JPH0692973B2 - ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 - Google Patents
ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬Info
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- JPH0692973B2 JPH0692973B2 JP59072427A JP7242784A JPH0692973B2 JP H0692973 B2 JPH0692973 B2 JP H0692973B2 JP 59072427 A JP59072427 A JP 59072427A JP 7242784 A JP7242784 A JP 7242784A JP H0692973 B2 JPH0692973 B2 JP H0692973B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト癌胎児性抗原（以下、CEAと略称するこ
ともある。）のサンドイッチ法による免疫化学的測定法
およびその試薬に関する。
ともある。）のサンドイッチ法による免疫化学的測定法
およびその試薬に関する。
従来の技術 CEAは1965年Goldらによって、ヒト大腸癌組織の過塩素
酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の消化管上皮に
も存在することから癌胎児性抗原（carcinoembryonic a
ntigen）と名付けられた。CEAは分子量約18万、約50％
の糖を含む蛋白である。CEAは胃癌、大腸癌、膵癌、肺
癌などの種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高レ
ベルで検出される場合が多く、癌の診断ならびに予備管
理用として繁用されている。
酸抽出物中に見い出され、しかも胎児期の消化管上皮に
も存在することから癌胎児性抗原（carcinoembryonic a
ntigen）と名付けられた。CEAは分子量約18万、約50％
の糖を含む蛋白である。CEAは胃癌、大腸癌、膵癌、肺
癌などの種々の癌患者で、癌組織や体液中に比較的高レ
ベルで検出される場合が多く、癌の診断ならびに予備管
理用として繁用されている。
従来より、CEAの酸素免疫測定法（以下、EIAと略称する
こともある。）については、サンドイッチ法が繁用され
てきた。サンドイッチ法は一般に次のように行なわれ
る。未知量のCEAを含む被検液に担体上に保持された過
剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に酵素で
標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させる（第
２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体上に保
持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応、第２
反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なって
もよい。
こともある。）については、サンドイッチ法が繁用され
てきた。サンドイッチ法は一般に次のように行なわれ
る。未知量のCEAを含む被検液に担体上に保持された過
剰量の抗体を加えて反応させ（第１反応）、次に酵素で
標識した過剰量の抗体の一定量を加えて反応させる（第
２反応）。担体上に保持された酵素もしくは担体上に保
持されなかった酵素の活性を測定する。第１反応、第２
反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なって
もよい。
第１反応および第２反応で用いられている抗体は同一の
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。
免疫動物で得られた抗血清、あるいは異なる免疫動物か
ら得られた抗血清、さらにこれらの抗体の１種類と細胞
融合法で得られた１種類のモノクローナル抗体、あるい
は２種類のモノクローナル抗体などが用いられている。
発明が解決しようとする問題点 CEAは一般にKrupeyらの方法〔イムノケミストリー（Imm
unochemistry）、第９巻（1972年）、第617頁〕に準じ
てヒト大腸癌組織の過塩素酸抽出物を、ゲルクロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィーもしくは電
気泳動法の各手法を組み合せて精製されていた。しか
し、これらの方法で得られたCEAは、操作中に強い酸性
溶媒にさらされているため、変性している恐れがあると
いう欠点を有する。このために緩和な条件でCEAを抽出
精製する方法が報告されているが〔キャンサー・リサー
チ（Cancer Research）、第35巻（1975年）第2928
頁〕、繁雑であり、またその有用性も明らかでない。更
に抽出のために用いられるヒト癌化組織としては通常、
大腸癌の転移肝癌が用いられるが原発部組織と完全に一
致する性質を有するものかどうかについては解明されて
いるとは言えない。更にCEAと共通の抗原決定基を有す
るCEA関連抗原が正常組織や新生児胎便中から発見され
ており、NCA〔Nonspecific cross-reacting antigen;Pr
oceedings of the National Academy of Sciences of t
he U.S.A第69巻（1972年），第2492頁〕やNCA-2〔Nonsp
ecific cross-reacting antigen-2;Journal of Immunol
ogy,第111巻（1973年）、第1926頁〕などと名付けられ
ている。これらのCEA関連抗原と交差反応する抗CEA抗体
を利用すると、その交差反応性のためにCEA測定値に影
響を与え、正確な測定値が得られない。
unochemistry）、第９巻（1972年）、第617頁〕に準じ
てヒト大腸癌組織の過塩素酸抽出物を、ゲルクロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィーもしくは電
気泳動法の各手法を組み合せて精製されていた。しか
し、これらの方法で得られたCEAは、操作中に強い酸性
溶媒にさらされているため、変性している恐れがあると
いう欠点を有する。このために緩和な条件でCEAを抽出
精製する方法が報告されているが〔キャンサー・リサー
チ（Cancer Research）、第35巻（1975年）第2928
頁〕、繁雑であり、またその有用性も明らかでない。更
に抽出のために用いられるヒト癌化組織としては通常、
大腸癌の転移肝癌が用いられるが原発部組織と完全に一
致する性質を有するものかどうかについては解明されて
いるとは言えない。更にCEAと共通の抗原決定基を有す
るCEA関連抗原が正常組織や新生児胎便中から発見され
ており、NCA〔Nonspecific cross-reacting antigen;Pr
oceedings of the National Academy of Sciences of t
he U.S.A第69巻（1972年），第2492頁〕やNCA-2〔Nonsp
ecific cross-reacting antigen-2;Journal of Immunol
ogy,第111巻（1973年）、第1926頁〕などと名付けられ
ている。これらのCEA関連抗原と交差反応する抗CEA抗体
を利用すると、その交差反応性のためにCEA測定値に影
響を与え、正確な測定値が得られない。
また、EIAで用いられる標識用酵素としては、安定で高
感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けない
ことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ，アルカリフオスフアターゼ，グル
コースオキシダーゼなどが用いられているが、上記の酵
素のうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極めて安
定な酵素で、酵素活性も高いため最も繁用されている。
感度測定が可能であり、標識化反応時に損傷を受けない
ことが望ましい。これまでにペルオキシダーゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ，アルカリフオスフアターゼ，グル
コースオキシダーゼなどが用いられているが、上記の酵
素のうち、ペルオキシダーゼは分子量約４万の極めて安
定な酵素で、酵素活性も高いため最も繁用されている。
ペルオキシダーゼをEIAに利用するにあたって、ペルオ
キシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる必
要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ欠
点を有し、改善が切望されていた。
キシダーゼと免疫化学的活性物質とを予め結合させる必
要があるが、通常行なわれている方法では、それぞれ欠
点を有し、改善が切望されていた。
問題点を解決するための手段 本発明者らは、上記の事情に鑑み更に検討を重ねたとこ
ろ、サンドイッチ法によるEIAにおいて２種の抗CEA抗体
を用い、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノクロ
ーナル抗体を用い、該サンドイッチ法におけるEIAにお
いて標識剤としてペルオキシダーゼを用いこれと抗体と
を一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、CEAを高感
度、高精度でしかも微量のCEAを測定できることを見い
出し、また、CEAを含有する癌化組織から非イオン性界
面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することによりCEAを
変性させることなく精製でき、またこのようにして精製
されたCEAを用いて製造されたCEA反応性モノクローナル
抗体を上記サンドイッチ法によるEIAに用いると、さら
に高精度でCEAを測定することができることを見い出
し、さらに研究した結果、本発明を完成した。
ろ、サンドイッチ法によるEIAにおいて２種の抗CEA抗体
を用い、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノクロ
ーナル抗体を用い、該サンドイッチ法におけるEIAにお
いて標識剤としてペルオキシダーゼを用いこれと抗体と
を一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いると、CEAを高感
度、高精度でしかも微量のCEAを測定できることを見い
出し、また、CEAを含有する癌化組織から非イオン性界
面活性剤を含む中性塩溶液で抽出することによりCEAを
変性させることなく精製でき、またこのようにして精製
されたCEAを用いて製造されたCEA反応性モノクローナル
抗体を上記サンドイッチ法によるEIAに用いると、さら
に高精度でCEAを測定することができることを見い出
し、さらに研究した結果、本発明を完成した。
本発明は、（１） 担体上に保持された抗体、抗原およ
び標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の
免疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と
標識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複
しない２種の抗体であり、該２種の抗体のうち少なくと
も一方がモノクローナル抗体であり、標識剤としてペル
オキシダーゼを用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いることを特徴とす
るヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法、および （２）、ペルオキシダーゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの、およびペルオキシダ
ーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せず
ヒト癌胎児性抗原に反応する抗体を担体上に保持したも
のであって、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノ
クローナル抗体であるものを含有するヒト癌胎児性抗原
の免疫化学的測定用試薬である。
び標識剤を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の
免疫化学的測定法において、担体上に保持される抗体と
標識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複
しない２種の抗体であり、該２種の抗体のうち少なくと
も一方がモノクローナル抗体であり、標識剤としてペル
オキシダーゼを用いこれと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いることを特徴とす
るヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法、および （２）、ペルオキシダーゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの、およびペルオキシダ
ーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せず
ヒト癌胎児性抗原に反応する抗体を担体上に保持したも
のであって、該２種の抗体のうち少なくとも一方がモノ
クローナル抗体であるものを含有するヒト癌胎児性抗原
の免疫化学的測定用試薬である。
本発明におけるモノクローナル抗体は、ヒト癌胎児性抗
原を含有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含
む中性塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で
免疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融
合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクロー
ナル抗体であることがさらに好ましい。
原を含有する癌化組織から、非イオン性界面活性剤を含
む中性塩溶液で抽出し、精製されたヒト癌胎児性抗原で
免疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ細胞との融
合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性モノクロー
ナル抗体であることがさらに好ましい。
また、本発明におけるペルオキダーゼと抗体との結合に
際し、ペルオキシダーゼにあらかじめチオール基を導入
したものを用いることがさらに好ましい。
際し、ペルオキシダーゼにあらかじめチオール基を導入
したものを用いることがさらに好ましい。
本発明において用いられる担体上に保持された抗体にお
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロー
スゲル〔例、セフアロース4B,セフアロース6B（フアル
マシア・フアインケミカル社（スエーデン）製〕，デキ
ストランゲル〔例、セフアデックスＧ−75,セファデッ
クスＧ−100,セファデックスＧ−200（フアルマシア・
フアインケミカル社製）〕，ポリアクリルアミドゲル
〔例、バイオゲルＰ−30,バイオゲルＰ−60,バイオゲル
Ｐ−100（バイオラッド・ラボラトリーズ社（米
国））〕，セルロース粒子〔例、アビセル（旭化成
製），イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチ
ルセルロース，カルボキシメチルセルロース）〕，物理
的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球，ガラスロッド，
アミノアルキルガラス球，アミノアルキルガラスロッ
ド），シリコン片，スチレン系樹脂（例、ポリスチレン
球，ポリスチレン粒子），イムノアッセイ用プレート
（例、ヌンク社（デンマーク）製）〕，イオン交換樹脂
｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR
C−50（ローム・アンド・ハース社（米国）製），ゼオ
カーブ226（パームチット社（西ドイツ）製）〕，弱塩
基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR−4B,ダ
ウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕｝などが
挙げられる。
ける担体としては、たとえば、ゲル粒子（例、アガロー
スゲル〔例、セフアロース4B,セフアロース6B（フアル
マシア・フアインケミカル社（スエーデン）製〕，デキ
ストランゲル〔例、セフアデックスＧ−75,セファデッ
クスＧ−100,セファデックスＧ−200（フアルマシア・
フアインケミカル社製）〕，ポリアクリルアミドゲル
〔例、バイオゲルＰ−30,バイオゲルＰ−60,バイオゲル
Ｐ−100（バイオラッド・ラボラトリーズ社（米
国））〕，セルロース粒子〔例、アビセル（旭化成
製），イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチ
ルセルロース，カルボキシメチルセルロース）〕，物理
的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球，ガラスロッド，
アミノアルキルガラス球，アミノアルキルガラスロッ
ド），シリコン片，スチレン系樹脂（例、ポリスチレン
球，ポリスチレン粒子），イムノアッセイ用プレート
（例、ヌンク社（デンマーク）製）〕，イオン交換樹脂
｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR
C−50（ローム・アンド・ハース社（米国）製），ゼオ
カーブ226（パームチット社（西ドイツ）製）〕，弱塩
基性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIR−4B,ダ
ウエックス３（ダウケミカル社（米国）製）〕｝などが
挙げられる。
担体に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し
得るが、たとえば“代謝",第８巻（1971年），第696頁
に記載されているブロムシアン法，グルタルアルデヒド
法などが挙げられる。また、より簡易な方法として物理
的に担体表面に吸着させてもよい。
得るが、たとえば“代謝",第８巻（1971年），第696頁
に記載されているブロムシアン法，グルタルアルデヒド
法などが挙げられる。また、より簡易な方法として物理
的に担体表面に吸着させてもよい。
本発明で用いられる抗体としてはモノクローナル抗CEA
抗体もしくはポリクローナル抗CEA抗体が用いられる。
抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自体公
知の方法〔Krupeyら，イムノケミストリー（Immunochem
istry ），第９巻（1972年），第617頁〕で精製したCE
A,更に望ましくは，ヒト癌組織から非イオン性界面活性
剤を含む中性塩溶液により抽出，精製されたCEA画分が
用いられる。
抗体もしくはポリクローナル抗CEA抗体が用いられる。
抗体の製造における免疫に用いる抗原としては、自体公
知の方法〔Krupeyら，イムノケミストリー（Immunochem
istry ），第９巻（1972年），第617頁〕で精製したCE
A,更に望ましくは，ヒト癌組織から非イオン性界面活性
剤を含む中性塩溶液により抽出，精製されたCEA画分が
用いられる。
ヒト癌化組織としてはCEAを含有するヒト癌化組織なら
いずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組織
が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階の
大腸癌組織を用いることができるが、デュークス（Duke
s）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。
いずれでも用いることができるが、特にヒト大腸癌組織
が望ましい。ヒト大腸癌組織としては、あらゆる段階の
大腸癌組織を用いることができるが、デュークス（Duke
s）ＣもしくはＤの段階のものが望ましい。
非イオン性界面活性剤としては、細胞成分を可溶化でき
るものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオキ
シド系非イオン界面活性剤〔例、Tween 20,Tween 40,Tw
een 80,Triton N−101,Triton X−100,Lobrol WX,Briji
96など、シグマ社（米国）製〕が用いられる。
るものならばいずれでも良いが、とりわけエチレンオキ
シド系非イオン界面活性剤〔例、Tween 20,Tween 40,Tw
een 80,Triton N−101,Triton X−100,Lobrol WX,Briji
96など、シグマ社（米国）製〕が用いられる。
中性塩としてはたとえば塩化ナトリウム，塩化カリウ
ム，硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化
組織あたり、約１ないし10倍量の約0.1ないし４％エチ
レンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約0.05Mない
し3M塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽出用溶媒
として用いることが好ましい。
ム，硫酸ナトリウムなどが良好に用いられる。ヒト癌化
組織あたり、約１ないし10倍量の約0.1ないし４％エチ
レンオキシド系非イオン界面活性剤を含む約0.05Mない
し3M塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムを抽出用溶媒
として用いることが好ましい。
更にCEAの抽出に際しては、抽出効率を向上させるた
め、撹拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。
め、撹拌、振盪、超音波処理などを行なってもよい。
上記の方法で得られたCEA抽出液は自体公知の精製手段
（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロマ
トグラフィー、ゲル電気永動法）で更に精製することが
できる〔Immunochemistry,第９巻（1972年），第617
頁。Cancer Research,第35巻（1975年），第2928頁参
照〕。
（例、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティ・クロマ
トグラフィー、ゲル電気永動法）で更に精製することが
できる〔Immunochemistry,第９巻（1972年），第617
頁。Cancer Research,第35巻（1975年），第2928頁参
照〕。
これらの精製手段によりCEAの純度を蛋白量あたり約数
パーセントから数10パーセントまでに濃縮することがで
きる。
パーセントから数10パーセントまでに濃縮することがで
きる。
モノクローナル抗CEA抗体はMilstein らの方法〔ネイチ
ュア（Nature），第256巻（1975年），第495頁〕と同様
の方法で作製することができる。例えば、上記精製CEA
を抗原として免疫して得られたマウス脾細胞とマウスの
ミエローマ細胞とを融合させることにより、モノクロー
ナル抗CEA抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）
を作製することができる。
ュア（Nature），第256巻（1975年），第495頁〕と同様
の方法で作製することができる。例えば、上記精製CEA
を抗原として免疫して得られたマウス脾細胞とマウスの
ミエローマ細胞とを融合させることにより、モノクロー
ナル抗CEA抗体を分泌する融合細胞（ハイブリドーマ）
を作製することができる。
すなわち、ハイブリドーマは精製CEAであらかじめ免疫
しておいたマウス（たとえばBALB/C系）から得られた脾
細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（たとえばNS−1,
PS−U1など）とを細胞融合剤（たとえばポリエチレング
リコール，センダウィルスなど）の存在下で混合し、融
合、培養することによって得られる。脾細胞とミエロー
マ細胞との混合比は1:1ないし10:1程度が有利に用いら
れる。
しておいたマウス（たとえばBALB/C系）から得られた脾
細胞と、同系マウスのミエローマ細胞（たとえばNS−1,
PS−U1など）とを細胞融合剤（たとえばポリエチレング
リコール，センダウィルスなど）の存在下で混合し、融
合、培養することによって得られる。脾細胞とミエロー
マ細胞との混合比は1:1ないし10:1程度が有利に用いら
れる。
ハイブリドーマはヒポキサンチン−アミノプチリン−チ
ミジン培地〔HAT培地：ネイチュアー，第256巻（1975
年），第495頁〕等を用いて選択的に増殖させることが
できる。
ミジン培地〔HAT培地：ネイチュアー，第256巻（1975
年），第495頁〕等を用いて選択的に増殖させることが
できる。
細胞培養液中に目的とする抗体が含まれているかどうか
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。CEAに特異性の高い抗体を産生するハイ
ブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロー
ン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通常
の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させることが
できる。ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによる塩析、
DEAEセルロースカラムクロマトグラフィーなど）により
濃縮精製される。
については自体公知の酵素免疫測定法を用いて検定する
ことができる。CEAに特異性の高い抗体を産生するハイ
ブリドーマはさらに通常の限界希釈法によりモノクロー
ン化される。得られた目的とするハイブリドーマは通常
の液体培地または哺乳動物の腹腔内で増殖させることが
できる。ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体
は公知の方法（たとえば硫酸アンモニウムによる塩析、
DEAEセルロースカラムクロマトグラフィーなど）により
濃縮精製される。
モノクローナル抗体はCEAに対して反応性が高く、正常
組織や非担癌患者由来の試料に対しては反応性がはるか
に小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイッチ法
によるEIA用として２種類のモノクローナル抗体が用い
られる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異なって
いるものが選ばれる。
組織や非担癌患者由来の試料に対しては反応性がはるか
に小さい性質を有する抗体が選ばれる。サンドイッチ法
によるEIA用として２種類のモノクローナル抗体が用い
られる場合、それぞれの抗体の抗原決定部位が異なって
いるものが選ばれる。
ポリクローナル抗CEA抗体は通常の方法で調製すること
ができる。即ち、精製CEAがヒト以外の温血動物に接種
される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば哺乳温
血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモ
ット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハ
ト、アヒル，ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該
抗原をヒト以外の温血動物に接種する方法としては、動
物に接種する抗原は抗体を産生するに有効な量でよく、
たとえばウサギに１回約0.1〜10mgを等容量（1ml）の生
理食塩水およびフロインドの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。
ができる。即ち、精製CEAがヒト以外の温血動物に接種
される。ヒト以外の温血動物としては、たとえば哺乳温
血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモ
ット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ、ハ
ト、アヒル，ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる。該
抗原をヒト以外の温血動物に接種する方法としては、動
物に接種する抗原は抗体を産生するに有効な量でよく、
たとえばウサギに１回約0.1〜10mgを等容量（1ml）の生
理食塩水およびフロインドの完全アジュバントで乳化し
て、背部ならびに後肢掌皮下に４週間おきに５回接種す
ると抗体を産生させ得る場合が多い。
このようにして、温血動物中に形成された抗体を採取す
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から12日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して血
清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に従
って塩析し、通常、CEAを保持させた担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収する
ことによりポリクローナル抗CEA抗体を精製することが
できる。
る方法としては、たとえばウサギでは、通常最終接種後
７日から12日の間に耳静脈から採血し、遠心分離して血
清として得られる。得られた抗血清は、公知の方法に従
って塩析し、通常、CEAを保持させた担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収する
ことによりポリクローナル抗CEA抗体を精製することが
できる。
本発明で用いられる２種の抗体は、モノクローナル抗CE
A抗体でもポリクローナル抗CEA抗体であってもよいが、
少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが好まし
い。また、抗体分子はIgG,F（ab′）２もしくはFab′で
あってもよい。
A抗体でもポリクローナル抗CEA抗体であってもよいが、
少なくとも一方がモノクローナル抗体であるのが好まし
い。また、抗体分子はIgG,F（ab′）２もしくはFab′で
あってもよい。
このようにして得られた抗CEAモノクローナル抗体は、C
EAのサンドイッチ法によるEIAにおける試薬として用い
ることができる。
EAのサンドイッチ法によるEIAにおける試薬として用い
ることができる。
標識剤であるペルオキシダーゼとしては、種々の起源の
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび，パイナップル，イチジク，甘諸，ソラマ
メ，トウモコロコシなどから得られるペルオキシダーゼ
が挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラデ
ィッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidas
e）（HRP）が好ましい。
ものを用いることができるが、その例としてはたとえば
西洋わさび，パイナップル，イチジク，甘諸，ソラマ
メ，トウモコロコシなどから得られるペルオキシダーゼ
が挙げられ、特に西洋わさびから抽出されたホースラデ
ィッシュ・ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidas
e）（HRP）が好ましい。
ペルオキシダーゼと抗体とを化合物〔Ｉ〕で結合するに
あたり、あらかじめペルオキシダーゼにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。
あたり、あらかじめペルオキシダーゼにチオール基を導
入したものを用いると好都合である。
チオール基をペルオキシダーゼに導入する方法として
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してチオール基を
導入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカ
プトサクシニックアンハイドライド（AMSAと略称するこ
ともある;S−acetyl mercaptosuccinic anhydride）,N
−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート〔SPDPと略称することもある;N−succinimidyl3
−（２−pyridyldithio）popionate〕など通常のチオー
ル基導入試薬が有利に用いられる。
は、ペルオキシダーゼのアミノ基を介してチオール基を
導入することができる。たとえば、Ｓ−アセチルメルカ
プトサクシニックアンハイドライド（AMSAと略称するこ
ともある;S−acetyl mercaptosuccinic anhydride）,N
−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート〔SPDPと略称することもある;N−succinimidyl3
−（２−pyridyldithio）popionate〕など通常のチオー
ル基導入試薬が有利に用いられる。
したがって、チオール基をペルオキシダーゼとの間に一
定の基が入っていることとなってもよい。
定の基が入っていることとなってもよい。
AMSAを用いる場合、ペルオキシダーゼ約0.1ないし10mg
を中性の緩衝液（たとえば0.1Mリン酸緩衝液）約0.2な
いし2mlに溶解し、約0.1ないし4mgのAMSAを約0.01ない
し0.1mlかN,N−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、
約10〜120分間、約４〜35℃で反応させる。次に約0.2〜
2Mヒドロキシルアミンを加えて約４〜35℃で約１〜60分
間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製してチオー
ル化ペルオキシダーゼを得ることができる。
を中性の緩衝液（たとえば0.1Mリン酸緩衝液）約0.2な
いし2mlに溶解し、約0.1ないし4mgのAMSAを約0.01ない
し0.1mlかN,N−ジメチルホルムアミドに溶解して加え、
約10〜120分間、約４〜35℃で反応させる。次に約0.2〜
2Mヒドロキシルアミンを加えて約４〜35℃で約１〜60分
間反応させ、ゲルクロマトグラフィーで精製してチオー
ル化ペルオキシダーゼを得ることができる。
SPDPを用いる場合、ペルオキシダーゼ約0.1ないし10mg
を中性の緩衝液（たとえば0.1Mリン酸緩衝液）約0.1〜1
mlに溶解し、約0.1〜3mgのSPDPのエタノール溶液を加え
て約４〜35℃で約10〜240分間反応させる。ゲルクロマ
トグラフィーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレ
イトール（dithiothreitol）などの還元用試薬を加えて
還元し、更にゲルクロマトグラフィーで精製してチオー
ル化ペルオキシダーゼを得ることができる。
を中性の緩衝液（たとえば0.1Mリン酸緩衝液）約0.1〜1
mlに溶解し、約0.1〜3mgのSPDPのエタノール溶液を加え
て約４〜35℃で約10〜240分間反応させる。ゲルクロマ
トグラフィーで過剰の試薬を除去したのち、ジチオスレ
イトール（dithiothreitol）などの還元用試薬を加えて
還元し、更にゲルクロマトグラフィーで精製してチオー
ル化ペルオキシダーゼを得ることができる。
ペルオキシダーゼと抗体とを結合させる化合物として、
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれでもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば1,2−,1,3−,1,4−シクロ
ヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６員環状炭化水
素残基の例としては、たとえば1,2−,1,3−,1,4−フェ
ニレンなどが挙げられる。
一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物を用いるが、上記式中、Ｒで表わされる２
価の６員環状炭化水素残基としては、飽和のもの、不飽
和のもののいずれでもよい。飽和の２価の６員環状炭化
水素の例としては、たとえば1,2−,1,3−,1,4−シクロ
ヘキシレンが挙げられ、不飽和の２価の６員環状炭化水
素残基の例としては、たとえば1,2−,1,3−,1,4−フェ
ニレンなどが挙げられる。
該化合物〔Ｉ〕において、ｎとしては１ないし５の整数
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６員
環状炭化水素残基が好ましく、特に1,4−シクロヘキシ
レンが好ましい。
が好ましく、特に１が好ましい。Ｒとしては２価の６員
環状炭化水素残基が好ましく、特に1,4−シクロヘキシ
レンが好ましい。
本発明の方法において用いられる化合物〔Ｉ〕は、たと
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（The
Journal of Biochemistry）第79巻233頁（1976年），ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）第101巻395頁
（1979年）、特開昭52−85163号公報、特開昭52−85164
号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製
造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。ｎおよ
びＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマレイミ
ド化合物〔II〕と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示
す。〕で表わされるサクシンイミド化合物〔III〕とを
脱水剤あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより
製造することができる。上記一般式において、ハロゲン
原子としては塩素，臭素などが挙げられ、アルカリ金属
原子としてはたとえばナトリム，カリウムなどが挙げら
れる。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、
硫酸，ジシクロヘキシルカルボジイミドなどが、脱酸剤
としてはたとえばピリジン，トリエチルアミンなどが挙
げられる。
えばザ・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（The
Journal of Biochemistry）第79巻233頁（1976年），ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）第101巻395頁
（1979年）、特開昭52−85163号公報、特開昭52−85164
号公報等に記載の方法あるいはこれらの方法に準じて製
造することができる。たとえば、一般式 〔式中、Ｘは水酸基またはハロゲン原子を示す。ｎおよ
びＲは前記と同意義を有する。〕で表わされるマレイミ
ド化合物〔II〕と一般式 〔式中、Ｙは水素原子またはアルカリ金属原子を示
す。〕で表わされるサクシンイミド化合物〔III〕とを
脱水剤あるいは脱酸剤の存在下で反応させることにより
製造することができる。上記一般式において、ハロゲン
原子としては塩素，臭素などが挙げられ、アルカリ金属
原子としてはたとえばナトリム，カリウムなどが挙げら
れる。また反応に用いられる脱水剤としてはたとえば、
硫酸，ジシクロヘキシルカルボジイミドなどが、脱酸剤
としてはたとえばピリジン，トリエチルアミンなどが挙
げられる。
前記化合物〔II〕は、たとえば特開昭52−85164号公報
に記載の方法あるいはこれに準じて製造することができ
る。たとえば一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物〔IV〕を脱水閉環せしめることにより得ら
れる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水酢酸
又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、温和
に加熱することにより反応させることができる。
に記載の方法あるいはこれに準じて製造することができ
る。たとえば一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
される化合物〔IV〕を脱水閉環せしめることにより得ら
れる。該脱水閉環させるには、脱水剤たとえば無水酢酸
又は無水酢酸と酢酸ナトリウム（無水物）を用い、温和
に加熱することにより反応させることができる。
さらに別法として、ヘルベティカ・キミカ・アクタ（He
lvetica Chimica Acta）第58巻（1975年）531頁に記載
されている方法あるいはこれに準じて製造することがで
きる。たとえば、一般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔Ｖ〕と、一般式 NH2（CH2）nRCOOH 〔VI〕 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるアミノ酸〔VI〕とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔VII〕を得る。次に一般式〔I
II〕で表わされるサクシンイミド化合物〔III〕を加え
先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下で反
応させることにより製造することができる。
lvetica Chimica Acta）第58巻（1975年）531頁に記載
されている方法あるいはこれに準じて製造することがで
きる。たとえば、一般式 〔式中、Ｚはアルキル基を示す〕で表わされるＮ−アル
コキシカルボニルマレイミド〔Ｖ〕と、一般式 NH2（CH2）nRCOOH 〔VI〕 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕 で表わされるアミノ酸〔VI〕とを反応させて、一般式 〔式中、ｎおよびＲは前記と同意義を有する。〕で表わ
されるマレイミド化合物〔VII〕を得る。次に一般式〔I
II〕で表わされるサクシンイミド化合物〔III〕を加え
先に述べたと同様の脱水剤もしくは脱酸剤の存在下で反
応させることにより製造することができる。
上記一般式〔Ｖ〕で表わされる化合物においてＺで表わ
されるアルキルとしては、たとえばメチル，エチルが挙
げられる。
されるアルキルとしては、たとえばメチル，エチルが挙
げられる。
ペルオキシダーゼに化合物〔Ｉ〕を反応させるには、両
者をpH約６ないし８の緩衝液中で約10ないし50℃の温度
で約10分ないし24時間反応させることによって行なわれ
る。該緩衝液としては、たとえばpH7.0の0.1Mリン酸緩
衝液,pH6.3の0.05Mリン酸緩衝液などが挙げられる。
者をpH約６ないし８の緩衝液中で約10ないし50℃の温度
で約10分ないし24時間反応させることによって行なわれ
る。該緩衝液としては、たとえばpH7.0の0.1Mリン酸緩
衝液,pH6.3の0.05Mリン酸緩衝液などが挙げられる。
このようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼ
の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセファデックス
Ｇ−25〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕，バイオゲルＰ−２〔バイオ・ラッド・ラボラ
トリーズ社（米国）製〕などが挙げられる。
の精製は、たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより
行なうことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行な
う際に用いられる担体としてはたとえばセファデックス
Ｇ−25〔ファルマシア・ファインケミカル社（スエーデ
ン）製〕，バイオゲルＰ−２〔バイオ・ラッド・ラボラ
トリーズ社（米国）製〕などが挙げられる。
マレイミド化ペルオキシダーゼを抗CEA抗体と反応させ
る場合、抗CEA抗体IgGあるいはペプシン分解して得られ
たＦ（ab′）２画分を、メルカプトエチルアミン類の存
在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによって精製さ
れた抗CEA抗体IgGもしくはFab′とマレイミド化ペルオ
キシダーゼとを反応させる。
る場合、抗CEA抗体IgGあるいはペプシン分解して得られ
たＦ（ab′）２画分を、メルカプトエチルアミン類の存
在下で還元し、ゲルクロマトグラフィーによって精製さ
れた抗CEA抗体IgGもしくはFab′とマレイミド化ペルオ
キシダーゼとを反応させる。
該反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃の温度
で、約１ないし48時間反応させることにより行なうこと
ができる。該緩衝液としては、たとえばpH6.0の5mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝
液などが挙げられる。
で、約１ないし48時間反応させることにより行なうこと
ができる。該緩衝液としては、たとえばpH6.0の5mMエチ
レンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝
液などが挙げられる。
このようにして得られたペルオキシダーゼ標識抗体は、
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲルAcA44〔LKB社（フラ
ンス）製〕，セファクリルＳ−200〔ファルマシア・フ
ァインケミカル（スエーデン）製〕などが挙げられる。
たとえばゲルクロマトグラフィーなどにより精製するこ
とができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる担
体としては、たとえばウルトロゲルAcA44〔LKB社（フラ
ンス）製〕，セファクリルＳ−200〔ファルマシア・フ
ァインケミカル（スエーデン）製〕などが挙げられる。
作用 本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。
まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきCEA含
有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これに
前記で得られたペルオキシダーゼと抗CEA抗体との結合
物を加えて反応させる。
有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後これに
前記で得られたペルオキシダーゼと抗CEA抗体との結合
物を加えて反応させる。
本発明の酵素免疫測定法において測定対象となるCEAを
含む被検試料としては、尿，血清，血漿，髄液あるいは
各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿，血清および
血漿が繁用される。
含む被検試料としては、尿，血清，血漿，髄液あるいは
各種臓器抽出物等が挙げられ、とりわけ尿，血清および
血漿が繁用される。
：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
：上記−の操作を既知量のCEAの標準溶液に対し
予め行ない、CEAと吸光度もしくは蛍光強度との関係を
標準曲線として作成しておく。
予め行ない、CEAと吸光度もしくは蛍光強度との関係を
標準曲線として作成しておく。
：未知量のCEAを含む分析対象物について得られた吸
光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象
物中のCEA含量を測定する。
光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対象
物中のCEA含量を測定する。
本発明のサンドイッチ法によるCEAの免疫化学的測定法
に用いられる定量用キットとしては、 〔Ａ〕主として、 （１） 担体上に保持された抗CEA抗体 （２） 本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（化合物〔Ｉ〕を用いて結合さ
れている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
に用いられる定量用キットとしては、 〔Ａ〕主として、 （１） 担体上に保持された抗CEA抗体 （２） 本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（化合物〔Ｉ〕を用いて結合さ
れている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
（３） 標準CEA （４） 上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、BS
Aと略称することもある。）を含むpH約６ないし９のリ
ン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）， （５） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％牛血清および約１％牛血清アルブミン（以下、BS
Aと略称することもある。）を含むpH約６ないし９のリ
ン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。）， （５） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。
が挙げられる。
〔Ｂ〕主として、 （１） 担体上に保持された抗CEA抗体， （２） 本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗CEA抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合され
ている。）， （３） 標準CEA, （４） 上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以
下、BSAと略称することもある。）を含むpH約６ないし
９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。）， （５） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。
標識化された抗CEA抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗CEA抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合され
ている。）， （３） 標準CEA, （４） 上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以
下、BSAと略称することもある。）を含むpH約６ないし
９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。）， （５） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。
が挙げられる。
さらに〔Ｃ〕主として、 （１） 担体上に保持された抗CEA抗体， （２） 本発明方法により得られたペルオキシダーゼで
標識化された抗CEA抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗CEA抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合され
ている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
標識化された抗CEA抗体（チオール化されたペルオキシ
ダーゼと抗CEA抗体とが化合物〔Ｉ〕を用いて結合され
ている。） 上記（１）および（２）の２種の抗体のうち少なくとも
一方はモノクローナル抗体である。
（３） 標準CEA, （４） 上記（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以
下、BSAと略称することもある。）を含むpH約６ないし
９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。） （５） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。
釈に用いる緩衝液（血清と蛋白性物質とを共存せしめた
約10％ヒツジ血清および約１％牛血清アルブミン（以
下、BSAと略称することもある。）を含むpH約６ないし
９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。） （５） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬。その
一例として蛍光法の場合、酵素基質としてｐ−ハイドロ
キシフエニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、ｏ−フ
エニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用い
る緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停
止液。
が挙げられる。
上記のキットは例えば下記の方法により使用することが
できる。
できる。
標準CEAもしくは比検液約10ないし200μｌに試薬（４）
を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて約０ない
し40℃で約１ないし48時間反応させる。担体を水洗後、
試薬（２）の約10ないし300μｌを加えたのち、約０な
いし40℃で反応させる。約１ないし48時間反応後、担体
を洗浄し担体上に結合しているペルオキシダーゼ活性を
測定する。即ちペルオキシダーゼの基質液約10〜1000μ
ｌを加えて約20〜40℃で約0.2〜24時間反応させたの
ち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは蛍
光強度を測定する。
を加えて希釈し、一定量の試薬（１）を加えて約０ない
し40℃で約１ないし48時間反応させる。担体を水洗後、
試薬（２）の約10ないし300μｌを加えたのち、約０な
いし40℃で反応させる。約１ないし48時間反応後、担体
を洗浄し担体上に結合しているペルオキシダーゼ活性を
測定する。即ちペルオキシダーゼの基質液約10〜1000μ
ｌを加えて約20〜40℃で約0.2〜24時間反応させたの
ち、酵素反応を停止させ、反応液中の吸光度もしくは蛍
光強度を測定する。
本発明の免疫化学的分析法用試薬を用いれば、通常の臨
床検査室において簡単な操作でCEAの高感度測定が可能
となる。
床検査室において簡単な操作でCEAの高感度測定が可能
となる。
実施例 参考例１ 過塩素酸抽出法による精製およびモノクロー
ナル抗体の作製 （１） 抗原の精製 Krupeyらの方法〔イムノケミストリー（Immuno-Chemist
ry），第９巻（1972年），第617頁〕に準じてCEAを精製
した。すなわち大腸癌組織100gを細断し、これに400ml
の蒸留水を加えてホモジナイザーで氷冷下１時間破砕し
て懸濁液を調製した。次に、等容量の2M過塩素酸を加え
て室温で30分間撹拌して抽出した。次に遠心分離し、そ
の上清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し
た。次に0.15MNaClを含む0.05Mリン酸緩衝液を用いてセ
ファロース4B〔ファルマシア製（スエーデン）〕のカラ
ム（2.3cm×100cm）にかけてゲルクロマトグラフィーを
行なった。CEAを含むフラクションを透析し、凍結乾燥
後、更にセファデックスＧ−200のカラム（2.3cm×100c
m）でゲルクロマトグラフィーを行ない、CEA溶出画分を
透析、凍結乾燥してCEAの精製抗原を得た（3mg）。
ナル抗体の作製 （１） 抗原の精製 Krupeyらの方法〔イムノケミストリー（Immuno-Chemist
ry），第９巻（1972年），第617頁〕に準じてCEAを精製
した。すなわち大腸癌組織100gを細断し、これに400ml
の蒸留水を加えてホモジナイザーで氷冷下１時間破砕し
て懸濁液を調製した。次に、等容量の2M過塩素酸を加え
て室温で30分間撹拌して抽出した。次に遠心分離し、そ
の上清について蒸留水に対して透析したのち凍結乾燥し
た。次に0.15MNaClを含む0.05Mリン酸緩衝液を用いてセ
ファロース4B〔ファルマシア製（スエーデン）〕のカラ
ム（2.3cm×100cm）にかけてゲルクロマトグラフィーを
行なった。CEAを含むフラクションを透析し、凍結乾燥
後、更にセファデックスＧ−200のカラム（2.3cm×100c
m）でゲルクロマトグラフィーを行ない、CEA溶出画分を
透析、凍結乾燥してCEAの精製抗原を得た（3mg）。
（２） モノクローナル抗CEA抗体の作製 前項（１）で得た精製抗原70μｇを生理食塩水150μｌ
に溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Freu
nd′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，第
26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μｌを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に投
与した。更に、２週毎に２回、フロインドの不完全アジ
ュバントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原130
μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｌを静脈投与
し、３日後膵臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fied MEM 培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×108
個とマウスミエローマ細胞（P3U1）２×107個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI−1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPMI−1640,15mlを徐々に加
えて希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞を
20％牛胎児血清を含むRPMI−1640培地100mlに分散させ
た。次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米
国）〕に上記細胞分散液2.0mlずつ注入し、更に２日目,
5日目，および８日目に培養上清の半量をHAT培地におき
かえた。14日後における培養上清について抗体価を測定
したところ、計120ウエル中12ウエルに陽性を認めた。
に溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Freu
nd′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，第
26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μｌを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に投
与した。更に、２週毎に２回、フロインドの不完全アジ
ュバントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原130
μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｌを静脈投与
し、３日後膵臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fied MEM 培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×108
個とマウスミエローマ細胞（P3U1）２×107個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI−1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPMI−1640,15mlを徐々に加
えて希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞を
20％牛胎児血清を含むRPMI−1640培地100mlに分散させ
た。次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米
国）〕に上記細胞分散液2.0mlずつ注入し、更に２日目,
5日目，および８日目に培養上清の半量をHAT培地におき
かえた。14日後における培養上清について抗体価を測定
したところ、計120ウエル中12ウエルに陽性を認めた。
次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清20％およびBALB/Cマウス胸腺細胞をフィーダー
（feeder）として加えた。RPMI−1640培地で希釈し、限
界希釈（lim-iting dilution）法を繰り返して行ない最
終的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する12種類の
ハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処理された
BALB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を
採取することにより、モノクローナル抗CEA抗体を得
た。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法
で塩析し、それぞれグロブリン画分を得た（M0〜K1〜M0
〜K12）。
児血清20％およびBALB/Cマウス胸腺細胞をフィーダー
（feeder）として加えた。RPMI−1640培地で希釈し、限
界希釈（lim-iting dilution）法を繰り返して行ない最
終的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する12種類の
ハイブリドーマが得られた。これらを鉱油で処理された
BALB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を
採取することにより、モノクローナル抗CEA抗体を得
た。これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法
で塩析し、それぞれグロブリン画分を得た（M0〜K1〜M0
〜K12）。
参考例２ 過ヨウ素酸架橋法 仲根らの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミスト
リー・アンド・サイトケミストリー（The Journal of H
istochemistry and Cytoche-mistry）第22巻（1974年）
第1084頁〕に従って行なった。7mgの西洋わさびペルオ
キシダーゼを1mlの0.3M重炭酸ナトリウム溶液（pH8.1）
にとかし、0.1mlの１％１−フルオロー2,4−ジニトロベ
ンゼンを加えて室温で１時間反応させた。次に0.06MNaI
O4 1mlを加えて室温で30分間撹拌したのち、0.16Mエチ
レングリコール水溶液1mlを加えて室温で１時間放置し
た。0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）に対して１夜
透析した。
リー・アンド・サイトケミストリー（The Journal of H
istochemistry and Cytoche-mistry）第22巻（1974年）
第1084頁〕に従って行なった。7mgの西洋わさびペルオ
キシダーゼを1mlの0.3M重炭酸ナトリウム溶液（pH8.1）
にとかし、0.1mlの１％１−フルオロー2,4−ジニトロベ
ンゼンを加えて室温で１時間反応させた。次に0.06MNaI
O4 1mlを加えて室温で30分間撹拌したのち、0.16Mエチ
レングリコール水溶液1mlを加えて室温で１時間放置し
た。0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）に対して１夜
透析した。
後述の実施例１−（２）で得られたモノクローナル抗CE
A抗体ガンマ・グロブリンフラクション（Mo−T3）5mgを
0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）1mlにとかし、先
に調製したアルデヒドペルオキシダーゼと混合して室温
で３時間反応させてから、5mgの水素化硼素ナトリウム
に加えて４℃で１夜反応させた。0.15MNaClを含む0.01M
リン酸緩衝液（pH7.1）に対して４℃で１夜透析した
後、ウルトロゲルAcA44を充てんしたカラム（1.5cm×45
cm）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.5）で溶出させた。後述の実施例１−
（５）と同様に溶出液の280および403nmの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗CEA抗体−HRP複合体はBSAとし
て0.1％、マーチオレートとして0.005％になるようにし
て４℃で保存した。
A抗体ガンマ・グロブリンフラクション（Mo−T3）5mgを
0.01M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.5）1mlにとかし、先
に調製したアルデヒドペルオキシダーゼと混合して室温
で３時間反応させてから、5mgの水素化硼素ナトリウム
に加えて４℃で１夜反応させた。0.15MNaClを含む0.01M
リン酸緩衝液（pH7.1）に対して４℃で１夜透析した
後、ウルトロゲルAcA44を充てんしたカラム（1.5cm×45
cm）を用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン
酸緩衝液（pH6.5）で溶出させた。後述の実施例１−
（５）と同様に溶出液の280および403nmの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗CEA抗体−HRP複合体はBSAとし
て0.1％、マーチオレートとして0.005％になるようにし
て４℃で保存した。
実施例 １ （１） 抗原の精製 大腸癌組織200gを細断し、これに600mlの１％Tween20
〔シグマ社（米国）製〕を含む0.15MNaCl溶液を加えて
ホモジナイザーで氷冷下10分間破砕して懸濁液を調製し
た。さらに超音波発生機で氷冷下１時間処理したのち、
12,000rpm20分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して
透析したのち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液
（pH6.5）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セファロース4B〔ファルマシア製（ス
エーデン）〕のカラム（2.2cm×26cm）にかけた。カラ
ムに保持された物質をα−メチル−Ｄ−マンノサイドを
含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留水に対して透析した
のち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液（pH6.5）
を用いてウルトロゲルAcA−34〔LKB社製（フランス）〕
のカラム（2.3cm×100cm）にかけてゲルクロマトグラフ
ィーを行ない、280〜350mlの画分を蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥してCEAの精製抗原を得た（5mg）。
〔シグマ社（米国）製〕を含む0.15MNaCl溶液を加えて
ホモジナイザーで氷冷下10分間破砕して懸濁液を調製し
た。さらに超音波発生機で氷冷下１時間処理したのち、
12,000rpm20分間遠心分離した。上清を蒸留水に対して
透析したのち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液
（pH6.5）に溶解し、同じ緩衝液を用いて調製したコン
カナバリンＡ結合セファロース4B〔ファルマシア製（ス
エーデン）〕のカラム（2.2cm×26cm）にかけた。カラ
ムに保持された物質をα−メチル−Ｄ−マンノサイドを
含む緩衝液を用いて溶出した。蒸留水に対して透析した
のち凍結乾燥した。次に0.2Mクエン酸緩衝液（pH6.5）
を用いてウルトロゲルAcA−34〔LKB社製（フランス）〕
のカラム（2.3cm×100cm）にかけてゲルクロマトグラフ
ィーを行ない、280〜350mlの画分を蒸留水に対して透析
し、凍結乾燥してCEAの精製抗原を得た（5mg）。
（２） モトクローナル抗CEA抗体の作製 前項（１）で得た精製抗原70μｇを生理食塩水150μｌ
に溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Freu
nd′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，第
26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μｌを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に投
与した。更に、２週毎に２回、フロインドの不完全アジ
ュバントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原130
μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｌに静脈投与
し、３日後脾臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fiedMEM培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×108個
とマウスミエローマ細胞（P3U1）２×107個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI−1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPMI−1640 15mlを徐々に
加えて希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞
を20％牛胎児血清を含むRPMI−1640培地100mlに分散さ
せた。次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米
国）〕に上記細胞分散液2.0mlずつ注入し、更に２日目,
5日目，および８日目に培養上清の半量をHAT培地におき
えた。14日後における培養上清について抗体価を測定し
たところ、計72ウエル中９ウエルに陽性を認めた。
に溶解し、これにフロインドの完全アジュバント〔Freu
nd′s complete adjuvant,“免疫の生化学",橘ら著，第
26頁，共立出版株式会社（1967年）〕250μｌを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをBALB/Cマウス皮下に投
与した。更に、２週毎に２回、フロインドの不完全アジ
ュバントを用いて免疫し、最終免疫として精製抗原130
μｇを生理食塩水に溶解して得た400μｌに静脈投与
し、３日後脾臓を取り出した。次に、Dulbecco′s modi
fiedMEM培地でよく洗浄したのち、当該脾細胞１×108個
とマウスミエローマ細胞（P3U1）２×107個とを混合
し、700rpmで15分間遠心してペレットをつくった。次に
ポリエチレングリコール6000をRPMI−1640に45％に溶解
した液0.4mlを加えて、更にRPMI−1640 15mlを徐々に
加えて希釈したのち、700rpmで15分間遠心分離し、細胞
を20％牛胎児血清を含むRPMI−1640培地100mlに分散さ
せた。次に24ウエルの培養プレート〔フロー社製（米
国）〕に上記細胞分散液2.0mlずつ注入し、更に２日目,
5日目，および８日目に培養上清の半量をHAT培地におき
えた。14日後における培養上清について抗体価を測定し
たところ、計72ウエル中９ウエルに陽性を認めた。
次に、これら陽性ハイブリドーマのクローニングを牛胎
児血清20％およびBALB/Cマウス胸腺細胞をフィーダー
（feeder）として加えたRPMI−1640培地で希釈し、限界
希釈（li-miting dilution）法を繰り返して行ない最終
的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する５種類のハ
イブリドーマが得られた。これらを鉱油で処理されたBA
LB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採
取することにより、モノクローナル抗CEA抗体を得た。
これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法で塩
析し、それぞれグロブリン画分を得た（M0−T1〜M0−
T6）。
児血清20％およびBALB/Cマウス胸腺細胞をフィーダー
（feeder）として加えたRPMI−1640培地で希釈し、限界
希釈（li-miting dilution）法を繰り返して行ない最終
的にはモノクローナル抗CEA抗体を産生する５種類のハ
イブリドーマが得られた。これらを鉱油で処理されたBA
LB/Cマウスの腹腔内に注入し、２〜３週間後に腹水を採
取することにより、モノクローナル抗CEA抗体を得た。
これらのモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム法で塩
析し、それぞれグロブリン画分を得た（M0−T1〜M0−
T6）。
（３） ポリクローナル抗CEA抗体の作製 前項（１）で得た精製抗原2mgを生理食塩水1mlに溶解
し、これにフロインドの完全アジュバント1mlを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをウサギの両太腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週
毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得
た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を調
製したのち、CEA結合セファロース4Bのカラムを用いる
アフィニティ・クロマトグラフィーに供した。カラムの
保持された抗体画分を0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（pH
2.3）で溶出することにより、CEAに強い親和性を有する
ポリクローナル抗体を得た。
し、これにフロインドの完全アジュバント1mlを加えて
よく混和して乳剤を作り、これをウサギの両太腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射した。以上の操作を３週
毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血して抗血清を得
た。硫酸アンモニウム法で塩析してグロブリン画分を調
製したのち、CEA結合セファロース4Bのカラムを用いる
アフィニティ・クロマトグラフィーに供した。カラムの
保持された抗体画分を0.17Mグリシン−塩酸緩衝液（pH
2.3）で溶出することにより、CEAに強い親和性を有する
ポリクローナル抗体を得た。
（４） モノクローナル抗体の反応性の比較 前項（２）および参考例１で得られた各種モノクローナ
ル抗体のCEAおよび関連抗原に対する反応性を調べた。
ル抗体のCEAおよび関連抗原に対する反応性を調べた。
試薬： 前項（２）および参考例１で得られたモノクローナ
ル抗CEA抗体感作マイクロプレート 西洋わさびペルオキシダーゼ（以下HRPと略称す
る）標識抗CEA抗体複合体〔DAKO Biochemicals社（デン
マーク）製〕 CEAおよびCEA関連抗原 緩衝液Ｂ（10％子牛血清、0.15MNaClを含むpH7.0の
0.02Mリン酸緩衝液）、緩衝Ａ（0.15MNaClを含むpH7.0
の0.02Mリン酸緩衝液） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬0.02％過酸
化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含むpH4.8の
0.1Mクエン酸一リン酸二ナトリウム緩衝液および反応停
止液（2N−硫酸）。
ル抗CEA抗体感作マイクロプレート 西洋わさびペルオキシダーゼ（以下HRPと略称す
る）標識抗CEA抗体複合体〔DAKO Biochemicals社（デン
マーク）製〕 CEAおよびCEA関連抗原 緩衝液Ｂ（10％子牛血清、0.15MNaClを含むpH7.0の
0.02Mリン酸緩衝液）、緩衝Ａ（0.15MNaClを含むpH7.0
の0.02Mリン酸緩衝液） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬0.02％過酸
化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含むpH4.8の
0.1Mクエン酸一リン酸二ナトリウム緩衝液および反応停
止液（2N−硫酸）。
抗体感作マイクロプレートの調製： EIA用イムノプレートＩ〔ヌンク社（デンマーク）製〕
の各ウエルに0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）で希釈して調製
した前項（２）あるいは参考例１のモノクローナル抗CE
A抗体溶液（50μg/ml）を100μｌずつ注入して４℃で一
夜放置して感作させた。0.1％BSAを含む0.01Mリン酸緩
衝液（pH7.0）で洗浄したのち、用時まで冷所保存し
た。
の各ウエルに0.1M炭酸緩衝液（pH9.6）で希釈して調製
した前項（２）あるいは参考例１のモノクローナル抗CE
A抗体溶液（50μg/ml）を100μｌずつ注入して４℃で一
夜放置して感作させた。0.1％BSAを含む0.01Mリン酸緩
衝液（pH7.0）で洗浄したのち、用時まで冷所保存し
た。
測定： 緩衝液Ｂに溶解させたCEA標準溶液100μｌを各ウエルに
注入し、37℃で３時間反応させた。各ウエルを緩衝液Ａ
で洗浄後、HRP標識抗CEA複合体溶液（HRPとして30ng/ウ
エル）100μｌを加えて25℃で3.5時間さらに反応させ
た。緩衝液Ａで洗浄し、これに0.02％過酸化水素と0.15
％ｏ−フェニレンジアミンを含む0.1Mクエン酸一リン酸
二ナトリウム緩衝液（pH4.8）100μｌを加えて30℃で30
分間反応させ、2N−硫酸100μｌずつ加えて反応を停止
させてから、マイクロプレート用自動比色計〔タイター
テック・マルチスキャン；フロー社（米国）製〕を用
い、ブランクを対照にして490nmにおける吸光度を測定
した。
注入し、37℃で３時間反応させた。各ウエルを緩衝液Ａ
で洗浄後、HRP標識抗CEA複合体溶液（HRPとして30ng/ウ
エル）100μｌを加えて25℃で3.5時間さらに反応させ
た。緩衝液Ａで洗浄し、これに0.02％過酸化水素と0.15
％ｏ−フェニレンジアミンを含む0.1Mクエン酸一リン酸
二ナトリウム緩衝液（pH4.8）100μｌを加えて30℃で30
分間反応させ、2N−硫酸100μｌずつ加えて反応を停止
させてから、マイクロプレート用自動比色計〔タイター
テック・マルチスキャン；フロー社（米国）製〕を用
い、ブランクを対照にして490nmにおける吸光度を測定
した。
結果を第１表に示したが、前記（２）で得られたモノク
ローナル抗CEA抗体は、６抗体中４抗体でCEA関連抗原で
あるNCA（nonspecific cross-reacting antigen）やNCA
−２（nonspecicfic crossreacting antigen−２）と反
応せず、したがって高い確率でCEAに特異的なモノクロ
ーナル抗CEA抗体の得られることが分った。一方、参考
例１で得られたモノクローナル抗CEA抗体は12抗体中１
抗体（M0−K6）だけがNCAならびにNCA−２とは反応せず
残りの11抗体はこれらのCEA関連抗原と反応した。
ローナル抗CEA抗体は、６抗体中４抗体でCEA関連抗原で
あるNCA（nonspecific cross-reacting antigen）やNCA
−２（nonspecicfic crossreacting antigen−２）と反
応せず、したがって高い確率でCEAに特異的なモノクロ
ーナル抗CEA抗体の得られることが分った。一方、参考
例１で得られたモノクローナル抗CEA抗体は12抗体中１
抗体（M0−K6）だけがNCAならびにNCA−２とは反応せず
残りの11抗体はこれらのCEA関連抗原と反応した。
（５） ポリクローナル抗CEA抗体（Fab′）−HRP複合
体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 6mgの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガーマン
ハイム社（西ドイツ）製〕を1mlの0.1Mリン酸緩衝液（p
H7.0）に溶解し、50μｌのN,N−ジメチルホルムアミド
にとかした結合試薬MMC（一般式〔Ｉ〕において、ｎ＝
1,R＝シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを加えて30
℃で60分間撹拌しながら反応させた。生成した沈殿を遠
心分離して除去し、上清をセフアデックスＧ−25のカラ
ム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液で溶出させ
た。タンパクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用い
て濃縮した。このようにして調製したマレイミド化ペル
オキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導
入されたマレイミド基の数は1.0〜1.2個であった（ペル
オキシダーゼの分子量を40,000,▲Ｅ280nm 1%▼＝22.75
として計算）。
体の製造 （ａ） マレイミド基の導入 6mgの西洋わさびペルオキシダーゼ〔ベーリンガーマン
ハイム社（西ドイツ）製〕を1mlの0.1Mリン酸緩衝液（p
H7.0）に溶解し、50μｌのN,N−ジメチルホルムアミド
にとかした結合試薬MMC（一般式〔Ｉ〕において、ｎ＝
1,R＝シクロヘキシレンである化合物）4.8mgを加えて30
℃で60分間撹拌しながら反応させた。生成した沈殿を遠
心分離して除去し、上清をセフアデックスＧ−25のカラ
ム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液で溶出させ
た。タンパクを含む画分を分取し、コロジオン膜を用い
て濃縮した。このようにして調製したマレイミド化ペル
オキシダーゼにおいてペルオキシダーゼ１分子あたり導
入されたマレイミド基の数は1.0〜1.2個であった（ペル
オキシダーゼの分子量を40,000,▲Ｅ280nm 1%▼＝22.75
として計算）。
（ｂ） マレイミド化ペルオキシダーゼと抗CEA抗体（F
ab′フラグメント）との複合体の製造前項（３）で得ら
れたポリクローナル抗CEA抗体5mgに0.1mgのペプシンを
加え30℃で一夜反応後、セファデックスＧ−150カラム
（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られた抗体Ｆ
（ab′）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元
し、セファデックスＧ−25のカラムによるゲルクロマト
グラフィーで精製してウサギ抗CEA抗体（Fab′フラグメ
ント）を得た。
ab′フラグメント）との複合体の製造前項（３）で得ら
れたポリクローナル抗CEA抗体5mgに0.1mgのペプシンを
加え30℃で一夜反応後、セファデックスＧ−150カラム
（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られた抗体Ｆ
（ab′）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元
し、セファデックスＧ−25のカラムによるゲルクロマト
グラフィーで精製してウサギ抗CEA抗体（Fab′フラグメ
ント）を得た。
上記（ａ）で調製したマレイミド化ペルオキシダーゼ1.
5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlに溶解し、先に
得た抗CEA抗体（Fab′フラグメント）1.8mgとかした5mg
をとかした5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を
含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlを加えて４℃で2
0時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44を充てん
したカラム（1.5×45cm）を用いるゲルクロマトグラフ
ィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出させ
た。溶出後の280nmの吸光度ならびに酵素活性を測定し
た。ペルオキシダーゼとウサギ抗CEA抗体（Fab′フラグ
メント）との複合体が生成していることを、以下の方法
で確認した。
5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlに溶解し、先に
得た抗CEA抗体（Fab′フラグメント）1.8mgとかした5mg
をとかした5mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を
含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlを加えて４℃で2
0時間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44を充てん
したカラム（1.5×45cm）を用いるゲルクロマトグラフ
ィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出させ
た。溶出後の280nmの吸光度ならびに酵素活性を測定し
た。ペルオキシダーゼとウサギ抗CEA抗体（Fab′フラグ
メント）との複合体が生成していることを、以下の方法
で確認した。
まず、酵素活性の測定はギルバルトらの方法〔アナリテ
ィカル・ケミストリー（Analytical Che-mistry），第4
0巻（1968年）,1256頁〕で行なった。即ち、溶出液の各
フラクションを0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で1800倍に希釈した。この10μｌ
に0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.05M酢酸ナトリウム
緩衝液（pH5.0）に溶解した0.5％ｐ−ハイドロキシフエ
ニル酢酸0.25mlを加えて混合し30℃で５分間インキュベ
ートした。次に0.01％過酸化水素0.05mlを加えて30℃で
20分反応させた。0.1Mグリシン緩衝液（pH10.3）2.5ml
を加えて酵素反応を停止させ、１μg/mlのキニンの蛍光
強度を100とし励起光320nmにおける405nmの蛍光強度を
測定した。結果を第１図に示す。第１図において、 は280nmにおける吸光度を、 はペルオキシダーゼ活性（蛍光強度として）をそれぞれ
示す。フラクション38付近においてペルオキシダーゼと
抗CEA抗体（Fab′フラグメント）との複合体の生成が極
めて良好であることが分かった。
ィカル・ケミストリー（Analytical Che-mistry），第4
0巻（1968年）,1256頁〕で行なった。即ち、溶出液の各
フラクションを0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH7.0）で1800倍に希釈した。この10μｌ
に0.1％ウシ血清アルブミンを含む0.05M酢酸ナトリウム
緩衝液（pH5.0）に溶解した0.5％ｐ−ハイドロキシフエ
ニル酢酸0.25mlを加えて混合し30℃で５分間インキュベ
ートした。次に0.01％過酸化水素0.05mlを加えて30℃で
20分反応させた。0.1Mグリシン緩衝液（pH10.3）2.5ml
を加えて酵素反応を停止させ、１μg/mlのキニンの蛍光
強度を100とし励起光320nmにおける405nmの蛍光強度を
測定した。結果を第１図に示す。第１図において、 は280nmにおける吸光度を、 はペルオキシダーゼ活性（蛍光強度として）をそれぞれ
示す。フラクション38付近においてペルオキシダーゼと
抗CEA抗体（Fab′フラグメント）との複合体の生成が極
めて良好であることが分かった。
（６） モノクローナル抗CEA抗体（Fab′）−HRP複合
体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体Υ−グ
ロブリンフラクション（M0−T3）5mgを0.1M酢酸緩衝液
（pH4.2）1mlに溶解し0.25mgのペプシンを加え37℃で１
夜反応させる。中和後セファデックスＧ−150カラム
（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られたＦ（a
b′）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、
セファデックスＧ−25のカラムによるゲルクロマトグラ
フィーで精製してモノクローナル抗CEA抗体（Fab′フラ
グメント）を得た。
体の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体Υ−グ
ロブリンフラクション（M0−T3）5mgを0.1M酢酸緩衝液
（pH4.2）1mlに溶解し0.25mgのペプシンを加え37℃で１
夜反応させる。中和後セファデックスＧ−150カラム
（直径2.5cm,長さ55cm）で精製した。得られたＦ（a
b′）２画分を２−メルカプトエチルアミンで還元し、
セファデックスＧ−25のカラムによるゲルクロマトグラ
フィーで精製してモノクローナル抗CEA抗体（Fab′フラ
グメント）を得た。
次に前項（５）−（ａ）で調製したマレイミド化ペルオ
キシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlに
溶解し、先に得たモノクローナル抗CEA抗体（Fab′フラ
グメント）1.8mgをとかした5mAエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15ml
を加えて４℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲル
AcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用いるゲルク
ロマトグラフィーにかけ、0.05Mリン酸緩衝液（pH6.5）
で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の280nmの吸
光度ならびに酵素活性を測定して目的フラクションを分
取した。得られたモノクローナル抗CEA抗体（Fab′）−
HRP複合体はBSAとして0.1％、マーチオレートとして0.0
05％になるように調整して４℃で保存した。
キシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15mlに
溶解し、先に得たモノクローナル抗CEA抗体（Fab′フラ
グメント）1.8mgをとかした5mAエチレンジアミン四酢酸
ナトリウム塩を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.15ml
を加えて４℃で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲル
AcA44を充てんしたカラム（1.5×45cm）を用いるゲルク
ロマトグラフィーにかけ、0.05Mリン酸緩衝液（pH6.5）
で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液の280nmの吸
光度ならびに酵素活性を測定して目的フラクションを分
取した。得られたモノクローナル抗CEA抗体（Fab′）−
HRP複合体はBSAとして0.1％、マーチオレートとして0.0
05％になるように調整して４℃で保存した。
（７） モノクローナル抗CEA抗体（IgG）−HRP複合体
の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体ガンマ
グロブリンフラクション（M0−T2）5mgを0.1Mリン酸緩
衝液（pH6.5）1mlに溶解し40μｌのN,N−ジメチルホル
ムアミドにとかした結合試薬MMC（一般式〔Ｉ〕におい
て、ｎ＝1,R＝シクロヘキシレンである化合物〕0.22mg
を加えて25℃で45分間撹拌しながら反応させた。生成し
た沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデックスＧ
−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.8）で溶出させた。タンパクを含む画分を分取
し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このようにして調
製したマレイミド化IgGにおいてIgG1分子あたり導入さ
れたマレイミド基の数は5.9個であった。
の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体ガンマ
グロブリンフラクション（M0−T2）5mgを0.1Mリン酸緩
衝液（pH6.5）1mlに溶解し40μｌのN,N−ジメチルホル
ムアミドにとかした結合試薬MMC（一般式〔Ｉ〕におい
て、ｎ＝1,R＝シクロヘキシレンである化合物〕0.22mg
を加えて25℃で45分間撹拌しながら反応させた。生成し
た沈殿を遠心分離して除去し、上清をセファデックスＧ
−25のカラム（1.0×45cm）に通し、0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.8）で溶出させた。タンパクを含む画分を分取
し、コロジオン膜を用いて濃縮した。このようにして調
製したマレイミド化IgGにおいてIgG1分子あたり導入さ
れたマレイミド基の数は5.9個であった。
別に、10mgのHRPを1.4mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）
に溶解し、100μｌのエタノールにとかした結合試薬SPD
P〔Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
−プロピオネート;N−succinimidyl−３−（２−pyridy
ldithio）−propionate〕1.25mgを加えて25℃で30分間
撹拌しながら反応させた。反応液はセファデックスＧ−
25のカラム（1.0×45cm）に通し0.1M酢酸緩衝液（pH5.
0）で溶出させてSPDPを除去した。次にジチオスレイト
ール（dithiothre-itol）17mgを加えて還元し、再びセ
ファデックスＧ−25のカラム（1.0cm×45cm）を用いる
ゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化HRPを得
た。
に溶解し、100μｌのエタノールにとかした結合試薬SPD
P〔Ｎ−サクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）
−プロピオネート;N−succinimidyl−３−（２−pyridy
ldithio）−propionate〕1.25mgを加えて25℃で30分間
撹拌しながら反応させた。反応液はセファデックスＧ−
25のカラム（1.0×45cm）に通し0.1M酢酸緩衝液（pH5.
0）で溶出させてSPDPを除去した。次にジチオスレイト
ール（dithiothre-itol）17mgを加えて還元し、再びセ
ファデックスＧ−25のカラム（1.0cm×45cm）を用いる
ゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化HRPを得
た。
次に先に調製し0.2mlに濃縮したマレイミド化IgG3mg
と、0.2mlに濃縮したチオール化HRP6mgとを４℃で16時
間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44〔LKB社製
（フランス）〕を充てんしたカラム（1.5cm×45cm）を
用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.5）で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液
の280nmの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラ
クションを分取した。得られたモノクローナル抗CEA抗
体（IgG）−HRP複合体はBSAとして0.1％、マーチオレー
トとして0.005％になるように調整して４℃で保存し
た。
と、0.2mlに濃縮したチオール化HRP6mgとを４℃で16時
間反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA44〔LKB社製
（フランス）〕を充てんしたカラム（1.5cm×45cm）を
用いるゲルクロマトグラフィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝
液（pH6.5）で溶出させた。前項（５）と同様に溶出液
の280nmの吸光度ならびに酵素活性を測定して目的フラ
クションを分取した。得られたモノクローナル抗CEA抗
体（IgG）−HRP複合体はBSAとして0.1％、マーチオレー
トとして0.005％になるように調整して４℃で保存し
た。
（８） モノクローナル抗CEA抗体（IgG）−HRP複合体
の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体ガンマ
グロブリンフラクション（M0−T2）5mgを0.1Mリン酸緩
衝液（pH6.5）1mlに溶解し、0.6mgのＳ−アセチルメル
カプトサクシニックアンハイドライド（Ｓ−acetylmerc
apto succinic anhy-dride）を40μｌのN,N−ジメチル
ホルムアミドに溶解して加え30分間25℃で反応させた。
0.1Mトリス緩衝液（pH7.0）0.2mlおよび1Mヒドロキシル
アミン0.2mlを加えて、さらに５分間30℃で反応させた
のち、セファデックスＧ−25のカラム（1.0×45cm）を
用いるゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化モ
ノクローナル抗CEA抗体（IgG）を得た。
の製造 前項（２）で得られたモノクローナル抗CEA抗体ガンマ
グロブリンフラクション（M0−T2）5mgを0.1Mリン酸緩
衝液（pH6.5）1mlに溶解し、0.6mgのＳ−アセチルメル
カプトサクシニックアンハイドライド（Ｓ−acetylmerc
apto succinic anhy-dride）を40μｌのN,N−ジメチル
ホルムアミドに溶解して加え30分間25℃で反応させた。
0.1Mトリス緩衝液（pH7.0）0.2mlおよび1Mヒドロキシル
アミン0.2mlを加えて、さらに５分間30℃で反応させた
のち、セファデックスＧ−25のカラム（1.0×45cm）を
用いるゲルクロマトグラフィーで精製してチオール化モ
ノクローナル抗CEA抗体（IgG）を得た。
次に前項（５）−（ａ）で調整したマレイミド化ペルオ
キシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.2mlに
溶解し、先に得たチオール化モノクローナル抗CEA抗体
（IgG）3mgと5mAエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩
とを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.2mlを加えて４℃
で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA34を充て
んしたカラム（1.5×45cm）を用いるゲルクロマトグラ
フィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出させ
た。前項（５）と同様に溶出液の280nmの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗CEA（IgG）−HRP複合体はBSAと
して0.1％、マーチオレートとして0.005％になるように
調整して４℃で保存した。
キシダーゼ1.5mgを0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.2mlに
溶解し、先に得たチオール化モノクローナル抗CEA抗体
（IgG）3mgと5mAエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩
とを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0）0.2mlを加えて４℃
で一夜反応させた。反応後、ウルトロゲルAcA34を充て
んしたカラム（1.5×45cm）を用いるゲルクロマトグラ
フィーにかけ、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で溶出させ
た。前項（５）と同様に溶出液の280nmの吸光度ならび
に酵素活性を測定して目的フラクションを分取した。得
られたモノクローナル抗CEA（IgG）−HRP複合体はBSAと
して0.1％、マーチオレートとして0.005％になるように
調整して４℃で保存した。
実施例２ （ａ） 各種HRP複合体の比較（感度、非特異的吸着） 実施例１で得られた各種HRP複合体の性能について調べ
るためEIAを行なった。EIA用の試薬として、次のものを
用いた。
るためEIAを行なった。EIA用の試薬として、次のものを
用いた。
試薬： 抗CEA抗体感作マイクロプレート 実施例１、参考例２で得られたHRP複合体、あるい
はDAKOイムノグロブリン社製（デンマーク）抗CEA抗体H
RP複合体 標準CEA 緩衝液Ｂ（10％子牛血清、0.15MNaClを含むpH7.0の
0.02Mリン酸緩衝液），緩衝液Ａ（0.15MNaClを含むpH7.
0の0.02Mリン酸緩衝液） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬0.02％過酸
化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含むpH4.8の
0.1Mクエン酸一リン酸ニナトリウム緩衝液および反応停
止液（2N−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： EIA用イムノプレートＩ〔ヌンク社（デンマーク）製〕
の各ウエルにポリクローナル抗CEA抗体〔ダコ・イムノ
グロブリン社（デンマーク）製〕を0.1M炭酸緩衝液（pH
9.6）で希釈して調製した抗体溶液（50μg/ml）を100μ
ｌずつ注入して４℃で一夜放置して感作させた。0.1％B
SAを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄したのち、
用時まで冷所保存した。
はDAKOイムノグロブリン社製（デンマーク）抗CEA抗体H
RP複合体 標準CEA 緩衝液Ｂ（10％子牛血清、0.15MNaClを含むpH7.0の
0.02Mリン酸緩衝液），緩衝液Ａ（0.15MNaClを含むpH7.
0の0.02Mリン酸緩衝液） ペルオキシダーゼ活性測定に必要な試薬0.02％過酸
化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含むpH4.8の
0.1Mクエン酸一リン酸ニナトリウム緩衝液および反応停
止液（2N−硫酸） 抗体感作マイクロプレートの調製： EIA用イムノプレートＩ〔ヌンク社（デンマーク）製〕
の各ウエルにポリクローナル抗CEA抗体〔ダコ・イムノ
グロブリン社（デンマーク）製〕を0.1M炭酸緩衝液（pH
9.6）で希釈して調製した抗体溶液（50μg/ml）を100μ
ｌずつ注入して４℃で一夜放置して感作させた。0.1％B
SAを含む0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄したのち、
用時まで冷所保存した。
測定： 緩衝液Ｂに溶解せさたCEA標準溶液100μｌを各ウエルに
注入し、37℃で３時間反応させた。各ウエルを緩衝液Ａ
で洗浄後、実施例１で得られたHRP複合体あるいはダコ
・イムノグロブリン（DAKO Immunoglobulins）社製ポリ
クローナル抗CEA抗体−HRP複合体溶液（それぞれ酵素活
性一定;HRPとして30ng/ウエル）100μｌを加えて25℃で
3.5時間さらに反応させた緩衝液Ａで洗浄し、これに0.0
2％過酸化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含む
0.1Mクエン酸一リン酸二ナトリウム緩衝液（pH4.8）100
μｌを加えて30℃で30分間反応させ、2N−硫酸100μｌ
ずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレート用
自動比色計〔タイターテック・マルチスキャン・フロー
社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして490nmに
おける吸光度を測定した。結果を第２表に示したが、参
考例２で得られたHRP重合体およびダコ・イムノグロブ
リン社製HRP複合体〔２ステップ グルタルアルデヒド
法；イムノケミストリー（Immuno-chemistry）、第８巻
（1971年）、第1175頁〕と比べて実施例１で得られた本
発明のHRP複合体はそれぞれウエルへの非特異的吸着は
極めて小さく、また高感度を与えた。
注入し、37℃で３時間反応させた。各ウエルを緩衝液Ａ
で洗浄後、実施例１で得られたHRP複合体あるいはダコ
・イムノグロブリン（DAKO Immunoglobulins）社製ポリ
クローナル抗CEA抗体−HRP複合体溶液（それぞれ酵素活
性一定;HRPとして30ng/ウエル）100μｌを加えて25℃で
3.5時間さらに反応させた緩衝液Ａで洗浄し、これに0.0
2％過酸化水素と0.15％ｏ−フェニレンジアミンを含む
0.1Mクエン酸一リン酸二ナトリウム緩衝液（pH4.8）100
μｌを加えて30℃で30分間反応させ、2N−硫酸100μｌ
ずつ加えて反応を停止させてから、マイクロプレート用
自動比色計〔タイターテック・マルチスキャン・フロー
社（米国）製〕を用い、ブランクを対照にして490nmに
おける吸光度を測定した。結果を第２表に示したが、参
考例２で得られたHRP重合体およびダコ・イムノグロブ
リン社製HRP複合体〔２ステップ グルタルアルデヒド
法；イムノケミストリー（Immuno-chemistry）、第８巻
（1971年）、第1175頁〕と比べて実施例１で得られた本
発明のHRP複合体はそれぞれウエルへの非特異的吸着は
極めて小さく、また高感度を与えた。
（ｂ） CEAの免疫化学的測定キットおよびCEAの測定 下記のCEA免疫化学的測定キットを用い、下記の操作法
に従って正常人および担癌患者血清中のhCG濃度を測定
した。
に従って正常人および担癌患者血清中のhCG濃度を測定
した。
CEAの免疫化学的測定キット： （１） 実施例1.（２）で得られたモノクローナル抗で
CEA抗体ガンマグロブリンフラクション（M0−T4）の15
μg/ml0.01MNaCl−0.01Mリン酸緩衝液（pH8.0）100ml中
にポリスチレン球（直径4.8mm、Precision Plastics Ba
ll Co.,Chicago,U.S.A.）1500個を浸し、５℃で１夜イ
ンキュベートし、更に0.1％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝
液（pH7.0）で洗浄してなる抗体感作ポリスチレン球 （２） 実施例1.（７）で得られるペルオキシダーゼ標
識抗CEA抗体複合体 （３） ０〜200ngの標準CEA （４） 上記（３）の試薬および被検試料の希釈上用い
る緩衝液Ｂおよび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照） （５） ｏ−フエニレンジアミン （６） 上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液C;0.1
％ウシ血清アルブミン,0.002％メルチオレートを含むpH
7.5の0.1Mリン酸緩衝液 （７） 上記（５）の溶解に用いる緩衝液D;0.02％過酸
化水素0.002％メルチオレートを含むpH4.8の0.1Mクエン
酸緩衝液 （８） 停止液;2N硫酸 操作方法 標準CEA溶液あるいは被検試料50μｌに試薬（４）緩衝
液B250μｌおよび試薬（１）１個を添加し、室温で１日
間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗後、試
薬（６）で希釈した試薬（２）300μｌ（複合体として
約30ng）を添加し、４℃で１日目反応させた。ポリスチ
レン球を緩衝液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した0.15
％の試薬（５）500μｌを加えて室温で40分間反応させ
たのち、2N硫酸1.5mlを添加して反応を停止させ、492nm
の吸光度を測定した。
CEA抗体ガンマグロブリンフラクション（M0−T4）の15
μg/ml0.01MNaCl−0.01Mリン酸緩衝液（pH8.0）100ml中
にポリスチレン球（直径4.8mm、Precision Plastics Ba
ll Co.,Chicago,U.S.A.）1500個を浸し、５℃で１夜イ
ンキュベートし、更に0.1％BSAを含む0.05Mリン酸緩衝
液（pH7.0）で洗浄してなる抗体感作ポリスチレン球 （２） 実施例1.（７）で得られるペルオキシダーゼ標
識抗CEA抗体複合体 （３） ０〜200ngの標準CEA （４） 上記（３）の試薬および被検試料の希釈上用い
る緩衝液Ｂおよび緩衝液Ａ（前項（ａ）参照） （５） ｏ−フエニレンジアミン （６） 上記（２）の試薬の希釈に用いる緩衝液C;0.1
％ウシ血清アルブミン,0.002％メルチオレートを含むpH
7.5の0.1Mリン酸緩衝液 （７） 上記（５）の溶解に用いる緩衝液D;0.02％過酸
化水素0.002％メルチオレートを含むpH4.8の0.1Mクエン
酸緩衝液 （８） 停止液;2N硫酸 操作方法 標準CEA溶液あるいは被検試料50μｌに試薬（４）緩衝
液B250μｌおよび試薬（１）１個を添加し、室温で１日
間反応させた。ポリスチレン球を緩衝液Ａで水洗後、試
薬（６）で希釈した試薬（２）300μｌ（複合体として
約30ng）を添加し、４℃で１日目反応させた。ポリスチ
レン球を緩衝液Ａで水洗し、試薬（７）で溶解した0.15
％の試薬（５）500μｌを加えて室温で40分間反応させ
たのち、2N硫酸1.5mlを添加して反応を停止させ、492nm
の吸光度を測定した。
上記の方法により、正常人および担癌患者血清中のCFA
濃度を測定した。結果は第３表に示される。
濃度を測定した。結果は第３表に示される。
測定の結果、正常人血清のCEA値は0.5〜1.2ng/ml（平均
1.0ng/ml）であったが各種癌患者血清のCEA値は高値を
与え最大565ng/mlとなった。
1.0ng/ml）であったが各種癌患者血清のCEA値は高値を
与え最大565ng/mlとなった。
発明の効果 本発明の試薬を用いると、高感度かつ正確にCEAが測定
され、大腸癌などの消火器癌や他の癌などの診断、予後
管理などに対して極めて有用である。すなわち、本発明
におけるチオール基を導入したペルオキシダーゼで標識
された抗体を用いた場合は、固相に対する非特異的な吸
着が小さいのでCEAの測定の盲検値が小さくしたがって
測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られたモノ
クローナル抗体はCEAに対して親和性が強く、他のCEA関
連抗原に対する交差反応性がはるかに小さいので被検液
に同時に存在するCEA関連抗原からの影響を受け難い。
更に、モノクローナル抗体を試薬の構成成分としている
ので製品の供給が容易であり、測定の再現性が高い。
され、大腸癌などの消火器癌や他の癌などの診断、予後
管理などに対して極めて有用である。すなわち、本発明
におけるチオール基を導入したペルオキシダーゼで標識
された抗体を用いた場合は、固相に対する非特異的な吸
着が小さいのでCEAの測定の盲検値が小さくしたがって
測定の信頼性が増大する。また、本発明で得られたモノ
クローナル抗体はCEAに対して親和性が強く、他のCEA関
連抗原に対する交差反応性がはるかに小さいので被検液
に同時に存在するCEA関連抗原からの影響を受け難い。
更に、モノクローナル抗体を試薬の構成成分としている
ので製品の供給が容易であり、測定の再現性が高い。
また、本発明の方法で得られたCEAを免疫原として作製
されたモノクローナル抗CEA抗体は、CEAに対する反応性
が高くしかもCEA関連抗原NCA,NCA−２との交差反応を有
しないモノクローナル抗CEA抗体である頻度が高く、従
ってモノクローナル抗CEA抗体作製方法として有用であ
る。
されたモノクローナル抗CEA抗体は、CEAに対する反応性
が高くしかもCEA関連抗原NCA,NCA−２との交差反応を有
しないモノクローナル抗CEA抗体である頻度が高く、従
ってモノクローナル抗CEA抗体作製方法として有用であ
る。
これらの選択されたモノクローナル抗CEA抗体は免疫化
学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドイッチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗CEA抗体とし
て用いることができる。これらの診断剤は大腸癌などの
消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる。
更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができ
る。
学的診断剤を構成する成分として利用することができ
る。例えばサンドイッチ法による酵素免疫試験法におい
ては担体上に保持された抗体および（もしくは）酵素で
標識された抗体におけるモノクローナル抗CEA抗体とし
て用いることができる。これらの診断剤は大腸癌などの
消化器癌や他の癌の診断、予後管理などに利用できる。
更にこれらの抗体は治療目的にも利用することができ
る。
第１図は、実施例１−（５）で得られたペルオキシダー
ゼとポリクローナル抗CEA抗体（Fab′フラグメント）と
の反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パ
ターンを表わす。
ゼとポリクローナル抗CEA抗体（Fab′フラグメント）と
の反応生成物のゲルクロマトグラフィーにおける溶出パ
ターンを表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−45560（ＪＰ，Ａ) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．４ （1982）Ｐ．41−57
Claims (4)
- 【請求項１】担体上に保持された抗体、抗原および標識
剤を結合させた抗体を用いるヒト癌胎児性抗原の免疫化
学的測定法において、担体上に保持される抗体と標識剤
を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない
２種の抗体であり、該２種の抗体のうち少なくとも一方
が、ヒト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非イオ
ン性界面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し精製されたヒ
ト癌胎児性抗原で免疫された哺乳動物のリンパ球とミエ
ローマ細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原
反応性モノクローナル抗体であり、標識剤としてペルオ
キシダーゼを用い、これと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたものを用いることを特徴とす
るヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法。 - 【請求項２】ペルオキシダーゼと抗体との結合に際し、
ペルオキシダーゼにあらかじめチオール基を導入したも
のを用いる特許請求の範囲第１項記載のヒト癌胎児性抗
原の免疫化学的測定法。 - 【請求項３】ペルオキシダーゼと抗体とを一般式 〔式中、ｎは０ないし５の整数を、Ｒは化学結合または
２価の６員環状炭化水素残基をそれぞれ示す。〕で表わ
される化合物で結合させたもの、およびペルオキシダ
ーゼに結合させる抗体と互いに抗原決定部位を重複せず
ヒト癌胎児性抗原に反応する抗体を担体上に保持したも
のであって、該２種の抗体のうち少なくとも一方が、ヒ
ト癌胎児性抗原を含有する癌化組織から、非イオン性界
面活性剤を含む中性塩溶液で抽出し精製されたヒト癌胎
児性抗原で免疫された哺乳動物のリンパ球とミエローマ
細胞との融合細胞から得られたヒト癌胎児性抗原反応性
モノクローナル抗体であるものを含有するヒト癌胎児性
抗原の免疫化学的測定用試薬。 - 【請求項４】ペルオキシダーゼと抗体との結合に際し、
ペルオキシダーゼにあらかじめチオール基を導入したも
のを用いる特許請求の範囲第３項記載のヒト癌胎児性抗
原の免疫化学的測定用試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59072427A JPH0692973B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
| EP85104133A EP0158291A3 (en) | 1984-04-10 | 1985-04-04 | A method for purifying carcinoembryonic antigen and a method for producing a carcinoembryonic antigen-reactive monoclonal antibody |
| CA000478552A CA1306427C (en) | 1984-04-10 | 1985-04-09 | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor |
| US06/721,901 US4816390A (en) | 1984-04-10 | 1985-04-10 | Immunochemical assay of carcinoembryonic antigen and reagent therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59072427A JPH0692973B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60214259A JPS60214259A (ja) | 1985-10-26 |
| JPH0692973B2 true JPH0692973B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=13488978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59072427A Expired - Lifetime JPH0692973B2 (ja) | 1984-04-10 | 1984-04-10 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0692973B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2507982B2 (ja) * | 1984-04-10 | 1996-06-19 | 武田薬品工業株式会社 | ヒト癌胎児性抗原反応性モノクロ―ナル抗体の製造法 |
| JPH083490B2 (ja) * | 1985-10-09 | 1996-01-17 | 武田薬品工業株式会社 | ヒト癌胎児性抗原の免疫化学的測定法および試薬 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5845560A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-03-16 | エフ・ホフマン−ラ・ロシユ・ウント・コンパニ−・アクチエンゲゼルシヤフト | 癌胚杭原の固相サンドウイツチ法による定量方法 |
| JPS5972428A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-24 | Canon Inc | 表示装置 |
-
1984
- 1984-04-10 JP JP59072427A patent/JPH0692973B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＰＰＬＩＥＤＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＶｏｌ．４（１９８２）Ｐ．４１−５７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60214259A (ja) | 1985-10-26 |
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