JPH0687777B2 - ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 - Google Patents
３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法Info
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- JPH0687777B2 JPH0687777B2 JP61160325A JP16032586A JPH0687777B2 JP H0687777 B2 JPH0687777 B2 JP H0687777B2 JP 61160325 A JP61160325 A JP 61160325A JP 16032586 A JP16032586 A JP 16032586A JP H0687777 B2 JPH0687777 B2 JP H0687777B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は３α−ヒドロキシステロイドを酸化して３−オ
キソステロイド及び過酸化水素とすることのできる酵素
及びこれを用いた３α−ヒドロキシステロイドの定量法
に関する。
キソステロイド及び過酸化水素とすることのできる酵素
及びこれを用いた３α−ヒドロキシステロイドの定量法
に関する。
生体中の３α−ヒドロキシステロイドには、胆汁酸類の
ほか、アンドロステロンなどのステロイドホルモンがあ
るが、特に臨床診断上重要な意義を有しているのは胆汁
酸である。胆汁酸は主にグルココール酸、タウロコール
酸、グルコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシ
コール酸、グルコデオキシコール酸、タウロデオキシコ
ール酸等よりなり、肝臓でコレステロールより合成され
た後、いわゆる腸肝循環系という極めて閉鎖的な回路を
循環するため、正常人の末梢血中にはごく微量しか存在
しない。しかし、肝・胆道系疾患においては、これらの
回路に破綻が生じ、血中胆汁酸量が上昇する。従つて胆
汁酸の血中濃度の上昇を指標として肝・胆道系疾患の存
否を判定することができると同時に、ある程度の重症度
を判定することも可能となる。これらのことから生体
中、特に血清中の３α−ヒドロキシステロイドの一成分
である胆汁酸の測定が肝・胆道系疾患の診断にとつて重
要なものとなつている。
ほか、アンドロステロンなどのステロイドホルモンがあ
るが、特に臨床診断上重要な意義を有しているのは胆汁
酸である。胆汁酸は主にグルココール酸、タウロコール
酸、グルコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシ
コール酸、グルコデオキシコール酸、タウロデオキシコ
ール酸等よりなり、肝臓でコレステロールより合成され
た後、いわゆる腸肝循環系という極めて閉鎖的な回路を
循環するため、正常人の末梢血中にはごく微量しか存在
しない。しかし、肝・胆道系疾患においては、これらの
回路に破綻が生じ、血中胆汁酸量が上昇する。従つて胆
汁酸の血中濃度の上昇を指標として肝・胆道系疾患の存
否を判定することができると同時に、ある程度の重症度
を判定することも可能となる。これらのことから生体
中、特に血清中の３α−ヒドロキシステロイドの一成分
である胆汁酸の測定が肝・胆道系疾患の診断にとつて重
要なものとなつている。
従来報告されている３α−ヒドロキシステロイドの定量
分析としては、クロマトグラフイー法、酵素法、免疫学
的測定法等があるが、日常の臨床検査の分野では簡便な
酵素法が主流となつている。即ち、胆汁酸（３α−ヒド
ロキシステロイド）にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下NADと略す）の存在下、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（以下３α−HSDと略す）
を作用させ、NADを還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下NADHと略す）とした後、次の様な方法
により分析がおこなわれている。
分析としては、クロマトグラフイー法、酵素法、免疫学
的測定法等があるが、日常の臨床検査の分野では簡便な
酵素法が主流となつている。即ち、胆汁酸（３α−ヒド
ロキシステロイド）にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下NADと略す）の存在下、３α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ（以下３α−HSDと略す）
を作用させ、NADを還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（以下NADHと略す）とした後、次の様な方法
により分析がおこなわれている。
（１）生成されたNADHの螢光を測定する法。
（２）生成されたNADHをジアホラーゼの作用によりNAD
とし、同時に共存させたレサズリンをレゾルフインに変
換し、その螢光を測定する方法。
とし、同時に共存させたレサズリンをレゾルフインに変
換し、その螢光を測定する方法。
（３）生成されたNADHをジアホラーゼの作用によりNAD
とし、同時に共存させたニトロブルーテトラゾリウムを
ジホルマザンに変換し、これを比色定量する方法。
とし、同時に共存させたニトロブルーテトラゾリウムを
ジホルマザンに変換し、これを比色定量する方法。
しかし、上記（１）および（２）の方法は螢光測定法で
あり操作が繁雑な上、高価な機器を必要とし、日常検査
ではほとんど利用されていないのが現状である。また、
（３）の方法は感度が悪く、その上血中胆汁酸濃度が極
めて低いために試料を多量に必要とし、試料成分による
妨害を受け易く、必ずしも満足いくものではない。さら
に生成するホルマザンは、水に難溶性の物質であり、測
定の際に用いるセル等の器具に吸着し、沈着するという
欠点もあつた。
あり操作が繁雑な上、高価な機器を必要とし、日常検査
ではほとんど利用されていないのが現状である。また、
（３）の方法は感度が悪く、その上血中胆汁酸濃度が極
めて低いために試料を多量に必要とし、試料成分による
妨害を受け易く、必ずしも満足いくものではない。さら
に生成するホルマザンは、水に難溶性の物質であり、測
定の際に用いるセル等の器具に吸着し、沈着するという
欠点もあつた。
したがつて、上記したような欠点のない、酵素を用いる
３α−ヒドロキシステロイドの有利な測定法の開発が望
まれていた。
３α−ヒドロキシステロイドの有利な測定法の開発が望
まれていた。
本発明者らは、３α−ヒドロキシステロイドの分析に利
用することのできる反応系について検討し、更にそれら
の系で利用できる酵素についても種々探索をおこなつ
た。そしてその結果、ある種の微生物中に、３α−ヒド
ロキシステロイドを酸化して３−オキソステロイドと過
酸化水素とすることのできる酵素（以下「３α−ヒドロ
キシステロイドオキシダーゼ」と称する）が存在するこ
とを見出した。
用することのできる反応系について検討し、更にそれら
の系で利用できる酵素についても種々探索をおこなつ
た。そしてその結果、ある種の微生物中に、３α−ヒド
ロキシステロイドを酸化して３−オキソステロイドと過
酸化水素とすることのできる酵素（以下「３α−ヒドロ
キシステロイドオキシダーゼ」と称する）が存在するこ
とを見出した。
また、この３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼを
３α−ヒドロキシステロイドと酸素に作用させれば定量
的に３−オキソステロイドと過酸化水素が生成すること
を見出した。
３α−ヒドロキシステロイドと酸素に作用させれば定量
的に３−オキソステロイドと過酸化水素が生成すること
を見出した。
本発明はこれらの知見に基き完成されたものであり、新
規な３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及
びこれを用いた３α−ヒドロキシステロイドの定量法を
提供するものである。
規な３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及
びこれを用いた３α−ヒドロキシステロイドの定量法を
提供するものである。
従来、多くの微生物は３α−ヒドロキシステロイドを代
謝することが知られており、とくにピリジンヌクレオチ
ドを補酵素として必要とするものが、タラレー（Talala
y）ら（Nature170巻,620頁、1952年）によつて検索され
ており、それ以後シユードモナス属（Pseudomomas）の
微生物から３α−ヒドロキシステロイドを補酵素−NAD
を介して酸化し、３−オキソステロイドとする３α−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが単離されてい
る。たとえばタラレーら（Nature,173巻,1189頁、1954
年）、ボイヤー（Boyer.J.）ら（Biochemistry4巻1825
頁、1965年）、デーリン（Dehlin）ら（Acta.67巻,197
頁、1963年）、マーカス（Marcus）ら（J.Biol.Chem.21
8巻,661頁1956年）およびウレーら（J.Biol.Chem.218
巻,675頁、1956年）等の報告がそれである。
謝することが知られており、とくにピリジンヌクレオチ
ドを補酵素として必要とするものが、タラレー（Talala
y）ら（Nature170巻,620頁、1952年）によつて検索され
ており、それ以後シユードモナス属（Pseudomomas）の
微生物から３α−ヒドロキシステロイドを補酵素−NAD
を介して酸化し、３−オキソステロイドとする３α−ヒ
ドロキシステロイドデヒドロゲナーゼが単離されてい
る。たとえばタラレーら（Nature,173巻,1189頁、1954
年）、ボイヤー（Boyer.J.）ら（Biochemistry4巻1825
頁、1965年）、デーリン（Dehlin）ら（Acta.67巻,197
頁、1963年）、マーカス（Marcus）ら（J.Biol.Chem.21
8巻,661頁1956年）およびウレーら（J.Biol.Chem.218
巻,675頁、1956年）等の報告がそれである。
この３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼは、
近年においても各種菌より単離され、製造されている。
例えばシユードモナス・プチダNRRL B-11064（Pseudomo
nus putida NRRL B-11064）（Agric.Biol.Chem.43巻,15
21頁、1979年）、バシラス・スフエリカス（Bacillus s
phaericus）（公開特許公報昭54-157894）、エシエリヒ
ア・フレウンジイ（Escherichia freundii）（J.Bact,7
9巻145頁、1960年）などの菌株からの取得が報告されて
いる。
近年においても各種菌より単離され、製造されている。
例えばシユードモナス・プチダNRRL B-11064（Pseudomo
nus putida NRRL B-11064）（Agric.Biol.Chem.43巻,15
21頁、1979年）、バシラス・スフエリカス（Bacillus s
phaericus）（公開特許公報昭54-157894）、エシエリヒ
ア・フレウンジイ（Escherichia freundii）（J.Bact,7
9巻145頁、1960年）などの菌株からの取得が報告されて
いる。
しかしながら、３α−ヒドロキシステロイドを酸化し、
３−オキソステロイドと過酸化水素とする代謝過程は報
告されていなかつた。
３−オキソステロイドと過酸化水素とする代謝過程は報
告されていなかつた。
ところが、シユードモナス属に属する菌株及び他の属の
菌株の一部は３α−ヒドロキシステロイドを代謝して３
−オキソステロイドとすると同時に過酸化水素を生成す
ることを今回初めて本発明者らが見出し、該菌株中から
３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物の取得
に成功したのである。
菌株の一部は３α−ヒドロキシステロイドを代謝して３
−オキソステロイドとすると同時に過酸化水素を生成す
ることを今回初めて本発明者らが見出し、該菌株中から
３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物の取得
に成功したのである。
本発明酵素の作用を式に示すと次の通りであるが、この
ような作用を有する酵素は未まで知られておらず新規な
ものである。
ような作用を有する酵素は未まで知られておらず新規な
ものである。
本発明の酵素３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ
組成物は、シユードモナス属（Pseudomonas）、ノカル
デイア属（Nocardia）、ピメロバクター属（Pimerobact
er）等に属する微生物のうち、３α−ヒドロキシステロ
イドを代謝し、３−オキソステロイドと過酸化水素を生
成するものを、酵素取得の場合の常法に従つて処理する
ことにより得られる。
組成物は、シユードモナス属（Pseudomonas）、ノカル
デイア属（Nocardia）、ピメロバクター属（Pimerobact
er）等に属する微生物のうち、３α−ヒドロキシステロ
イドを代謝し、３−オキソステロイドと過酸化水素を生
成するものを、酵素取得の場合の常法に従つて処理する
ことにより得られる。
本発明の酵素を得るのに用いられる微生物の例として
は、シユードモナス・テストステロニー（Ps.testoster
oni）ATCC 11996及びシグマ（SIGMA）社よりヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼを含む凍結乾燥菌体として
市販されているものが挙げられる。
は、シユードモナス・テストステロニー（Ps.testoster
oni）ATCC 11996及びシグマ（SIGMA）社よりヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼを含む凍結乾燥菌体として
市販されているものが挙げられる。
微生物中から本発明酵素を取得するには、非イオン性界
面活性剤を含有する緩衝液を用いて菌体細胞壁を破壊
し、酵素を遊離させ、これを抽出すれば良い。これらの
方法については、例えば特公昭54-8318号、同57-28552
号等に詳しく記載されており、公知のこれら方法及びそ
の変法が用いられる。
面活性剤を含有する緩衝液を用いて菌体細胞壁を破壊
し、酵素を遊離させ、これを抽出すれば良い。これらの
方法については、例えば特公昭54-8318号、同57-28552
号等に詳しく記載されており、公知のこれら方法及びそ
の変法が用いられる。
より具体的には非イオン性界面活性剤存在下、超音波、
高圧ホモジナイザー、フレンチプレスあるいは機械的破
砕等により菌体を破壊した後、酵素を菌体外に排出さ
せ、可溶化する。次いで、この３α−ヒドロキシステロ
イドオキシダーゼを含む可溶化溶液から過、遠心分離
等の技術を用いて菌体破壊物等を除去した後、比較的多
量に存在する核酸をプロタミン硫酸を用いて沈殿させ除
去する。こうして得られた粗製酵素液は、ブチルトヨパ
ール（東洋ソーダ工業社製）、セフアアクリル（フアル
マシア社製）、イオン交換セフアロース（フアルマシア
社製）、ヒドロキシアパタイト、ウルトロゲル（LKB社
製）等を用いたクロマトグラフイー、あるいは硫酸アン
モニウム塩析など通常の酵素精製技術を適宜用い、組み
合わせて精製される。さらに得られた精製酵素は、限外
過等によつて濃縮する。このようにして得られた酵素
を保存するためには、多糖類、多価アルコール類、アミ
ノ酸類、緩衝剤などを賦形剤として用い、固体状、好ま
しくは凍結乾燥状に変換するとよい。
高圧ホモジナイザー、フレンチプレスあるいは機械的破
砕等により菌体を破壊した後、酵素を菌体外に排出さ
せ、可溶化する。次いで、この３α−ヒドロキシステロ
イドオキシダーゼを含む可溶化溶液から過、遠心分離
等の技術を用いて菌体破壊物等を除去した後、比較的多
量に存在する核酸をプロタミン硫酸を用いて沈殿させ除
去する。こうして得られた粗製酵素液は、ブチルトヨパ
ール（東洋ソーダ工業社製）、セフアアクリル（フアル
マシア社製）、イオン交換セフアロース（フアルマシア
社製）、ヒドロキシアパタイト、ウルトロゲル（LKB社
製）等を用いたクロマトグラフイー、あるいは硫酸アン
モニウム塩析など通常の酵素精製技術を適宜用い、組み
合わせて精製される。さらに得られた精製酵素は、限外
過等によつて濃縮する。このようにして得られた酵素
を保存するためには、多糖類、多価アルコール類、アミ
ノ酸類、緩衝剤などを賦形剤として用い、固体状、好ま
しくは凍結乾燥状に変換するとよい。
叙上の如くして得られた本発明の３α−ヒドロキシステ
ロイドオキシダーゼ組成物の性質の一例を、シユードモ
ナス・テストステロニーATCC 11996起源のものについて
示す。
ロイドオキシダーゼ組成物の性質の一例を、シユードモ
ナス・テストステロニーATCC 11996起源のものについて
示す。
（１）作用:3α−ヒドロキシステロイド類の３α水酸基
を特異的に酸化し、３−オキソステロイド類とすると同
時に過酸化水素を生成する。
を特異的に酸化し、３−オキソステロイド類とすると同
時に過酸化水素を生成する。
（２）基質特異性：エチオコラン型（５β−アンドロス
タン−３α−オール）に対して作用する。アンドロステ
ロン型（５α−アンドロスタン−３α−オール）には作
用しない。
タン−３α−オール）に対して作用する。アンドロステ
ロン型（５α−アンドロスタン−３α−オール）には作
用しない。
（３）至適pH:pH9.2付近でエチオコラン−３α−オール
−17−オンに対する作用が至適である（第４図）。
−17−オンに対する作用が至適である（第４図）。
（４）pH安定性:30℃で30分処理した場合、pH5.5〜pH9.
5において90％以上の残存活性を示した（第５図）。
5において90％以上の残存活性を示した（第５図）。
（５）至適温度:pH7.0においては、エチオコラン−３α
−オール−17−オンの場合40℃付近にある。
−オール−17−オンの場合40℃付近にある。
（６）温度安定性:pH7.0において37℃、10分では95％以
上安定である。
上安定である。
（７）Km値:8×10-4Ｍ（エチオコラン−３α−オール−
17−オンに対して） 本発明の３α−ヒドロキシステロイドの定量法は、上記
の如くして得られた３α−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼ組成物を用い、次の如くしておこなわれる。すな
わち、被検体を酵素の存在下３α−ヒドロキシステロイ
ドオキシダーゼ組成物又はこれを含有する酵素製剤とと
もにインキュベートし、３−オキソステロイドと過酸化
水素を生成せしめ、生成した過酸化水素量または３−オ
キソステロイド量から３α−ヒドロキシステロイドが定
量される。
17−オンに対して） 本発明の３α−ヒドロキシステロイドの定量法は、上記
の如くして得られた３α−ヒドロキシステロイドオキシ
ダーゼ組成物を用い、次の如くしておこなわれる。すな
わち、被検体を酵素の存在下３α−ヒドロキシステロイ
ドオキシダーゼ組成物又はこれを含有する酵素製剤とと
もにインキュベートし、３−オキソステロイドと過酸化
水素を生成せしめ、生成した過酸化水素量または３−オ
キソステロイド量から３α−ヒドロキシステロイドが定
量される。
過酸化水素の量を測定する方法としては、例えば生成さ
れる過酸化水素を、過酸化水素の存在下で色調変化を生
じる１種もしくは２種以上の呈色剤から成るシステムに
よつて測定する方法がよく利用されている。すなわち、
存在する過酸化水素量を１種もしくは２種以上の呈色剤
の色調変化を比色定量することによつて測定する方法で
ある。
れる過酸化水素を、過酸化水素の存在下で色調変化を生
じる１種もしくは２種以上の呈色剤から成るシステムに
よつて測定する方法がよく利用されている。すなわち、
存在する過酸化水素量を１種もしくは２種以上の呈色剤
の色調変化を比色定量することによつて測定する方法で
ある。
好適な方法の一例としては、過酸化水素量を過剰のフエ
ノールとペルオキシダーゼとの存在下での過酸化水素と
４−アミノアンチピリンとの反応によつて測定し、この
過酸化水素量から３α−ヒドロキシステロイド量を測定
する方法が挙げられる。また他の適当な反応試薬系例え
ば、４−アミノアンチピリンとフエノール系化合物、ナ
フトール化合物またはアニリン系化合物との組み合わ
せ、３−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）とアニ
リン系化合物との組み合わせ、２−２′−アジノビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（AB
TS）、ロイコメチレンブルー誘導体等によつても生成す
る過酸化水素量を測定することができ、これから３α−
ヒドロキシステロイド量を測定することができる。
ノールとペルオキシダーゼとの存在下での過酸化水素と
４−アミノアンチピリンとの反応によつて測定し、この
過酸化水素量から３α−ヒドロキシステロイド量を測定
する方法が挙げられる。また他の適当な反応試薬系例え
ば、４−アミノアンチピリンとフエノール系化合物、ナ
フトール化合物またはアニリン系化合物との組み合わ
せ、３−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（MBTH）とアニ
リン系化合物との組み合わせ、２−２′−アジノビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（AB
TS）、ロイコメチレンブルー誘導体等によつても生成す
る過酸化水素量を測定することができ、これから３α−
ヒドロキシステロイド量を測定することができる。
一方、３−オキソステロイドの量を測定する方法として
は、例えば適当な有機溶媒（酢酸エチル、エチルエーテ
ルなど）によつて３−オキソステロイドを反応液から抽
出・濃縮した後、適合する展開溶媒（ベンゼン：クロロ
ホルム：メタノール系あるいは酢酸エチル：ベンゼン系
など）を用いて展開させ、UV吸収あるいはヨード噴霧等
の化学的分析手段を用いて移動スポツトを確認、単離し
た後、常法により定量するか、あるいは３−オキソステ
ロイドに３−オキソステロイド−Δ4−デヒドロゲナー
ゼ（E.C.1、３、99.6）を作用させ、３−オキソステロ
イドが３−オキソ−Δ4−ステロイドに酸化されるのと
同時に電子受容体が還元されることを利用して酸化還元
比色系に測定する方法（特願昭60-64547号）を用いれば
よい。このときの酸化還元発色剤としてはニトロブルー
テトラゾリウム、インドニトロテトラゾリウムなどが用
いられる。
は、例えば適当な有機溶媒（酢酸エチル、エチルエーテ
ルなど）によつて３−オキソステロイドを反応液から抽
出・濃縮した後、適合する展開溶媒（ベンゼン：クロロ
ホルム：メタノール系あるいは酢酸エチル：ベンゼン系
など）を用いて展開させ、UV吸収あるいはヨード噴霧等
の化学的分析手段を用いて移動スポツトを確認、単離し
た後、常法により定量するか、あるいは３−オキソステ
ロイドに３−オキソステロイド−Δ4−デヒドロゲナー
ゼ（E.C.1、３、99.6）を作用させ、３−オキソステロ
イドが３−オキソ−Δ4−ステロイドに酸化されるのと
同時に電子受容体が還元されることを利用して酸化還元
比色系に測定する方法（特願昭60-64547号）を用いれば
よい。このときの酸化還元発色剤としてはニトロブルー
テトラゾリウム、インドニトロテトラゾリウムなどが用
いられる。
このような３α−ヒドロキシステロイドの定量分析は、
多数の定量分析を連続して行なう自動分析で行なうこと
もできるし、あるいは少数のサンプルを個々に分析する
こともできる。
多数の定量分析を連続して行なう自動分析で行なうこと
もできるし、あるいは少数のサンプルを個々に分析する
こともできる。
定量分析に用いる試薬は個々の方法によつて異なるが、
過酸化水素測定を定量分析として用いるときは、その試
薬類は通常 ３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ酵素製剤お
よび 生成される過酸化水素量を測定に要する１種もしくは
それ以上の試薬 を含むものである。ここでは他の試薬類のいくつかは、
３−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物を有する
酵素製剤と配合が可能であり、酵素製剤に配合して配合
試薬を得てもよい。また酵素製剤は凍結乾燥または濃縮
液体状であつてもよい。とくにペルオキシダーゼの存在
を要する定量法の場合、これを入れて凍結乾燥酵素製剤
を形成させることができる。
過酸化水素測定を定量分析として用いるときは、その試
薬類は通常 ３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ酵素製剤お
よび 生成される過酸化水素量を測定に要する１種もしくは
それ以上の試薬 を含むものである。ここでは他の試薬類のいくつかは、
３−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物を有する
酵素製剤と配合が可能であり、酵素製剤に配合して配合
試薬を得てもよい。また酵素製剤は凍結乾燥または濃縮
液体状であつてもよい。とくにペルオキシダーゼの存在
を要する定量法の場合、これを入れて凍結乾燥酵素製剤
を形成させることができる。
上記の成分は、３α−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼ組成物として最終濃度100〜1,000単位/mlで含むの
が好ましい。なお１単位の３α−ヒドロキシステロイド
オキシダーゼ組成物はpH9.0 37℃において１分間に１μ
moleの過酸化水素を生成しうる量の酵素である。添加す
る酵素重量は各々の酵素活性により決定することが好ま
しい。またこうした製剤は、一般には、使用者が測定時
に緩衝液で希釈して用いるような濃縮された形態の酵素
製剤とすることもできる。また、成分は過酸化水素を
比色すべき場合、例えば４−アミノアンチピリンとフエ
ノール系化合物またはアニリン系化合物のような酸素受
容体であり、それらは前述した他の適当な反応物質に置
き換えることができる。これら成分の酵素類、成分
の試薬類及び他の任意試薬成分は瓶中でそのまま使用し
得るような形態でも、あるいは使用者が希釈し使用する
濃縮形態でも供給することができる。
ーゼ組成物として最終濃度100〜1,000単位/mlで含むの
が好ましい。なお１単位の３α−ヒドロキシステロイド
オキシダーゼ組成物はpH9.0 37℃において１分間に１μ
moleの過酸化水素を生成しうる量の酵素である。添加す
る酵素重量は各々の酵素活性により決定することが好ま
しい。またこうした製剤は、一般には、使用者が測定時
に緩衝液で希釈して用いるような濃縮された形態の酵素
製剤とすることもできる。また、成分は過酸化水素を
比色すべき場合、例えば４−アミノアンチピリンとフエ
ノール系化合物またはアニリン系化合物のような酸素受
容体であり、それらは前述した他の適当な反応物質に置
き換えることができる。これら成分の酵素類、成分
の試薬類及び他の任意試薬成分は瓶中でそのまま使用し
得るような形態でも、あるいは使用者が希釈し使用する
濃縮形態でも供給することができる。
本発明は、本発明酵素が３α−ヒドロキシステロイドを
３α−オキソステロイドと過酸化水素に定量的に酸化す
ることができること及び該酵素の作用により生成する過
酸化水素から３α−ヒドロキシステロイド量が定量でき
ることに基くものである。
３α−オキソステロイドと過酸化水素に定量的に酸化す
ることができること及び該酵素の作用により生成する過
酸化水素から３α−ヒドロキシステロイド量が定量でき
ることに基くものである。
以上のように本発明方法は酵素の作用により生成される
過酸化水素または３−オキソステロイドを測定すること
を利用するものであるため、被検体の加熱処理、除蛋
白、抽出等の操作を要せず、従来法と異なりジホルマザ
ンの容器への吸着が回避される上、感度の良いものであ
る。さらに過酸化水素の測定系では発色剤を適宜選択す
ることによつて高波長側における比色が可能となり、血
清あるいは血漿中の防害物質（ヘモグロビン、ビリルビ
ン等）の影響を低減化する特徴をもそなえている。
過酸化水素または３−オキソステロイドを測定すること
を利用するものであるため、被検体の加熱処理、除蛋
白、抽出等の操作を要せず、従来法と異なりジホルマザ
ンの容器への吸着が回避される上、感度の良いものであ
る。さらに過酸化水素の測定系では発色剤を適宜選択す
ることによつて高波長側における比色が可能となり、血
清あるいは血漿中の防害物質（ヘモグロビン、ビリルビ
ン等）の影響を低減化する特徴をもそなえている。
次に実施例を挙げ、本発明を詳細に説明するが、それら
はこの発明を何ら限定するものではない。
はこの発明を何ら限定するものではない。
実施例1.3α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成
物の調製： 滅菌した生育培地20lに、シユードモナステストステロ
ニーATCC 11996の種培養液500mlを接種した。生育培地
のpHは7.00で、その主成分は次のとおりである。
物の調製： 滅菌した生育培地20lに、シユードモナステストステロ
ニーATCC 11996の種培養液500mlを接種した。生育培地
のpHは7.00で、その主成分は次のとおりである。
（g/l） 酵母抽出液 10 (NH4)2HPO4 1 (NH4)H2PO4 1 KH2PO4 2 MgSO4・７H2O 0.2 NaCl 0.01 ZnSO4・７H2O 0.005 MnSO4・３H2O 0.005 CuSO4・５H2O 0.0005 乳酸ナトリウム 最終0.5％ 培養液は28℃で24時間生育させたのち、培地の最終濃度
が50〜500mg/lとなるようにテストステロンのアセトン
溶解液を添加し酵素を誘導した。その後、同温度で10〜
24時間培養した。培養終了後、遠心分離し、菌体を分離
採取した。採取菌体細胞を５℃で、１％（W/V）トリト
ンX-100を含むpH7.0の0.02moleリン酸緩衝液５倍量にて
１容となるように懸濁した。ガラスビーズを用いる細
胞破砕機DCNO-MILL（Willy A.Bachofen AG Maschinenfa
brik社製）を用いて酵素を破砕溶離させた。それを遠心
分離し、上清から３α−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼを含む抽出液が得られた。抽出液に硫酸アンモニウ
ム430gを加え、最終65％飽和とした後、沈殿する画分を
遠心分離によつて集めた。沈殿を0.1％トリトンX-100を
含む0.1Mの（pH7）リン酸緩衝液に溶解し、同緩衝液に
て残存硫酸アンモニウムを除去するため透析操作を一昼
夜行なつた。あらかじめ0.1％トリトンX-100を含むpH7.
0の同緩衝液で平衡化されたDEAE−セフアロースCL-6B
（フアルマシア社製）を充填したカラム（容量200ml）
に通した。目的とする３α−ヒドロキシステロイドオキ
シダーゼを0.1％トリトンX-100を含む同緩衝液中で塩化
ナトリウムのモル濃度を次第に上昇させる直線的勾配に
よつて溶離を行ない溶出させた。この３α−ヒドロキシ
ステロイドオキシダーゼを含む溶離液画分を限外過膜
により５℃で濃縮させた。濃縮した溶液（20ml）は37℃
で３α−ヒドロキシステロイドを酸化する活性を有し、
総回収率は10％であり、比活性0.5u/mgであつた。
が50〜500mg/lとなるようにテストステロンのアセトン
溶解液を添加し酵素を誘導した。その後、同温度で10〜
24時間培養した。培養終了後、遠心分離し、菌体を分離
採取した。採取菌体細胞を５℃で、１％（W/V）トリト
ンX-100を含むpH7.0の0.02moleリン酸緩衝液５倍量にて
１容となるように懸濁した。ガラスビーズを用いる細
胞破砕機DCNO-MILL（Willy A.Bachofen AG Maschinenfa
brik社製）を用いて酵素を破砕溶離させた。それを遠心
分離し、上清から３α−ヒドロキシステロイドオキシダ
ーゼを含む抽出液が得られた。抽出液に硫酸アンモニウ
ム430gを加え、最終65％飽和とした後、沈殿する画分を
遠心分離によつて集めた。沈殿を0.1％トリトンX-100を
含む0.1Mの（pH7）リン酸緩衝液に溶解し、同緩衝液に
て残存硫酸アンモニウムを除去するため透析操作を一昼
夜行なつた。あらかじめ0.1％トリトンX-100を含むpH7.
0の同緩衝液で平衡化されたDEAE−セフアロースCL-6B
（フアルマシア社製）を充填したカラム（容量200ml）
に通した。目的とする３α−ヒドロキシステロイドオキ
シダーゼを0.1％トリトンX-100を含む同緩衝液中で塩化
ナトリウムのモル濃度を次第に上昇させる直線的勾配に
よつて溶離を行ない溶出させた。この３α−ヒドロキシ
ステロイドオキシダーゼを含む溶離液画分を限外過膜
により５℃で濃縮させた。濃縮した溶液（20ml）は37℃
で３α−ヒドロキシステロイドを酸化する活性を有し、
総回収率は10％であり、比活性0.5u/mgであつた。
酵素溶液は保存剤としてアジドを加えたが、このものは
５℃で２〜３ケ月保存可能であり、その間実質上総活性
を保持した。なお、得られた３α−ヒドロキシステロイ
ドオキシダーゼ組成物の各基質に対する相対活性は下表
の通りである。
５℃で２〜３ケ月保存可能であり、その間実質上総活性
を保持した。なお、得られた３α−ヒドロキシステロイ
ドオキシダーゼ組成物の各基質に対する相対活性は下表
の通りである。
実施例2.エチオコラン−３α−オール−17−オンの定量
分析： まず、３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物
20u/l（１％トリトンX-100含む）、60mM4−アミノアン
チピリン及び30mMフエノールペルオキシダーゼ10,000u/
mlを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7）から成る測定試薬を
調製した。
分析： まず、３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物
20u/l（１％トリトンX-100含む）、60mM4−アミノアン
チピリン及び30mMフエノールペルオキシダーゼ10,000u/
mlを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7）から成る測定試薬を
調製した。
エチオコラン−３α−オール−17−オンのメタノール溶
解液200μｌを上記測定試薬0.5mlに加え、37℃で10分間
反応させた後、波長500nmで吸光度を測定した。また同
一試料について３α−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ組成物を除いた測定試薬で同様な操作を行ないこれを
検体ブランクとした。なお被検体はエチオコラン−３α
−オール−17−オンをメタノールで種々の濃度に希釈し
たものを使用した。この結果を第２表に示す。
解液200μｌを上記測定試薬0.5mlに加え、37℃で10分間
反応させた後、波長500nmで吸光度を測定した。また同
一試料について３α−ヒドロキシステロイドオキシダー
ゼ組成物を除いた測定試薬で同様な操作を行ないこれを
検体ブランクとした。なお被検体はエチオコラン−３α
−オール−17−オンをメタノールで種々の濃度に希釈し
たものを使用した。この結果を第２表に示す。
実施例3.血清中の胆汁酸の定量分析： 血清または標準液200μｌを実施例２で用いたのと同じ
測定試薬0.5mlに加えて37℃で10分間反応させたのち、
波長500nmで測定した。また同一試料について３α−ヒ
ドロキシステロイドオキシダーゼ組成物を除いた測定試
薬で同様な操作を行ない検体ブランクとした。なお被検
体としてはグリココール酸（以下GCと略す）を添加した
血清を無添加血清で種々の濃度に希釈したものを使用し
た。この結果は第３表に、またこの結果に基づいて作成
した検量線を第１図に示す。
測定試薬0.5mlに加えて37℃で10分間反応させたのち、
波長500nmで測定した。また同一試料について３α−ヒ
ドロキシステロイドオキシダーゼ組成物を除いた測定試
薬で同様な操作を行ない検体ブランクとした。なお被検
体としてはグリココール酸（以下GCと略す）を添加した
血清を無添加血清で種々の濃度に希釈したものを使用し
た。この結果は第３表に、またこの結果に基づいて作成
した検量線を第１図に示す。
実施例4. フエノールの代わりに30mMソジウムＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロオキシ−３−スルフオプロピル）−3,5−
ジメトキシアニリン（DAOSと略す）を用いる以外は実施
例２と同一の測定試薬を用い測定波長を600nmとして実
施例３の測定法と同様の操作を行ない、検量線を求め
た。この結果は第４表に、またこの結果に基づいて作成
した検量線を第２図に示す。
（２−ヒドロオキシ−３−スルフオプロピル）−3,5−
ジメトキシアニリン（DAOSと略す）を用いる以外は実施
例２と同一の測定試薬を用い測定波長を600nmとして実
施例３の測定法と同様の操作を行ない、検量線を求め
た。この結果は第４表に、またこの結果に基づいて作成
した検量線を第２図に示す。
実施例5. 実施例４のDAOSの代わりに10m mole/lのロイコメチレン
ブルーを用い、血清あるいは被検体を50μｌ、測定波長
を670nmとし実施例３の測定法と同様の操作を行ない検
量線を求めた。この結果は第５表に示す。またこの結果
に基づいて作成した検量線を第３図に示す。
ブルーを用い、血清あるいは被検体を50μｌ、測定波長
を670nmとし実施例３の測定法と同様の操作を行ない検
量線を求めた。この結果は第５表に示す。またこの結果
に基づいて作成した検量線を第３図に示す。
実施例6. 血清10検体を各々100μｌ使用し実施例４と同様な操作
を行ない、各血清の吸光度を求め、その検量線より３α
−ヒドロキシステロイド量を算出した。これに対して３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによつて測
定するキツト、エンザバイル（ナイガード；第一化学薬
品（株））で同一検体を用いて測定した結果を含め第６
表に示す。
を行ない、各血清の吸光度を求め、その検量線より３α
−ヒドロキシステロイド量を算出した。これに対して３
α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼによつて測
定するキツト、エンザバイル（ナイガード；第一化学薬
品（株））で同一検体を用いて測定した結果を含め第６
表に示す。
実施例７ 実施例２の４−アミノアンチピリン、フエノールおよび
ペルオキシダーゼの代わりに5mM NTBおよび100uの３−
オキソ−５β−ステロイドΔ4−デヒドロゲナーゼを用
いて測定試薬を調製した。
ペルオキシダーゼの代わりに5mM NTBおよび100uの３−
オキソ−５β−ステロイドΔ4−デヒドロゲナーゼを用
いて測定試薬を調製した。
測定波長を540nmとして実施例２の測定法と同様の操作
を行ない検量線を求めた。この結果を第７表に示す。
を行ない検量線を求めた。この結果を第７表に示す。
第１図ないし第３図は、それぞれ実施例３ないし実施例
５で得た検量線を示す図面である。なお、縦軸は吸光度
を、横軸はGC濃度をそれぞれ示す。第４図及び第５図は
本発明の酵素の至適pH及びpH安定性を示す図面である。
なお、縦軸は相対活性を、横軸はpHをそれぞれ示す。
５で得た検量線を示す図面である。なお、縦軸は吸光度
を、横軸はGC濃度をそれぞれ示す。第４図及び第５図は
本発明の酵素の至適pH及びpH安定性を示す図面である。
なお、縦軸は相対活性を、横軸はpHをそれぞれ示す。
Claims (3)
- 【請求項１】次の理化学的性質（１）〜（７）を有する
シュードモナス属に属する菌由来の３α−ヒドロキシス
テロイドオキシダーゼ組成物。 （１）作用:3α−ヒドロキシステロイド類の３α水酸基
を特異的に酸化し、３−オキソステロイド類とすると同
時に過酸化水素を生成する。 （２）基質特異性：エチオコラン型（５β−アンドロス
タン−３α−オール）に対して作用する。アンドロステ
ロン型（５α−アンドロスタン−３α−オール）には作
用しない。 （３）至適pH:pH9.2付近でエチオコラン−３α−オール
−17−オンに対する作用が至適である（第４図）。 （４）pH安定性:30℃で30分処理した場合、pH5.5〜9.5
において90％以上の残存活性を示した（第５図）。 （５）至適温度:pH7.0においては、エチオコラン−３α
−オール−17−オンの場合40℃付近にある。 （６）温度安定性:pH7.0において37℃、10分では95％以
上安定である。 （７）Km値:8×10-4Ｍ（エチオコラン−３α−オール−
17−オンに対して） - 【請求項２】シュードモナス・テストステロニーATCC 1
1996の培養物中から得られたものである特許請求の範囲
第１項記載の３α−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ
組成物。 - 【請求項３】被検体を、下記の理化学的性質（１）〜
（７）を有するシュードモナス属に属する菌由来の３α
−ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物又はこれを
含有する酵素製剤とともにインキュベートし、生成され
る過酸化水素量または３−オキソステロイド量を測定す
ることを特徴とする３α−ヒドロキシステロイドの定量
法。 （１）作用:3α−ヒドロキシステロイド類の３α水酸基
を特異的に酸化し、３−オキソステロイド類とすると同
時に過酸化水素を生成する。 （２）基質特異性：エチオコラン型（５β−アンドロス
タン−３α−オール）に対して作用する。アンドロステ
ロン型（５α−アンドロスタン−３α−オール）には作
用しない。 （３）至適pH:pH9.2付近でエチオコラン−３α−オール
−17−オンに対する作用が至適である（第４図）。 （４）pH安定性:30℃で30分処理した場合、pH5.5〜9.5
において90％以上の残存活性を示した（第５図）。 （５）至適温度:pH7.0においては、エチオコラン−３α
−オール−17−オンの場合40℃付近にある。 （６）温度安定性:pH7.0において37℃、10分では95％以
上安定である。 （７）Km値:8×10-4Ｍ（エチオコラン−３α−オール−
17−オンに対して）
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61160325A JPH0687777B2 (ja) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 |
| US07/063,912 US4889801A (en) | 1986-07-08 | 1987-06-19 | 3α-hydroxysteroid oxidase and quantitative analysis of 3α-hydroxysteroid making use of same |
| DE8787109789T DE3783671T2 (de) | 1986-07-08 | 1987-07-07 | 3-alpha-hydroxysteroid-oxydase und massanalyse von 3-alpha-hydroxysteroid unter verwendung derselben. |
| AT87109789T ATE84821T1 (de) | 1986-07-08 | 1987-07-07 | 3-alpha-hydroxysteroid-oxydase und massanalyse von 3-alpha-hydroxysteroid unter verwendung derselben. |
| EP87109789A EP0252490B1 (en) | 1986-07-08 | 1987-07-07 | 3-alpha-hydroxysteroid oxidase and quantitative analysis of 3-alpha-hydroxysteroid making use of same |
| NO872823A NO171458C (no) | 1986-07-08 | 1987-07-07 | 3alfa-hydroksysteroid-oksydase, kvantitativ analyse av 3alfa-hydroksysteroid ved bruk derav, og et reagens for denne kvantitative analyse |
| ES87109789T ES2053475T3 (es) | 1986-07-08 | 1987-07-07 | Una 3-alfa-hidroxiesteroide oxidasa y analisis cuantitativo de una 3-alfa-hidroxiesteroide. |
| GR920402541T GR3006941T3 (ja) | 1986-07-08 | 1993-01-29 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61160325A JPH0687777B2 (ja) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6314692A JPS6314692A (ja) | 1988-01-21 |
| JPH0687777B2 true JPH0687777B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=15712520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61160325A Expired - Lifetime JPH0687777B2 (ja) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4889801A (ja) |
| EP (1) | EP0252490B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0687777B2 (ja) |
| AT (1) | ATE84821T1 (ja) |
| DE (1) | DE3783671T2 (ja) |
| ES (1) | ES2053475T3 (ja) |
| GR (1) | GR3006941T3 (ja) |
| NO (1) | NO171458C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2719709B2 (ja) * | 1988-11-28 | 1998-02-25 | 丸金醤油株式会社 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 |
| JP2811319B2 (ja) * | 1989-04-18 | 1998-10-15 | 旭化成工業株式会社 | 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物 |
| CH686445A5 (de) * | 1992-10-06 | 1996-03-29 | Balzers Hochvakuum | Kammer und Kammerkombination fuer eine Vakuumanlage und Verfahren zum Durchreichen mindestens eines Werkstueckes. |
| CN113151207B (zh) * | 2021-04-21 | 2023-03-31 | 重庆第二师范学院 | NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1397406A (en) * | 1971-06-22 | 1975-06-11 | Nyegaard & Co As | Enzymic reagent |
| JPS6131097A (ja) * | 1984-07-23 | 1986-02-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な高感度酵素的測定法 |
| US4680259A (en) * | 1984-09-26 | 1987-07-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for colorimetric determination of total cholesterol |
| US4737457A (en) * | 1986-02-26 | 1988-04-12 | Eastman Kodak Company | Analytical composition, element and method for the determination of hydrogen peroxide |
-
1986
- 1986-07-08 JP JP61160325A patent/JPH0687777B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-19 US US07/063,912 patent/US4889801A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-07 DE DE8787109789T patent/DE3783671T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-07 NO NO872823A patent/NO171458C/no not_active IP Right Cessation
- 1987-07-07 AT AT87109789T patent/ATE84821T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-07 ES ES87109789T patent/ES2053475T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-07 EP EP87109789A patent/EP0252490B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-01-29 GR GR920402541T patent/GR3006941T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4889801A (en) | 1989-12-26 |
| NO171458B (no) | 1992-12-07 |
| NO872823D0 (no) | 1987-07-07 |
| JPS6314692A (ja) | 1988-01-21 |
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| EP0252490A3 (en) | 1990-01-17 |
| NO171458C (no) | 1993-03-17 |
| NO872823L (no) | 1988-01-11 |
| DE3783671D1 (de) | 1993-03-04 |
| EP0252490B1 (en) | 1993-01-20 |
| ATE84821T1 (de) | 1993-02-15 |
| GR3006941T3 (ja) | 1993-06-30 |
| EP0252490A2 (en) | 1988-01-13 |
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