで洗浄し、次いで減圧下、 2
0-25℃で乾燥させて乾燥生成物 4.5ｇを得る。 ＜工程ｅ11およびｆ11＞：保護基 -“ＣΦ3 ”- の脱ブ
ロック化およびジスルフィド橋によって架橋したコラー
ゲンの調製 工程ｄ11において形成された生成物 4.5ｇをＤＭＦ45ｍ
ｌ中で 3時間撹拌する。この誘導体はこの段階で完全に
可溶化する。メタノール20ｍｌ中の可溶化されたヨウ素
1.45ｇ（ 7 mmol ）を添加する。
【０１０３】ゲルが形成される。この媒体を18時間静置
した後、脱色が完了するまで水／アセトン混合液（50／
50 v/v）で数回洗浄する。エチルアセテートで 3回洗浄
した後、生成物を乾燥させて乾燥最終誘導体3.46ｇを得
る。
【０１０４】得られるコラーゲンの置換の程度は、ＤＴ
ＮＢを用いるチオール基の測定によると、アミノ酸 100
当りシステイン残基 3ないし 5のオーダーである。この
架橋誘導体をジチオトレイトールで還元して、空気、過
酸化水素またはヨウ素と容易に架橋し得るコラーゲンチ
オール誘導体を得ることができる。
【０１０５】例２：アテロコラーゲンのサクシニル塩か
らの、架橋した形態および架橋し得る形態のコラーゲン
- サクシニル- システイニルの合成（方法Ｉ） ＜予備工程＞：アテロコラーゲンのサクシニル塩の調製 コハク酸12ｇ（ 102 mmol ）をイソプロパノール 225ｍ
ｌに溶解する。この反応媒体にアテロコラーゲン12ｇを
添加し、 20-25℃で 2時間、磁気的に撹拌する。
【０１０６】50μｍシーブで濾過した後、コラーゲン繊
維の水分を切り、次いで再度ふるいにかける前にイソプ
ロパノール 150ｍｌで 2回洗浄する。続いて、減圧下、
25-30 ℃で 4時間乾燥させた後、アテロコラーゲンの乾
燥サクシニル塩13ｇを除去する。 ＜工程ａ1 およびｂ1 ＞：塩の可溶化およびサクシニル
塩からのサクシニル化アテロコラーゲンの合成 アテロコラーゲンのサクシニル塩10ｇを、磁気的に撹拌
しながら、ＤＮＦ／ＤＭＳＯ混合液（60／40 v/v） 240
ｍｌに溶解する。この媒体に、新鮮な蒸留トリエチルア
ミン 8.7ｍｌ（62.5 mmol ）と共に無水コハク酸 3.9ｇ
（39 mmol ）を添加する。この反応媒体を磁気的に撹拌
しながら 20-25℃で24時間放置した後、蒸留水に対して
透析する。ｐＨ 2-4に酸性化した後、ｐＨ 2の水に対し
て透析する前に、アセトンで生成物を沈殿させる。凍結
乾燥の後、 9.5％サクシニル化誘導体（電位差測定によ
る決定） 8ｇが得られる。 ＜工程ｃ1 およびｄ1 ＞：サクシニル化アテロコラーゲ
ンの活性化およびS-トリフェニルメチルシステインメチ
ルエステルのグラフト 9.5％サクシニル化アテロコラーゲン（全酸性度 8.37 m
mol） 4.5ｇを、 20-25℃で18時間、磁気的に撹拌しな
がら、無水ＤＭＦ90ｍｌに溶解する。媒体を-5／-10 ℃
に冷却した後、トリエチルアミン 1.575ｍｌ（11.3 mmo
l ）を添加し、次いで、エチルクロロホルメート 1.2ｍ
ｌ（12.6 mmol ）を滴下により添加する。 -5／-10 ℃
で15分間撹拌した後、サクシニル化コラーゲンが活性化
され、工程ｃ1 が完了する。
【０１０７】工程ｄ1 は、反応媒体にS-トリフェニルメ
チルシステインメチルエステル 6.8ｇ（16.5 mmol ）を
添加することにより開始し、これを磁気的に撹拌しなが
ら-5℃で 1時間、次いで 20-25℃で16時間放置する。
【０１０８】続いて、形成された誘導体をエチルアセテ
ート 400ｍｌで沈殿させる。ＤＭＳＯに再溶解し、エチ
ルアセテート中に再沈殿させた後、この誘導体をメタノ
ールで洗浄し、次いで減圧下で乾燥させて乾燥生成物
7.6ｇを得る。 ＜工程ｅ11およびｆ11＞：保護基 -“ＣΦ3 ”- の脱ブ
ロック化およびジスルフィド橋によって架橋されたコラ
ーゲンの調製 工程ｄ1 で形成された生成物 7.6ｇをＤＭＦ80ｍｌ中で
3時間撹拌する。メタノール 100ｍｌを添加する。誘導
体はこの段階で完全に可溶化される。次いで、メタノー
ル20ｍｌ中の可溶化されたヨウ素1.77ｇ（ 7 mmol ）を
添加する。
【０１０９】ゲルが形成される。この媒体を18時間静置
した後、脱色が完了するまで水／アセトン混合液（50／
50 v/v）で数回洗浄する。エチルアセテートで 3回洗浄
した後、生成物を乾燥して乾燥最終誘導体 6ｇを得る。
【０１１０】得られた修飾コラーゲンの置換の程度は、
ＤＴＮＢを用いるチオール基の測定により、アミノ酸 1
00当りシステイン残渣11であると評価される。この架橋
誘導体をジチオトレイトールで還元して、空気、過酸化
水素およびヨウ素と容易に架橋し得るコラーゲンチオー
ル誘導体を得ることができる。
【０１１１】例３：テロペプチドを有するタイプＩ＋II
I ウシコラーゲンからの（架橋および架橋可能な）コラ
ーゲン- サクシニル- システイニルの合成（方法Ｉ） ＜工程ａ1 およびｂ1 ＞：テロペプチドを有するタイプ
Ｉ＋III ウシコラーゲンを50℃で水80ｍｌに溶解し、得
られた溶液をこの温度で 1時間撹拌する。次いで、コラ
ーゲン溶液を約30℃に冷却した後、ジチオトレイトール
0.25ｇ（1.11 mmol ）を添加し、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈを 9.5とする。得られた溶液を 1時間撹拌した後、塩
酸を用いてｐＨを 2.5-3とする。次いで、 2容量のアセ
トンを用いてコラーゲンを沈殿させ、同溶媒中で洗浄し
た後、濾過により回収して減圧下で乾燥させる。
【０１１２】前に得られた粉末コラーゲン（ 2.2ｇ）を
メタノール20ｍｌに懸濁し、15分間撹拌した後、コハク
酸 0.4ｇ（3.29 mmol ）を含有する無水ジメチルスルホ
キシド40ｍｌを添加する。30分間撹拌した後、減圧下30
℃でメタノールを留去する。得られた溶液に無水コハク
酸2.91ｇ（29.1 mmol ）、次いで、無水コハク酸が溶解
した後、新鮮な蒸留トリエチルアミン 4.5ｍｌ（32.3 m
mol ）を添加する。この媒体を20℃で 2時間撹拌する。
アセトン 200ｍｌを用いてサクシニル化コラーゲンを沈
殿させた後、濾過により回収する。その後、この沈殿物
をｐＨ 8の水80ｍｌに溶解して 15,000 ｇで20分間遠心
し、その上清を、塩酸でｐＨを約 2に保った蒸留水に対
して透析する。透析物を凍結乾燥し、電位差測定によっ
て決定された18％の置換度を有するサクシニル化コラー
ゲン 2.3ｇを得る。 ＜工程ｃ1 、ｄ1 およびｅ1 ＞：18％サクシニル化ウシ
コラーゲン（カルボキシル基約 2.52 mmol） 1ｇを無水
ＤＭＳＯ25ｍｌに可溶化する。この非常に粘性の高い溶
液に粉末カルボニルジイミダゾール0.55ｇ（3.39 mmol
）を添加する。この媒体を減圧下で脱気し、45分間撹
拌する。無水ＤＭＳＯ 5ｍｌ中に溶解したシスチンジメ
チルエステル 0.8ｇ（2.35 mmol ）を添加することによ
り数分以内にゲルが得られる。このゲルを暗所に18時間
放置する。これをアセトン 100ｍｌ中に分散させ、2 時
間撹拌した後数個のアセトン浴で洗浄する。濾過により
回収し、減圧下で乾燥させる。
【０１１３】得られた修飾コラーゲン（ 1ｇ）をｐＨ
9.5に維持される水50ｍｌに懸濁させる。ｐＨ 9.5に維
持される水10ｍｌ中ジチオトレイトール 0.4ｇ（ 2.6 m
mol ）の溶液を添加し、この媒体を 20-25℃で18時間撹
拌する。得られた溶液を１５，０００ｇで１５分間遠心
して上清をｐＨ 1.8に酸性化し、得られるゲルをｐＨ
1.5-1.8の蒸留水に対して透析する。透析物を凍結乾燥
し、出発コラーゲンのアミノ酸 100当りチオール基約 9
の置換度を有する修飾コラーゲン 0.985ｇを得る。
【０１１４】例４：テロペプチドを有するタイプＩ＋II
I ウシコラーゲンからのコラーゲン- サクシニル- シス
タミンの合成（方法Ｉ） プロトコルは例３と同じである。
【０１１５】サクシニル化コラーゲン 1ｇからチオ化コ
ラーゲン1.05ｇを得る。グラフト率は、出発コラーゲン
のアミノ酸に基づいて14％であると見積られる。 例５：テロペプチドを有するコラーゲンからのコラーゲ
ン- サクシニル-シスタミニルの合成および脱サクシニ
ルシスタミン反応サブユニット（方法II） 酸可溶性コラーゲン 2.2ｇ（リシル残基約0.78 mmol ）
をメタノール75ｍｌ中で15分間撹拌した後、ジメチルス
ルホキシド 125ｍｌを添加する。この混合物を40℃で15
分間撹拌した後、メタノールを減圧下で留去する。（塩
基性水性媒体中で無水コハク酸をシスアミンと反応させ
ることにより得られる）ジサクシニルシスタミンのジイ
ミダゾール塩 0.707ｇ（ 1.564 mmol ）をＤＭＳＯ20ｍ
ｌに溶解し、得られた溶液をコラーゲン溶液に添加す
る。この混合液を 20-25℃で20時間撹拌した後、得られ
たゲルをアセトン 200ｍｌに分散させ、この溶媒 100ｍ
ｌ×2で洗浄し、次いで、水酸化ナトリウムでｐＨ 7-9.
5に維持される水 500ｍｌ×2で 2時間に亘って洗浄す
る。
【０１１６】このゲルを濾過により回収した後、水酸化
ナトリウムでｐＨ 9.5に調整されるジチオトレイトール
（ 0.5ｇ、3.25 mmol ）の水溶液50ｍｌ中に入れる。 2
0-25℃で18時間撹拌した後、この媒体を40℃で15分間加
熱し、次いで15,000ｇで10分間遠心する。その後、上清
をｐＨ 1.8に酸性化し、同じｐＨの水に対して透析す
る。次に、コラーゲン媒体を凍結乾燥し、出発コラーゲ
ンのアミノ酸の 3％がチオ化されたコラーゲン 1.8ｇを
得る。
【０１１７】例６：タイプＩ＋III ウシコラーゲンから
のコラーゲン- サクシニル-シスタミニルの合成（方法
Ｉ） 18％サクシニル化アテロコラーゲン（カルボキシル基約
25 mmol）10ｇを無水ジメチルスルホキシド 150ｍｌに
溶解する。得られた粘性溶液を減圧下で脱気した後、 2
0-25℃の温度で粉末カルボニルジイミダゾール 9.1ｇ
（56 mmol ）を全量一度に添加する。カルボニルジイミ
ダゾールが溶解した後、得られた溶液を減圧下で 1ない
し 2時間脱気する。塩酸シスタミン 7.6ｇ（33.77 mmo
l）を40℃で無水ＤＭＳＯ50ｍｌに溶解し、得られた溶
液を、激しく撹拌しながら、活性化コラーゲンの溶液に
全量一度に添加する。数分以内に得られるゲル状媒体を
20-25℃で 3-24 時間静置する。次に、このゲルをエチ
ルアセテート 400ｍｌに分散させ、濾過により回収した
後、アセトン 300ｍｌで 2回洗浄する。次いで、得られ
た顆粒状生成物を、水酸化ナトリウムでｐＨ10に維持さ
れる水に16時間分散させ、続いて濾過により回収する。
得られた生成物をｐＨ10の水90ｍｌに懸濁した後、ｐＨ
10の水20ｍｌ中ジチオトレイトール3.85ｇ（25 mmol ）
の溶液を添加する。得られた混合液を20℃で16時間撹拌
し、15,000ｇで15分間遠心する。
【０１１８】その上清を塩酸でｐＨ 1.8に酸性化した
後、ｐＨ 1.5-2の水に対して透析する。透析物を凍結乾
燥してチオ化コラーゲン10.7ｇを得る。ＤＴＮＢ法によ
るチオール基の測定は、コラーゲンのアミノ酸を基にし
て15％の置換度、すなわち、出発サクシニル化コラーゲ
ンのカルボキシル基に基づいて約55％の置換度を示す。
【０１１９】例７：タイプＩ＋III ウシアテロコラーゲ
ンからのコラーゲン- サクシニル-システイニルの合成
（方法Ｉ） 18％サクシニル化アテロコラーゲンを例６と同様の条件
下で活性化する。シスチンジメチルエステル 8.5ｇ（25
mmol ）を無水ＤＭＳＯ10ｍｌに溶解した後、得られた
溶液を活性化コラーゲンの溶液に添加する。この媒体を
20-25℃で 16-60時間撹拌する。得られたゲルを激しく
撹拌しながら 3容量のアセトンに分散させ、この溶媒 1
50ｍｌ中で 3回洗浄した後、濾過により回収する。その
後、この修飾コラーゲンを、減圧下で残留アセトンを蒸
発させることにより粉末の形態で得るか、または直接次
の工程に用いることができる。
【０１２０】修飾コラーゲンを、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ 9.5に維持される水 100ｍｌに懸濁させる。この懸濁
液に、ｐＨ 9.5の水20ｍｌ中ジチオトレイトール3.85ｇ
（25mmol ）の溶液を添加する。この混合物を 20-25℃
で 16-24時間撹拌し、15,000ｇで15分間遠心する。その
上清を塩酸でｐＨ 1.8に酸性化した後、透析水に対する
ＤＴＮＢ試験が陰性となるまで、ｐＨ 1.5-2の水に対し
て透析する。透析物を凍結乾燥する。ＤＴＮＢ法による
チオール基の測定は、コラーゲンのアミノ酸に基づいて
約 9％の置換度を示す。
【０１２１】例８：アテロコラーゲンからのコラーゲン
- サクシニル- シスタミニルの合成（方法II） タイプＩ＋III ウシアテロコラーゲン 2.4ｇ（リシル残
基約 0.855 mmol ）を、例３、工程ｂ1 に記載の方法に
よって、無水ＤＭＳＯ30ｍｌに溶解する。
【０１２２】ジサクシニルシスタミン 0.6ｇ（1.7 mmo
l）をジメチルホルムアミド20ｍｌに溶解し、さらに粉
末カルボニルジイミダゾール0.55ｇ（3.41 mmol ）を添
加する。この溶液を減圧下で脱気し、 2時間撹拌する。
【０１２３】得られた異種媒体を前に得られたコラーゲ
ン溶液に添加し、得られた溶液を20-25 ℃で18時間撹拌
する。その後、 3容量のアセトンを添加することにより
コラーゲンを沈殿させ、濾過により収集する。次いで、
この沈殿物を酸性ｐＨに維持される水 200ｍｌに分散さ
せ、この懸濁液を18時間撹拌する。
【０１２４】洗浄した沈殿物を、水酸化ナトリウムでｐ
Ｈ10に維持される水50ｍｌに分散させる。ｐＨ10の水 5
ｍｌ中ジチオトレイトール0.26ｇ（1.7 mmol）の溶液を
得られた懸濁液に添加する。この媒体を 20-25℃で 24-
48時間撹拌し、塩酸でｐＨ 1.8に酸性化する。得られた
ゲルをｐＨ 1.5-2の水に対して透析した後、凍結乾燥し
て修飾コラーゲン 2.3ｇを得る。ＤＴＮＢ法によるチオ
ール基の測定は、出発コラーゲンのアミノ酸に基づいて
3.1％の置換度を示し、これはリシル基のほぼ100％の
置換度に相当する。
【０１２５】例９：アテロコラーゲンからのコラーゲン
- サクシニル- システイニルの合成（方法Ｉ） 例２に記載のプロトコルに従い、アテロコラーゲン 4ｇ
（リシル基約 1.42mmol）をＤＭＳＯに溶解する。ジサ
クシニルシスチンジメチルエステル 0.7ｇ（カルボキシ
ル基 3 mmol ）をＤＭＳＯ10ｍｌに溶解した後、カルボ
ニルジイミダゾール 0.486ｇ（ 3 mmol ）を添加する。
この溶液を撹拌して減圧下で 1時間脱気した後、コラー
ゲン溶液に添加する。 20-25℃で72時間静置した後、こ
の反応媒体をアセトン 300ｍｌに分散させる。その固相
をアセトン 200ｍｌで 1時間、次いで、水酸化ナトリウ
ムでｐＨ 9-9.5に維持される水 500ｍｌ中で 2× 1時間
洗浄する。このゲルを濾過により回収した後、ｐＨ 9.5
の水70ｍｌに分散させる。
【０１２６】この懸濁液にｐＨ 9.5のジチオトレイトー
ル（ 6ｍｌ、 0.7ｇ、4.54 mmol ）水溶液を添加する。
18時間の反応時間の後、この媒体を30℃で10分間加熱
し、次いで15,000ｇで15分間遠心する。その上清に例７
と同様の処理を施し、出発コラーゲンのアミノ酸の 2.4
-2.8％がチオ化されたコラーゲン 3.9ｇを得る。 ＜チオール化されたコラーゲンの酸化架橋＞全てのチオ
ール化されたコラーゲンは、酸化剤の存在下で酸化可能
であり架橋可能である。溶液中におけるコラーゲンの酸
化条件（水性溶液、有機溶液または混合溶液、温度、イ
オン強度、ｐＨ、濃度）および酸化剤の性質に依存し
て、架橋はゲルの形成または溶液の粘度の変化による沈
殿をもたらす。
【０１２７】使用される酸化剤としては、酸化剤それ自
体、紫外線の存在下における酸素、酸性、中性または塩
基性媒質中の過酸化水素、アルコール性もしくは水性溶
液中のヨウ素が挙げられる。架橋はまた、例えば酸化性
溶液中に浸漬することによって、膜または粉末の形態の
可溶化されていないチオール化コラーゲンに対しても行
なわれ得る。
【０１２８】全ての酸化されたコラーゲンは、水性媒質
および有機媒質中において不溶であるが、塩基性ｐＨの
還元製溶液、例えばｐＨ 9.5のジチオトレイトール水性
溶液中において可溶化され得る。
【０１２９】例１０：ゲルの形成 例８で製造したアテロコラーゲン 0.5ｇ（約0.16 mmol
のチオール基を含む）を40℃で10mlの水に溶解し、該溶
液を水酸化ナトリウムでｐＨ７とし、またｐＨ９の 1M
カーボネート緩衝液でｐＨ 8.2とした。この溶液を0.22
マイクロメータのフィルター上で濾過し、次いで温度を
低下することによりゲル化させた。
【０１３０】こうして得られた温度可逆性のゲルは、0.
15％の過酸化水素を含むｐＨ 8.2の0.15 M ほう酸ナト
リウム緩衝液 150ml中に浸漬され、穏やかに撹拌しなが
ら、該溶液中に６〜24時間保持された。次いで、得られ
た透明なゲルは水浴中で数回洗浄され、25％エタノール
水溶液中に保存され得る。
【０１３１】このゲルはもはや温度可逆性ではなく、且
つ遊離のチオール基を含んでいない。 例１１：膜の形成 例８で製造したコラーゲン 0.7ｇ（約0.23 mmol のチオ
ール基を含む）を40℃で50mlの水に溶解し、次いで例１
０のようにしてｐＨを 8.2にした。0.22マイクロメータ
のフィルター上で濾過した後、この溶液を120mm ×120m
m のポリスチレンボックス上に流し込み、20〜25℃で空
気中に解放して蒸発させた。得られた膜を、次いで100m
l の過酸化水素溶液（例１０）中に１〜５時間浸漬し、
続いて水で洗浄した。この膜は、乾燥状態または25％エ
タノール水溶液中で保存され得る。
【０１３２】例１２：組織接着剤の生体外での評価 ウサギ筋肉組織（背）に対する、本発明による生成物の
接着剤特性の評価を行なった。この組織は、生理的食塩
水溶液中において４℃で最大48時間に維持された。この
ウサギ組織を、電気カッターを用いて繊維に沿って切断
した（mmでの寸法：2.5 ×2.5 ×2.5 ）。
【０１３３】試験は標準収縮機、例えば 100Ｎの力ゲー
ジを備えたAdamel Lhormargy DY34を用いて行なった。
この機械によって力- 変位曲線を得ることができ、該曲
線から最終接着強度（張力モードで）および接着エネル
ギー（曲線かの面積から）を計算することができる。
【０１３４】夫々のタイプの試験において、シアノアク
リレート接着剤（例えば LOCTITE（商標名）強力接着剤
液状またはゲル状）を用いることにより、ウサギ組織の
二つの試験検体が寸法の大きい極めて剛性の不活性支持
体、例えばガラスまたはカードボード上に貼着された。
この試験は、３分の接触時間の後に４Ｎの圧力下で行な
われた。
【０１３５】スクシニル化システアミンコラーゲン（例
４で調製されたもの）の５％溶液が、不活性雰囲気下で
調製された。そのｐＨは７〜８に調節された。試験の前
に、組織の表面は BETADINE （商標名）皮膚溶液（ヨウ
素化ポリビニルピロリドン）で浅く浸され、次いで 100
μｌのコラーゲン溶液が二つの組織の間に添加された。
ヨウ素化溶液との接触に際し、漸進的なゲル化が観察さ
れた。
【０１３６】４Ｎの圧力下で３分経過した後に、試験さ
れたコラーゲン- シスチンは 3.5±1.9 Ｎの接着強度
（14試験の平均）と、 7.0±3.1 ｍＪの接着エネルギー
を示した。
【０１３７】これらの興味深い結果は、フィブリン接着
剤についての同様の試験で得られた結果と比較された。
即ち、BIOCOL（商標名）接着剤（200 μｌを添加）につ
いては、接着強度は 2.5±1.6 Ｎ（17試験の平均）であ
り、接着エネルギーは 3.8±2.0 ｍＪであった。

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 架橋可能な修飾コラーゲンであって、水
    および／または非プロトン性の極性有機溶媒に可溶であ
    り、システインまたはその誘導体の残基に担持された遊
    離の若しくは置換されたチオール基を有し、前記残基の
    少なくとも幾つかはスペーサ化合物を介してコラーゲン
    に固定されている架橋可能な修飾コラーゲン。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の修飾コラーゲンであっ
    て、前記スペーサ化合物が、環状無水物を形成できるジ
    カルボン酸に由来する炭素環性の炭化水素ユニットであ
    る修飾コラーゲン。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の修飾コラーゲンであっ
    て、問題の前記ジカルボン酸が、コハク酸、グルタル
    酸、フタル酸、イタコン酸、シトラコン酸、マレイン酸
    およびこれらの誘導体からなる非限定的化合物群から選
    択される修飾コラーゲン。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の修飾コラーゲンであっ
    て、前記遊離の若しくは置換されたチオール基を担持す
    る残基が、システイン、シスチン、ホモシステイン、ホ
    モシスチン、システアミン及びシスタミンからなる非限
    定的化合物群から選択される修飾コラーゲン。
  5. 【請求項５】 不溶性の架橋されたコラーゲンであっ
    て、その鎖間の架橋構造が、少なくとも一部はコラーゲ
    ンに固定されたシステイン性残基から得られるジスルフ
    ィド橋によって形成され、少なくとも一部はスペーサ化
    合物を介して形成される架橋されたコラーゲン。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の架橋されたコラーゲン
    であって、請求項１〜４の何れか一つに記載のコラーゲ
    ンから得られる架橋されたコラーゲン。
  7. 【請求項７】 水および／または非プロトン性の極性有
    機溶媒に可溶であり、且つ遊離の若しくは置換されたチ
    オール基を有する架橋可能または自動架橋可能な修飾コ
    ラーゲンの製造方法であって、 -ａ1 - 少なくとも一つの非プロトン性の極性有機溶媒
    中において、出発コラーゲンを可溶化する工程と、 -ｂ1 - 該可溶化されたコラーゲンをアシル化およびカ
    ルボキシル化する工程と、 -ｃ1 - 該コラーゲンの遊離カルボキシル基を活性化す
    る工程と、 -ｄ1 - 該活性化されたコラーゲンを、一以上のブロッ
    クされたチオール基を含み、適切な場合には一以上のブ
    ロックされたカルボキシル基を含むシステイン性残基と
    反応させ、所期の修飾コラーゲンの不活性前駆体を得る
    工程とを具備した方法。
  8. 【請求項８】 水および／または非プロトン性の極性有
    機溶媒に可溶であり、且つ遊離の若しくは置換されたチ
    オール基を有する架橋可能または自動架橋可能な修飾コ
    ラーゲンの製造方法であって、 -ａ2 - 少なくとも一つの極性有機溶媒中において、出
    発コラーゲンを可溶化する工程と、 -ｂ2 - 保護されたチオール基を含んだスペーサ化合物
    ／システイン性残基サブユニットを調製する工程と、 -ｃ2 - 該サブユニットの遊離カルボキシル基を活性化
    する工程と、 -ｄ2 - 前記コラーゲンを該サブユニットと反応させ
    て、所期の修飾コラーゲンの不活性前駆体を得る工程と
    を具備した方法。
  9. 【請求項９】 請求項７または８に記載の方法であっ
    て、追加の工程として更に、 -ｅ1 又はｅ2 - 前記不活性前駆体を、好ましくは還元
    によって直接活性化し、安定化された遊離の若しくは置
    換されたチオール基を担持した修飾コラーゲンを得る工
    程を具備した方法。
  10. 【請求項１０】 請求項７または８に記載の方法であっ
    て、追加の工程として更に、 -ｅ11又はｅ21- 前記不活性前駆体を、好ましくは酸化
    によって間接的に活性化し、鎖間のジスルフィド橋を介
    して架橋されたコラーゲンを得る工程と、 -ｆ11又はｆ21- 該架橋されたコラーゲンを、好ましく
    は還元によって、安定化された遊離の若しくは置換され
    たチオール基を担持する修飾コラーゲンに変換する工程
    とを具備した方法。
  11. 【請求項１１】 架橋された不溶性コラーゲンの製造方
    法であって、請求項７および請求項９に記載の工程ａ1
    〜ｄ1 およびｅ1 、または請求項８および請求項９に記
    載の方法の工程ａ2 〜ｄ2 およびｅ2 を実行することか
    らなる方法。
  12. 【請求項１２】 請求項７〜１１の何れか１項に記載の
    方法を実行したときに得られるコラーゲンからなる中間
    体であって、該コラーゲンはその少なくとも幾つかの反
    応性ＯＨ基およびＮＨ2 基を介してジカルボン酸と反応
    され、100 アミノ酸当り４〜22のカルボキシルグラフト
    を含んでいる中間体。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の中間体であって、
    前記ジカルボン酸がコハク酸またはグルタル酸である中
    間体。
  14. 【請求項１４】 請求項１〜４の何れか１項に記載の架
    橋可能な修飾コラーゲン、請求項７〜１１の何れか１項
    に記載の方法によって得られる架橋可能な修飾コラーゲ
    ン、請求項５〜６に記載の架橋されたコラーゲン、また
    は請求項１１に記載の方法によって得られる架橋された
    コラーゲンの、医療において用いられ得る物品への適用
    であって、インプラント、補綴物、人工皮膚、包帯、補
    綴物のための被覆材等を含むタイプの物品への適用。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜４の何れか１項に記載の架
    橋可能な修飾コラーゲン、請求項７〜１１の何れか１項
    に記載の方法によって得られる架橋可能な修飾コラーゲ
    ン、請求項５〜６に記載の架橋されたコラーゲン、また
    は請求項１１に記載の方法によって得られる架橋された
    コラーゲンの適用であって、接着性物品および／または
    生体材料の製造、並びに生物学的もしくは外科的糊の製
    造のための適用。
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