JPH0695945B2

JPH0695945B2 - アセチルＣｏＡの製造法

Info

Publication number: JPH0695945B2
Application number: JP24081986A
Authority: JP
Inventors: 光木村; 幸作村田; 道夫野中; 信行佐藤
Original assignee: マルハ株式会社
Priority date: 1986-10-09
Filing date: 1986-10-09
Publication date: 1994-11-30
Anticipated expiration: 2009-11-30
Also published as: JPS6394989A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、アセチルCoAの新規な製造法、詳しくは酵素
グルタチオンチオールエステラーゼを生産する酵母菌体
を利用してコエンチームＡとＳ−アセチルグルタチオン
とから、上記酵素のアセチル基転移反応によりアセチル
CoAを製造する方法に関する。

〔従来の技術〕従来のアセチルCoAの製造法としては、アセチルCoA高含
有菌から分離、精製する方法（特開昭52-41294号公報参
照）、及びクロストリジュームクリュイベリやバチルス
ステロサーモフィルス等から精製したフォスフェイトア
セチルトランスフェラーゼを用いて、アセチルリン酸と
コエンチームＡからアセチルCoAを合成する酵素法など
がある。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、菌体から分離、精製する方法では、精製
操作に手間がかかり収量も少ないという問題があり、ま
た、フォスフェイトアセチルトランスフェラーゼを用い
る酵素法では、基質のアセチルリン酸が高価であるこ
と、更にアセチルリン酸は不安定で分解しやすいなどの
問題があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は、以上のような問題点を解決したアセチル
CoAの製造法を提供することを目的として鋭意研究の結
果、酵母に含有されるグルタチオンチオールエステラー
ゼを用いて、弱アルカリ条件下でＳ−アセチルグルタチ
オンとコエンチームＡとから容易にアセチルCoAを合成
できることを知見した。

本発明は、上記知見に基づきなされたもので、グルタチ
オンチオールエステラーゼ活性含有体を用いてコエンチ
ームＡとＳ−アセチルグルタチオンとからアセチルCoA
を生成させることを特徴とするアセチルCoAの製造法を
提供するものである。

以下、本発明のアセチルCoAの製造法について詳述す
る。

本発明で用いられるグルタチオンチオールエステラーゼ
活性含有体は、グルタチオンチオールエステラーゼ活性
を有するものであれば良く、該グルタチオンチオールエ
ステラーゼ活性含有体としては、酵母菌体、酵母抽出
液、物理化学的処理酵母菌体及び固定化酵母菌体等が挙
げられる。また酵母菌体としては、サッカロミセス属、
カンディダ属、ハンセヌラ属、チゾサッカロミセス属、
ピッチャ属あるいはクロエッケラ属に属する菌体が挙げ
られる。上記の物理化学的処理酵母菌体は、酵母菌体又
は固定化酵母菌体をトルエン等で処理したものである。
また、固定化酵母菌体において、酵母菌体の固定化に使
用する担体が、ポリアクリルアミドゲル、光硬化樹脂、
アルギン酸カルシウム、カラギーナンあるいは寒天が用
いられる。そして、固定化菌体を用いれば、本発明のア
セチルCoAの製造法における連続反応を容易に行うこと
ができる。

而して、本発明で用いるグルタチオンチオールエステラ
ーゼ活性含有体の調整法は、特に制限されないが、好ま
しくは、例えば、次のようにして行うことができる。

即ち、酵母、例えばサッカロミセスセレビジェDKD-5D
-H（酵母菌体）を含有する酵母を、栄養培地、例えば0.
1〜４％酵母エキス（好ましくは１〜２％）、0.1〜４％
ペプトン（好ましくは１〜２％）、0.1〜４％グルコー
ス（好ましくは１〜２％）及び水より成り、pH5〜７
（好ましくは5.5〜6.5）に調整した10lの栄養培地に
て、20〜40℃（好ましくは30℃）で15〜30時間（好まし
くは20〜24時間）振盪培養し、得られた培養液より菌体
を遠心分離により集める。尚、上記のpHの調整は、塩
酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリス緩衝液
等を用いて行うのが好ましい。

かくして10lの培地より約100gの湿菌体が得られる。

得られた湿菌体（100g）を0.85％食塩水で洗浄する。洗
浄菌体100gを50mlの10mMトリス緩衝液（pH7.0）に懸濁
後、ダイノミルを用いて０℃、３分間菌体破砕処理を行
い菌体破砕液とする。

この菌体破砕液を遠心分離して、その上澄液（粗酵素
液）を得る。次いで、この粗酵素液を40℃、30分加熱処
理を行い変性タンパク質を遠心分離し、その上澄液を、
10mMトリス緩衝液（pH7.0）で平衡化したDEAEセルロー
スカラムクロマトグラフィー（５×56cm）に供し、0-1M
塩化カルシウムで溶出する。活性画分を濃縮後10mMトリ
ス緩衝液（pH7.0）で一晩透析を行った後、それを10mM
トリス緩衝液で平衡化したセファデックスG-150（４×1
00cm）に供し、活性画分を集める。この活性画分を硫酸
アンモニウム30％飽和になるように調製し、同様に30％
飽和硫酸アンモニウム、10mMトリス緩衝液（pH7.0）で
平衡化したブチルトヨパールカラムクロマトグラフィー
（５×15cm）に供し、30〜０％飽和硫酸アンモニウムで
溶出し、その活性画分を濃縮後、一晩10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）で透析する。

これを同緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタイトカ
ラムクロマトグラフィー（５×10cm）に供し、10-500mM
リン酸緩衝液（pH7.0）で溶出し活性画分を集める。更
にこの活性画分を0.2M塩化カルシウム、10mMトリス緩衝
液（pH7.0）で一晩透析した後、同緩衝液で平衡化し
た、セファデックスG-150（1.5×95cm）に供し、その活
性画分を得る。このようにして得た、活性画分は、グル
タチオンチオールエステラーゼ活性含有体として、本発
明の実施に用いられる。

また、酵母菌体の固定化は、担体として、例えば、ポリ
アクリルアミドを用いる場合、次のようにして行える。
即ち、上記の精製酵素を得るときと同様にして集めた菌
体、2.5g（湿重量）を8mlになるように0.85％食塩水に
懸濁する。これに、1.5gのアクリルアミド、80mgのビス
アクリルアミド、1mlのジメチルアミノプロピオニトリ
ル、及び2.5％過硫酸アンモニウム1mlを手早く加え、混
合した後、30℃以上にならないように氷冷しながら固化
させる。これを１〜2mmの立方体状に形成することによ
ってキューブ状の固定化菌体（約10gのポリアクリルア
ミドゲル固定化菌体）を得ることが出来る。

上記の如くして得られた固定化菌体では、その格子内に
包括された菌体は破壊されていないため基質（Ｓ−アセ
チルグルタチオン、コエンチームＡ）と充分に接触でき
ず、アセチルCoA合成活性は低い。そこで、格子内に存
在する菌体を破壊するため上記固定化菌体10gを１〜20
％（v/v）（好ましくは８〜10％）のトルエン、１〜10m
M（好ましくは5mM）Ｓ−アセチルグルタチオン、１〜50
mM（好ましくは10mM）の塩化カルシウムを含む10mlの0.
1Mトリス緩衝液（pH7.0）に懸濁し、20〜40℃（好まし
くは30〜35℃）にて振盪することにより、グルタチオン
チオールエステラーゼ活性を長時間安定に保持する固定
化菌体を得ることが出来る。

本発明におけるアセチルCoA合成反応は、上述の如くし
て得た活性画分（酵母菌体）や固定化菌体等のグルタチ
オンチオールエステラーゼ活性含有体を、１〜10mM（好
ましくは３〜6mM）のコエンチームＡ、及び１〜50mM
（好ましくは20〜40mM）のＳ−アセチルグルタチオンと
混和し、且つpH7〜９（好ましくは８〜９）で20〜50℃
（好ましくは37℃）下に10〜60分（好ましくは15〜30
分）反応させることにより行うことが出来る。また、こ
の際、トリス緩衝液等を用いてpHを７〜９（好ましくは
８〜９）に調整する。また、更に、塩化カルシウム等の
金属イオンの存在させることにより、アセチルCoAの生
産量は約1.5倍増加させることが出来る。

また、固定化菌体10gをカラムに充填し、これに１〜10m
M（好ましくは５〜10mM）のコエンチームA,1〜50mM（好
ましくは４〜40mM）のＳ−アセチルグルタチオンを含む
0.1Mトリス緩衝液（pH7〜９）（好ましくは８〜９）
を、20〜40℃（好ましくは30〜35℃）、空間速度（S.
V.）0.1〜２（時間）^-1（好ましくはS.V.＝１（時間）
^-1）で連続的に導通することにより連続的にアセチルCo
Aを取得することが出来る。アセチルCoAは、反応終了濾
液を直接イオン交換カラムクロマトグラフィーなどに導
通することにより分離精製することが出来る。

また、同時にＳ−アセチルグルタチオン分解産物である
グルタチオンも回収することが出来る。

〔実施例〕

以下に実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明
する。尚、下記試験例は、種々の酵母中にそれぞれ含有
されている各種菌体のグルタチオンチオールエステラー
ゼ活性の測定例及びその結果を示すものである。

試験例種々の酵母を１の栄養培地（２％グルコース、１％酵
母エキス、２％ペプトン）にて30℃で24時間振盪培養す
る。これらの培地からそれぞれ菌体を遠心分離で集め0.
85％食塩水にて洗浄後、それぞれ該菌体を破砕し遠心分
離にてそれぞれ上澄液（粗酵素液）を得る。

これらの粗酵素液を用いて各種菌体のグルタチオンチオ
ールエステラーゼ活性を次のようにして測定した。それ
ぞれの粗酵素液100μｌを1Mトリス緩衝液100μｌ、15mM
S−アセチルグルタチオン10μｌ、及び蒸留水790μｌ
と混和して反応液として、それぞれ波長240nmでの吸光
度の減少を測定した。その結果を下表に示す。

実施例１上記試験例１でグルタチオンチオールエステラーゼ活性
を有することが認められた菌である、サッカロミセス
セレビジエ DKD-5D-Hを、10lの栄養培地（２％グルコ
ース１％酵母エキス、２％ペプトン）で30℃、24時間培
養して100gの湿菌体を得た。

この湿菌体を50mlの0.85％食塩水に懸濁し、ダイノミル
で０℃、３分間菌体破砕処理を行い、この菌体破砕液を
遠心分離して上澄液（粗酵素液）を得た。この粗酵素液
をDEAEセルロース、セファデックスG-150、ブチルトヨ
パール、ヒドロキシルアパタイト等の各種カラムクロマ
トグラフィーで精製し且つ40℃、30分の熱処理して精製
グルタチオンチオールエステラーゼを得た。

上記の精製グルタチオンチオールエステラーゼの活性画
分は、３つに分かれた（画分を、便宜上P1画分、P2画
分、及びP3画分とする）。その中のP3の画分を用いて、
50mMコエンチームA200μｌ、25mM S−アセチルグルタチ
オン400μｌ、1Mトリス緩衝液（pH8.0）100μｌ、蒸留
水100μｌ、及び酵素液（P3画分）200μｌで反応させ、
更に100μｌの酵素液と100μｌのＳ−アセチルグルタチ
オンを随時添加し、反応させたところ、約５時間後に
は、理論収率のほぼ90％収率でアセチルCoAが生成し
た。

実施例２実施例１で得られた菌体を、それぞれ次の如く処理して
種々の処理菌体を調製した。

〔調製１〕上記菌体1gを1mlの10mMトリス緩衝液（pH7.0）に懸濁
し、これに0.1mlのトルエンを加え30℃にて激しく攪拌
し、トルエン処理菌体を調製した。

〔調製２〕上記菌体1.25gに、0.75gのアクリルアミド（モノマ
ー）、40mgのビスアクリルアミド、0.5mlのジメチルア
ミノプロピオニトリル、0.5mlの2.5％過硫酸カリウムを
加え、ゲル化した後、１〜2mm角に切断した固定化菌体
を調製した。

〔調製３〕上記固定化菌体〔調製２〕について、〔調製１〕におけ
ると同様トルエン処理を行い、トルエン処理固定化菌体
を調製した。

以上の如くして調製した各種処理菌体、及び未処理菌
体、菌体破砕液各1gを、それぞれ、15mM S−アセチルグ
ルタチオン20μｌ、15mMコエンチームA20μｌ、及び1M
トリス緩衝液（pH7.0）100μｌ（1ml）の反応液と混合
し、これらをそれぞれ37℃20分反応させ、アセチルCoA
を生成させた。

生成したアセチルCoAは下表の通りであった。

実施例３実施例１の反応を、種々の金属イオン（下表に示す金属
化合物使用）の存在下で行った。その結果、生成したア
セチルCoAの生成量は下表の通りであった。

実施例４実施例１の反応を、下表に示す如く種々pHを変え行っ
た。その結果、アセチルCoAの生成量は下表の通りであ
った。

〔発明の効果〕本発明のアセチルCoAの製造法によれば、簡易な方法で
安価にアセチルCoAを製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルタチオンチオールエステラーゼ活性含
有体を用いてコエンチームＡとＳ−アセチルグルタチオ
ンとからアセチルCoAを生成させることを特徴とするア
セチルCoAの製造法。
【請求項２】グルタチオンチオールエステラーゼ活性含
有体が、酵母菌体、酵母抽出液、物理化学的処理酵母菌
体あるいは固定化酵母菌体である、特許請求の範囲第
（１）項記載のアセチルCoAの製造法。
【請求項３】グルタチオンチオールエステラーゼ活性含
有体である酵母菌体が、サッカロミセス属、カンディダ
属、ハンセヌラ属、チゾサッカロミセス属、ピッチャ属
あるいはクロエッケラ属に属する菌体である、特許請求
の範囲第（１）項記載のアセチルCoAの製造法。
【請求項４】固定化酵母菌体において、酵母菌体の固定
化に使用する担体が、ポリアクリルアミドゲル、光硬化
樹脂、アルギン酸カルシウム、カラギーナンあるいは寒
天である、特許請求の範囲第（２）項記載のアセチルCo
Aの製造法。
【請求項５】固定化菌体を用いて連続反応を行わせる、
特許請求の範囲第（４）項記載のアセチルCoAの製造
法。