JPH0250427B2

JPH0250427B2 -

Info

Publication number: JPH0250427B2
Application number: JP9742581A
Authority: JP
Inventors: Junichi Fujimatsu; Tomiaki Morimoto; Toshio Shikata
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1981-06-25
Filing date: 1981-06-25
Publication date: 1990-11-02
Also published as: EP0068465A3; CA1177749A; EP0068465B1; DE3267565D1; EP0068465A2; JPS58753A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体および検出試
薬に関する。さらに詳しくは、非Ａ非Ｂ型肝炎関
連抗体および当該抗体の結合体並びにこれらを主
要な構成成分として含有する非Ａ非Ｂ型肝炎関連
抗原検出試薬に関する。ウイルス肝炎については従来よりＡ型およびＢ
型の存在が知られており、すでに関連抗原抗体系
も明らかにされ、これを利用した免疫血清学的な
診断が可能となり、さらにワクチンの開発、導入
にまで至つている。しかしながら、これに伴つて非Ａ非Ｂ型肝炎、
すなわち、従来から知られているＡ型肝炎および
Ｂ型肝炎のいずれにも属さないウイルス肝炎の存
在が知られるようになり、しかもその発生頻度が
予想以上に高いことが明らかとなつて来た。例え
ば、輸血後肝炎の80〜90％あるいはさらにこれ以
上のものが非Ａ非Ｂ型肝炎であり、散発的に発生
する急性肝炎についても約50％は非Ａ非Ｂ型肝炎
であることが報告されるに至つている。また正常
供血者の中にさえ非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスの保有
者がかなりの数存在することが明らかとなつて来
た。以下に記載する文献は非Ａ非Ｂ型肝炎に関す
る上述の状況を報告するものであり、参考のため
に列挙する。 (1) Prince、A.M.et al.：Long−incubation
post−transfusion hepatitis without
serological evidence of exposure to
hepatitis−Ｂ virus.Lancet.H：241−246、
1974. (2) Alter、H.J.et al.：Clinical and
serological analysis of transfusion−
associated hepatitis.Lancet.H：838−841、
1975. (3) Feinstone、S.M.et.al：Transfusion−
associated hepatitis not due to viral
hepatitis type Ａ or B.N.Engl.J.Med.292：
767−770、1975. (4) Meyers、J.D.et al.：Parenterally
transmitted non−Ａ、non−Ｂ hepatitis.
Ann.Intern.Med.87：57−59、1977. (5) Villarejos、V.M.et al.：Evidence for
viral hepatitis other than type Ａ or type
Ｂ among persons in Costa Rica.N.Engl.J.
Med.293：1350−1352.1975. (6) Dienstag、J.L.et al.：Etiology of
sporadic hepatitis Ｂ surface anuigen−
negative hepatitis.Ann.Intern.Med.87：−
６、1977. さて、ここで非Ａ非Ｂ型肝炎とはＡ型肝炎ウイ
ルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイル
ス、エプスタインバーウイルスなど従来知られた
ウイルス以外のウイルスが病原体として関与する
ことにより発生すると考えられる肝炎であつて、
HA抗体、HBs抗体、HBc抗体、HBe抗体など
既知ウイルスに対する抗体について有意の上昇が
認められないものを言う。従つて、非Ａ非Ｂ型肝
炎患者とは、肝炎ウイルスに起因する肝炎患者で
あつて、Ａ型肝炎診断およびＢ型肝炎診断におい
て陰性を示し、Ａ型肝炎からもＢ型肝炎からも除
外された患者であると定義される。一般に非Ａ非
Ｂ型肝炎では、Ｂ型肝炎に比較すると輸血から発
症までの平均潜伏期が短く、またGPTの最大値
も低いという傾向がある。しかしその反面、持続
性があり、例えばGPT異常は慢性化してかなり
の長期間に及ぶという特徴がある。しかし、いづ
れにせよ、非Ａ非Ｂ型肝炎は輸血後肝炎の大部分
を占めており、かつ非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスが原
因となる肝疾患は肝硬変、肝癌など広範囲に及ん
でおり、適切なる対応策が早急に開発されること
が望まれているのである。とりわけ、輸血用血液
中の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原を正確に検出する手
段が提供されることは当該分野における急務であ
る。しかるに、非Ａ非Ｂ型肝炎については、未だ
そのウイルス本態あるいはそれに関連した抗原抗
体系が確立されておらず、従つて適切なる診断お
よびワクチンの製造がなされていないのが現状で
ある。かかる実情にかんがみ、本発明者は非Ａ非Ｂ型
肝炎について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ型肝炎
に特異的である関連抗原を物質として単離するこ
とを試み、その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝から
の分離精製により所期の物質を収得することに成
功した。さらに引き続き、本発明者は当該物質を
用いて非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体を免疫学的手法に
より作製することを試み、これに成功し、本発明
を完成するに至つた。以上より明らかなごとく、本発明の目的は非Ａ
非Ｂ型肝炎について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ
型肝炎に特異的である関連抗体を提供すること並
びに同抗体を用いて非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原の検
出を可能にすることである。次に本発明を詳細に説明する。本発明抗体は非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原との間に
おいて特異的に抗原抗体反応を呈する性質があ
り、この性質が本発明抗体を特定する。ここに非
Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原とは非Ａ非Ｂ型肝炎患者の
剖検肝からの分離精製によつて得られ、下記のご
とき理化学的性状によつて特定されるものであ
る。すなわち、その分子量はゲル過法により求
めると150万以上である。沈降定数（10^-13）は
Beckmann Model Ｅで測定すると51.5Sを示す。
塩化セシウムまたは臭化カリウム溶液中の浮上密
度（ｇ／cm³）はアツベの屈折計によつて求めると
1.15〜1.25である。粒子直径（ｎｍ）は電子顕微
鏡観察によると26〜37（平均31.5）である。電気
的移動度は免疫電気泳動法により求めるとα₂−α₁
グロブリンの領域である。本発明抗体が上記の非Ａ非Ｂ型肝炎抗原との間
において呈する抗原抗体反応は、後記実験例１に
示されるごとく特異的なものである。従つて当該
反応によつて本発明抗体を特定することができ
る。また当該反応は、後記実験例２および３に示
されるごとく定量的である。従つて当該反応を利
用して非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原の検出をすること
ができる。次に本発明抗体は頻回輸血を受けた患者血清あ
るいは非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者血清を原料とし
て、これらからの分離精製によつて直接的に収得
することもできるが、一般にはヒト以外の動物を
使つて免疫学的手法により間接的に収得する。す
なわち、後記実施例１に示されるごとく、前記非
Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原を例えばフロインド完全ア
ジユバントと共に家兎に頻回接種して免疫を与
え、そこから得られる抗血清についてIgG精製分
劃をおこない収得することができる。また、ここで使用される非Ａ非Ｂ型関連抗原は
非Ａ非Ｂ型肝炎肝炎剖検肝を出発物質として通常
のタンパク分劃精製法、例えば密度勾配遠心分離
法、塩析法、電気泳動法、ゲル過法、アフイニ
テイークロマトグラフイー法、等電点分劃法、限
外過法、コーンの分劃法を適宜組合わせて収得
することができる。例えば非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝
ホモジネート上清について、まずセフアクリルＳ
−200を用いてカラムクロマトグラフイー分劃を
行い、得られた抗原陽性フラクシヨンを限外過
して加圧濃縮し、最後に超遠心分離と透析を繰返
す。ここで超遠心分離には蔗糖濃度勾配遠心およ
び塩化セシウム密度勾配遠心を組合わせて一回な
いし数回行うのが好ましい。次に本発明抗体の用途としては、非Ａ非Ｂ型肝
炎関連抗原の検出、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断、非Ａ
非Ｂ型肝炎の予防等をあげることができる。すな
わち、本発明抗体は前記のごとく非Ａ非Ｂ型肝炎
関連抗原との間において特異的な抗原抗体反応を
呈することができるので、当該抗原を正確に検出
するための試薬を構成するものとなることができ
る。例えば輸血用血液に対する検査用試薬を構成
することができる。同様に非Ａ非Ｂ型肝炎の診断
薬を製造するための原料となることも期待され
る。また、本発明抗体は非Ａ非Ｂ型肝炎を予防す
るための免疫グロブリン製剤の構成原料となるこ
とも期待される。次に本発明検出試薬は本発明抗体を使用してい
づれの免疫学的検出方法を利用するものであつて
も可能である。つまり検出試薬は採用する免疫学
的検出方法に応じて適宜に調製することができ
る。例えば検出方法としてマイクロオクタロニー
法（MO）、免疫電気泳動法（IES、IEP）、補体
結合反応法（CF）、免疫粘着血球凝集反応法
（IAHA）、一元平板免疫拡散法（SRID）を利用
する場合には本発明抗体をそのまま使用して適当
な形態に調製すればよい。一例として一元平板免
疫拡散法を利用する場合を示せば、支持体として
寒天、アガロース、デンプン、ポリアクリルアミ
ドゲル等の中から適当なものを選び、これを緩衝
液に加熱溶解し、次に本発明抗体を添加混合し、
得られる溶液をガラス板上あるいはプラスチツク
容器内に流し冷却固化し、固化したゲル平板に被
検血清注入用の孔をあければよい。しかるに、検出方法として逆受身赤血球凝集反
応法（Ｒ−PHA）、放射性免疫測定法（RIA）、
酵素抗体法（ELISA）等を利用する場合には本
発明抗体に適当なる結合体となす必要がある。す
なわち逆受身赤血球凝集反応法（Ｒ−PHA）を
利用する場合には本発明抗体を微小粒子に結合さ
せる必要がある。微小粒子としては哺乳類および
鳥類の赤血球が好ましいが、その他、ポリスチレ
ンラテツクス、ポリエステルラテツクス、塩化ビ
ニル、ベントナイト、ガラスビーズ等の約１〜
10μの粒子も使用することができる。本発明抗体
と微小粒子を結合させるには、例えばグルタール
アルデヒド、ホルムアルデヒド、タンニン酸、ビ
スジアゾダイスベンチジン、塩化クロム、カルボ
ジイミドなどを使用すればよい。放射性免疫測定法（RIA）を利用する場合には
本発明抗体をアイソトープでラベル化する必要が
ある。アイソトープとしては ¹²⁵I、 ¹³¹Iを使用
することができ、クロラミンＴ法により結合させ
ればよい。酵素抗体法（ELISA）を利用する場合には、
本発明抗体を酵素と結合させる必要がある。酵素
としては、例えばグルコースオキシダーゼ、アル
カリホスフアターゼ、ペルオキシダーゼ、ベータ
ーガラクトシダーゼ等を使用することができる。
結合剤としてはグルタールアルデヒドを使用すれ
ばよい。本発明抗体およびこれを含む検出試薬の有用性
を以下に記載する実験例をもつて説明する。実験例１試料ａ非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製によつ
て得られ、前記の理化学的性状を有する非Ａ非
Ｂ型肝炎関連抗原（以下、実験例２および実験
例３において同じ）ｂ非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者の血清ｃ非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝ホモジネート上清ｄ正常ヒト肝ホモジネート上清ｅ正常ヒト血清ｆ実施例１によつて得られた本発明抗体（家兎
免疫抗血清をIgG精製分劃したもの）方法アガロースＡ−45（半井化学）0.8％（Ｗ／Ｖ）、
EDTA・3Na0.02M、塩化ナトリウム0.1M、
NaN₃0.1％をトリス塩酸緩衝液（0.01M、PH7.5）
に溶解し、厚さ1.5mmの寒天ゲル平板を作製し、
試料についてマイクロオクタロニー法による検出
テストをおこなつた。結果結果を図１に示す。図中ａ〜ｆの丸枠は対応す
る試料をスポツトした配置エリアを示す。図１に
おいてba間の沈降線とbc間の沈降線とは完全に
融合しており、またab間の沈降線とaf間の沈降
線とは完全に融合している。つまりａとｃとはｂ
に対して免疫学的に同一の抗原性を有し、またｂ
とｆとはａに対して免疫学的に同一の抗体特異性
を示している。他方、正常ヒト肝ホモジネートｄ
および正常ヒト血清ｅは交差反応をまつたく示し
ていない。そもそも非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝とは前
記定義から明らかなごとく、肝炎ウイルスに起因
する肝炎患者であつて、Ａ型肝炎診断およびＢ型
肝炎診断において陰性を示し、Ａ型肝炎からもＢ
型肝炎からも除外された患者の剖検肝である。従
つて非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの抗原を使用して
実施例１のごとく免疫産生せしめた本発明抗体ｆ
は非Ａ非Ｂ型肝炎抗原ａとの間において特異的な
抗原抗体反応を呈するものであり、かつ当該抗体
は非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者の血清からも収得す
ることのできるものであることが判明する。実験例２試料非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原を表１の抗原希釈比欄
記載のごとき７段階に希釈したものを試料とし
た。また実施例２の記載において希釈倍率を適宜
変更することにより、抗体含有率が0.6％、1.0％
および1.4％である三種のSRID法用アガロースゲ
ルを用意した。方法試料を各5μづつ添加し、室温に放置して20
時間経過後に、生成した沈降リングの直径（mm）
を測定した。結果結果を表１に示す。表１よりSRID法を利用す
る本発明試薬を使用することより非Ａ非Ｂ型肝炎
関連抗原の定量検索が可能となることが判明す
る。例えば、アガロースゲルにおける抗体含有率
を1.0％以下にすると定量性が向上することが判
る。

【表】表中、一は抗原抗体反応による沈降リングが検
出されない、＋は沈降リングの形成はあるが、精
確にリング直径を測定することができない（直径
4.0mm以下）の意味を表わす。実験例３試料ａ非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原ｂ非Ａ非Ｂ型肝炎患者肝ホモジネート上清ｃ正常ヒト肝ホモジネート上清また実施例３の記載において、IgG精製物をリ
ン酸緩衝生理食塩液でその抗体希釈比が１：10、
１：20、１：40および１：80になるように希釈し
た液を使用して、その他については実施例３記載
と同様に処理し、四種類ろＲ−PHA法用抗体感
作羊赤血球を用意した。方法アクリル製のマイクロタイトレーシヨンプレー
ト（Ｖ−タイプ）に２％正常家兎血清を含有する
リン酸緩衝生理食塩液（0.15M、PH7.2）25μを
添加し、検体試料を二系列ずつ2ⁿ倍希釈した。次
に一方の系列には２％正常家兎血清を含有するリ
ン酸緩衝生理食塩液（0.15M、PH7.2）25μを、
他方の系列には非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者の血清
25μを添加し、37℃で30分間インキユベートし
た。その後抗体感作羊赤血球を添加し、室温で２
時間放置し、凝集の有無を確認した。緩衝液側の
凝集価が３管（８倍希釈）以上を示し、非Ａ非Ｂ
型肝炎回復期患者の血清の添加による凝集抑制が
２管以上確認された場合に陽性と判定し、凝集を
認めた最大希釈倍数の逆数を抗原価とした。結果結果を表２に示す。

【表】表中、−は凝集価２倍以下を示す。表２より、本発明抗体を感作せしめた羊赤血球
による凝集反応の感度はMO法に比較して50〜
100倍以上であり、優れて高いことが判明する。
また凝集抗原の特異性は本発明抗体を含む非Ａ非
Ｂ型肝炎回復期患者の血清による凝集抑制の有無
から明瞭に確認することができることも判明す
る。以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに
詳細に説明する。実施例１非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製によつて
得られ、前記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎関連抗原を含有する溶液にフロイント完全ア
ジユバントを１：１の比に加えて乳化した。乳化
液0.5mlをウサギの背部皮下、皮内および足蹠部
に分割注射して免疫した。１週間後に同量の乳化
液を同様にして追加免疫し、さらに初回の免疫よ
り１カ月後に倍量の乳化液を再度追加免疫した。
最後の免疫より１週間後より数回にわたつて採血
し、血清を分離した。この血清に同量の正常ヒト
肝ホモジネート上清を加え、37℃で１時間、さら
に４℃で１夜放置した。これを10000rpmで10分
間遠心分離し、上澄液を採取した。本発明抗体を
水溶液の状態で保存し、実施例２で用いた。次に、本発明抗体50mlを0.01Mリン酸緩衝液
（PH8.0）を外液として４℃一昼夜透析した。さら
に、0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）で十分平衡化
したDEAEセルロースをカラムに充填し、本発明
抗体を添加、γ−グロブリン以外の血清蛋白を吸
着させた。引続きリン酸緩衝液（0.01M、PH8.0）
で未吸着のγ−グロブリンを溶出させ回収し、
PM−10メンブレンを用い加圧限外濃縮し、蛋白
量を約1.0mg／mlに調整し、本発明抗体IgG精製物
として実施例３、４、５に用いた。実施例２ PH7.5、0.01Mのトリス塩酸緩衝液（0.15Mの塩
化ナトリウムおよび0.1％の窒化ナトリウムを含
む）中にアガロースを1.2％濃度になるように加
熱溶解した。このアガロース溶液80mlを約56℃ま
で冷却し、実施例１で得られた溶液を10倍に希釈
し、その20mlを添加して撹拌した。これをプラス
チツク容器中に注入して放冷し、厚さ１mmのアガ
ロースゲル平板となした。この平板に一定の間隔
をおいて直径３mmの試料孔をあけた。得られたも
のは抗体含有率が2.0％のものであり、SRID法を
利用する検出試薬に使用される。実施例３ヒツジ血液を遠心管にとり、生理食塩液を用い
て2000rpmで10分間の遠心分離を５回繰返し、赤
血球を洗滌した。この赤血球にPH7.5、0.15Mの
リン酸緩衝生理食塩液を加えて５％濃度に調製し
た。同リン酸緩衝生理食塩液で2.5％濃度に調製
したグルタールアルデヒド溶液を前記赤血球浮遊
液中に、その５分の１容加え、撹拌しながら室温
で約５時間反応させ、赤血球を固定した。ついで
この溶液を遠心分離して固定赤血球を得、さらに
生理食塩液を用い遠心分離により数回洗滌した。
この固定赤血球を前記リン酸緩衝液で５mg／ml浮
遊液に調整し、これに同リン酸緩衝生理食塩液で
５mg／dlに調製したタンニン酸溶液を等量添加し
て30分間撹拌した。この溶液を遠心分離してタン
ニン酸処理固定赤血球を得、さらに生理食塩液を
用い遠心分離により数回洗滌した。得られたタン
ニン酸処固定赤血球に前記リン酸緩衝液を加え、
５％赤血球浮遊液とした。この赤血球浮遊液と実施例１で得られたIgG精
製物を前記リン酸緩衝生理食塩液で蛋白質濃度が
約50μｇ／ml（抗体釈比１：20）になるように希
釈した液とを同量混合し、室温で60分間撹拌して
感作した。この液を遠心分離して感作血球を得、
さらに生理食塩液を用い遠心分離により数回洗滌
した。得られた感作赤血球に２％正常家兎血清含
有リン酸緩衝生理食塩液を加えて７％浮遊液とし
た。この感作赤血球はＲ−PHA法を利用する検
出試薬に使用される。実施例４実施例１で得られたIgG精製物をPH7.5、0.05M
のリン酸緩衝液に溶解し、蛋白質濃度を１mg／ml
に調整する。この液10μに１ミリキユーリーの
¹²⁵I−Na50μを加え、さらにクロラミンＴを
前記リン酸緩衝液に1.5mg／mlの割合に溶解した
液を10μ加えて30秒間撹拌する。次いでメタ重
亜硫酸ナトリウムを前記リン酸緩衝液に２mg／ml
の割合に溶解した液を100μ加えて反応を停止
させる。ヨウ化カリウムを前記リン酸緩衝液に10
mg／mlの割合に溶解した液100μをこの反応液
に加え、ただちにセフアデツクスＧ−50を用いた
ゲル過により ¹²⁵I標識物質と ¹²⁵Iとを分離す
る。得られた ¹²⁵I標識物質の比放射能は約５〜
20μCi／μｇとなる。この ¹²⁵I標識物質はRIA法
を利用する検出試薬に使用される。実施例５実施例１で得られたIgG精製物を５〜10mg／ml
（0.05Mリン酸緩衝生理食塩液中）となるまで濃
縮し、この0.1〜0.2mlに対してアルカリホスフア
ターゼ（５mg／ml）を0.3mlの割合で添加し撹拌
する。次に2.5％グルタールアルデヒド溶液50μ
を添加し、室温で30分間撹拌する。これを0.05M
トリス塩緩衝液（PH8.0）で一昼夜透析し、
2000rpmで10分間遠心分離したのち、その上清を
酵素標識抗原としてEIA法を利用する検出試薬に
使用される。

【図面の簡単な説明】

図１は実験例１結果の項に記載の図１に相当す
る図面であり、マイクロオクタロニー法における
沈降線の生成状況を示す模式図である。

Claims

【特許請求の範囲】１非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製によつ
て得られ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ
型肝炎関連抗原との間において特異的な抗原抗体
反応を呈する非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体。分子量 150万以上（ゲル過法）沈降定数（10^-13） 51.5S（超遠心析法）浮上密度（ｇ／cm³） 1.15〜1.25（塩化セシウム
中および臭化カリウム中）粒子直径（ｎｍ） 26〜37 電気的移動度
α₂−α₁グロブリン領域（アガロースゲル中）２非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製よつて
得られ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ型
肝炎関連抗原との間において特異的な抗原抗体反
応を呈する非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体を主要な構成
成分として含有する非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原検出
試薬分子量 150万以上（ゲル過法）沈降定数（10^-13） 51.5S（超遠心分析法）浮上密度（ｇ／cm³） 1.15〜1.25（塩化セシウム
中および臭化カリウム中）粒子直径（ｎｍ） 26〜37 電気的移動度
α₂−α₁グロブリン領域（アガロースゲル中）