JPH0684366B2

JPH0684366B2 - 抗腫瘍抗生物質ｂｕ―３２８５ｔ

Info

Publication number: JPH0684366B2
Application number: JP2183875A
Authority: JP
Inventors: 広昭大熊; 康二富田; 正隆小西; 英夫亀井
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1989-07-12
Filing date: 1990-07-11
Publication date: 1994-10-26
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: JPH03115276A; CA2020878A1; PT94670B; FI95286B; PT94670A; IE902535A1; CA2020878C; EP0408336B1; US4952709A; FI95286C; ES2060957T3; AU5892890A; AU617950B2; EP0408336A3; IE64853B1; EP0408336A2; ATE111091T1; KR930005868B1; FI903459A0; DE69012245T2

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景（１）発明の分野本発明は新規抗腫瘍抗生物質、BU−3285T、および属カ
イニア（Chainia）に属する微生物の培養によりそれを
製造する方法に関する。この化合物は高水準の抗腫瘍活
性を示し、また抗真菌活性を有する。本発明はまた一定
のスルファターゼ酵素によるBU−3285Tのスルファート
結合の酵素開裂により得られるBU−3285Tデスルファー
トに関する。デスルファート誘導体は抗腫瘍活性を有す
る。

（２）従来技術の説明出願人が知っている従来技術の文献の中で以下のものが
最も近い従来技術であると思われるものに相当する。

1985年１月22日に発行された米国特許第4,495,286号
は、抗生物質および抗腫瘍薬として有用であるCL1565抗
生物質複合体を産生できる微生物ストレプマイセス・プ
ルフェラカス・亜種フォストレウス（Streptomyces pul
veracus subsp.fostreus）ATCC31906の生物学的に純粋
な培養株を開示している。

1986年３月25日に発行された米国特許第4,578,383号は
新規なリン含有抗生物質化合物CL1565およびそれらの
塩、並びに該化合物の種々の塩を単独でまたは他の抗腫
瘍薬と組合せて含む薬学的組成物を教示している。

1987年７月14日に発行された米国特許第4,680,416号は
新規なピラノン化合物および関連化合物、該化合物の製
法、並びに細胞毒および（または）抗白血病薬としての
それらの使用を教示している。

これらの文献はいずれも本発明の新規化合物または抗腫
瘍および抗真菌抗生物質薬としてのそれらの使用は教示
されていない。

発明の概要本発明はBU−3285Tとして示される新規な抗腫瘍および
抗真菌抗生物質、並びにこゝにカイニア・ロセア（Chai
nia rosea）株L827−７（ATCC−53903）として示される
新放線菌を用いてBU−3285Tを製造する発酵法に関す
る。本発明はまたBU−3285Tの脱硫酸誘導体および一定
のスルファターゼによるBU−3285Tの酵素処理によるそ
の製造に関する。BU−3285Tデスルファートは抗腫瘍活
性を有することが認められた。

発明の詳細な説明 BU−3285Tの製造に好ましい産生株はインドのグジャラ
ト州で採集された土壌試料から分離された放線菌、株N
o.L827−７である。新抗生物質BU−3285T並びに既知共
生産物質、クロモマイシン、ペンタレノラクトン（pent
alenolactone）およびアブラマイシン（aburamyein）、
の混合物がこの株の発酵により得られた。

形態学、培養および生理学的特徴並びに細胞化学に基づ
いて、前記産生株はカイニア（Chainia）の種、すなわ
ちカイニア・ロセア（Chainia rosea）として確認され
た。

形態学：気生菌糸は形成されないかまたは寒天培地上にわずかに
生成される。基中菌糸はよく枝分れし、非分節的であ
る。基中菌糸中に、単または複数ホラウス（phorous）
菌糸を有する風船状半透明体（３×10μｍ）が主に産生
され、それは硬い球状体（直径10〜60μｍ）になる。走
査電子顕微鏡検査は球状表面が波うち、膜をもたないこ
とを示す。極薄細片顕微鏡写真は不規則に巻いた小球エ
ンベロープおよび部分膨潤菌糸を示し、それらは細胞外
代謝物質で接合されている。

気生菌糸はほとんど形成されないが密または開放らせん
胞子鎖（20〜50またはそれ以上の胞子毎鎖）をもつ。胞
子は卵形または長円形（0.6×0.8〜1.2μｍ）であり、
滑らかな表面を有する。

培養および生理学的特徴：気生菌糸は通常形成されないが、しかしISP培地No.4お
よび７上にわずかにみられる。基中菌糸のリバースカラ
ーは濃橙〜暗赤褐色である。これらの色素は拡散性でな
い。

メラニンは生成されず、チロシナーゼ反応は陰性であ
る。

細胞化学：全細胞水解物はLL−ジアミノピメリン酸およびマンノー
スを含み、従ってタイプＩに属する。リン脂質はホスフ
ァチジルエタノールアミンを含み、従ってＰ−II型であ
る。小球体は2,3−ジアミノプロピオン酸を含む。

変異株：良好な気生菌糸を形成する自然変異体が反復継代で生ず
る。

分類位置：小球体はカイニア（Chainia）中に記載される菌核とし
て確認される^1,2。形態学および細胞化学は株L827−７
が属カイニア（Chainia）中へ分類されることを示し
た。表１および２中に示される培養および生理学的特徴
は当該株がカイニア・アウレア（Chainia aurea）、C.
フラバ（flava）、C.ミヌチスクレロチカ（minutiscler
otica）、C.ロセア（rosea）、およびC.ルブラ（rubr
a）、殊に属の15種の中でC.ロセア（rosea）に類似する
ことを明らかにした^1,2,3。

従ってL827−７はカイニア・ロセア（Chainia rosea）
の新株として確認された。

1.レケバリーアほか（Lechevalier,M.P.;H.A.Lechevali
er and C.E.Heintz）：アクチノミセターレス（Aetinom
ycetales）目のカイニア・オリバセア（Chainia olivac
ea）、チルマラカル（Thirumalachar）およびスカプレ
（sukapure）の菌核の形態および化学的性質、インタナ
ショナル・ジャーナル・オブ・システマチック・バクテ
リオロジー（Int.J.Syst.Bacteriol.），23:157〜170,1
973。

2.ルアンほか（Ruan,J.;M.P.Lechevalier,C.Jiang and
H.A.Lechevalier）：カイニア・クンミンゲンシス（Cha
inia kunmingensis），土壌中に発見された新放線菌
種、インタナショナル・ジャーナル・オブ・システマチ
ック・バクテリオロジー（Int.J.Syst.Bacteriol.），3
5:164〜168,1985. 3.シャーリングほか（Shirling,E.B.and D.Gottlie
b）：ストレプトマイセス（Streptomyces）のタイプ株
の協同的説明:V.追加説明．インタナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Int.
J.Syst.Bacteriol.），22:265〜394,1972。

カイニア・ロセア（Chainia rosea）株No.L827−７の生
物学的に純粋な培養株はアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（American Type Culture Collectio
n,Rockville,Maryland）に受託番号ATCC−53903のもと
で寄託された。

他の微生物の場合のように、本発明の新BU−3285T産生
培養株カイニア・ロセア（Chainia rosea）ATCC−53903
の特徴は変化を受け易い。ATCC−53903株の組換え体、
変異体および突然変異体は既知変異体例えば紫外線、Ｘ
線、高周波、放射線および薬品による処理により得るこ
とができる。BU−3285Tを産生する特徴を保持するカイ
ニア・ロセア（Chainia rosea）ATCC−53903の自然およ
び誘発変異体、突然変異体および組換え体は本発明によ
り包含されるものとする。

BU−3285Tはカイニア・ロセア（Chainia rosea）のBU−
3285T産生株、好ましくはカイニア・ロセア（Chainia r
osea）ATCC−53903またはその突然変異体または変異体
を水性普通培地中で深部好気性条件下に培養することに
より製造することができる。微生物体は資化性炭素源例
えば資化性炭水化物を含む普通培地中で増殖させる。適
当な炭素源の例にはラクトース、グリセリン、スクロー
ス、コーンスターチ、グルコース、マンノース、フルク
トース、セロビオース、トレハロース、マンニトールお
よびキシロースが含まれる。普通培地はまた資化性窒素
源例えば魚粉、ペプトン、大豆粉、落花生粕、綿実粕お
よびコーンスティープリカーを含むであろう。栄養無機
塩もまた培地中に混合されることができ、そのような塩
はナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、
リン酸、硫酸、塩化物、臭化物、硝酸、炭酸または類似
のイオンを与えることができる任意の普通の塩を含むこ
とができる。

BU−3285T抗生物質の製造は生物体の満足な増殖を促す
温度すなわち約18〜45℃で行なうことができ、便宜には
約28℃の温度で行なわれる。普通、最適生産は約３〜４
日のインキュベーション期間後に得られる。発酵はフラ
スコ中および種々の容量の実験室的または工業発酵装置
中で行なうことができる。タンク発酵を行なうとき、ブ
ロス培養を傾斜または土壌培養株あるいは微生物体の凍
結乾燥培養株を接種することにより普通ブイヨン中に増
殖型株接種材料を生成させることが望ましい。この方法
で活性接種材料を得た後それを抗生物質の大規模製造の
ための発酵タンク培地に無菌的に移す。増殖した接種菌
を含む培地はそれが微生物が良好に増殖している限り新
抗生物質の製造のためにタンク中に使用されるものと同
一または異なることができる。

BU−3285T抗生物質の製造は発酵の間にブロスの試料ま
たは菌糸固体の抽出物を当該抗生物質に感受性であると
知られた微生物体に対する抗生物質活性を試験すること
により追求できる。この抗生物質の試験に有用な検定菌
はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）および
クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus n
eoformans）IAM4514である。微生物検定法は、好ましく
は寒天平板上のペーパーディスク検定法により行なわれ
る。

発酵が終るとBU−3285Tが発酵ブロスから回収され、適
当な有機溶媒による抽出、次いで一連のカラムクロマト
グラフィーにより３つの既知共産生物質、ペンタレノラ
クトン、アブラマイシンおよびクロモマイシン、から分
離される。実施例１および２はBU−3285Tを実質的に純
粋なものとして得る特定操作を示す。

実施例１ BU−3285Tの発酵カイニア・ロセア（Chainia rosea）株No.L827−７のよ
く増殖した斜面培地を、２％麦芽エキス〔オリエンタル
（Oriental）製〕、２％コーンスティープリカー〔オー
ジ・コーン・スターチ社（oji Corn Starch Co.）
製〕、0.5％NaCl、0.02％K₂HPO₄および0.2％CaCO₃から
なる増殖培地（pH7.0、滅菌前）100mlを含む500ml三角
フラスコに接種した。

増殖培地を回転振とう機（200rpm）上で28℃で３日間イ
ンキュベートし、次いで培養株5mlを、増殖培地と同組
成を有する生産培地100mlを含む500ml三角フラスコ中へ
継代した。発酵は回転振とう機上で28℃で４日間行なっ
た。発酵ブロス中の抗生物質生成はカンジダ・アルビカ
ンス（Candida albicans）A9540を試験菌として用いる
ペーパーディスク寒天拡散法により測定した。

発酵はまたタンク発酵装置中で行なった。フラスコ発酵
中に調製されたシード菌２リットル部を200リットルタ
ンク発酵装置中の生産培地120リットル中へ接種した。
発酵は250rpmのかくはん速度および120リットル毎分の
通気速度で28℃で行なった。抗生物質生成は70時間の発
酵後に最大30μg/mlに達した。

実施例２抽出および精製実施例１中に示した操作により製造し、採集したブロス
（58l、pH7.5）にｎ−ブタノール（40l）を加え、１時
間かくはんした。混合物をシャープルス（Sharples）遠
心分離機〔コクサン（Kokusan）No.4A〕により有機層お
よび水層に分離した。有機抽出物（30l）を、ときどき
水を添加することにより共沸的に減圧で１に濃縮し
た。濃縮物をｎ−ヘキサン（10l）中へ滴下すると抗生
物質複合体（32.2g）が暗褐色固体として沈殿した。粗
固体を50％水性メタノール（300ml）中に溶解し、ダイ
アイオン（Diaion）HP−20のカラム〔ミツビシカセイ
（Mitsubishi Kasei）；φ８×20cm〕上に置いた。50％
水性メタノール（2.8l）で洗浄した後、カラムを80％水
性メタノール、次に80％水性アセトンで展開した。溶出
液を120ml画分で捕集し、試験菌としてクリプトコッカ
ス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）IAM
4514を用いてペーパーディスク検定によりそれを試験し
た。活性画分をプールし、減圧で濃縮して褐色残留物
（11.0g）を得た。残留物をシリカゲルのカラム〔ワコ
ーゲル（wako gel）Ｃ−200、φ４×70cm）上で溶離剤
として初めにｎ−ヘキサン−アセトン（1:1v/v）次にア
セトンを用いてクロマトグラフィーにかけた。溶出液を
微生物検定〔C.ネオフォルマンス（neoformans）IAM451
4〕およびTLC（SiO₂、ｎ−ブタノール−酢酸−水＝4:1:
1v/v）に基づいてモニターした。共生産抗生物質をｎ−
ヘキサン−アセトン（1:1v/v）で溶出させた後、BU−32
85Tをアセトンで溶出させた。適当な画分を合せて減圧
で濃縮した。残留物を、予めM/15リン酸塩緩衝液（pH7.
0）−アセトニトリル（8:2v/v）で平衡させた逆相シリ
カゲルカラム〔ODS−60,350/250メッシュ、ヤマムラ・
ケミカル・ラボ（Yamamura Chemical Lab.）、カラムφ
４×32cm〕上でクロマトグラフィーにかけた。同じ溶媒
（５リットル）で洗浄した後、カラムをM/15リン酸塩緩
衝液（pH7.0）−アセトニトリル（7:3v/v）で展開してB
U−3285Tを溶離した。相当する画分を濃縮し、次にダイ
アイオンHP−20上で脱塩すると半純固体（2.2g）が得ら
れた。固体に10％水性メタノール（pH9.0、100ml）中の
EDTA（2g）を加え、過剰のEDTAを除くために溶液をダイ
アイオンHP−20（40ml）のカラムに通した。回収された
活性固体をセファデックス（Sephadex）LH−20のカラム
（φ４×40cm）上で、展開溶媒としてメタノールを用い
てクロマトグラフィーにかけた。微生物検定〔C.ネオフ
ォルマンス（neoformans）IAM4514〕および前記のTLCを
用いてモニターし、適当な画分を減圧で濃縮すると純BU
−3285T753mgが白色無定形粉末として得られた。

物理化学的性質 BU−3285Tは白色無定形固体として得られた。この固体
は水、メタノール、エタノールおよびジメチルスルホキ
シドに可溶、アセトンおよび酢酸エチル中にわずかに可
溶であったが、しかしクロロホルムおよびｎ−ヘキサン
中に不溶性であった。それはヨウ素蒸気および硫酸に対
し陽性反応を、しかしニンヒドリンおよびアンスロン試
験に対し陰性反応を与えた。BU−3285TのFAB−質量スペ
クトルは492の分子量に相当するm/z493(M+H)⁺、515(M+N
a)⁺および531(M+K)⁺に擬似分子イオンを示した。BU−32
85Tの分子式は高分解能FAB−質量スペクトル〔Ｍ＋Na⁺,
m/z515.1692:C₂₃H₃₃O₈SNa₂に対する計算値m/z515.171
4〕によりC₂₃H₃₃O₈SNaと決定された。BU−3725Tの物理
化学的性質は表３中に総括される。IRスペクトル（第１
図）は3400,2930,1720,1635,1460および1260cm^-1に吸収
バンドを示した。1720cm^-1における強いカルボニル吸収
はα，β−不飽和δ−ラクトンを示唆し、1260cm^-1にお
ける吸収は抗生物質中のスルファート基を示唆する。BU
−3285TのUVスペクトルは酸およびアルカリ性溶液中で
変化しない260,269および279に特有極大を有し、分子中
の共役トリエン基を示す。BU−3285Tの¹H−NMRスペクト
ル（表４および第２図）は２個のメチル（δ:0.64およ
び0.87）、５個のメチレン（δ:1.23〜1.29,1.39,2.10,
および2.17＆2.38）、５個のメチン（δ:1.23〜1.29,4.
09,4.29,4.46,および4.79）および10個のオレフィンプ
ロトン（δ:5.35,5.67,5.74,5.79,5.95,6.00,6.14,6.4
7,6.54および6.99）を示した。BU−3285Tの¹³C−NMR
（表５）は２個のメチル（δ:8.7および13.9）、５個の
メチレン（δ:21〜37）、５個のメチン（δ:40〜82）、
10sp²（δ:120〜147）および１個のカルボニル炭素
（δ:163.4）を含む23炭素シグナルを示した。

構造決定前記のように、BU−3285Tは高分解能FAB−質量分光測定
によりC₂₃H₃₃O₈SNaの分子式を有すると決定された。26
0,269および279nmにおけるUV吸収極大は抗生物質中のト
リエン基の存在を示唆する。そのIRスペクトルはα，β
−不飽和δ−ラクトンおよびＯ−スルホ基にそれぞれ帰
属できる1720および1620cm^-1における強い吸収をもって
いた。フラグメントイオン（Ｍ−SO₃Na^-,m/z389）並び
に擬似分子イオン（Ｍ−H^-,m/z491）が負SIMSスペクト
ル中に観察され、BU−3285T中の−ナトリウムスルファ
ートエステルの存在を支持する。BU−3285Tの¹H−NMR中
の10個のオレフィンプロトン中、δ:5.95および6.99に
おけるシグナルはα、β−負飽和δ−ラクトンのα−お
よびβ−プロトンにそれぞれ帰属された。¹H−¹HCOSY実
験においてこのδ−プロトンはヒドロキシル支持メチン
プロトン（δ:4.09）に結合され、それが次いで他のＯ
−結合メチンプロトン（δ:4.79）に結合されてδ−ラ
クトン環を形成する。COSY研究はさらにδ:4.79におけ
るプロトンがトランス二重結合（δ:5.69および5.79）
に、次いでCH₂・CH(OSO₃Na)・CH(CH₃)・CH（OH）−に連
結して部分構造（Ａ）を確立することを明らかにした。
スルファートの部分はＣ−９がかなり低磁場（δ:71.
0）で共鳴した¹³C−NMRにより決定された。ヒドロキシ
ル基の位置はアセチル化による相当するプロトンの約1p
pm低磁場シフトにより確認された。残り６つのオレフィ
ンプロトン（δ:5.35,5.74,6.00,6.14,6.47および6.5
4）はUVスペクトルから演繹された共役トリエン部分と
して帰属された。観察されたカップリングはシス、シ
ス、トランストリエン構造（部分構造Ｂ）を示した。¹H
−および¹³C−NMRスペクトルは明らかに残りの部分がｎ
−ペンチル基（部分構造Ｃ、δ＝21.9,28.4,30.8,32.4
および13.9）であることを示した。

長範囲¹H−¹³C COSY研究は３部分構造の結合性を明ら
かにし、BU−3285Tの全構造が下記のように決定され
た。

前記から、カイニア・ロセア（Chainia rosea）株No.L8
27−７発酵により産生される新規抗腫瘍抗生物質BU−32
85TがUVスペクトル中に特有トリエン吸収を示す酸性親
水性化合物であることが決定された。二次元NMR実験お
よび質量分光測定を用いた構造研究はBU−3285Tがピロ
ン環、共役トリエンおよび−ナトリウムスルファート部
分をもつ新規化合物であることを確認した。構造は部分
的にフォストリエシン（fostriecin）およびその類似体
の構造に関連している。しかし、それは特有の−ナトリ
ウムスルファートエステル官能性をもつことで既知抗生
物質とは異なる。

BU−3285Tは試験管内抗真菌活性並びにマウスに移植し
たP388およびＬ−1210白血病並びにB16黒色腫に対する
有効な生体内阻止活性を示す。構造的に関連する抗生物
質フォストリエシンおよびその類似体は抗真菌活性およ
びB16黒色腫に対する抗腫瘍効果を有しないと報告され
ている。BU−3285TはまたＬ−1210白血病細胞中のタン
パク質合成の特異阻止物質であると認められた。

BU−3285Tの抗腫瘍活性 BU−3285Tを若干のマウスおよびヒト細胞系に対する試
験管内細胞毒性およびマウス中の生体内抗腫瘍活性につ
いて試験した。マイトマイシンＣを試験管内および生体
内両実験における参照化合物として用いた。B16−F10
（マウス黒色腫）およびモーザー（Moser）（ヒト結腸
直腸癌）細胞はウシ胎児血清（FCS、10％）およびカナ
マイシン（60μg/ml）を補足した濃厚イーグル最小必須
培地中で対数期まで増殖させ、HCT−116（ヒト結腸癌）
細胞はFCS（10％）、ペニシリン（100U/ml）およびスト
レプトマイシン（100μg/ml）を補足したマコイ（McCo
y）の5A培地中であり;P388（マウスリンパ性白血病）細
胞およびそのビンクリスチン耐性サブライン（P388/VC
R）はFCS（10％）、ペニシリン（100U/ml）およびスト
レプトマイシン（100μg/ml）を補足したRPMI1640培地
中であった。

B16−F10、モーザー、HCT−116およびP388細胞を採集
し、96ウエル（B16−Ｆ−10、モーザーおよびHCT−116
細胞に対し）または24ウエル（P388細胞に対し）細胞培
養プレートのウエル中へ、それぞれ３×10⁴、６×10⁴、
６×10⁴および２×10⁴細胞/mlの接種菌量で移植した。
それらを５％CO₂および95％空気の増湿雰囲気中で37℃
で72時間インキュベートした。細胞毒性は0.006％ニュ
ウトラルレッド溶液で生育可能細胞を染色した後540nm
で比色定量的に測定した。P388細胞に対する生育可能細
胞の数はコールターカウンターにより測定した。表６中
に示されたように、３非白血病細胞系、B16−F10、HCT
−116およびモーザー細胞、の中でBU−3285Tはモーザー
細胞（天然に存在する薬物耐性細胞）に対して最も強い
細胞毒性活性を示した。興味深いことに、この化合物は
P388/VCRに対してその親細胞に対するものに比較してほ
ゞ同様の細胞毒性を示した。

巨大分子生合成（DNA、RNAおよびタンパク質）に対する
BU−3285Tの阻止効果は培養L1210マウス白血病細胞中で
測定した。細胞（５×10⁵細胞/ml）を化合物とともに37
℃で15分間インキュベートし、次いで標識前駆物質³H−
チミジン、¹⁴C−ウリジンまたは³H−ロイシンを培養混
合物中へ加えた後さらに60分間インキュベートした。冷
５％トリクロロ酢酸溶液で洗浄した後、細胞の酸不溶性
画分中に取込まれた放射能を液体シンチレーションカウ
ンターにより測定した。表７中に示されるように、BU−
3285Tはタンパク質合成をRNA合成より18倍強く阻止し
た。この化合物は試験した最高濃度の100μg/mlでDNA合
成に対して有意な阻止効果を示さなかった。

BU−3285Tの生体内抗腫瘍活性を実験マウス腫瘍系中で
測定した。めすCDF₁マウスに10⁶リンパ性白血病P388細
胞または10⁵リンパ系白血病L1210細胞を含む希釈腹水0.
4mlを腹腔内接種し、おすBDF₁マウスは10％メラニン性
黒色腫B16ブライ0.5mlを腹腔内接種した。試験化合物は
次の処理スケジュール：第１、２および３日（QID×
３）または第１、４および７日（Q3D×３）、によりマ
ウスに腹腔内投与した。表８、９および10中に示される
ように、BU−3285Tは試験したすべての腫瘍系中で良好
な抗腫瘍活性を示した。マイトマイシンＣと比べると、
この化合物の活性はP388白血病に対して匹敵したが、し
かし最小有効量に関してB16黒色腫およびL1210白血病に
対しては若干弱かった。

BU−3285Tの試験管内抗真菌活性試験管内抗真菌活性を系列寒天希釈法により種々の真菌
に対して測定した。サブロー（Sabouraud）デキストロ
ース寒天（pH7.0）を実験に対して用いた。接種菌量は1
0⁶CFU/mlに調整した。28℃で40時間インキュベートした
後、最小阻止濃度（MIC）を試験した。次に総括するよ
うに、BU−3285Tは比較的良好で、広い抗真菌プロフィ
ルを示した。

1989年７月12日における米国特許出願第378,677号の提
出後、一定のスルファターゼ酵素がBU−3285Tのスルフ
ァート結合を開裂して式、を有する脱硫酸したBU−3285Tを生成することが認めら
れた。脱硫酸誘導体は親抗生物質に類似する試験管内細
胞毒性を示した。脱硫酸化合物はマウスリンパ性白血病
P388系中で行なった１生体内試験で活性でなかった。脱
硫酸化合物は試験管内で真菌に対する活性を示さなかっ
た。

BU−3285Tは種々の源〔表11;シグマ・ケミカル社（Sigm
a Chemical Co.）〕から得られたスルファターゼ酵素で
pH7.5またはpH5.0で処理した。生成物をシリカゲルTLC
〔キーゼルゲル（Kiesel gel）60F₂₅₄〕によりOD254nm
〔シマヅ社（Shimadzu Co.）〕における走査による検出
で分析した。表11中に記載されるように、Ｈ−５スルフ
ァターゼ（Ｓ−3009タイプＨ−５）はBU−3285Tの脱硫
酸誘導体をpH7.5および5.0の両方で良好な収率で生じ
た。表中に挙げた他の３スルファターゼはまた非常に低
い収率でデスルファートを生じた。実施例３は脱硫酸し
たBU−3285Tの製造を例示する。

反応条件基質（BU−3285T,0.4mg/50μl-H₂O）各酵素５単位/100μl-緩衝液各緩衝液 200μｌ H₂O 250μｌ合計 500μｌ 37℃で18時間インキュベート検出：反応混合物20μｌをシリカゲルプレート〔メルク社（Me
rck Co.）上にのせ、プレートをCHCl₃−MeOH（5:1,v/
v）の溶媒系で展開した。TLCプレートをOD254nm読取り
により走査した。

実施例３ BU−3285Tデスルファートの製造 BU−3285T（45mg）およびスルファターゼ（28mg、Ｓ−3
009タイプＨ−５）の0.1Mトリス−HCl緩衝液（pH7.5、1
0ml）中の溶液を37℃で18時間インキュベートした。反
応混合物を水（40ml）中へ注加し、次いで酢酸エチル50
mlで２回で抽出した。抽出物を合わせて真空で蒸発乾固
すると淡青色残留物27mgが得られた。残留物を塩化メチ
レン：メタノール（5:1v/v）の溶媒系を用いる調製用TL
C、次いでメタノールを展開溶媒として用いるセファデ
ックスLH−20（φ２×40cm）上のカラムクロマトグラフ
ィーにより精製した。TLC（SiO₂、塩化メチレン：メタ
ノール、5:1v/v）により溶出液をモニターし、適当な画
分をプールし、減圧で濃縮するとBU−3285Tデスルファ
ート8mgが白色無定形粉末として得られた。

BU−3285Tデスルファートの物理化学的性質 BU−3285Tデスルファートは白色無定形固体として得ら
れた。この固体はメタノール、エタノール、アセトンお
よびジメチルスルホキシド中に可溶、水中にわずかに可
溶であるが、しかし四塩化炭素およびｎ−ヘキサン中に
不溶性である。それはヨウ素蒸気および硫酸に対し陽性
応答を、しかしニンヒドリンおよびアンスロン試験に対
し陰性応答を与えた。BU−3285Tデスルファートの正FAB
−質量スペクトルは390の分子量に相当するm/z413(M+N
a)⁺および429(M+K)⁺における擬似分子イオンを示した。
その分子式は分光測定分析によりC₂₃H₃₄O₅であると推定
され、それがBU−3285Tの脱硫酸誘導体であることを示
唆した。BU−3285Tデスルファートの物理化学的性質は
表12中に総括される。IRスペクトルは3410、2930、285
0、1715、1670、1635、1450、1380、1085および1035cm
^-1に吸収バンドを示した。スルファート基に帰属される
1260cm^-1における強い吸収が親抗生物質中に認められる
が、しかし生成物中には失なわれる。BU−3285Tデスル
ファートのUVスペクトルは260、270および280nmに吸収
極大を有し、それらはBU−3285Tの場合におけるように
酸およびアルカリ溶液中で変化せず、分子中の共役トリ
エン基の保持を示す。¹H−NMRスペクトル（表13）は、B
U−3285T中のスルファート基をもつ炭素原子に結合した
メチンプロトンが高磁場へ（δ4.46からδ3.94へ）移動
したことを除いてBU−3285Tのそれに密に類似する。こ
れらのスペクトルデータは生成物がすべての他の構造特
徴を保持するが、しかしBU−3285Tのスルファート基の
代りにヒドロキシル基をもつことを示す。

BU−3285Tデスルファートの抗腫瘍活性 BU−3285Tおよびその脱硫酸誘導体、BU−3285Tデスルフ
ァートをマウスおよびヒト腫瘍細胞系に対する試験管内
細胞毒性について比較試験した。

B16−F10（マウス黒色腫）、HCT−116（ヒト結腸癌）、
A549（ヒト肺癌）およびA549/VP29（A549のエトポシド
耐性サブライン）を、FCS（ウシ胎児血清、10％）およ
び非必須アミノ酸を補足したイーグルのMEM〔ニッスイ
（Nissui）〕中（B16−F10）、またはFCS（10％）、必
須および非必須アミノ酸、ビタミンおよび抗生物質を補
足したマコイの5A培地〔ギブコ（Gibco）〕中（HCT−11
6および両A549）で５％CO₂インキュベーター中で増湿雰
囲気下に37℃で増殖させた。指数増殖B16−F10、FCT−1
16およびA549細胞を採集し、計数し、培地中にそれぞれ
1.5×10⁴、３×10⁴および３×10⁴細胞/mlに懸濁した。
細胞懸濁液180μｌを96ウエルマイクタイターウエルの
ウエル中に第０日に植えた後試験物質（20μｌ）を第１
日に加え、プレートを72時間インキュベートした。細胞
毒活性はニュートラルレッド溶液で生育可能細胞を染色
した後540nmで比色定量的に測定した。結果は表14中に
総括される。BU−3285TおよびBU−3285Tデスルファート
はともにマウスおよびヒト腫瘍細胞系に対して全く活性
であり、それらのIC₅₀値はそれぞれ1.9〜38μg/mlおよ
び5.5〜14μg/mlであった。興味深いことに、デスルフ
ァートは耐性腫瘍細胞系A549/VP29に対して親細胞系に
対するものに比較してほゞ同様の細胞毒性を与えた。

前記化合物の巨大分子（DNA、RNAおよびタンパク質）生
合成に対する阻止効果を培養L1210マウス白血病細胞中
で測定した。細胞（５×10⁵細胞/ml）を試験物質ととも
に37℃で15分間インキュベートし、次いで標識前駆物質
³H−チミジン、¹⁴C−ウリジンまたは³H−ロイシンを培
地に加えた後さらに60分間インキュベートした。冷５％
トリクロロ酢酸溶液で洗浄した後、細胞の酸不溶性画分
中に取込まれた放射能を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。表15中に示されるように、BU−3285Tお
よびBU−3285Tデスルファートはそれぞれ5.8および2.4
μg/ml、並びに6.1および8.1μg/mlのIC₅₀値でRNAおよ
びタンパク質合成を強く阻止した。BU−3285Tデスルフ
ァートおよび親化合物はともに試験した最高濃度の100
μg/mlでDNA合成に対して有意な阻止効果を示さなかっ
た。

前記のようにBU−3285Tは真菌生物体および哺乳動物悪
性腫瘍に対する阻止活性を有する。BU−3285Tデスルフ
ァートは哺乳動物腫瘍に対する阻止活性を示す。

従って本発明の一観点によれば、宿主に有効抗真菌量の
BU−3285Tを投与することを含む真菌感染により罹患し
た動物宿主を治療的に処置する方法が提供される。

他の観点において、宿主に有効腫瘍阻止量のBU−3285T
またはBU−3285TデスルファートあるいはBU−3285Tまた
はBU−3285Tデスルファートを含む薬学的組成物を投与
することを含むBU−3285TまたはBU−3285Tデスルファー
トに感受性の悪性腫瘍により罹患した哺乳動物宿主を治
療的に処置する方法が提供される。

本発明のなお他の観点において、BU−3285T有効抗真菌
量を不活性な薬学的に許容できる担体または希釈剤と組
合せて含む薬学的組成物が提供される。これらの組成物
は非経口投与に適する任意の薬学的形態に調合すること
ができる。

なお他の観点において、BU−3285TまたはBU−3285Tデス
ルファート有効腫瘍阻止量を不活性な薬学的に許容でき
る担体または希釈剤と組合わせて含む薬学的組成物が提
供される。これらの組成物は非経口投与に適する任意の
薬学的形態に調合することができる。

非経口投与のための本発明による調製物には無菌水性ま
たは非水性溶液、懸濁液または乳濁液が含まれる。それ
らはまた使用直前に無菌水、生理食塩水または若干の他
の無菌注射可能媒質中に溶解することができる無菌固体
組成物の形態に製造することができる。

本発明の化合物の実際の好ましい用量が、使用される個
々の化合物、配合された個々の組成物、投与の方法並び
に処置される個々の位置、宿主および疾患により変動す
ることは理解されよう。薬物の作用を修飾する多くの因
子例えば体重、性、食事、投与の時間、投与の経路、排
出の速度、宿主の状態、薬物組合せ、反応感受性および
疾患の程度が当業者により考慮されよう。所与組の条件
に最適の用量は当業者により、与えられた実験データを
考慮して普通の用量決定試験を用いて確かめられること
ができる。

本発明は種々の特定実施例および態様に関して記載され
ているけれども、本発明がそれらに限定されないことを
理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

第１図はBU−3285TのIRスペクトルを示し、第２図はBU
−3285Tの¹H−NMRスペクトル（400MHz、DMSO−d₆中）を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】構造式：を有する化合物BU−3285T。
【請求項２】式：を有するBU−3285Tを製造する方法であって、カイニア
・ロセア（Chainia rosea）のBU−3285T産生株を、炭素
および窒素の同化可能源を含む水性普通培地中で液内好
気性条件下に実質量のBU−3285Tが前記培地中の前記生
物体により生産されるまで培養し、次いで培地から実質
的に共生物質を含まないBU−3285Tを回収することを含
む方法。
【請求項３】BU−3285T産生株がカイニア・ロセア（Cha
inia rosea）ATCC−53903あるいはその突然変異体また
は変異体である、請求項（２）記載の方法。
【請求項４】炭素の同化可能源を含む水性普通培地中で
液内好気性条件下に培養すると抗生物質BU−3285Tを生
ずることができる微生物カイニア・ロセア（Chainia ro
sea）ATCC−53903の生物学的に純粋な培養株あるいはBU
−3285T産生の特徴を保持するカイニア・ロセア（Chain
ia rosea）ATCC−53903の変異体または突然変異体。
【請求項５】請求項（１）記載のBU−3285T治療有効量
および薬学的担体を含む、真菌感染により罹患した動物
宿主の治療処置に用いる薬学的組成物。
【請求項６】BU−3285T腫瘍阻止量および薬学的担体を
含む、請求項（１）記載のBU−3285Tに感受性の腫瘍に
より罹患した哺乳動物宿主の治療処置に用いる薬学的組
成物。
【請求項７】式：を有するBU−3285Tデスルファートと称される化合物。
【請求項８】式：のBU−3285Tデスルファートを製造する方法であって、
式：の抗生物質BU−3285Tを、BU−3285Tを所望BU−3285Tデ
スルファート誘導体に転化できるスルファターゼ酵素と
反応させることを含む方法。
【請求項９】BU−3285Tデスルファート腫瘍阻止量およ
び薬学的担体を含む、請求項（７）記載のBU−3285Tデ
スルファートに感受性の腫瘍により罹患した哺乳動物宿
主の治療処置に用いる薬学的組成物。