JPH0690746A - ７−アミノセファロスポラン酸の酵素的製造方法 - Google Patents
７−アミノセファロスポラン酸の酵素的製造方法Info
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- JPH0690746A JPH0690746A JP3282343A JP28234391A JPH0690746A JP H0690746 A JPH0690746 A JP H0690746A JP 3282343 A JP3282343 A JP 3282343A JP 28234391 A JP28234391 A JP 28234391A JP H0690746 A JPH0690746 A JP H0690746A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高収率でグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
を産生し、最終生成物たる７−アミノセファロスポラン
酸を分解するβ−ラクタマーゼ活性を実質的に有しない
Ｅ．ｃｏｌｉリコンビナント株を得る。 【構成】 ７β−（４−カルボキシブタンアミド）セフ
ァロスポラン酸から７−アミノセファロスポラン酸の酵
素的製造に関する組換えＤＮＡ技術；Ｅ．ｃｏｌｉ中で
の７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポ
リンアシラーゼ活性酵素をコードする遺伝子のクローニ
ング；ハイパニプロダクション；酵素抽出及び固定化に
よる遺伝子の単離。
を産生し、最終生成物たる７−アミノセファロスポラン
酸を分解するβ−ラクタマーゼ活性を実質的に有しない
Ｅ．ｃｏｌｉリコンビナント株を得る。 【構成】 ７β−（４−カルボキシブタンアミド）セフ
ァロスポラン酸から７−アミノセファロスポラン酸の酵
素的製造に関する組換えＤＮＡ技術；Ｅ．ｃｏｌｉ中で
の７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポ
リンアシラーゼ活性酵素をコードする遺伝子のクローニ
ング；ハイパニプロダクション；酵素抽出及び固定化に
よる遺伝子の単離。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、７−アミノセファロス
ポラン酸の酵素的製造法に関する。特に、本発明は、７
β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン
酸から７−アミノセファロスポラン酸の酵素的製造に関
し、リコンビナントＤＮＡ技術；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ属微生物中での７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）セファロスポリンアシラーゼ活性酵素をコードする
遺伝子のクローニング；前記微生物での発酵による前記
酵素のハイパープロダクション（ｈｙｐｅｒｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ）；及び前記酵素の抽出及び固定化により、
前記酵素をコードする遺伝子を単離する方法を提供する
ものである。
ポラン酸の酵素的製造法に関する。特に、本発明は、７
β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラン
酸から７−アミノセファロスポラン酸の酵素的製造に関
し、リコンビナントＤＮＡ技術；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ属微生物中での７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）セファロスポリンアシラーゼ活性酵素をコードする
遺伝子のクローニング；前記微生物での発酵による前記
酵素のハイパープロダクション（ｈｙｐｅｒｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ）；及び前記酵素の抽出及び固定化により、
前記酵素をコードする遺伝子を単離する方法を提供する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】醗酵による７β−（４−カルボキシブタ
ンアミド）セファロスポリンアシラーゼ（以下、グルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼと言う）の製造としては、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐ．（Ｓｈｉｂｕｙａ等、（１９８１）Ａｇｒ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４５，１５６１；Ｍａｔｓｕｄａ
Ａ．等（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３，
１２２２；Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等（１９８７）Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，５８１５）のような微生物
の使用が知られている。上記微生物によるこれらの酵素
の生産は、多くの欠点を有している。第一に、グルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性レベルが非常に低いこと
であり、第二に、グルタリルアシラーゼ活性とともに、
これらの微生物によって他の酵素が生産されることであ
る。例えば、７−アミノセファロスポラン酸を分解する
β−ラクタマーゼ及びアセチラーゼであり、これらは、
生産収率の低下及び最終生成物精製プロセスのコスト高
をもたらす。前記の酵素コンタミネーションを防止する
ために、該グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの精製が
必要となり、これは、そして７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）セファロスポラン酸から出発して７−アミ
ノセファロスポラン酸を得る酵素的プロセスのコストを
高め、そのプロセスを大きく損なうことになる。
ンアミド）セファロスポリンアシラーゼ（以下、グルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼと言う）の製造としては、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐ．（Ｓｈｉｂｕｙａ等、（１９８１）Ａｇｒ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４５，１５６１；Ｍａｔｓｕｄａ
Ａ．等（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３，
１２２２；Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等（１９８７）Ｊ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，５８１５）のような微生物
の使用が知られている。上記微生物によるこれらの酵素
の生産は、多くの欠点を有している。第一に、グルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性レベルが非常に低いこと
であり、第二に、グルタリルアシラーゼ活性とともに、
これらの微生物によって他の酵素が生産されることであ
る。例えば、７−アミノセファロスポラン酸を分解する
β−ラクタマーゼ及びアセチラーゼであり、これらは、
生産収率の低下及び最終生成物精製プロセスのコスト高
をもたらす。前記の酵素コンタミネーションを防止する
ために、該グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの精製が
必要となり、これは、そして７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）セファロスポラン酸から出発して７−アミ
ノセファロスポラン酸を得る酵素的プロセスのコストを
高め、そのプロセスを大きく損なうことになる。
【０００３】最近、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＧＫ１６
株（Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ １６３，１２２２）及びＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓＳＥ８３株（Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等、（１９８
７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１６９，５８１５）からの
グルタリル−７ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を単離する２つ
のプロセスが記述されている。第１のプロセスでは、グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼをコードする遺伝子
を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＧＫ１６のライブラリー
から得られたクローンのインディビジュアライズドアッ
セイ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ａｓｓａｙ）、
酵素的アッセイ法により単離した。第二のケースでは、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼをコードする遺伝子
をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＳＥ８３のライブラリーか
ら得たクローンのインディビジュアライズドアッセイに
より、７−アミノセファロスポラン酸には感受性である
が、７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロス
ポラン酸には感受性でないアッセイ−微生物を用いて、
単離している。これらの方法は、共に極めて煩わしく、
非効率的である。というのは、これらは、何千ものクロ
ーンを分析するからである。更に、両方法とも、感度上
の限界を、特に、酵素的方法の場合に有している。Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＧＫ１６及ひＳＧ８３のグルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子は、遺伝子工学で頻ぱ
んに使用されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株で
発現される（Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等、（１９８５）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３，１２２２，Ｍａｔｓ
ｕｄａ Ａ．等、（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１６９，５８１５）。
株（Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ １６３，１２２２）及びＰｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓＳＥ８３株（Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等、（１９８
７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１６９，５８１５）からの
グルタリル−７ＡＣＡアシラーゼ遺伝子を単離する２つ
のプロセスが記述されている。第１のプロセスでは、グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼをコードする遺伝子
を、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＧＫ１６のライブラリー
から得られたクローンのインディビジュアライズドアッ
セイ（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ ａｓｓａｙ）、
酵素的アッセイ法により単離した。第二のケースでは、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼをコードする遺伝子
をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＳＥ８３のライブラリーか
ら得たクローンのインディビジュアライズドアッセイに
より、７−アミノセファロスポラン酸には感受性である
が、７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロス
ポラン酸には感受性でないアッセイ−微生物を用いて、
単離している。これらの方法は、共に極めて煩わしく、
非効率的である。というのは、これらは、何千ものクロ
ーンを分析するからである。更に、両方法とも、感度上
の限界を、特に、酵素的方法の場合に有している。Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ＧＫ１６及ひＳＧ８３のグルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子は、遺伝子工学で頻ぱ
んに使用されるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株で
発現される（Ｍａｔｓｕｄａ Ａ．等、（１９８５）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３，１２２２，Ｍａｔｓ
ｕｄａ Ａ．等、（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１６９，５８１５）。
【０００４】
【発明が解決すべき課題】土壌から単離したグルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼ−生産性Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ ｓｐ．は、極めて低い酵素的収率レベルを示
し、極めて退屈な突然変異的（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）ス
クリーニング法が必要であった。この方法は、生産性を
改善するものの、満足すべき良好な結果を導くものでは
ない。変異による改良方法を用いて、１００−１５０倍
の増加が得られたが、本発明により得られた１，０００
倍の増加からはほど遠いものであった。他方、より良い
生産性ミュータントをスクリーニングした後でさえ、前
記した好ましくない酵素（β−ラクタマーゼ、エステラ
ーゼ等）の合成は、避けられない。Ａｃｉｎｅｂｅｃｔ
ｅｒ ｓｐ．からのグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
をコードする遺伝子の単離、クローニング及び同定並び
に形質転換によるＥ．ｃｏｌｉ中への再挿入に関する科
学的文献中にも、いかなる参照も見出されなかった。
−７ＡＣＡ−アシラーゼ−生産性Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃ
ｔｅｒ ｓｐ．は、極めて低い酵素的収率レベルを示
し、極めて退屈な突然変異的（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）ス
クリーニング法が必要であった。この方法は、生産性を
改善するものの、満足すべき良好な結果を導くものでは
ない。変異による改良方法を用いて、１００−１５０倍
の増加が得られたが、本発明により得られた１，０００
倍の増加からはほど遠いものであった。他方、より良い
生産性ミュータントをスクリーニングした後でさえ、前
記した好ましくない酵素（β−ラクタマーゼ、エステラ
ーゼ等）の合成は、避けられない。Ａｃｉｎｅｂｅｃｔ
ｅｒ ｓｐ．からのグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
をコードする遺伝子の単離、クローニング及び同定並び
に形質転換によるＥ．ｃｏｌｉ中への再挿入に関する科
学的文献中にも、いかなる参照も見出されなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】従来のランダムミューテ
ーション法及びオーバープロデューシング（ｏｖｅｒ−
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）株のスクリーニングによっては、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性の注目すべき増
加を得ることはできなかったが、本発明のリコンビナン
トＤＮＡ技術により可能となった。このようなリコンビ
ナントＤＮＡ法による収率の増加は、親株（Ｐａｒｅｎ
ｔａｌ ｓｔｒａｉｎ）中に存在する前記好ましからざ
る酵素活性を排除するという付加的利益を持たらす。
ーション法及びオーバープロデューシング（ｏｖｅｒ−
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）株のスクリーニングによっては、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性の注目すべき増
加を得ることはできなかったが、本発明のリコンビナン
トＤＮＡ技術により可能となった。このようなリコンビ
ナントＤＮＡ法による収率の増加は、親株（Ｐａｒｅｎ
ｔａｌ ｓｔｒａｉｎ）中に存在する前記好ましからざ
る酵素活性を排除するという付加的利益を持たらす。
【０００６】デオキシリボ核酸（以下、ＤＮＡという）
のドナーとして、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを
生産するどのような微生物、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ、及び特に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．ＡＴＣＣ５３８９１からでも開始することができ
る。そして、その染色体ＤＮＡ（これは、グルタリル−
７ＡＣＡ−アシラーゼをコードする遺伝情報を含んでい
る）を消化し、得られたＤＮＡフラグメントをＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：株から得られたＤＮＡベク
ター中に挿入した。得られたリコンビナントベクターを
グルタリル−７ＡＣＡアシラーゼを生産しない、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ属に属し数種の化合物に栄養要求性
（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）を示す宿主微生物の細胞に導
入した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性を発現
するリコンヒナントベクターを持つ形質転換体を、人工
培地を用いてスクリーニングした。この中には、宿主が
栄養要求を持つ１種若しくは数種の化合物を、グルタリ
ル酸又はグルタリル酸の誘導体である他の酸又はグルタ
リル酸の誘導体でない他の酸とのアミド型の結合（ｌｉ
ｎｋ）によるリンケージによって得られた前記化合物の
誘導体により置換され、そして、ＤＮＡドナー株により
生産されたグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼにより加
水分解に服される。
のドナーとして、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを
生産するどのような微生物、例えばＡｃｉｎｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ、及び特に、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．ＡＴＣＣ５３８９１からでも開始することができ
る。そして、その染色体ＤＮＡ（これは、グルタリル−
７ＡＣＡ−アシラーゼをコードする遺伝情報を含んでい
る）を消化し、得られたＤＮＡフラグメントをＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：株から得られたＤＮＡベク
ター中に挿入した。得られたリコンビナントベクターを
グルタリル−７ＡＣＡアシラーゼを生産しない、Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ属に属し数種の化合物に栄養要求性
（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）を示す宿主微生物の細胞に導
入した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性を発現
するリコンヒナントベクターを持つ形質転換体を、人工
培地を用いてスクリーニングした。この中には、宿主が
栄養要求を持つ１種若しくは数種の化合物を、グルタリ
ル酸又はグルタリル酸の誘導体である他の酸又はグルタ
リル酸の誘導体でない他の酸とのアミド型の結合（ｌｉ
ｎｋ）によるリンケージによって得られた前記化合物の
誘導体により置換され、そして、ＤＮＡドナー株により
生産されたグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼにより加
水分解に服される。
【０００７】このために、前述の証明をドナー株由来の
酵素的抽出物を用いて行なう必要があり、これらのアミ
ド型誘導体（これらに対し、グルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼは親和性を示す）が、グルタリル酸及び宿主の
栄養要求を補完し、その生育をさせるのに必須な化合物
を解放しながら、前記酵素によって加水分解されて、グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産することができ
る細胞が、前記した人工培地中で生き残ることができ
る。
酵素的抽出物を用いて行なう必要があり、これらのアミ
ド型誘導体（これらに対し、グルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼは親和性を示す）が、グルタリル酸及び宿主の
栄養要求を補完し、その生育をさせるのに必須な化合物
を解放しながら、前記酵素によって加水分解されて、グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産することができ
る細胞が、前記した人工培地中で生き残ることができ
る。
【０００８】ここで、この人工培地では他の２つの細胞
のタイブも又生存できるということを指摘することは重
要である。即ち、宿主細胞の栄養要求に反応性のある遺
伝子におけるバック−ミューテーション（ｂａｃｋ−ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ）を有する細胞、及び宿主細胞で栄養要
求に反応する酵素をコードする遺伝情報を、リコンヒナ
ントベクター中で獲得した細胞である。第１の型のコン
タミナント細胞を避けるため、栄養要求をコントロール
する変異での非常に低いリバージョン率（ｒｅｖｅｒｓ
ｉｏｎ ｒａｔｅ）を示す宿主細胞を用いた。例えば、
栄養要求に反応する遺伝子の全部又は一部を欠損した細
胞の如くである。
のタイブも又生存できるということを指摘することは重
要である。即ち、宿主細胞の栄養要求に反応性のある遺
伝子におけるバック−ミューテーション（ｂａｃｋ−ｍ
ｕｔａｔｉｏｎ）を有する細胞、及び宿主細胞で栄養要
求に反応する酵素をコードする遺伝情報を、リコンヒナ
ントベクター中で獲得した細胞である。第１の型のコン
タミナント細胞を避けるため、栄養要求をコントロール
する変異での非常に低いリバージョン率（ｒｅｖｅｒｓ
ｉｏｎ ｒａｔｅ）を示す宿主細胞を用いた。例えば、
栄養要求に反応する遺伝子の全部又は一部を欠損した細
胞の如くである。
【０００９】第２の型のコンタミナント細胞を避けるた
めに、２つの栄養要求を示す宿主細胞を用いること、及
ひ株が栄養要求する化合物を対応するグルタリル誘導体
で置換することが可能であり、この場合、２つの栄養要
求に反応性のある２つの酵素をコードする遺伝情報を同
時に含む形質転換体を見出す可能性は、極めて低い。
めに、２つの栄養要求を示す宿主細胞を用いること、及
ひ株が栄養要求する化合物を対応するグルタリル誘導体
で置換することが可能であり、この場合、２つの栄養要
求に反応性のある２つの酵素をコードする遺伝情報を同
時に含む形質転換体を見出す可能性は、極めて低い。
【００１０】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産
する細胞と一緒に培地に現れる前記の両細胞のタイプ
は、これらの最後のものから容易に分画することができ
る。というのは、数時間後、グルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼ生産性コロニーの回りに、共生バクテリアの生
育ハロー（ｈａｌｏ）が検出できるからである（グルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼの作用により解放された化
合物を利用している）
する細胞と一緒に培地に現れる前記の両細胞のタイプ
は、これらの最後のものから容易に分画することができ
る。というのは、数時間後、グルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼ生産性コロニーの回りに、共生バクテリアの生
育ハロー（ｈａｌｏ）が検出できるからである（グルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼの作用により解放された化
合物を利用している）
【００１１】更に、非−生産性グルタリル−７ＡＣＡ−
アシラーゼバクテリア（バック−ミューテーションを有
するか又は栄養要求を補完する化合物をコードする遺伝
情報により形質転換されている）を、グルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼ−生産性バクテリアから簡単なプレー
ト複製（ｐｌａｔｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）実験に
より区別することができる。これは、非−生産性バクテ
リアは、栄養要求を示す両方の化合物及び対応するグル
タリル誘導体が存在しない最小培地で生育できるのに対
して、生産性グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼバクテ
リアは生育するためにこれら両方の化合物を要求するた
めである。
アシラーゼバクテリア（バック−ミューテーションを有
するか又は栄養要求を補完する化合物をコードする遺伝
情報により形質転換されている）を、グルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼ−生産性バクテリアから簡単なプレー
ト複製（ｐｌａｔｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）実験に
より区別することができる。これは、非−生産性バクテ
リアは、栄養要求を示す両方の化合物及び対応するグル
タリル誘導体が存在しない最小培地で生育できるのに対
して、生産性グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼバクテ
リアは生育するためにこれら両方の化合物を要求するた
めである。
【００１２】従って、本発明によって、７β−（４−カ
ルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシラーゼを
高収率で生産するＥ．ｃｏｌｉ株の製造法を提供し、こ
の方法は次の工程を含む。 イ） ７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロ
スポリンアシラーゼをコードする配列を含む微生物の株
の全ＤＮＡを消化（ｄｉｇｅｓｔ）し、このＤＮＡフラ
グメントをＤＮＡベクター中に置いて（プレースして）
プラスミディックライブラリー（ｐｌａｓｍｉｄｉｃ
ｌｉｂｒａｒｙ）を形成し、 ロ） グルタリル酸又は関連する酸でアミドリンクを形
成できる化合物に栄養要求のあるＥ．ｃｏｌｉ宿主を、
該プラスミディックライブラリーに含められたＤＮＡ配
列で形質転換し、 ハ） 非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株が栄養要求する化合物
のグルタル酸アミド、又は関連する酸のアミドを含む培
地での生育により７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）セファロスポリンアシラーゼをコードする配列を含
む、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ宿主を選択し ニ） 選択された宿主から、７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）セファロスポリンアシラーゼをコードする
配列を含むベクターを単離し、このベクターＤＮＡを消
化し、得られたＤＮＡ配列の各々をＥ．ｃｏｌｉベクタ
ー中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター配列の
支配下におき、 ホ） グルタル酸又は関連する酸とアミドリンクを形成
することができる化合物に栄養要求のあるＥ．ｃｏｌｉ
宿主を、工程（ニ）で形成されたベクターのそれぞれに
より形質転換し、それから工程（ハ）と同じ培地での生
育により、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターの支配下、７β−
（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシ
ラーゼをコードする配列を含む形質転換宿主を選択し、 ヘ） 選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主からベクターを単離
し、それらを使用して、実質的にβ−ラクタマーゼ活性
を欠くように選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換す
る。
ルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシラーゼを
高収率で生産するＥ．ｃｏｌｉ株の製造法を提供し、こ
の方法は次の工程を含む。 イ） ７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロ
スポリンアシラーゼをコードする配列を含む微生物の株
の全ＤＮＡを消化（ｄｉｇｅｓｔ）し、このＤＮＡフラ
グメントをＤＮＡベクター中に置いて（プレースして）
プラスミディックライブラリー（ｐｌａｓｍｉｄｉｃ
ｌｉｂｒａｒｙ）を形成し、 ロ） グルタリル酸又は関連する酸でアミドリンクを形
成できる化合物に栄養要求のあるＥ．ｃｏｌｉ宿主を、
該プラスミディックライブラリーに含められたＤＮＡ配
列で形質転換し、 ハ） 非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株が栄養要求する化合物
のグルタル酸アミド、又は関連する酸のアミドを含む培
地での生育により７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）セファロスポリンアシラーゼをコードする配列を含
む、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ宿主を選択し ニ） 選択された宿主から、７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）セファロスポリンアシラーゼをコードする
配列を含むベクターを単離し、このベクターＤＮＡを消
化し、得られたＤＮＡ配列の各々をＥ．ｃｏｌｉベクタ
ー中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター配列の
支配下におき、 ホ） グルタル酸又は関連する酸とアミドリンクを形成
することができる化合物に栄養要求のあるＥ．ｃｏｌｉ
宿主を、工程（ニ）で形成されたベクターのそれぞれに
より形質転換し、それから工程（ハ）と同じ培地での生
育により、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターの支配下、７β−
（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシ
ラーゼをコードする配列を含む形質転換宿主を選択し、 ヘ） 選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主からベクターを単離
し、それらを使用して、実質的にβ−ラクタマーゼ活性
を欠くように選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換す
る。
【００１３】従って、本発明によれば、グルタリル−７
ＡＣＡ−アシラーゼ生産に関する生産株の遺伝情報を抽
出すること、及びリコンビナントベクターをスクリーニ
ングするシステムとして、人工培地中の宿主細胞の栄養
要求を補完することに基づく方法を用いて、該遺伝情報
を単離することを可能とする方法が提供される。
ＡＣＡ−アシラーゼ生産に関する生産株の遺伝情報を抽
出すること、及びリコンビナントベクターをスクリーニ
ングするシステムとして、人工培地中の宿主細胞の栄養
要求を補完することに基づく方法を用いて、該遺伝情報
を単離することを可能とする方法が提供される。
【００１４】本発明のこの側面での主たる新規とする点
は、迅速に且つ非常に感度良く、クローニングベクター
の使用により得られたリコンビナントベクターのライブ
ラリーの中でグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生産性
クローンを、使用するシステムで全く制限なしに単離で
きる新規で非常に簡単なスクリーニングシステムを採用
することにある。これは、β−ラクタマーゼのような、
ベクター中に存在する選択マーカーに依存しないためで
ある。
は、迅速に且つ非常に感度良く、クローニングベクター
の使用により得られたリコンビナントベクターのライブ
ラリーの中でグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生産性
クローンを、使用するシステムで全く制限なしに単離で
きる新規で非常に簡単なスクリーニングシステムを採用
することにある。これは、β−ラクタマーゼのような、
ベクター中に存在する選択マーカーに依存しないためで
ある。
【００１５】本発明の新規方法は、たった一つの培養ペ
トリプレートで完全なライブラリーの分析を可能とし、
個々に利用しうるトランスホーマントを必要としない。
これは、短時間内で、ＤＮＡ消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏ
ｎ）の種々のベクター及び種々のシステムを使用して得
られた多数の異なるライブラリーを分析する可能性を意
味する。本方法の高い感度は、栄養要求の化合物のバク
テリアにより一般的に要求される量が極めて小さいとい
う事実（特にｐ−アミノ安息香酸のようなビタミンの場
合にそうである）からも分かる。
トリプレートで完全なライブラリーの分析を可能とし、
個々に利用しうるトランスホーマントを必要としない。
これは、短時間内で、ＤＮＡ消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏ
ｎ）の種々のベクター及び種々のシステムを使用して得
られた多数の異なるライブラリーを分析する可能性を意
味する。本方法の高い感度は、栄養要求の化合物のバク
テリアにより一般的に要求される量が極めて小さいとい
う事実（特にｐ−アミノ安息香酸のようなビタミンの場
合にそうである）からも分かる。
【００１６】この場合、たとえクローンしたグルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼの活性が非常に小さくても、バ
クテリアは生育できる。特に、培養プレートを数日間イ
ンキュベートすることができ、グルタリル誘導体を加水
分解するのに必要な酵素の量を生産する時間が許される
ということを考慮すればそうである。本方法の更に利点
とするところは、グルタリルー７ＡＣＡ−アシラーゼ遺
伝子のサブクローニング作業を非常に容易にすることで
ある。これは、本方法により、活性サブクローニングが
迅速且つ容易にスクリーニングされうるためである。
−７ＡＣＡ−アシラーゼの活性が非常に小さくても、バ
クテリアは生育できる。特に、培養プレートを数日間イ
ンキュベートすることができ、グルタリル誘導体を加水
分解するのに必要な酵素の量を生産する時間が許される
ということを考慮すればそうである。本方法の更に利点
とするところは、グルタリルー７ＡＣＡ−アシラーゼ遺
伝子のサブクローニング作業を非常に容易にすることで
ある。これは、本方法により、活性サブクローニングが
迅速且つ容易にスクリーニングされうるためである。
【００１７】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
の単離用の宿主として本発明で選択した微生物は、Ｅｓ
ｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＨＢ１０１株であり、
これは、チアミン、Ｌ−プロリン及びＬ−ロイシンに対
して栄養要求を示す。形質転換でき、アミノ酸又はグル
タル酸若しくはグルタル酸に関連した他の酸とアミドリ
ンクを形成できる他の化合物に対して栄養要求性であ
り、そして、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼにより
加水分解される他のどのような株も宿主細胞として採用
しうる。
の単離用の宿主として本発明で選択した微生物は、Ｅｓ
ｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＨＢ１０１株であり、
これは、チアミン、Ｌ−プロリン及びＬ−ロイシンに対
して栄養要求を示す。形質転換でき、アミノ酸又はグル
タル酸若しくはグルタル酸に関連した他の酸とアミドリ
ンクを形成できる他の化合物に対して栄養要求性であ
り、そして、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼにより
加水分解される他のどのような株も宿主細胞として採用
しうる。
【００１８】従って、前駆体としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉのＨＢ１０１株の栄養要求を補完するた
めに使用する化合物は、グルタリル−Ｌ−ロイシンであ
った。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを単離するの
に有用であると示された他の化合物の例としては、スク
シニル−Ｌ−プロリンを挙げることができる。
ｉａ ｃｏｌｉのＨＢ１０１株の栄養要求を補完するた
めに使用する化合物は、グルタリル−Ｌ−ロイシンであ
った。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを単離するの
に有用であると示された他の化合物の例としては、スク
シニル−Ｌ−プロリンを挙げることができる。
【００１９】使用することのできるもうひとつの化合物
は、ｐ−アミノ安息香酸のグルタリルアミドである。た
だし、ｐ−アミノ安息香酸に栄養要求な株が使用され
る。例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＡＢ３
２９２又はＡＢ３２９５株である。既述したように、本
方法の特異性を増加させるために、２つの化合物を一度
に使用することが可能である。例えば、グルタリル−Ｌ
−ロイシン及びスクシニル−Ｌ−プロリンである。
は、ｐ−アミノ安息香酸のグルタリルアミドである。た
だし、ｐ−アミノ安息香酸に栄養要求な株が使用され
る。例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＡＢ３
２９２又はＡＢ３２９５株である。既述したように、本
方法の特異性を増加させるために、２つの化合物を一度
に使用することが可能である。例えば、グルタリル−Ｌ
−ロイシン及びスクシニル−Ｌ−プロリンである。
【００２０】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産
し、及び選ばれた宿主細胞中で発現できる化合物をコー
ドする遺伝子を有する如何なる微生物もＤＮＡ源として
使用しうる。
し、及び選ばれた宿主細胞中で発現できる化合物をコー
ドする遺伝子を有する如何なる微生物もＤＮＡ源として
使用しうる。
【００２１】ＤＮＡドナー細胞としては、例えば、グル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生産株Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３を使用することができ
る。
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生産株Ａｃｉｎｅｔｏｂ
ａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３を使用することができ
る。
【００２２】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１中のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子の
単離方法を述べるのに使用するＤＮＡベクターは、ＰＡ
ＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２５として知られ
ているプラスミドであった。抗生物質に耐性の選択マー
カーを有する他のプラスミドも又使用できる。使用する
宿主微生物に応じて、他の特別のＤＮＡベクターで前述
のものと異なるものも使用できる。
１０１中のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子の
単離方法を述べるのに使用するＤＮＡベクターは、ＰＡ
ＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２５として知られ
ているプラスミドであった。抗生物質に耐性の選択マー
カーを有する他のプラスミドも又使用できる。使用する
宿主微生物に応じて、他の特別のＤＮＡベクターで前述
のものと異なるものも使用できる。
【００２３】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ単離の
例では、第１の工程は、ＤＮＡドナーとして使用される
株のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性により、選
択生育培地でひき続き使用されるグルタリル誘導体を加
水分解できることを確認することから構成される。この
様な証明は、従来の生化学的技術によりなされる。
例では、第１の工程は、ＤＮＡドナーとして使用される
株のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性により、選
択生育培地でひき続き使用されるグルタリル誘導体を加
水分解できることを確認することから構成される。この
様な証明は、従来の生化学的技術によりなされる。
【００２４】その後、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼ遺伝子のドナーのＤＮＡを十分に又は部分的に消化す
る。ＤＮＡベクター（一般的にはプラスミド）も又切断
端でＤＮＡドナーフラグメントのものと相補的な配列を
生じさせる制限エンドヌクレアーゼによりダイジェスト
する。
ゼ遺伝子のドナーのＤＮＡを十分に又は部分的に消化す
る。ＤＮＡベクター（一般的にはプラスミド）も又切断
端でＤＮＡドナーフラグメントのものと相補的な配列を
生じさせる制限エンドヌクレアーゼによりダイジェスト
する。
【００２５】このように生じたベクターとフラグメント
をＴ４ ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼ−活性酵素を
使用してライゲートする。ドナー細胞のＤＮＡフラグメ
ントの１つ以上とベクターとのライゲーションにより得
られたリコンヒナントベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉのＨＢ１０１株のような適当な株に、従
来の形質転換技術、例えばＭａｍｉａｔｉｓ Ｔ．等
（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｕ・Ｓ・Ａに記述された技術によって導入すること
ができる。
をＴ４ ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼ−活性酵素を
使用してライゲートする。ドナー細胞のＤＮＡフラグメ
ントの１つ以上とベクターとのライゲーションにより得
られたリコンヒナントベクターは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉのＨＢ１０１株のような適当な株に、従
来の形質転換技術、例えばＭａｍｉａｔｉｓ Ｔ．等
（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ，Ｕ・Ｓ・Ａに記述された技術によって導入すること
ができる。
【００２６】望ましい形質転換体を、ＤＮＡベクターの
抵抗性を持ち、且つＤＮＡドナーのフラグメントを持ち
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性を発現するクロ
ーンのみが生育し得る培地内で選択する。以前に述べた
けれども宿主細胞が栄養要求性の遺伝子の活性を回復し
たであろう他のコンタミナント株が、この選択培地中に
出現するであろう。
抵抗性を持ち、且つＤＮＡドナーのフラグメントを持ち
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性を発現するクロ
ーンのみが生育し得る培地内で選択する。以前に述べた
けれども宿主細胞が栄養要求性の遺伝子の活性を回復し
たであろう他のコンタミナント株が、この選択培地中に
出現するであろう。
【００２７】この場合、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラ
ーゼ生産株は区別できる。これは、その回りに、生育中
のサテライト共生バクテリアのハローが前述した如く形
成されるためである。形質転換体を単離したら、グルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼの発現を確認する。何故な
ら、その細胞は、細胞が栄養要求する化合物又は、培地
中で選択化合物として用いられた対応するグルタリル誘
導体を含む培地中で生育することができるためである。
ーゼ生産株は区別できる。これは、その回りに、生育中
のサテライト共生バクテリアのハローが前述した如く形
成されるためである。形質転換体を単離したら、グルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼの発現を確認する。何故な
ら、その細胞は、細胞が栄養要求する化合物又は、培地
中で選択化合物として用いられた対応するグルタリル誘
導体を含む培地中で生育することができるためである。
【００２８】前述したように単離したグルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼ生産株をそれからいくつかの微生物学
的及び生化学的検査にかけ、リコンビナントＤＮＡベク
ターの物理的マップを決定し、そして得られた酵素を分
析する。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子に関
する遺伝情報がそのリコンビナントベクターに含まれて
いることを明らかにするために、種々の技術例えば、イ
ンビトロ遺伝子発現システム、マキシセルを適用するこ
とが可能である。もっとも、単離で使用した宿主細胞と
異なるもう一つの宿主細胞中で、リコンビナントベクタ
ーの簡単な再クローニングを行ない、ひき続いて得られ
た新しいリコンビナント株がグルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼを生産していることを証明することはより容易
である。
ＣＡ−アシラーゼ生産株をそれからいくつかの微生物学
的及び生化学的検査にかけ、リコンビナントＤＮＡベク
ターの物理的マップを決定し、そして得られた酵素を分
析する。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子に関
する遺伝情報がそのリコンビナントベクターに含まれて
いることを明らかにするために、種々の技術例えば、イ
ンビトロ遺伝子発現システム、マキシセルを適用するこ
とが可能である。もっとも、単離で使用した宿主細胞と
異なるもう一つの宿主細胞中で、リコンビナントベクタ
ーの簡単な再クローニングを行ない、ひき続いて得られ
た新しいリコンビナント株がグルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼを生産していることを証明することはより容易
である。
【００２９】リコンビナントベクターの物理的マップの
決定は、従来の遺伝子工学技術により、種々の制限エン
ドヌクレアーゼを用いて描くことができる。グルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼの定量化は従来のスペクトロホ
トメトリック技術又は、ＨＰＬＣ装置を用いて行なうこ
とができる。
決定は、従来の遺伝子工学技術により、種々の制限エン
ドヌクレアーゼを用いて描くことができる。グルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼの定量化は従来のスペクトロホ
トメトリック技術又は、ＨＰＬＣ装置を用いて行なうこ
とができる。
【００３０】リコンビナントベクターを含むグルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼの物理的マップが描けたら、以
下の工程を実施して、本発明の第２の側面に進む。即
ち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの一株でのグル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼのハイパープロダクショ
ンである。この目的のため、グルタリル−７ＡＣＡ−生
産性トランスフォーマントを、前述した方法によって選
択した。従って、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの
ロケーションをより正確に決定することができた。
−７ＡＣＡ−アシラーゼの物理的マップが描けたら、以
下の工程を実施して、本発明の第２の側面に進む。即
ち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの一株でのグル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼのハイパープロダクショ
ンである。この目的のため、グルタリル−７ＡＣＡ−生
産性トランスフォーマントを、前述した方法によって選
択した。従って、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの
ロケーションをより正確に決定することができた。
【００３１】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
の転写レベルを増加させるために、つまりこの微生物で
のこの酵素の生産を増加させるために、グルタリル−７
ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒ
ｃ、ｔｒｐプロモーター、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉでの遺伝子の発現に従来から使用されている
他のプロモーターのようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉプロモーター配列の支配下に置くことができる。
の転写レベルを増加させるために、つまりこの微生物で
のこの酵素の生産を増加させるために、グルタリル−７
ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒ
ｃ、ｔｒｐプロモーター、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉでの遺伝子の発現に従来から使用されている
他のプロモーターのようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉプロモーター配列の支配下に置くことができる。
【００３２】このプロセスを実施するために、Ａｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ５３８９１染色体ＤＮＡ
から単離したグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
を含むリコンビナントベクターを選択し、これを異なる
制限エンドヌクレアーゼで消化した。得られたフラグメ
ントをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、例えばｐＢＲ３
２５、ｐＵＣ１８、ｐＡＣＹＣ１８４のようなプラスミ
ディックベクター又はライゲートするフラグメントとコ
ンパチブルな制限部位を示す制限エンドヌクレアーゼに
より以前消化した他のプラスミディックベクターとライ
ゲートした。
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ５３８９１染色体ＤＮＡ
から単離したグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
を含むリコンビナントベクターを選択し、これを異なる
制限エンドヌクレアーゼで消化した。得られたフラグメ
ントをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて、例えばｐＢＲ３
２５、ｐＵＣ１８、ｐＡＣＹＣ１８４のようなプラスミ
ディックベクター又はライゲートするフラグメントとコ
ンパチブルな制限部位を示す制限エンドヌクレアーゼに
より以前消化した他のプラスミディックベクターとライ
ゲートした。
【００３３】こうして得たリコンビナントベクターを形
質転換によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１
０１のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株中に
導入し、そしてグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生
産するトランスフォーマントを既に説明したようにスク
リーニングした。リコンビナントベクターを得たら、制
限酵素により、その物理マップを描き、どのＤＮＡフラ
グメントがグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を
含んでいるか決定した。
質転換によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＨＢ１
０１のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株中に
導入し、そしてグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生
産するトランスフォーマントを既に説明したようにスク
リーニングした。リコンビナントベクターを得たら、制
限酵素により、その物理マップを描き、どのＤＮＡフラ
グメントがグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を
含んでいるか決定した。
【００３４】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
を含むＤＮＡフラグメントを、例えばプロモーター配列
ｔａｃを含むプラスミドｐＤＲ５４０のようなＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの配列プロモーターを含む他
のプラスミディックベクターのように挿入した（ｄｅ
Ｂｏｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａ１．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）。グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子をプロモーター
ｔａｃの支配下にあるように位置させた。かく得られた
新リコビナントベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株
に形質転換し、そしてグルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼ生産性トランスフォーマントを前述した方法によりス
クリーニングした。
を含むＤＮＡフラグメントを、例えばプロモーター配列
ｔａｃを含むプラスミドｐＤＲ５４０のようなＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの配列プロモーターを含む他
のプラスミディックベクターのように挿入した（ｄｅ
Ｂｏｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａ１．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）。グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子をプロモーター
ｔａｃの支配下にあるように位置させた。かく得られた
新リコビナントベクターをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ ＨＢ１０１のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ株
に形質転換し、そしてグルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼ生産性トランスフォーマントを前述した方法によりス
クリーニングした。
【００３５】これらの形質転換体でのグルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼの生産は、種々の形質転換体培養から
得られた抽出物中に存在する酵素活性を評価することに
より分析した。これらの評価はスペクトロホトメトリッ
ク技術及びＨＰＬＣクロマトグラフィーの両方で行なっ
た。このように、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生
産株が得られ、その生産レベルは、前に特定した初期の
単離中に得られたリコンビナントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ株からのものより有意に高かった。
ＣＡ−アシラーゼの生産は、種々の形質転換体培養から
得られた抽出物中に存在する酵素活性を評価することに
より分析した。これらの評価はスペクトロホトメトリッ
ク技術及びＨＰＬＣクロマトグラフィーの両方で行なっ
た。このように、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生
産株が得られ、その生産レベルは、前に特定した初期の
単離中に得られたリコンビナントＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ株からのものより有意に高かった。
【００３６】本プロセスの第２の段階により達成できた
高生産収率は、遺伝子に高い発現をもたらすＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに特異的なプロモーター配列を
使用したことによるものである。このグルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．由来で、そのオリジナルなプロモーター配列は、Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．中では効率よく働く
が、必ずしもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中では
そうではないため、Ｅ．ｃｏｌｉ中の初期のリコンビナ
ントクローンは低い収率レベルを示す。というのは、そ
れらはグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子をオリ
ジナルのプロモーターを通じて発現するからである。従
って、プロモーターの変更は、本発明の方法において重
大な改善を意味している。
高生産収率は、遺伝子に高い発現をもたらすＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに特異的なプロモーター配列を
使用したことによるものである。このグルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．由来で、そのオリジナルなプロモーター配列は、Ａ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．中では効率よく働く
が、必ずしもＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中では
そうではないため、Ｅ．ｃｏｌｉ中の初期のリコンビナ
ントクローンは低い収率レベルを示す。というのは、そ
れらはグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子をオリ
ジナルのプロモーターを通じて発現するからである。従
って、プロモーターの変更は、本発明の方法において重
大な改善を意味している。
【００３７】本発明中の方法の第３の側面は、酵素生産
レベル及び得られた酵素的抽出物の質を産業上の用途の
ため改良する目的をもって、種々のサポート上にそれら
を固定化することにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉのいくつかの株中の前記したグルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼ遺伝子を含むリコンビナントベクターを
導入することにある。
レベル及び得られた酵素的抽出物の質を産業上の用途の
ため改良する目的をもって、種々のサポート上にそれら
を固定化することにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉのいくつかの株中の前記したグルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼ遺伝子を含むリコンビナントベクターを
導入することにある。
【００３８】上記コメントしたように、遺伝子工学技術
を実施するのに通常使用される多くの株は、７−アミノ
セファロスポラン酸の生産を意図した酵素的抽出物を得
るのには適当ではない。というのは、それらの株は７−
アミノーセファロスポラン酸を分解し、それ故最終収率
を低下させる、ある量のβ−ラクタマーゼとアセチラー
ゼを生産するためである。
を実施するのに通常使用される多くの株は、７−アミノ
セファロスポラン酸の生産を意図した酵素的抽出物を得
るのには適当ではない。というのは、それらの株は７−
アミノーセファロスポラン酸を分解し、それ故最終収率
を低下させる、ある量のβ−ラクタマーゼとアセチラー
ゼを生産するためである。
【００３９】Ｅ．ｃｏｌｉ中でグルタリル−７ＡＣＡ−
アシラーゼをコードする遺伝子の発現のために、このよ
うな株及び使用されたプラスミドが、グルタリル−７Ａ
ＣＡと７−ＡＣＡの両方を分解するβ−ラクタマーゼ活
性を欠くことが必須である。Ｅ．ｃｏｌｉ中で外来蛋白
の発現に使用される多くのプラスミドは、アンピシリン
に耐性のある選択マーカー遺伝子（これはβ−ラクタマ
ーゼ活性をコードする）を有する。
アシラーゼをコードする遺伝子の発現のために、このよ
うな株及び使用されたプラスミドが、グルタリル−７Ａ
ＣＡと７−ＡＣＡの両方を分解するβ−ラクタマーゼ活
性を欠くことが必須である。Ｅ．ｃｏｌｉ中で外来蛋白
の発現に使用される多くのプラスミドは、アンピシリン
に耐性のある選択マーカー遺伝子（これはβ−ラクタマ
ーゼ活性をコードする）を有する。
【００４０】この目的のため、β−ラクタム系抗生物質
の生合成に関する遺伝子の発現を意図する全ての作業を
アンピシリン耐性遺伝子を欠いたベクターを用いて実施
した。しかしながら、高いアンピシリンレベルに耐性で
ない一方、大量のＥ．ｃｏｌｉ株は、β−ラクタマーゼ
活性の基礎的レベルを有している。
の生合成に関する遺伝子の発現を意図する全ての作業を
アンピシリン耐性遺伝子を欠いたベクターを用いて実施
した。しかしながら、高いアンピシリンレベルに耐性で
ない一方、大量のＥ．ｃｏｌｉ株は、β−ラクタマーゼ
活性の基礎的レベルを有している。
【００４１】β−ラクタマーゼ活性を所有するグルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子（日本特許出願１１０
２９２／１９８５）をホストする微生物として使用され
るＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２−Ｃ−６００の場合のように、
基質の一部を明らかに破壊する。本発明においては、グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼのホストとして使用す
るために、β−ラクタマーゼを生産しないＥ．ｃｏｌｉ
の株を発見することが必須である。このように、グルタ
リル−７ＡＣＡは、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
の活性によってのみ影響される。
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子（日本特許出願１１０
２９２／１９８５）をホストする微生物として使用され
るＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２−Ｃ−６００の場合のように、
基質の一部を明らかに破壊する。本発明においては、グ
ルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼのホストとして使用す
るために、β−ラクタマーゼを生産しないＥ．ｃｏｌｉ
の株を発見することが必須である。このように、グルタ
リル−７ＡＣＡは、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
の活性によってのみ影響される。
【００４２】しかしながら、本発明者らは又、β−ラク
タマーゼを生産しないが、β−ラクタムにハイパーセン
シティブ（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）な株も又、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの発現に適当であ
り、従って、このような酵素を生産する改善に適当なこ
とを見出した。
タマーゼを生産しないが、β−ラクタムにハイパーセン
シティブ（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）な株も又、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの発現に適当であ
り、従って、このような酵素を生産する改善に適当なこ
とを見出した。
【００４３】非β−ラクタマーゼ生産Ｅ．ｃｏｌｉ株を
スクリーニングするために、クロモジェニックセファロ
スポリン「ニトロセフィン（Ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎ）」
（Ｏｘｏｉｄ）を採用した、酵素活性を測定するカロリ
メトリック法を使用した。得られた結果を表１に示す。
スクリーニングするために、クロモジェニックセファロ
スポリン「ニトロセフィン（Ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎ）」
（Ｏｘｏｉｄ）を採用した、酵素活性を測定するカロリ
メトリック法を使用した。得られた結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
【００４５】β−ラクタマーゼ活性の弱いＥ．ｃｏｌｉ
株を選択したら、セファロスポリン及び７−ＡＣＡから
の分解生成物の出現をもたらすエステラーゼ、アセチラ
ーゼのような好ましくない酵素活性を欠くコロニーを単
離した。
株を選択したら、セファロスポリン及び７−ＡＣＡから
の分解生成物の出現をもたらすエステラーゼ、アセチラ
ーゼのような好ましくない酵素活性を欠くコロニーを単
離した。
【００４６】このために、前述の選択株の粗抽出物中の
ナトリウムセファロスポリンＣを基質として使用するこ
とにより、酵素活性を評価した。これらの株を選択した
後、既に得られているグルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼを含むリコンビナントベクターを形質転換によりその
様に挿入した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの生
産レベルは、別の形質転換体で決定し、最も良い生産菌
を選択した。結果は、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼの生産、非検出レベルのβ−ラクタマーゼ、及び低下
したレベルの７−アミノセファロスポリン−アセチラー
ゼであった。
ナトリウムセファロスポリンＣを基質として使用するこ
とにより、酵素活性を評価した。これらの株を選択した
後、既に得られているグルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼを含むリコンビナントベクターを形質転換によりその
様に挿入した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼの生
産レベルは、別の形質転換体で決定し、最も良い生産菌
を選択した。結果は、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼの生産、非検出レベルのβ−ラクタマーゼ、及び低下
したレベルの７−アミノセファロスポリン−アセチラー
ゼであった。
【００４７】本発明の第３の段階の新規性は、得られた
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉリコンビナント株
が、親のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ
５３８９１よりも多くのグルタリル−７ＡＣＡ−アシラ
ーゼを生産するだけでなく、更に、７−アミノセファロ
スポラン酸最終生成物を分解する酵素の生産が非常に低
レベルであるという事実にある。これらリコンビナント
微生物から得られた酵素抽出物の使用することによっ
て、プロセスのコストを極端に高くするグルタリルー７
ＡＣＡ−アシラーゼの長期かつ高価な精製プロセスにむ
かうことなく、７β−（４−カルボキシブタンアミド）
セファロスポラン酸を７−アミフセファロスポラン酸へ
非常に高収率で転換することができる。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉリコンビナント株
が、親のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ
５３８９１よりも多くのグルタリル−７ＡＣＡ−アシラ
ーゼを生産するだけでなく、更に、７−アミノセファロ
スポラン酸最終生成物を分解する酵素の生産が非常に低
レベルであるという事実にある。これらリコンビナント
微生物から得られた酵素抽出物の使用することによっ
て、プロセスのコストを極端に高くするグルタリルー７
ＡＣＡ−アシラーゼの長期かつ高価な精製プロセスにむ
かうことなく、７β−（４−カルボキシブタンアミド）
セファロスポラン酸を７−アミフセファロスポラン酸へ
非常に高収率で転換することができる。
【００４８】既に選択されたＥ．ｃｏｌｉ株中に、グル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性をコードする遺伝子
を持つプラスミドを挿入するために、第１の工程は、コ
ンピテントな細胞を得ることである。コンピテントな細
胞とは、一般的な化学的処置によって、その膜の等価性
の変化を示し、外来ＤＮＡの分子を受け入れることがで
きるものを意味する。前記プラスミドをこのコンピテン
ト細胞に形質転換により挿入した。
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性をコードする遺伝子
を持つプラスミドを挿入するために、第１の工程は、コ
ンピテントな細胞を得ることである。コンピテントな細
胞とは、一般的な化学的処置によって、その膜の等価性
の変化を示し、外来ＤＮＡの分子を受け入れることがで
きるものを意味する。前記プラスミドをこのコンピテン
ト細胞に形質転換により挿入した。
【００４９】形質転換とは、外来ＤＮＡをホストのコン
ピテントな細胞に導入することを意味する。
ピテントな細胞に導入することを意味する。
【００５０】導入されたプラスミドは、Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ ｓｐ．のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラ
ーゼ遺伝子に加えて、クロラムフェニコールに耐性の遺
伝子、選択マーカーを有している。
ｂａｃｔｅｒ ｓｐ．のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラ
ーゼ遺伝子に加えて、クロラムフェニコールに耐性の遺
伝子、選択マーカーを有している。
【００５１】形質転換により得られたクロラムフェニコ
ールに耐性のＥ．ｃｏｌｉ株が、目的とするプラスミド
を持っていることを証明するために、一連の単離された
コロニーから、プラスミデイックＤＮＡのミニプレパレ
ーションを作成した。後に、プラスミドを従来技術によ
り分析した。
ールに耐性のＥ．ｃｏｌｉ株が、目的とするプラスミド
を持っていることを証明するために、一連の単離された
コロニーから、プラスミデイックＤＮＡのミニプレパレ
ーションを作成した。後に、プラスミドを従来技術によ
り分析した。
【００５２】既に選択したＥ．ｃｏｌｉを使用してグル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産するため、この
Ｅ．ｃｏｌｉを炭素源（例えば、グルコース、スクロー
ス、ラクトース、グリセロール、ベジタブルオイル、
等）、窒素源（例えば、酵母エキス、肉エキス、ソイミ
ール、ピーナッツミール、コーンステープリカー、等）
及びミネラル塩を含む培地で生育させる。この生産の温
度範囲は、１８−３８℃でｐＨ５−９である。フラスコ
醗酵として、５０、１００、２５０、５００ｍｌ及び１
リットルを、フラスコ容量の１０〜５０％の培地量を含
んで使用できる。発酵は１２−９０時間続く。
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産するため、この
Ｅ．ｃｏｌｉを炭素源（例えば、グルコース、スクロー
ス、ラクトース、グリセロール、ベジタブルオイル、
等）、窒素源（例えば、酵母エキス、肉エキス、ソイミ
ール、ピーナッツミール、コーンステープリカー、等）
及びミネラル塩を含む培地で生育させる。この生産の温
度範囲は、１８−３８℃でｐＨ５−９である。フラスコ
醗酵として、５０、１００、２５０、５００ｍｌ及び１
リットルを、フラスコ容量の１０〜５０％の培地量を含
んで使用できる。発酵は１２−９０時間続く。
【００５３】リコンビナント微生物の生育は、リコンビ
ナントベクターの安定性を保持する適当な条件を与える
ことで、改良することができる。例えば、グルタリル−
７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を含むリコンビナントベク
ターが耐性マーカーを示す、例えば、クロラムフェニコ
ール又はテトラサイクリンのような抗生物質の培地に添
加することによってである。これは、生産の安定化の他
に、他の好ましくない微生物の培地中へのコンタミネー
ションを避け、及びリコンビナントベクターを失って、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産することがで
きない細胞も又排除する。
ナントベクターの安定性を保持する適当な条件を与える
ことで、改良することができる。例えば、グルタリル−
７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を含むリコンビナントベク
ターが耐性マーカーを示す、例えば、クロラムフェニコ
ール又はテトラサイクリンのような抗生物質の培地に添
加することによってである。これは、生産の安定化の他
に、他の好ましくない微生物の培地中へのコンタミネー
ションを避け、及びリコンビナントベクターを失って、
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産することがで
きない細胞も又排除する。
【００５４】リコンビナント微生物中で生産されたグル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼは、従来の方法により細
胞を分離し固定化するために、培地を遠心分離して回収
することができる。固定化されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、
酵素の活性ｐＨ及び温度（ｐＨ６．５、８．５；２０−
４０℃）でグルタリル−７ＡＣＡをＡ７−ＡＣＡに転換
するのに使用しうる。得られた７−ＡＣＡも又従来方法
により分離する。
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼは、従来の方法により細
胞を分離し固定化するために、培地を遠心分離して回収
することができる。固定化されたＥ．ｃｏｌｉ細胞は、
酵素の活性ｐＨ及び温度（ｐＨ６．５、８．５；２０−
４０℃）でグルタリル−７ＡＣＡをＡ７−ＡＣＡに転換
するのに使用しうる。得られた７−ＡＣＡも又従来方法
により分離する。
【００５５】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼは又、
酵素抽出物からも精製することができる。そのために、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を遠心分離した後、それらを従来方法
（圧力、超音波処理、浸透ショック等）により破壊し、
得られた抽出物を従来の沈殿、クロマトグラフィー及び
膜技術によって精製する。
酵素抽出物からも精製することができる。そのために、
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を遠心分離した後、それらを従来方法
（圧力、超音波処理、浸透ショック等）により破壊し、
得られた抽出物を従来の沈殿、クロマトグラフィー及び
膜技術によって精製する。
【００５６】濃縮した酵素抽出物を、それから適当な不
活性サポート（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｒ、商標）
で反応させて固定化し、即ち、固定化された酵素は、循
環的に、グルタリル−７ＡＣＡ溶液の転換と、７−ＡＣ
Ａの単離に、公知の技術によって使用される。本発明を
以下の実施例により詳細に述べる。
活性サポート（例えば、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｒ、商標）
で反応させて固定化し、即ち、固定化された酵素は、循
環的に、グルタリル−７ＡＣＡ溶液の転換と、７−ＡＣ
Ａの単離に、公知の技術によって使用される。本発明を
以下の実施例により詳細に述べる。
【００５７】
【実施例】例１ １． Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ＡＴＣＣ ５３８
９１により生産されたグルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼのグリタリル−Ｌ−ロイシンを分解する能力のアッセ
イ
９１により生産されたグルタリル−７ＡＣＡ−アシラー
ゼのグリタリル−Ｌ−ロイシンを分解する能力のアッセ
イ
【００５８】Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ａ
ＴＣＣ５３８９１株から生じた精製グルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼで、３Ｕ／リットルの活性を示すもの
の、ひとつの０．１ｍｌアリコート（１Ｕは３７℃で１
分間に７−アミノ−セファロスポラン酸の１μｍｏｌを
解放するのに必要な酵素の量に等価）を０．１ｍｌアリ
コートのグルタリル−Ｌ−ロイシンの１０ｍｇ／ｍｌ溶
液とともに、１００ｍＭホスフェートバッファーの存在
下、ｐＨ８．０で１０時間３７℃でインキュベートし
た。
ＴＣＣ５３８９１株から生じた精製グルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼで、３Ｕ／リットルの活性を示すもの
の、ひとつの０．１ｍｌアリコート（１Ｕは３７℃で１
分間に７−アミノ−セファロスポラン酸の１μｍｏｌを
解放するのに必要な酵素の量に等価）を０．１ｍｌアリ
コートのグルタリル−Ｌ−ロイシンの１０ｍｇ／ｍｌ溶
液とともに、１００ｍＭホスフェートバッファーの存在
下、ｐＨ８．０で１０時間３７℃でインキュベートし
た。
【００５９】この混合物中のＬ−ロイシンの存在が、混
合物へのニンヒドリンの添加による反応の着色と、アミ
ノ酸アナライザーでの反応生成物の分析による両方で示
された。従って、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼが
グリルタリル−Ｌ−ロイシンを加水分解することができ
ることを示している。
合物へのニンヒドリンの添加による反応の着色と、アミ
ノ酸アナライザーでの反応生成物の分析による両方で示
された。従って、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼが
グリルタリル−Ｌ−ロイシンを加水分解することができ
ることを示している。
【００６０】２． ＤＮＡベクターの調製 いくつかの抗生物質に対する耐性マーカーを含むプラス
ミドベクターＰＡＣＹＣ１８４（Ｔｅｔｒ、Ｃａ
ｍｒ）、ｐＵＣ１８（Ａｍｐｒ）及びｐＤＲ５４０（Ａ
ｍｐｒ）を次のように調製した。即ち、前記プラスミド
を個々に所有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの
株を１０ｇ／リットル酵母エキス；５ｇ／リットルＮａ
Ｃｌを含む０．５リットルの培地中で、３７℃、１６時
間インキュベートした。
ミドベクターＰＡＣＹＣ１８４（Ｔｅｔｒ、Ｃａ
ｍｒ）、ｐＵＣ１８（Ａｍｐｒ）及びｐＤＲ５４０（Ａ
ｍｐｒ）を次のように調製した。即ち、前記プラスミド
を個々に所有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの
株を１０ｇ／リットル酵母エキス；５ｇ／リットルＮａ
Ｃｌを含む０．５リットルの培地中で、３７℃、１６時
間インキュベートした。
【００６１】インキュベーション後、細胞を安定化し、
洗滌し、溶解し、そしてプラスミドをアルカリ法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ Ｔ，等（１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）により単離した。
この方法により得られたＤＮＡをＣｓＣｌグラジエント
中で遠心分離により精製した。
洗滌し、溶解し、そしてプラスミドをアルカリ法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ Ｔ，等（１９８２） Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）により単離した。
この方法により得られたＤＮＡをＣｓＣｌグラジエント
中で遠心分離により精製した。
【００６２】３． グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
生産に関する遺伝情報を含むＤＮＡドナーの調整Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９
１の株を酸性グルタミン酸ナトリウム、５；ＫＨ２ＰＯ
４、１．５；コラーゲン加水分解物、２５；コーンステ
ープリカー、５；及びグルコース、２を含む（ｇ／リッ
トル）培地中で生育させた。インキュベーションを２５
℃で４８時間持続させた。それから、細胞を安定化さ
せ、洗滌し、ＳＤＳ１％、ＥＤＴＡ２０ｍＭ及びプロテ
ィナーゼｋ０．１ｍｇ／ｍｌで溶解した。この溶解混合
物を５５℃で３時間加熱した。
生産に関する遺伝情報を含むＤＮＡドナーの調整Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９
１の株を酸性グルタミン酸ナトリウム、５；ＫＨ２ＰＯ
４、１．５；コラーゲン加水分解物、２５；コーンステ
ープリカー、５；及びグルコース、２を含む（ｇ／リッ
トル）培地中で生育させた。インキュベーションを２５
℃で４８時間持続させた。それから、細胞を安定化さ
せ、洗滌し、ＳＤＳ１％、ＥＤＴＡ２０ｍＭ及びプロテ
ィナーゼｋ０．１ｍｇ／ｍｌで溶解した。この溶解混合
物を５５℃で３時間加熱した。
【００６３】次に、混合物をフェノールとクロロホルム
−イソアミリックアルコールで数回抽出し、ＤＮＡを含
む水性相をエタノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを
エタノール１００％及びエタノール７０％で洗滌し、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５（Ｅ
ＤＴＡ １ｍＭを含む）に溶解させた。
−イソアミリックアルコールで数回抽出し、ＤＮＡを含
む水性相をエタノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡを
エタノール１００％及びエタノール７０％で洗滌し、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５（Ｅ
ＤＴＡ １ｍＭを含む）に溶解させた。
【００６４】４． ＤＮＡベクターへのＤＮＡドナーフ
ラグメントの挿入Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９
１株から得られた１μｇのＤＮＡを含むいくつかのサン
プルを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで３７℃で消
化し、異なる時間で、サンプルを６５℃で１０分間加熱
することにより反応を停止させた。このようにして、い
くつかの部分的ＤＮＡ消化物を得、これをエチジウムブ
ロミドで染色し、その後アガロースゲル中で電気泳動に
付した。
ラグメントの挿入Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９
１株から得られた１μｇのＤＮＡを含むいくつかのサン
プルを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで３７℃で消
化し、異なる時間で、サンプルを６５℃で１０分間加熱
することにより反応を停止させた。このようにして、い
くつかの部分的ＤＮＡ消化物を得、これをエチジウムブ
ロミドで染色し、その後アガロースゲル中で電気泳動に
付した。
【００６５】ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドからの２μｇ
ＤＮＡを含むいくつかのサンプルを制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩで、３７℃；１時間消化し、そして６５
℃で１０分間加熱して反応を停止させた。
ＤＮＡを含むいくつかのサンプルを制限エンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩで、３７℃；１時間消化し、そして６５
℃で１０分間加熱して反応を停止させた。
【００６６】Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．のＤ
ＮＡ部分ＢａｍＨＩ消化物からの各サンプルを、ＡＴ
Ｐ、Ｍｇ２＋イオン及び２−メルカプトエタノールの存
在下、１６時間、１４℃でＴ４ ＤＮＡリガーゼによ
り、プラスミドｐＡＣＹ１８４ ＢａｍＨＩ消化のサン
プルとライゲートさせた。
ＮＡ部分ＢａｍＨＩ消化物からの各サンプルを、ＡＴ
Ｐ、Ｍｇ２＋イオン及び２−メルカプトエタノールの存
在下、１６時間、１４℃でＴ４ ＤＮＡリガーゼによ
り、プラスミドｐＡＣＹ１８４ ＢａｍＨＩ消化のサン
プルとライゲートさせた。
【００６７】この方法により、プラスミドｐＡＣＹＣ１
８４に挿入された、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．ＡＴＣＣ５３８９１のＤＮＡフラグメントを含む、
いくつかのリコンビナントベクターコレクションを得
た。
８４に挿入された、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓ
ｐ．ＡＴＣＣ５３８９１のＤＮＡフラグメントを含む、
いくつかのリコンビナントベクターコレクションを得
た。
【００６８】５． リコンビナントベクターによる宿主
細胞の遺伝子形質転換及びグルタリル−７ＡＣＡ−アシ
ラーゼ遺伝子の単離 形質転換用に選択した宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株であった。これらの細胞
をコンピテントとするため、ＭａｎｉａｔｉｓＴ．等
（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに
述べられたＲｂＣｌ法を用いた（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．
Ａ．）。異なるアリコートのコンピテントＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を上記第４段階
で得られたリコンビナントベクターコレクションの異な
るアリコートと混合した。
細胞の遺伝子形質転換及びグルタリル−７ＡＣＡ−アシ
ラーゼ遺伝子の単離 形質転換用に選択した宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株であった。これらの細胞
をコンピテントとするため、ＭａｎｉａｔｉｓＴ．等
（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに
述べられたＲｂＣｌ法を用いた（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．
Ａ．）。異なるアリコートのコンピテントＥｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を上記第４段階
で得られたリコンビナントベクターコレクションの異な
るアリコートと混合した。
【００６９】コンピテント細胞とリコンビナントベクタ
ーの混合物を４℃、１５分間培養し、次にこれを３７
℃；３分間加熱した。それから、ＬＢ培地の１ｍｌのア
リコートを上記アリコートに添加し、３７℃１時間イン
キュベートした。細胞を安定化させ、８．５ｇ／リット
ルＮａＣｌの溶液で洗滌した。その後これらの細胞をＭ
９食塩水培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等（１９８２）
ＭｏｌｅＣｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．
Ａ）２ｇ／リットル グルコース、１ｍｇ／リットルチ
アミン−ＨＣｌ、１００ｍｇ／リットル・Ｌ−プロリ
ン、５０ｍｇ／リットルクロラムフェニコール、５ｍｇ
／リットル グルタリル−Ｌ−ロイシン、及び１．５ｇ
／リットル寒天を含むペトリプレートに植えた。
ーの混合物を４℃、１５分間培養し、次にこれを３７
℃；３分間加熱した。それから、ＬＢ培地の１ｍｌのア
リコートを上記アリコートに添加し、３７℃１時間イン
キュベートした。細胞を安定化させ、８．５ｇ／リット
ルＮａＣｌの溶液で洗滌した。その後これらの細胞をＭ
９食塩水培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等（１９８２）
ＭｏｌｅＣｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕ．Ｓ．
Ａ）２ｇ／リットル グルコース、１ｍｇ／リットルチ
アミン−ＨＣｌ、１００ｍｇ／リットル・Ｌ−プロリ
ン、５０ｍｇ／リットルクロラムフェニコール、５ｍｇ
／リットル グルタリル−Ｌ−ロイシン、及び１．５ｇ
／リットル寒天を含むペトリプレートに植えた。
【００７０】プレートを３７℃でインキュベートし、４
−７日以内にコロニーを収集し、単離した。グルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産できるコロニーの周り
に、サテライトコロニーの生育ハローが観察された。
−７日以内にコロニーを収集し、単離した。グルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産できるコロニーの周り
に、サテライトコロニーの生育ハローが観察された。
【００７１】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生産コ
ロニは、遺伝子ｌｅｕ Ｂをリバート（ｒｅｖｅｒｔ）
するバクテリア又は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１００株のｌｅｕ Ｂ遺伝子に等価な挿入され
た遺伝子を有するバクテリアとは区別される。何故な
ら、その周りに生育ハローを形成するのに加えて、それ
らは、以前述べたような人工培地で、Ｌ−ロイシン又は
グルタリル−Ｌ−ロイシンを含む人工培地を含むペトリ
プレートでのみ生育することができるからである。ここ
で、ペトリプレートの上記培養にＬ−ロイシンを添加
し、そして、スクシニル−Ｌ−プロリンでＬ−プロリン
を置換したとき、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを
生産する能力を有する細胞は、生育することができた
が、それ以外の細胞は該能力を有さなかったということ
を強調しておかなければならない。
ロニは、遺伝子ｌｅｕ Ｂをリバート（ｒｅｖｅｒｔ）
するバクテリア又は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＨＢ１００株のｌｅｕ Ｂ遺伝子に等価な挿入され
た遺伝子を有するバクテリアとは区別される。何故な
ら、その周りに生育ハローを形成するのに加えて、それ
らは、以前述べたような人工培地で、Ｌ−ロイシン又は
グルタリル−Ｌ−ロイシンを含む人工培地を含むペトリ
プレートでのみ生育することができるからである。ここ
で、ペトリプレートの上記培養にＬ−ロイシンを添加
し、そして、スクシニル−Ｌ−プロリンでＬ−プロリン
を置換したとき、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを
生産する能力を有する細胞は、生育することができた
が、それ以外の細胞は該能力を有さなかったということ
を強調しておかなければならない。
【００７２】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼも又ス
クシニル−Ｌ−プロリンを加水分解し、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１バクテリアの生育に必
須なＬ−プロリンを解放することができるという事実に
よっている。
クシニル−Ｌ−プロリンを加水分解し、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１バクテリアの生育に必
須なＬ−プロリンを解放することができるという事実に
よっている。
【００７３】このように、ＢａｍＨＩ部位で、Ａｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１の約
８．５ｋｂのＤＮＡインサートであって、バクテリアに
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産する能力を授
けるＤＮＡインサートを含むｐＡＣＹＣ１８４由来のリ
コンビナントプラスミドを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＪＣ１１）株が得られた。
このプラスミドは、又バクテリアにクロラムフェニコー
ル耐性を授けている。
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１の約
８．５ｋｂのＤＮＡインサートであって、バクテリアに
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを生産する能力を授
けるＤＮＡインサートを含むｐＡＣＹＣ１８４由来のリ
コンビナントプラスミドを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＪＣ１１）株が得られた。
このプラスミドは、又バクテリアにクロラムフェニコー
ル耐性を授けている。
【００７４】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１（ｐＪＣ１１）株をＬＢ培地で３７℃、２０時間
生育させた。次に、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
をソニケーションにより細胞内から解放させた。酵素活
性を従来のカロリメトリック法（Ｂａｌａｓｈｉｎｇｈ
ａｍ Ｋ．等（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ ２７６，２５０）により決定した。こ
こで、７−アミノセファロスポラン酸をスタンダードに
用いて較正曲線を計算した。決定されたグルタリル−７
ＡＣＡ−アシラーゼ活性は、０．０２Ｕ／ｍｇ蛋白であ
った。これらの値は、又ＨＬＰＣクロマトグラフィーを
用いて計算し、同様の結果を得た。
１０１（ｐＪＣ１１）株をＬＢ培地で３７℃、２０時間
生育させた。次に、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
をソニケーションにより細胞内から解放させた。酵素活
性を従来のカロリメトリック法（Ｂａｌａｓｈｉｎｇｈ
ａｍ Ｋ．等（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ ２７６，２５０）により決定した。こ
こで、７−アミノセファロスポラン酸をスタンダードに
用いて較正曲線を計算した。決定されたグルタリル−７
ＡＣＡ−アシラーゼ活性は、０．０２Ｕ／ｍｇ蛋白であ
った。これらの値は、又ＨＬＰＣクロマトグラフィーを
用いて計算し、同様の結果を得た。
【００７５】６． 発現ベクター中のグルタリル−７Ａ
ＣＡ−アシラーゼ遺伝子のサブクローニング ｐＪＣ１１プラスミドのいくつかのサンプルを制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＶにより３７℃１時間消化し、
その後制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩにより３７
℃で消化を行ない、反応を種々のインターバルで、サン
プルを６５℃で１０分間加熱することによって停止させ
た。これにより、プラスミドの完全な消化が酵素Ｅｃｏ
ＲＶについて、部分的な消化が酵素ＨｉｎｃＩＩについ
て得られた。
ＣＡ−アシラーゼ遺伝子のサブクローニング ｐＪＣ１１プラスミドのいくつかのサンプルを制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲＶにより３７℃１時間消化し、
その後制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩにより３７
℃で消化を行ない、反応を種々のインターバルで、サン
プルを６５℃で１０分間加熱することによって停止させ
た。これにより、プラスミドの完全な消化が酵素Ｅｃｏ
ＲＶについて、部分的な消化が酵素ＨｉｎｃＩＩについ
て得られた。
【００７６】更に、１μｇのプラスミドｐＵＣ１８を含
むいくつかのサンプルを、制限エンドヌクレアーゼＨｉ
ｎｃＩＩで１時間３７℃で消化し、反応の停止のため
に、６５℃１０分間加熱した。
むいくつかのサンプルを、制限エンドヌクレアーゼＨｉ
ｎｃＩＩで１時間３７℃で消化し、反応の停止のため
に、６５℃１０分間加熱した。
【００７７】プラスミドｐＪＣＩＩ消化物の各サンプル
をプラスミドｐＵＣ１８消化物のサンプルと合わせ、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。そして、いくつ
かのライゲーション混合物を、パラグラフ（５）で述べ
たのと同様のプロセスによりコンピテントなＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換す
るのに使用した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生
産株を、パラグラフ（５）で述べたのと同様にただし、
クロラムフェニコールを１００ｎｇ／リットルアンピシ
リンと置換した人工選択培地を含むペトリプレートでの
生育により単離した。
をプラスミドｐＵＣ１８消化物のサンプルと合わせ、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。そして、いくつ
かのライゲーション混合物を、パラグラフ（５）で述べ
たのと同様のプロセスによりコンピテントなＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換す
るのに使用した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ生
産株を、パラグラフ（５）で述べたのと同様にただし、
クロラムフェニコールを１００ｎｇ／リットルアンピシ
リンと置換した人工選択培地を含むペトリプレートでの
生育により単離した。
【００７８】そこで、プラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｃ
ＩＩ部位にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣ
Ｃ５３８９１のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝
子を含む約３ＫｂのＤＮＡインサートを含むＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＪＣ４０）株
が得られた。
ＩＩ部位にＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣ
Ｃ５３８９１のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝
子を含む約３ＫｂのＤＮＡインサートを含むＥｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＪＣ４０）株
が得られた。
【００７９】１マイクログラムのプラスミドｐＪＣ４０
を含むいくつかのサンプルを制限ヌクレアーゼＢａｍＨ
Ｉにより３７℃で消化し、６５℃で１０分間加熱して、
反応を停止させた。商業的なプラスミドｐＤＲ５４０
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）は、ＢａｍＨＩ部位に近接してｔａｃプロモー
ターを含み、これにより、そこに挿入された遺伝子は、
プロモーターにより発現することができる。
を含むいくつかのサンプルを制限ヌクレアーゼＢａｍＨ
Ｉにより３７℃で消化し、６５℃で１０分間加熱して、
反応を停止させた。商業的なプラスミドｐＤＲ５４０
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）は、ＢａｍＨＩ部位に近接してｔａｃプロモー
ターを含み、これにより、そこに挿入された遺伝子は、
プロモーターにより発現することができる。
【００８０】プラスミドｐＪＣ４０消化物の各サンプル
をプラスミドｐＤＲ５４０消化物のサンプルと合わせ、
そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。そし
て、ライゲーション混合物をパラグラフ（５）で述べた
のと同じ方法でコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換するのに使用し
た。
をプラスミドｐＤＲ５４０消化物のサンプルと合わせ、
そしてＴ４ ＤＮＡリガーゼでライゲートした。そし
て、ライゲーション混合物をパラグラフ（５）で述べた
のと同じ方法でコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞を形質転換するのに使用し
た。
【００８１】グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを、そ
れらをｐＪＣ４０の単離に対して述べた培地と類似の選
択人工培地を含むペトリプレート内で生育させて単離し
た。プロモーターｔａｃにより、グルタリル−７ＡＣＡ
−アシラーゼ遺伝子を発現するバクテリアは、プラスミ
ドｐＪＣ４０を含むバクテリアから区別される。何故な
ら、前者は、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼをより
良く発現することによって、より高速度で生育し、従っ
て、選択プレート中でより大きなコロニーを生みだす。
れらをｐＪＣ４０の単離に対して述べた培地と類似の選
択人工培地を含むペトリプレート内で生育させて単離し
た。プロモーターｔａｃにより、グルタリル−７ＡＣＡ
−アシラーゼ遺伝子を発現するバクテリアは、プラスミ
ドｐＪＣ４０を含むバクテリアから区別される。何故な
ら、前者は、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼをより
良く発現することによって、より高速度で生育し、従っ
て、選択プレート中でより大きなコロニーを生みだす。
【００８２】かくして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＨＢ１０１（ｐＪＣ４０ １１）株を単離した。
これは、プラスミドｐＤＲ５４０のＢａｍＨＩ部位に、
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９
１のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を含む約
２．８ＫｂのＤＮＡインサートを含んでいる。
ｌｉ ＨＢ１０１（ｐＪＣ４０ １１）株を単離した。
これは、プラスミドｐＤＲ５４０のＢａｍＨＩ部位に、
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９
１のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を含む約
２．８ＫｂのＤＮＡインサートを含んでいる。
【００８３】プラスミドｐＪＣ５４０ １１はアンピシ
リン耐性を授けており、７−アミノセファロスポラン酸
を分解するβ−ラクタマーゼを発現するので、プロモー
ターｔａｃとグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
の融合をβ−ラクタム系抗生物質に耐性を与えない異な
るプラスミドにシフトすることが必要であった。そのた
めに、１μｇのプラスミドｐＪＣ４０ １１を制限エン
ドヌクレアーゼＸｂａｌ及びＨｉｎｄＩＩＩにより、３
７℃１時間消化した。そして同じことを１マイクログラ
ムのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を用いて行なった。両
方の反応とも、６５℃１０分間で不活性化させた。
リン耐性を授けており、７−アミノセファロスポラン酸
を分解するβ−ラクタマーゼを発現するので、プロモー
ターｔａｃとグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子
の融合をβ−ラクタム系抗生物質に耐性を与えない異な
るプラスミドにシフトすることが必要であった。そのた
めに、１μｇのプラスミドｐＪＣ４０ １１を制限エン
ドヌクレアーゼＸｂａｌ及びＨｉｎｄＩＩＩにより、３
７℃１時間消化した。そして同じことを１マイクログラ
ムのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４を用いて行なった。両
方の反応とも、６５℃１０分間で不活性化させた。
【００８４】両方の消化物を一緒にし、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼでライゲートし、このライゲーション混合物を使
って、パラグラフ（５）で述べたとおり、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１のコンピテントな細
胞を形質転換した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
生産菌をｐＪＣ１１の単離のために述べた培地と類似の
選択人工培地を含むペトリプレートで生育させて単離し
た。
ガーゼでライゲートし、このライゲーション混合物を使
って、パラグラフ（５）で述べたとおり、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１のコンピテントな細
胞を形質転換した。グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ
生産菌をｐＪＣ１１の単離のために述べた培地と類似の
選択人工培地を含むペトリプレートで生育させて単離し
た。
【００８５】このようにして、プロモーターｔａｃと融
合したＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＴＣＣ５３
８９１のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を含
む約２．９ＫｂのＤＮＡインサートを、プラスミドｐＡ
ＣＹＣ１８４のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位の間に含
む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
（ｐＪＣ２００）株を単離した。
合したＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＡＴＣＣ５３
８９１のグルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ遺伝子を含
む約２．９ＫｂのＤＮＡインサートを、プラスミドｐＡ
ＣＹＣ１８４のＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ部位の間に含
む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
（ｐＪＣ２００）株を単離した。
【００８６】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１（ｐＪＣ２００）をＬＢ培地で２０時間、３７℃
で生育させた。次に、細胞を安定化させ、そしてグルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼを超音波処理により細胞内
部から解放した。酵素活性をパラグラフ（５）で述べた
方法により評価した。決定されたグルタリル−７ＡＣＡ
−アシラーゼ活性は、０．２Ｕ／ｍｇ蛋白であった。
１０１（ｐＪＣ２００）をＬＢ培地で２０時間、３７℃
で生育させた。次に、細胞を安定化させ、そしてグルタ
リル−７ＡＣＡ−アシラーゼを超音波処理により細胞内
部から解放した。酵素活性をパラグラフ（５）で述べた
方法により評価した。決定されたグルタリル−７ＡＣＡ
−アシラーゼ活性は、０．２Ｕ／ｍｇ蛋白であった。
【００８７７． プラスミドｐＪＣ２００の異なるＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株への導入 プラスミドｐＪＣ２００の生産改良を行なったにも拘ら
ず、このようなプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株はグルタリル−７ＡＣＡ−
アシラーゼを生産するのに適当であるとは考えられなか
った。何故なら、これらの細胞の酵素抽出物中に、グル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ反応からの最終生成物で
ある、７−アミノセファロスポラン酸を部分的に分解す
る酵素活性が検出されたからである。これが、我々自身
のコレクション（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からいくつか
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株を、パラグラフ
（５）で述べた方法と類似の方法によりそれらをコンピ
テントにすることによって、形質転換した理由である。 【００８８】これらの作業の結果、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ Ｐ−３株（ｐＪＣ２００）を単離し
た。このＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ−３
（ｐＪＣ２００）株を２１℃でＴＢ培地で４８時間生育
させた。それから、細胞を安定化し、超音波処理により
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを細胞内部から解放
した。
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株への導入 プラスミドｐＪＣ２００の生産改良を行なったにも拘ら
ず、このようなプラスミドを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１株はグルタリル−７ＡＣＡ−
アシラーゼを生産するのに適当であるとは考えられなか
った。何故なら、これらの細胞の酵素抽出物中に、グル
タリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ反応からの最終生成物で
ある、７−アミノセファロスポラン酸を部分的に分解す
る酵素活性が検出されたからである。これが、我々自身
のコレクション（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からいくつか
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株を、パラグラフ
（５）で述べた方法と類似の方法によりそれらをコンピ
テントにすることによって、形質転換した理由である。 【００８８】これらの作業の結果、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ Ｐ−３株（ｐＪＣ２００）を単離し
た。このＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ−３
（ｐＪＣ２００）株を２１℃でＴＢ培地で４８時間生育
させた。それから、細胞を安定化し、超音波処理により
グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼを細胞内部から解放
した。
【００８９】酵素活性をパラグラフ（５）で述べたカロ
リメトリック法によって評価した。決定されたグルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性は、２Ｕ／ｍｇ蛋白であ
った。これらの値は、又ＨＰＬＣクロマトグラフィー法
によって計算され、同一の結果が得られた。
リメトリック法によって評価した。決定されたグルタリ
ル−７ＡＣＡ−アシラーゼ活性は、２Ｕ／ｍｇ蛋白であ
った。これらの値は、又ＨＰＬＣクロマトグラフィー法
によって計算され、同一の結果が得られた。
【００９０】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ−
３（ｐＪＣ２００）株によるグルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼ収率の増加は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１のオリジナル株よりも、そし
て以前に得られたいかなる他のリコンビナント株よりも
極めて高い。更に、これらの新しいグルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼ生産リコンピナント株の抽出液は、７−
アミノセファロスポラン酸を分解する酵素活性を検知し
うるほど含まない。そして、それ故、それらは産業上の
使用上、サポートに固定化されているため、グルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼ源として非常に有用である。Ｐ
−３（ｐＪＣ２００）は、ナショナルコレクション オ
ブ インダストリアル アンド マリーン バクテリア
リミテッド（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ
Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＮＣＩＭＢ）
に、寄託番号ＮＣＩＭＢ４０４３３として寄託されてい
る。
３（ｐＪＣ２００）株によるグルタリル−７ＡＣＡ−ア
シラーゼ収率の増加は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１のオリジナル株よりも、そし
て以前に得られたいかなる他のリコンビナント株よりも
極めて高い。更に、これらの新しいグルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼ生産リコンピナント株の抽出液は、７−
アミノセファロスポラン酸を分解する酵素活性を検知し
うるほど含まない。そして、それ故、それらは産業上の
使用上、サポートに固定化されているため、グルタリル
−７ＡＣＡ−アシラーゼ源として非常に有用である。Ｐ
−３（ｐＪＣ２００）は、ナショナルコレクション オ
ブ インダストリアル アンド マリーン バクテリア
リミテッド（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ
Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＮＣＩＭＢ）
に、寄託番号ＮＣＩＭＢ４０４３３として寄託されてい
る。
【００９１】例２ 株のエステラーゼ活性を証明するため、等量の細胞ペー
ストから得られた細胞抽出物を得た。この抽出物をリン
酸バッファー０．１Ｍ（ｐＨ：７）中のセファロスポリ
ンＣの１：１溶液と混合し、反応混合物は、５０００Ｕ
／ｍｌ ｃｅｆ．Ｃを含む。
ストから得られた細胞抽出物を得た。この抽出物をリン
酸バッファー０．１Ｍ（ｐＨ：７）中のセファロスポリ
ンＣの１：１溶液と混合し、反応混合物は、５０００Ｕ
／ｍｌ ｃｅｆ．Ｃを含む。
【００９２】最初のＣｅｆ．Ｃに対するデスアセチルＣ
ｅｆ．Ｃの出現の率は、室温で８時間インキュベーショ
ン後：
ｅｆ．Ｃの出現の率は、室温で８時間インキュベーショ
ン後：
【００９３】 ％Ｄｅｓａｃｅｔｙｌ Ｃｅｆ．Ｃ． コントロール（Ｃｅｆ．Ｃ） １．８ Ｅ．ｃｏｌｉ Ａ（ｐＪＣ２００） ４９．７ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３（ｐＪＣ２００） ８７
【００９４】例３ 本例は、グルタリル−７ＡＣＡ−酵素を生産する遺伝子
を運び、そしてクロラムフェニコール耐性マーカーを有
するプラスミドｐＪＣ２００により形質転換された、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３株の獲得に関する。
を運び、そしてクロラムフェニコール耐性マーカーを有
するプラスミドｐＪＣ２００により形質転換された、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３株の獲得に関する。
【００９５】Ａ． Ｅ・ｃｏｌｉのコンピテント細胞
（目的のプラスミドで形質転換されるべきもの）を得る
ため、次の工程を実施した。−５０ｍｌのＳＯＢ培地
（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１６６，５５７）を入れた２５０ｍｌフラスコに
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３細胞を植え、３７℃、２５０ｒ．
ｐ．ｍ．で１５−１８時間インキュベートし、そして５
０ｍｌＳＯＢ培地を入れた５００ｍｌフラスコを１００
μｌの先の培地でインキュベートし、ＯＤ６００＝０．
４になるまで３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．で生育させ
た。細胞を４℃でトップデスク遠心分離機で２５００
ｒ．ｐ．ｍ．で収集し、そしてＲＦ１（Ｈａｎａｈａ
ｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７）
の最初の容量の１／３に再懸濁させた。
（目的のプラスミドで形質転換されるべきもの）を得る
ため、次の工程を実施した。−５０ｍｌのＳＯＢ培地
（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１６６，５５７）を入れた２５０ｍｌフラスコに
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３細胞を植え、３７℃、２５０ｒ．
ｐ．ｍ．で１５−１８時間インキュベートし、そして５
０ｍｌＳＯＢ培地を入れた５００ｍｌフラスコを１００
μｌの先の培地でインキュベートし、ＯＤ６００＝０．
４になるまで３７℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．で生育させ
た。細胞を４℃でトップデスク遠心分離機で２５００
ｒ．ｐ．ｍ．で収集し、そしてＲＦ１（Ｈａｎａｈａ
ｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７）
の最初の容量の１／３に再懸濁させた。
【００９６】このサスペンジョンを氷上で１５分間イン
キュベートし、再び前記した条件で遠心分離し、ＲＦ２
（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．（６６，５５７）の最初の容量の１／１２に再懸
濁させた。
キュベートし、再び前記した条件で遠心分離し、ＲＦ２
（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．（１９８３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．（６６，５５７）の最初の容量の１／１２に再懸
濁させた。
【００９７】このようにして得られたコンピテント細胞
を氷上で１５分間インキュベートし、そして４００μｌ
のアリコートに分配した。これは、ドライアイス−エタ
ノール浴中で瞬間的に凍結させた。
を氷上で１５分間インキュベートし、そして４００μｌ
のアリコートに分配した。これは、ドライアイス−エタ
ノール浴中で瞬間的に凍結させた。
【００９８】Ｂ． これらのコンピテント細胞のプラス
ミドｐＪＣ２００による形質転換を以下の工程で実施し
た。
ミドｐＪＣ２００による形質転換を以下の工程で実施し
た。
【００９９】Ａで得られた細胞をゆっくりと解凍し、直
ちに１００μｌの該細胞を１０−１５μｇプラスミドと
混合する。混合物を氷上で３０分間インキュベートす
る。次に、混合物を４２℃、４５秒間の熱ショックにか
け、そして直ちに氷上で２−５分間インキュベートす
る。１ｍｌ ＳＯＢを添加し、インキュベーションを３
７℃で１時間、緩かに振らしながら（約１００ｒ．ｐ．
ｍ．）インキュベーションを行なう。形質転換された細
胞をクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を有する
ＬＢ培地プレート中に植えて、３７℃で１５−１８時間
インキュベートする。
ちに１００μｌの該細胞を１０−１５μｇプラスミドと
混合する。混合物を氷上で３０分間インキュベートす
る。次に、混合物を４２℃、４５秒間の熱ショックにか
け、そして直ちに氷上で２−５分間インキュベートす
る。１ｍｌ ＳＯＢを添加し、インキュベーションを３
７℃で１時間、緩かに振らしながら（約１００ｒ．ｐ．
ｍ．）インキュベーションを行なう。形質転換された細
胞をクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を有する
ＬＢ培地プレート中に植えて、３７℃で１５−１８時間
インキュベートする。
【０１００】Ｃ． 本方法により得られたＥ．ｃｏｌｉ
Ｐ−３ ｐＪＣ２００細胞の生化学及び生育特性
Ｐ−３ ｐＪＣ２００細胞の生化学及び生育特性
【０１０１】 生育、３０−３７℃ ＋ 条件的嫌気性 ＋ ＴＳｌ（トリプルシュガーアイアン） Ａ／Ａ ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） ＋ ＡＤＨ（アルギニンジヒドロラーゼ） − ＬＤＣ（リジンデカルボキシラーゼ） ＋ ＯＤＣ（オルニチン デカルボキシラーゼ） ＋ クエン酸塩使用 − マロン酸塩使用 − ＳＨ２生産 − ウリアーゼ −
【０１０２】 インドール生産 ＋ アセトイン生産 − アセトアミド加水分解 − エスクリン加水分解 − インドキシル−ベータ−Ｄ−グリコシド − ゼラチン加水分解 − 糖醗酵：
【０１０３】 グルコース ＋（遅い） ラフィノース ＋ ソルビトール ＋ スクロース ＋ イノシトール − アドニトール − ラムノース ＋ Ｌ−アラビノース ＋
【０１０４】 酸生成での糖の酸化 グルコース ＋ マンニトール ＋ イノシトール − ソルビトール ＋ ラムノース ＋ マルトース ＋ キシロース ＋ スクロース ＋ メロビオース ＋ アミグダリン − アラビノース ＋
【０１０５】 ＤＰ−３００の存在下での生育 − （３０μｇ／１００ｍｌ） ＤＰ−３００の存在下での生育 − （３０μｇ／１００ｍｌ）
【０１０６】 ｐ−クマリン酸の存在下での生育 ＋ （２ｍｇ／ｍｌ） レビネ（ｌｅｖｉｎｅ）寒天中の生育 ＋ コンキー（Ｍａｃ Ｃｏｎｋｅｙ）寒天中の生育 ＋
【０１０７】例４ 本例は、グルタリル−７ＡＣＡ−アシラーゼ酵素の生産
のための実施例１で述べたように、得られた形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３（ｐＪＣ２００）株の生育に関す
る。
のための実施例１で述べたように、得られた形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ−３（ｐＪＣ２００）株の生育に関す
る。
【０１０８】前記株の凍結バイアルから植えたＬＡ培地 （組成ｇ／リットル：バクトトリプトン、１０；バクト
−酵母エキス、５；ＮａＣｌ，１０；クロラムフェニコ
ール、０．０３；寒天、１５）の斜面培養基を５ｍｌの
０．９％滅菌食塩水溶液中に懸濁させる。
−酵母エキス、５；ＮａＣｌ，１０；クロラムフェニコ
ール、０．０３；寒天、１５）の斜面培養基を５ｍｌの
０．９％滅菌食塩水溶液中に懸濁させる。
【０１０９】ＴＢ液体培地（組成ｇ／リットル：バクト
トリプトン、１２；酵母エキス、２４；グリセロール、
４；ＫＨ２ＰＯ４、２．３１；Ｋ２ＨＰＯ４、１２．５
４；クロラムフェニコール、０．０３）の接種材料を５
００／１００ｍｌフラスコ中の０．５ｍｌの懸濁液で植
え、そしてそれから２８℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．２４時
間インキュベートした。
トリプトン、１２；酵母エキス、２４；グリセロール、
４；ＫＨ２ＰＯ４、２．３１；Ｋ２ＨＰＯ４、１２．５
４；クロラムフェニコール、０．０３）の接種材料を５
００／１００ｍｌフラスコ中の０．５ｍｌの懸濁液で植
え、そしてそれから２８℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．２４時
間インキュベートした。
【０１１０】同じ培地を入れた５００／１００フラスコ
に、前述のもの（１％シード）を植え、２１℃、２５０
ｒ．ｐ．ｍ．４８−７２時間インキュベートした。
に、前述のもの（１％シード）を植え、２１℃、２５０
ｒ．ｐ．ｍ．４８−７２時間インキュベートした。
【０１１１】細胞を４０００ｒ．ｐ．ｍ．２０分間の遠
心分離によりブロスから分離し、それから、最初のブロ
スの容量になるまで、リン酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ
８．０中に再懸濁させる。
心分離によりブロスから分離し、それから、最初のブロ
スの容量になるまで、リン酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ
８．０中に再懸濁させる。
【０１１２】この細胞懸濁液をカロリメトリックに又は
ＨＰＬＣにより滴定した。
ＨＰＬＣにより滴定した。
【０１１３】このプロセスによって、オリジナルなＡｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１株
と比較して、４００倍の酵素活性の増加が得られた。
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１株
と比較して、４００倍の酵素活性の増加が得られた。
【０１１４】例５ この例は新しい醗酵培地を用いてグルタリル−７ＡＣＡ
−アシラーゼを得ることを目的とした形質転換Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｐ−３（ｐＪＣ２００）株の生育に関する。
−アシラーゼを得ることを目的とした形質転換Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｐ−３（ｐＪＣ２００）株の生育に関する。
【０１１５】接種材料を例４で述べたとおり調製した。
当該接種材料を、酵母自己溶解物２４；カゼイン加水分
解物、１２；グリセロール、４；ＰＯ４Ｈ２Ｋ、２．３
１４；ＰＯ４ＨＫ２、１２．５４；の組成（ｇ／リット
ル）の培地を含む５００ｍｌフラスコに１％再接種し
た。殺菌にひきつづき、クロラムフェニコールの溶液を
最終濃度３０μｇ／ｍｌで添加し、最後にインキュベー
ションを２１℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．４８−７２時間行
なった。
当該接種材料を、酵母自己溶解物２４；カゼイン加水分
解物、１２；グリセロール、４；ＰＯ４Ｈ２Ｋ、２．３
１４；ＰＯ４ＨＫ２、１２．５４；の組成（ｇ／リット
ル）の培地を含む５００ｍｌフラスコに１％再接種し
た。殺菌にひきつづき、クロラムフェニコールの溶液を
最終濃度３０μｇ／ｍｌで添加し、最後にインキュベー
ションを２１℃、２５０ｒ．ｐ．ｍ．４８−７２時間行
なった。
【０１１６】この細胞を４，０００ｒ．ｐ．ｍ． ２０
分間の遠心分離によりブロスから分離し、リン酸バッフ
ァー０．１Ｍ、ｐＨ８．０に最初のブロス容量まで再懸
濁させた。
分間の遠心分離によりブロスから分離し、リン酸バッフ
ァー０．１Ｍ、ｐＨ８．０に最初のブロス容量まで再懸
濁させた。
【０１１７】上記細胞懸濁液をカロリメトリック法又は
ＨＰＬＣによって滴定した。本プロセスによって、Ａｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１株
と比較して５００倍の酵素活性の増加が得られた。
ＨＰＬＣによって滴定した。本プロセスによって、Ａｃ
ｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＴＣＣ５３８９１株
と比較して５００倍の酵素活性の増加が得られた。
【０１１８】例６ 本例では、生育条件及びＥ．ｃｏｌｉ Ａ （ｐＪＣ２
００）株により得られた生産について開示する。
００）株により得られた生産について開示する。
【０１１９】培養ブロスの調製及び細胞の分離の例４の
スペックをＥ．ｃｏｌｉ Ａ（ｐＪＣ２００）株の凍結
バイアルに適用した。
スペックをＥ．ｃｏｌｉ Ａ（ｐＪＣ２００）株の凍結
バイアルに適用した。
【０１２０】このケースで得られたグルタリル−７ＡＣ
Ａ−アシラーゼの生産は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ・ＡＴＣＣ５３８９１株から得られた生産よりも
６００倍高かった。
Ａ−アシラーゼの生産は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ
ｓｐ・ＡＴＣＣ５３８９１株から得られた生産よりも
６００倍高かった。
【０１２１】例７ 全細胞でのブロスの活性 ０．４％グリセロールを２４及び４８時間、Ｏ．Ｄ．
６００＝２２、で添加する修正を加えて、例５と同様に
調製した１．５リットルの培地を５０００ｇで遠心分離
し、これにより８５ｇの細胞ペースト（湿度８０％）を
得た。
６００＝２２、で添加する修正を加えて、例５と同様に
調製した１．５リットルの培地を５０００ｇで遠心分離
し、これにより８５ｇの細胞ペースト（湿度８０％）を
得た。
【０１２２】このようにして得られた１ｇの細胞ペース
トを、２％グルタリル−７ＡＣＡを含む５０ｍｌのリン
酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ８．０中に懸濁させた。そ
して３７℃１０分間インキュベートした。この時間経過
後、２０％酢酸を、反応混合物１ｍｌに対して３ｍｌの
割合で添加することによって反応を停止させた。得られ
た懸濁液を遠心分離し、形成された７−ＡＣＡを透明な
上澄液中で定量した。
トを、２％グルタリル−７ＡＣＡを含む５０ｍｌのリン
酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ８．０中に懸濁させた。そ
して３７℃１０分間インキュベートした。この時間経過
後、２０％酢酸を、反応混合物１ｍｌに対して３ｍｌの
割合で添加することによって反応を停止させた。得られ
た懸濁液を遠心分離し、形成された７−ＡＣＡを透明な
上澄液中で定量した。
【０１２３】７−ＡＣＡのスタンダードに対してＨＰＬ
Ｃにより実施したコントロールは、出発ブロス中の活性
を示し、これはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ａ
ＴＣＣ５３８９１株と比較して１０００倍の増加を示し
た。
Ｃにより実施したコントロールは、出発ブロス中の活性
を示し、これはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ａ
ＴＣＣ５３８９１株と比較して１０００倍の増加を示し
た。
【０１２４】例８ 溶解細胞でのブロスの活性 例４で述べたとおりにして得られた１０ｇの細胞を５０
ｍｌリン酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ８．０中に懸濁さ
せ、そして超音波破壊（５パルス、各１５秒）にかけ
た。
ｍｌリン酸バッファー０．１Ｍ、ｐＨ８．０中に懸濁さ
せ、そして超音波破壊（５パルス、各１５秒）にかけ
た。
【０１２５】４０ｍｌの細胞ホモジェネートを得た。こ
れは、細胞破壊の前に、９１％の活性を残していた（Ｈ
ＰＬＣにより測定）。
れは、細胞破壊の前に、９１％の活性を残していた（Ｈ
ＰＬＣにより測定）。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/70 Ｃ１２Ｐ 35/06 8931−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 バレド フェンテス ジョゼ ルイス スペイン国レオン，２ ビー，ブロックェ 15，モイセス デ レオン (72)発明者 サルト マルドナド フランシスコ スペイン国レオン，３ ビー，カルレ フ ェロ，15
Claims (16)
- 【請求項１】 イ） ７β−（４−カルボキシブタンア
ミド）セファロスポリンアシラーゼをコードする配列を
含む微生物の株の全ＤＮＡを消化し、そのＤＮＡフラグ
メントをＤＮＡベクターにプレースしてプラスミディッ
クライブラリーを形成し； ロ） プラスミディックライブラリーに含まれるＤＮＡ
配列の各々により、グルタル酸若しくは関連する酸とア
ミド結合を形成できる化合物に栄養要求性を持つＥ．ｃ
ｏｌｉ宿主を形質転換し、 ハ） 非形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ株が栄養要求性である化
合物の、グルタル酸アミド若しくは関連する酸アミドを
含む培地上の生育により、７β−（４−カルボキシブタ
ンアミド）セファロスポリンアシラーゼをコードする配
列を含む形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を選択し、 ニ） ７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロ
スポリンアシラーゼをコードする配列を含むベクター
を、選択された宿主から単離し、ベクターＤＮＡを消化
し、得られたＤＮＡ配列の各々をＥ．ｃｏｌｉベクター
中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉプロモーター配列の支
配下にあるようにし、 ホ） グルタル酸若しくは関連する酸とアミド結合でき
る化合物に栄養要求性のあるＥ．ｃｏ１ｉ宿主を、工程
（ニ）で形成されたベクターのそれぞれで形質転換し、
次いでＥ．ｃｏｌｉプロモーターの支配下にある７β−
（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシ
ラーゼをコードする配列を含む形質転換宿主を上記工程
（ハ）の培地上の生育により選択し、そして ヘ） 選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主からベクターを単離
し、それらを使用して 、実質的にβ−ラクタマーゼ活
性を欠くように選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主を形質転換
する、 工程を含む、高収率の７β−（４−カルボキシブタンア
ミド）セファロスポリンアシラーゼを生産するＥ．ｃｏ
ｌｉ株の生産方法。 - 【請求項２】 最終的なＥ．ｃｏ１ｉ宿主が、低下した
アセチルエステラーゼ活性を持つように、さらに選択さ
れたものである請求項１の方法。 - 【請求項３】 工程（ロ）のＥ．ｃｏ１ｉ株がロイシン
に対して栄養要求性である請求項１又は２の方法。 - 【請求項４】 グルタル酸に関連する酸が、コハク酸で
ある請求項１又は２の方法。 - 【請求項５】 ７β−（４−カルボキシブタンアミド）
セファロスポリンアシラーゼをコードする配列を含む微
生物が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒの株である請求項
１から４のいずれか１項の方法。 - 【請求項６】 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．プ
ラスミディックライブラリーを構築するのに使用するＡ
ｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ドナーが、ＡＴＣＣ
５３８９１として寄託されているものである請求項５の
方法。 - 【請求項７】 β−ラクタマーゼ活性を実質的に欠くよ
うに選択されたＥ．ｃｏｌｉ株がＮＣＩＭＢ４０４３２
として寄託されたＥ．ｃｏｌｉ Ｐ−３である請求項１
から６のいずれか１項の方法。 - 【請求項８】 請求項１から７のいずれかの方法により
生産された高生産性Ｅ．ｃｏｌｉ株を、７β−（４−カ
ルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシラーゼを
発現できる条件下で生育させ、全ブロスから発現した７
β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリン
アシラーゼを回収することを含む高収率の７β−（４−
カルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシラーゼ
の生産方法。 - 【請求項９】 得られた７β−（４−カルボキシブタン
アミド）セファロスポリンアシラーゼの活性が、少くと
も２Ｕ／ｍｇである請求項８の方法。 - 【請求項１０】 水性媒体中で７β−（４−カルボキシ
ブタンアミド）セファロスポラン酸、３−デスアセトキ
シ−７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロス
ポラン酸又はそれらの塩から選ばれる基質を、請求項８
又は９の方法により得られた７β−（４−カルボキシブ
タンアミド）セファロスポリンアシラーゼと反応させる
ことを含む、７−アミノセファロスポラン酸及びその誘
導体の製造方法。 - 【請求項１１】 最終的な形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ宿主の
全細胞により又は物理化学的に細胞又は酵素を固定化す
るよう処置されたＥ．ｃｏｌｉ宿主から得られた物質に
より反応を行う請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 ７β−（４−カルボキシブタンアミ
ド）セファロスポリンアシラーゼをコードするＡｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒからのＤＮＡの配列を含むベクター
により形質転換されたＥ．ｃｏｌｉの株。 - 【請求項１３】 Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ由来の７
β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリン
アシラーゼをコードする配列が、Ｅ．ｃｏｌｉプロモー
ター配列の支配下にある請求項１２のＥ．ｃｏｌｉの
株。 - 【請求項１４】 実質的にβ−ラクタマーゼ活性を欠く
ように選択されたＥ．ｃｏｌｉ宿主を、請求項１３の
Ｅ．ｃｏｌｉの株から単離したＥ．ｃｏｌｉプロモータ
ー配列の支配下で７β−（４−カルボキシブタシアミ
ド）セファロスポリンアシラーゼをコードするＡｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒからのＤＮＡ配列を含むベクターに
より形質転換し得られたＥ．ｃｏｌｉの株。 - 【請求項１５】 高収率の７β−（４−カルボキシブタ
ンアミド）セファロスポリンアシラーゼを生産できるＮ
ＣＩＭＢ４０４３３として寄託されたＥ．ｃｏｌｉの
株、そのミュータント、バリアント及ひプロジェニ。 - 【請求項１６】 請求項１５のＥ．ｃｏｌｉ株中に保持
されているＥ．ｃｏｌｉ ｔａｃプロモーター配列の支
配下で７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロ
スポリンアシラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むｐＪ
Ｃ２００プラスミド。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES9002109 | 1990-08-03 | ||
| ES9002109A ES2020792A6 (es) | 1990-08-03 | 1990-08-03 | Un procedimiento enzimatico para la presentacion de acido 7-amino-cefa-losporanico y un procedimiento para expresar la enzima 7b (4-carboxibutanamido) cefalosporinacilasa. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0690746A true JPH0690746A (ja) | 1994-04-05 |
| JP3404406B2 JP3404406B2 (ja) | 2003-05-06 |
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ID=8268451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28234391A Expired - Fee Related JP3404406B2 (ja) | 1990-08-03 | 1991-08-02 | ７−アミノセファロスポラン酸の酵素的製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5354667A (ja) |
| EP (1) | EP0469919B1 (ja) |
| JP (1) | JP3404406B2 (ja) |
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| DK (1) | DK0469919T3 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11510398A (ja) * | 1996-04-19 | 1999-09-14 | アンティビオティコス，ソシエダ アノニマ | 酵素７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシラーゼの修飾方法及び単一クロマトグラフィー段階においてその酵素を精製する方法 |
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|---|---|---|---|---|
| KR0171897B1 (ko) * | 1989-12-27 | 1999-02-01 | 후지사와 도모끼찌로 | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 |
| IT1269180B (it) * | 1994-01-14 | 1997-03-21 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Processo per la produzione dell'enzima acido 7beta- (4-carbossibutanamido)-cefalosporanico acilasi |
| DE4437420A1 (de) * | 1994-10-19 | 1996-04-25 | Hoechst Ag | Verbessertes, induktionsfreies Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Glutarylamidase |
| FR2780416B1 (fr) * | 1998-06-10 | 2002-12-20 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede |
| IT1312567B1 (it) * | 1999-05-21 | 2002-04-22 | Antibioticos Spa | Processo per la sintesi di derivati beta-lattamici. |
| ES2252302T3 (es) | 2000-09-22 | 2006-05-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Amidasa de glutaril cefalosporina a partir de pseudomonas diminuta bs-203. |
| KR100530299B1 (ko) | 2003-08-11 | 2005-11-22 | 산도즈 게엠베하 | 변이 세팔로스포린 ｃ 아실라제 및 이를 이용한 7-ａｃａ 제조방법 |
| CN1912127B (zh) * | 2005-08-08 | 2011-05-25 | 百瑞全球有限公司 | 一种大肠杆菌表达载体及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| EP0322032A3 (en) * | 1987-12-21 | 1991-01-30 | Merck & Co. Inc. | One-step enzymatic conversion of cephalosporin c and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives |
| JPH04504362A (ja) * | 1989-04-04 | 1992-08-06 | バイオピユア・コーポレーシヨン | 酵素による７―アミノセフアロスポラン酸の製造 |
-
1990
- 1990-08-03 ES ES9002109A patent/ES2020792A6/es not_active Expired - Lifetime
-
1991
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- 1991-08-02 JP JP28234391A patent/JP3404406B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 1997-06-24 GR GR970401509T patent/GR3023866T3/el unknown
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|---|---|---|---|---|
| JPH11510398A (ja) * | 1996-04-19 | 1999-09-14 | アンティビオティコス，ソシエダ アノニマ | 酵素７β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポリンアシラーゼの修飾方法及び単一クロマトグラフィー段階においてその酵素を精製する方法 |
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