JPS604423B2 - ペプチドホルモンの定量方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はべプチドホルモンの定量方法に関する。

生理活性物質または生体に投与した薬物あるいはそれら
の代射産物の血中、尿中濃度等を測定する方法としては
、それらの物質の免疫学的活性を測定する免疫化学的測
定方法と生物学的活性を測定する生物学的測定方法とが
あるが、後者の生物学的活性を指標として測定するのが
最も合理的であり、従来は生物学的測定法（Ｂｉｏａｓ
ｓａｙ）が用いられていた。

しかし、この方法は測定感度が低く手技が繁雑であるた
め、近年前者の免疫化学的方法が多く用いられている。
なかでも、放射性同位元素または酵素を標識剤とする放
射免疫分析法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：以
下ＲＩＡと略す。）または酵素免疫分析法（８ｎｚｙｍ
ｅｌ−ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：以下Ｅ仏と略す。）は測
定感度が高く、定量性にすぐれているので広く利用され
ている。前記ＲＩＡとＥＩＡの測定原理は共通しており
、両者は抗原と抗体との間の特異的、かつ鋭敏な反応を
利用するものであって、測定しようとする物質（以下測
定物質という。

）を、その免疫学的活性を指標として測定するものであ
る。免疫学的活性は、多くの場合生物学的活性とよい相
関を示すが、ある種の物質、例えば富』轡皮質刺激ホル
モン、成長利ホルモン等では両者の活性が解離し、ＲＩ
ＡやＥＩＡで測定した値が、必ずしもその物質の生物活
性を示しているとはいえない場合がある。

このため最近では、測定感度が非常に高く、かつその測
定値がその物質の生物活性を示していると考えられる方
法として、放射受容体分析法（Ｒｄｄｉｏｒｅｃｅｐｔ
ｏｒａｓｓａｙ：以下ＲＲＡと略す。

）が用いられるようになっている。前記ＲＲＡは、生理
活性物質および薬物に対する「標的器官の細胞膜または
細胞内に存在する受容体の結合活性を利用するものであ
り、ＲＲＡも厳密には生物学的活性を測定するそのとは
言えないが、ＲＩＡまたはＥＩＡに比べてより精確に生
物活性の値を測定できる方方法として期待されている。

なお「ＲＲＡの測定方法は、ＲＩＡとほぼ同機であって
、測定物質と測定物質に標識剤を結合させた標識物質の
一定量とを、それらの物質の受容体の一定量に対して結
合反応させると測定物質と標識物質とはその存在量に比
例して受容体に結合するので、測定物質の存在量が増加
すると、それに反比例して標識物質の受容体への結合量
は減少する。次に、適当な方法で受容体に結合した標識
物質と結合しなかった標識物質とに分離し、いずれかの
分画の標識剤の活性を測定し、同時に濃度既知の標識物
質を用いて同様に操作して作成した標準曲線により、未
知の量の測定物質の量を測定することができる。前記の
測定方法は、ＲＩＡにおける競合法に相当するものであ
って、ＲＲＡではＲＩＡにおけるサンドイッチ法に相当
する方法は行なわれていない。

また、標識剤としては、放射性同位元素のほか酵素また
は蛍光物質を用いる方法〔ＥｍＭｍｅｒｅｃｅｐｔｏｒ
ａｓｓａｙ：（以下ＥＲＡと略す。

）またはＦｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅｒｅｃｅｐのｒａｓｓ
ａｙ〕が理論的には考えられるが」従来は放射性同位元
素が用いられているにすぎない。ＲＲＡの測定感度は、
生物学的測定法 （Ｂｉｏａｓｓａｙ）に比べれば非常に高いとはいえ、
ＲＩＡに比べるとや）劣り、更に測定値の変動が大きい
という欠点がある。

この原因の１つとして、測定に羊いる受容体として、通
常は受容体そのものではなく、器官のスライス、遊離細
胞、培養細胞、組織ホモジネート、純化した細胞膜など
、受容体を含む種々のフラクション（以下受容体分圏と
称する。）を用いているため、測定物質と受容体との特
異的結合の他に、非特異的な結合が生じ、その程度が種
々の条件によって変動するものと考えられる。このよう
な変動を除くには、受容体分画を十分に精製して、非特
異的結合を生ずる物質を除去することが必要であるが、
そのためには競艇密度勾配超遠心を繰り返すなど、非常
に繁雑な操作が非要である。また「受容体分画における
受容体と細胞膜との結合は天然の結合のままであるので
、受容体分画の調製過程や測定の操作過程において、受
容体が自然に可溶化されて溶出したり、測定における遠
心分離操作によって受容体分画自体の損失が生じること
も測定値の変動する一因と考えられる。本発明者らは、
受容体を高度に精製する繁雑な操作を必要とせず、しか
も測定感度および精度の優れた、簡易な測定法の開発に
ついて研究を重ねた結果、本発明を完成した。

本発明は、受容体を細胞膜か可溶化して分離したのち、
これを適当な不溶性の担体に結合させて得た不溶化受容
体を用いて、従来のＲＩＡ及びＲＲＡではなし得なかっ
た高精度、高感度の生物活性の測定方法を提供するもの
である。

本発明の実施には不落化した受容体と測定抗原に対して
特異的に反応する抗体を標識剤で標議した標識抗体と測
定抗原の三者が必要である。

第一段階の反応は受容体と測定物質との生物学的結合を
生ぜしめるものであり、第二段階のの反応は測定物質と
標識抗体との免疫学的結合を生ぜしめるものである。こ
の両者の反応を同時あるいは順次行うことによって生物
学的活性を正確に測定することを可能にしたのである。
本発明を実施するには通常次のように行なう。

先ず、測定物質（例えばホルモン等）の受容体を可溶化
するのであるが、従来ＲＲＡにおいて測定の受容体とし
て用いられている器官のスライス、遊離細胞、組織ホモ
ジネート、純化細胞膜等の受容体分画をそのまま、また
はホモジナィズし、炉過または遠心によって大きな組織
塊等を除去した後、更に２００００〜３０００仇．ｐ．
ｍ．で遠心分離して沈澄を集める。得られた沈糖に適当
な緩衡液〔例えばリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）〕または
界面活性剤溶液〔例えばトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｐ
ｎＸ−１００、商品名、小宗化学薬品（株）製）の０．
１〜２．０リン酸緩衝溶液〕を加れて浮遊液とし、氷冷
ないし３７０で３０分〜２時間駐出する。前記の如く緩
衝液によって可溶化した受容体は、測定物質との結合能
が強く、これを不落性の坦体に結合させて得た不熔化受
容体は、測定の感度および精度とも良好であるので、測
定の受容体として優れているが、細胞膜からの溶出量が
少ないという欠点がある。一方、界面活性剤溶液で可溶
化した場合は、緩衝液で可溶化して得た受容体に比べて
、結合館はや）劣るが、より多くの可溶化受容体を得る
ことができる。

次に前記可溶化受容体を適当な不溶性担体に結合させる
のであるが、不溶性坦体としては、血球、ポリスチレン
ラテツクス、プラスチックチューブ、セフアロース、セ
フアデックス等、従来免疫化学の分野において、抗原ま
たは抗体の担体として用いられるものが使用できる。

例えば血球を用いる場合には、各種の動物、例えばゥシ
、ゥマ「ヒツジ、ウサギ、ヒトなどのホ乳類やニワトリ
、七面鳥等の鳥類等の血球を用い、この血球をホルマリ
ン、ピルビンアルデヒド、過酸化水素等の固定剤で処理
した後、血球と受容体との結合を容易にし、かつ強固に
するため、タンニン酸、ビスージアゾベンジジン、１．
３−ジフルオロー４．６ージニトロベンゼン、グルタル
アルデヒドなどの結合剤で処理する。例えばヒツジの血
球を使用する場合には、ヒツジの血液を遠心分離して血
球を分取し、これを生理食塩水で洗浄した後、濃度約８
％の浮遊液とする。これに濃度約３％のホルマリン溶液
の等量を加えて混合し、３７０で１報時間反応させた後
洗浄して、生理食塩水で濃度１０％の浮遊液とする。こ
の浮遊液を結合剤、例えばタンニン酸で処理するには、
前記ホルマリン処理血球を濃度１．０〜６．０％好まし
くは３．３％にリン酸綬食塩水（以下ＰＢＳと略す。）
に浮遊し、これに濃度０．００２５〜２．０％の夕ンニ
ン酸溶液の等量を混合するか、前記ホルマリン処理血球
１の上あたりに、前記濃度のタンニン酸溶液を１０〜５
０柵の割合で加えて混合し、２５〜５６こ０で３０〜９
０分間反応させる。この処理により、血球１Ｍあたり０
．３〜５００の９のタンニン酸が結合する。なお、血球
の量は、血球浮遊液を遠心分離して得た血球の見かけの
容積で表わす。

このように処理した血球を担体として用い、これに化溶
化受容体を結合させるには、前記故合剤処理血球を濃度
１．６〜６．０％にＰＢＳに浮遊し、これと、先に調製
した可溶化受容体溶液の等量とを混合し、２５〜５６つ
○で２０〜６０分間反応させる。

なお、血球を担体とした不落化受容体と酵素を標識剤と
した方法とを組合わせた測定方方法においては、血球自
体に酵素活性が存在すると、標識剤としての酵素の活性
測定の妨げになるので、子め血球自体の酵素活性を除去
することが必要である。血球自体の酵素活性を除去する
には、除去すべき酵素の種類によって異なるが、一般的
にはｐＨ、温度等を当該酵素の不安定な領域に導き失活
させる。例えば西洋わさびパーオキシダーゼを標識剤と
する場合には、これと同種の活性を示す酵素が血球中に
存在しているので、ホルマリンで処理した血球浮遊液を
ｐＨ３以下の酸性条件下に保存して酵素活性を失活させ
る。また、担体としてポリスチレンラテックスやプラス
チックチューブを用いる場合には、固定剤および結合剤
による処理は行なわなくともよい〈、これらの担体の浮
遊液と可溶化した受容体の溶液とを混合してインキュべ
−ションすることによって、担体に受容体を結合させる
ことができる。

セルロースやセフアデツクスを担体に用いる場合には、
ブロムシアンでこれらを活性化して受容体を結合させる
。測定物質の抗体を標識するには、標識剤として酵素（
例えば西洋わさびパーオキシダーゼ、アルカリホスフア
ターゼ、、グルコースオキシターゼ等）を用い、グルタ
ルアルデビド法、マレィド法、過ヨウ素酸法等公知の方
法を利用する。

このようにして得た不溶化受容体を用いて測定を行なう
には次のように実施する。まず、検体と不溶化受容体と
を試験管にとり、インキュベーションする。これに標識
抗体の一定量を加えてインキュベーションした後、遠心
して枕檀を分取する。次いで、この沈澄に適当な基質溶
液を加えてインキュベーションし、上清の吸光度を測定
し、同時に検体のかわりに濃度既知の標準溶液を用いて
作成した標準曲線により検体の量を測定する。

本発明の測定方法は、ＲＩＡにおいてサンドイッチ法と
呼ばれる方法に応用したものである。一般にサンドイッ
チ法は競合法に比べ測定感度および精度がよく、さらに
測定可能の範囲が広い等の利点を有することが知られて
いる。したがって測定物質のパートナーとして不熔化受
容体を用いるとともに、これに標識抗体を組合わせてサ
ンドイッチ法の原理を応用した本発明の測定方法は、測
定物質をその生物活性を指標として良好な測定感度およ
び精度で測定することができる。本発明の測定方法によ
って測定しうる物質としては「例えばｈＣＧ、成長ホル
モントィンスリン等をあげることができるが、これらに
限定されるものではなく、受容体の存在が知られている
物質の測定に応用することができる。

本発明の不溶化受容体は種々の特徴を有する。

従来、測定の受容体としては、主として組織ホモジネー
トの受容体分画が用いられているが、この分画を調製す
るには、組織ホモジネートに大きな遠心力をかけて沈降
させている。したがって測定操作においても〜 この受
容体分画を反応液から分離するには、調製時と同程度の
遠心力を必要とするのでその操作は容易ではない。この
ため、反応液にＣａＨ，Ｍｇ什等の試薬を加え、受容体
分画同志を会合または凝集させて遠心分離を容易にする
等工夫をしいるが、本発明の不落化受容体は「受容体を
細胞膜から可溶化して分離しのち、これを血球、高分子
ラテツクスなどの不顔性担体に結合させたものであるか
ら〜小さな遠心力で容易に沈降させることができる。従
って従来のような特殊な処理を必要とせず、測定操作が
熔易である。また、本発明の不溶化受容体は取扱いが容
易な不潟性坦体に強固に結合しているから、従来の受容
体分画のように、測定操作中に受容体が細胞膜から除々
に熔出したり、受容体自体が流出したりして〜測定値を
大きく変動させることがなく、測定精度を大幅に向上さ
せることができる。更に本発明の測定方法は受容体を用
いる測定法の利点と抗原抗体反応「特にサンドイッチ法
の利点の組合わせによって、測定物質を良好な測定感度
および精度で測定することができる。

本発明を実施例によってさらに具体的に説明する。

実施例 １ 不溶化ゴナドトロピン受容体の製造 ａ 可溶化ゴナドトロピン受容体の製造 断頭により殺したラッドから峯丸を摘出し、その白膜を
剥離した後バ−チス（Ｖｉｒｔｊｓ）のホモナイザーで
約３硯砂、間ホモジナイズした。

これを１００伍‐ｐ．ｍ．で１０分間遠心後、その上清
を更に２５００仇．ｐ．ｍ．で３０分間遠心した。上清
を除去し、得られた次薄を０．５％のＴｒｉｂｎＸ−１
００を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０の‘に浮遊
し、４℃で３０〜６粉ご間放置した後、２７００仇．ｐ
．ｍ．でＩＱ分間遠心し「不港部分を除去して、可溶化
ゴナドトロピン受容体を製造した。ｂ 不落化ゴナドト
ロピン受容体の製造 ｉｏ％ポリスチレンラテックス浮遊液２の‘と前記ａの
受容体溶液との等量を混合し、５が○で２０分間インキ
ュベーションして、ポリスチレンラテックスにゴナドト
ロピン受容体を結合させた。

反応終了後、８００位．ｐ．ｍ．で５分間遠心し、Ｐ斑
で２回洗浄した後、これを０．１％ＢＳＡを含むＰ斑１
０の‘に浮遊し、不落化ゴナドトｏピン受容体を得た。
実施例 ２ 不溶化成長ホルモン受容体の製造 ａ 可溶化成長ホルモン受容体の製造 胆嚢、大血管および結合織を除去した家兎の肝臓をハサ
ミで細切りし、０．３ Ｍブドウ糖溶液中で２回洗い、
肝組織の５倍量の０．３Ｍブドウ糖液を加えてホモジナ
ィズした。

これをガーゼで炉遇した後、炉液を６０庇で２０分間（
４００）遠心分離し、上清を１５００鷹で２０分間（４
００）遠′０分離した。この上情をさらに１００００の
で９０分間（４００）で遠心分離し、得られた汝湾を０
．５％Ｔｒｉ■ｎＸ−１００を含むＰＢＳに浮遊し、室
温で１時間魔拝した。これを１００００的で３０分間（
４００）遠心分離し、不溶部分を除去し、可溶化成長ホ
ルモン受容体を製造した。ｂ 担体用血球の調製 市販補体結合反応用緬羊血液（東芝化学製）５０泌を３
００伍．ｐ．ｍ．１０分間遠心して血球成分を分取し、
生理食塩水で３回洗浄した後、生理食塩水で８％の濃度
の浮遊液とした。

これに等容量の３％ホルマリン溶液を加え、３７０で１
糊時間インキュべ−ションした後精製水で４回洗浄し、
使用時まで１０％浮遊液として４℃に保存した。ｃ 不
溶化受容体の製造前記ｂの血球浮遊液２の‘を遠心して
血球を分離し、Ｐ斑で２回洗浄した。

これを６叫のＰ既に浮遊し、同容量のタンニン酸溶液（
濃度０．２５％）と混合した後、５６００で３０分間イ
ンキュベーションした。冷却後、Ｐ茂で２回洗浄した後
、Ｐ酸６泌に浮遊し、これに前記ａの受容体溶液６羽を
混合し、、５６ｏｏで２０分間インキュべ−ションして
、血球に成長ホルモン受容体を結合させた。次いで、こ
れを急冷し、ＰＢＳで２回洗浄した後、０．１％牛血清
ァルブミン（以下母Ａと略す）を含むＰ斑２机上に浮遊
し、不溶化成長ホルモン受容体を得た。実施例 ３ 不溶化ゴナドトロピン受容体の製造 ａ 可溶化ゴナドトロピン受容体の製造 断頭により殺したラットから筆丸の白膜を剥離し、Ｐ斑
中で精細管を椀さ、間質細胞フラグメントを得。

これをガーゼで炉遇した後、炉液を１００仇．ｐ．ｍ．
で１８分間遠心し、その上清を更に２５００仇．ｐ．ｍ
．で３０分間遠心した。上清を除去し、得られた沈澄を
峯丸１個あたり２の‘の１％ＴｒｉｐｎＸ−１００を含
むＰ既に浮遊した。これを室温で３び分間燭拝して可溶
化ゴナドトロピン受容体を得た。ｂ 不溶化ゴナドトロ
ピン受容体の製造 前記ａで製造した受容体溶液１の‘を内径１．５肌長さ
１０伽のポリスチレン試験管に入れ、５６ｑ○で２０分
間反応させ、試験管にゴナドトロピン受容体を結合させ
た。

反応終了後、ＰＢＳで洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳ溶液２のとを加え、４℃で３時間放置し後、Ｐ母で
洗浄して、不溶化ゴナドトロピン受容体を製造した。実
施例 ４ 不溶化ゴナドトロピン受容体の製造 ａ 可溶化受容体の製造 実施し３一ａの方法に準じて操作し「 ２７００的の汝澄を得た後「 これをＰＢＳ２の‘に浮
遊して、可溶化受容体液とした。

ｂ 担体用血球の製造 実施例２−ｂの方法に準じて緬羊血球を固定し、１０％
浮遊液とした。

この血球浮遊液５柵に０．８Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ２．０）５机とを加えて混合し、５分間放置した後、
３００仇．ｐ．ｍ．で５分間遠心分離した。上清を除去
し、得られた沈澄を前記緩衝液１ｏｗ‘に浮遊して５分
間放置した後、再び遠心分離して上清を除去した。得ら
れた晩澄をＰ斑で２回洗浄した後ＬＰＢＳで１０％の濃
度の血球浮遊液とした。ｃ 不落化ゴナドトロピン受容
体の製造 前記ａの受容体溶液２叫と前記ｂの血球浮遊液２の上を
使用して、実施例２−ｃの方法に準じて「不溶化ゴナド
トロピン受容体を製造した。

実施例 ５不溶化ゴナドトロピン受容体の製造 ａ 可溶化ィンスリン受容体の製造 ラットの肝臓を大血管および結合織を除いた後、ハサミ
で細切し、氷冷した０．２８のブドウ糖溶液で２回洗浄
した。

これに氷冷した０．２９Ｍブドウ糖溶液を肝組織の５倍
量を加えてホモジナィズし、６０庇で１び分間遠心した
。この上清を１２００庇で３０分間遠心し、得られた上
蒲液に塩化ナトリウムと硫酸マグネシウムをそれぞれ０
．１Ｍおよび０．２Ｍとなるように添加した。これを４
０００的で４０分間遠心分離した後、得られた沈簿を０
．０９Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に浮遊し、
２０秒間ホモジナィズした。再び４０００的で４０分間
遠心し、得られた枕澄を１％のＴｒｉｏｎＸ−１００を
含む０．０Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に浮遊
し、室温で３０分間擬拝した後、ｌｏｏｏｏ船で３０分
間遠心分離（４００）し、上清を分取して不落化ィンス
リン受容体を得た。

ｂ 不落化インスリン受容体の製造０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．０）に溶かした０．５％グルタルアルデビド
溶液２柵に、直径３脚、長さ８肋のポリエチレン棒２０
本を入れ、室温で２時間インキュベーションした。

前記ポリエチレン棒を精製水で十分洗浄した後、この榛
を前記ａの受容体溶液２の‘に加え、４℃で放置し、ポ
リエチレン棒にィワスリン受容体を結合させた。反応終
了後、これを精製水で洗浄した後〜 ＩＭエタノールァ
ミンＰ既溶液２の‘に入れ「室温で３０分間インキュべ
−ションした後、精製水で洗浄し、不溶化ィンスリン受
容体を製造した。実施例 ６胎盤性性腺刺激ホルモンの
測定 ａ 胎盤性性腺刺激ホルモン（以下ｈＣＧと略す。

）標準溶液の調製日本薬局方収載のｈＣＧ標準品を０．
１％母Ａを含むＰ既に溶解し、３００００，３０００？
３００，３０，３７０ｉＵ′その各能度のｈＣＧ標準
溶液を調製した。

ｂ 抗ｈＣＧ抗体の製造ｈＣＯを２雌仇‘の濃度に生理
食塩水に溶解しし これにフロントの完全アジュバント
を混合して十分乳化した。

これをウサギの背部皮下に、１週に１回（１の‘〆図）
、５回以上投与し「最終投与ｉ週間後に採血して抗血清
をを得た。この抗血清を硫酸ナトリウムで２回塩折して
「抗ｈＣＧ抗体を製造した。ｃ 抗ｈＣＧ抗体・酵素結
合物の製造 ５の９の 西洋わさびパーオキシターゼ （Ｈｏｒｓｅｒａｄｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉ船ｓｅ以下
ＨＲＰと略す）を０．９の炭酸水素ナトリウム溶液１の
‘に溶解解し、１％２．４−ジニトロフルオルベンゼン
０。

１柵を加えて室温で１時間燈拝した。

これに０．０８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１叫を加え
３び分間室温で混合した後、０．１８ Ｍェチレレング
リコール溶液１．０の上を加え、室温で１時間混合した
。次いで０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に対して
１夜透析した後、これに、前記ｂの抗ｈＣＧ抗体を前記
緩衝液に５雌′の‘の濃度に溶解した溶液１．０奴を加
え、室温で３時間反応させた後、５の９の水素化ホウ酸
ナトリウムを加え、４℃で更に３時間反応させた。反応
終了後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して１夜透析した後
、セフアデツクスＧ２００で分画、精製して、抗ｈＣＧ
抗体・ＨＲＰ結合物を得た。ｄ ｈＣＧの測定 前記ａの標準ｈＣＧ溶液０．１の‘、実施例４の不溶化
ゴナドトロピン受容体浮遊液０．１机【および０．１％
ＢＳＡを含むＰＢＳＯ．４の‘を試験管に入れ、３７℃
で４０分間インキュベーションした。

次いで、これに前記ｃの抗ｈＣＧ抗体・ＨＲＰ結合物溶
液０４１叫を加え、３７０で６び分間インキュべ−ショ
ンした。３００仇．ｐ．ｍ．で５分間遠心して上清を除
去した後Ｐ母で３回洗浄し、これに５−ァミノサリチル
酸６０の９′のおよび０．３％過酸化水素水１の‘′ｄ
‘を含む基質溶液３のとを加え、室温で６０分間反応さ
せた。

１．６％ァジ化ナトリウ夢溶液１滴を加えて反応を停止
させた後軽く遠心して、上清の吸光度（４６則ｍ）を測
定した。

結果の１例を第１図に示した。比較例 １ ゴナドトロピン受容体分画を用いたｈＣＯの測定ａ ゴ
ナドトロピン受容体分画の製造断頭により殺したラツト
の塁丸を摘出し、その白膜を剥離してＶＭｉｓのホモジ
ナィザ−で約３現砂、間ホモジナィズした。

これをガーゼで炉過し、炉液を１５０的で１０分間遠心
分離し、得られた沈澄を拳丸１個あたり１０肌のＰＢＳ
に浮遊して「ゴナドトロピン受容体分画を製造した。ｂ
ｈＣＧの測定実施例６−ａで調製したｈＣＧ標準溶液
０．１の‘、前記ａのゴナドトロピン受容体分画０．１
叫および０．１％斑Ａを含むＰＢＳＯ．４の‘を試験管
に入れ、３７０で４０分間インキュベーションした。

次いで、実施例６一ｃの抗ｈＣＧ抗体・ＨＲＰ結合物溶
液０．１の‘を加えてさらに６０分間インキュベーショ
ンした。３００仇．ｐ．ｍ．で１０分間遠心して上清を
除去した後、Ｐ茂で３回洗浄し、これに実施例６一ｄで
用いた基質溶液３の‘を加えて室温で６雌ふ間反応させ
た。

１．６％ァジ化ナトリゥム溶液を１滴加えて反応を程止
させた後還○分離し、上蒲の吸光度を測定した。

結果の１例を第２図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例６の結果を示すグラフ、第２図は比較例
１の結果を示すグラフ。 第１図 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 哺乳動物の組織又は細胞からペプチドホルモンの受
   容体を界面活性剤を含む緩衝液で可溶化された状態で抽
   出し、２ 該抽出受容体を不溶性坦体にタンニン酸、グ
   ルタルアルデビドなどの結合剤を用いて結合せしめて不
   溶化し、３ 該不溶化受容体に、 i 血液成分又は尿の被検試料と、 ii 該ペプチドホルモンと特異的に結合する抗体に標識
   剤として酵素を結合せしめた標識抗体とを、同時か又は
   別々に反応せしめて、不溶化受容体−ペプチドホルモン
   −標識抗体結合物を形成し、４ 該結合物を反能液から
   分離し、 ５ 該結合物又は反応液のいずれか一方の標識剤の活性
   を測定することからなるペプチドホルモンの定量方法。