JPH0695959B2 - 総クレアチンキナ−ゼ又はイソエンチ−ムの測定用分析要素及び測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関する。特に、本発明は水性液
体、例えば生物学的液体中の総クレアチンキナーゼ又は
そのイソエンチームの測定方法に関する。本発明は、ま
た、このような方法に有用な多層分析要素に関する。

〔従来の技術〕

ヒト血清中のクレアチンキナーゼ（本明細書ではCKと略
すが、クレアチンホスホキナーゼ、CPK又はATP:クレア
チンホスホトランスフェラーゼE.C.2.7.3.2.としても知
られている）の活性の測定は骨格筋の病気、例えば心筋
の疾患を診断するため最も感度の高い実験室法の一つで
あると考えられている。総CK測定は、例えば、進行性筋
萎縮症、皮膚筋炎及び特に心筋梗塞の診断に有用であ
る。

総クレアチンキナーゼの標準分析（すなわち、全部のイ
ソエンチームの分析）は、一般に下記の式で説明される
正反応又は逆反応を使用するものである。

クレアチン＋アデノシン−５′−トリホスフェート（AT
P）クレアチンホスフェート＋アデノシン−５′−ジ
ホスフェート（ADP）正反応及び逆反応の両方が分析操
作に使用されるが、逆反応の使用は正反応より約６倍早
いので、逆反応を使用するのが好ましい。次いで、ATP
の存在を多数の比色法又は電位差滴定法によって測定す
ることができる。

CKは、ヒトの体液及び組織中に３種のイソエンチームの
形、すなわち、例えば筋肉中にはCK-MM、例えば脳中に
はCK-BB、例えば心筋中にはCK-MBの形で存在する。健康
なヒトの血清に生ずるCK活性は、CK-BBが一般に血液中
に流入しないので、通常、CK-MMイソエンチームによ
る。健康な個体では、CK-MBは一般に一定の臓器、例え
ば心筋に限定される。しかしながら、心筋が心筋梗塞の
場合のように損傷を受けている場合には、CK-MBは血清
中に放出され、そこで検出される。

生物学的液体中のCK-MBの測定方法において遭遇する困
難は、他の２種のイソエンチームからの阻害である。実
用のためには、液体中のCK-BBの量はほとんどの測定に
おいて無視しうると考えられる。CK-MBの測定方法にお
いて、Ｍサブユニットを特定の抗体で沈澱又は抑制させ
てCK-MMの阻害を排除し、次いで、残留するハイブリッ
ドイソエンチームCK-MBを測定することが知られてい
る。

液体分析に有用な乾式多層分析要素の開発は、比較的最
近に臨床化学に寄与した。これらの要素は、一般に、そ
の上に記録層及び多孔性拡散層が被覆されている支持体
を有する。記録層は、一般にポリマー結合剤（例えばゼ
ラチン）及び場合により、試薬、緩衝剤、界面活性剤等
を含めて他の成分を１種以上含む。

米国特許第4,547,461号明細書に記載されているような
層CKの測定に有用な要素を含めて、多数の多層分析要素
が種々の分析のため設計され、市場で使用されてきた。
このような要素は、一般に、要素をできるだけ薄くし、
生産コストを低減するために、記録層に約5.5g/m²以下
（乾燥被覆量）の結合剤物質を用いて製造された。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、このような要素は、高湿度環境、例えば
25℃で相対湿度50％で安定性が低く、室温保持特性が低
いことが分かった。更に、このような分析要素の製造に
使用される製造方法は、必ずの種の環境で実施される。
このような条件下での低い安定性は、重大な問題であ
る。このことは、生産者及び使用者による要素の取り扱
いに柔軟性を制限する。生産者は，要素を高湿度にさら
す時間を制限しようとしなければならない。更に、使用
者が万一、使用前に保存しておく冷凍室から要素を出し
てしまった場合には、要素は分析において誤った結果を
生じるであろう。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の問題点は、少なくとも8g/m²の被覆量で存在する
結合剤物質を含む記録層を有する総クレアチンキナーゼ
又はそのイソエンチームの測定用の多層分析要素を用い
て克服された。

本発明は、更に、 （Ａ）クレアチンキナーゼに対する基質、該基質とクレ
アチンキナーゼとの反応に応答して検出可能な変化を生
じる指示薬組成物及び少なくとも8g/m²の被覆量で存在
する結合剤物質を含む記録層を有する分析要素と、クレ
アチンキナーゼ又はそのイソエンチームを含むと思われ
る液体の試料を接触させる工程、及び （Ｂ）クレアチンキナーゼ又はそのイソエンチームの存
在により起こる検出可能な変化を測定する工程を含む総
クレアチンキナーゼ又はそのイソエンチームの測定方法
を提供する。

〔実施態様〕

本発明は、水性液体中の総クレアチンキナーゼ又はクレ
アチンキナーゼイソエンチームの測定（定性又は定量測
定）に関する。特に、本発明は動物又はヒトの生物学的
液体、好ましくはヒトの液体を分析するため使用するこ
とができる。このような液体は、全血、血漿、血清、リ
ンパ液、胆汁、尿、脊髄液、痰、汗等及び糞便排泄物を
含むが、これらに限定されない。骨格筋、心臓、腎臓、
肺、脳、骨髄、皮膚等のようなヒト又は動物の組織の液
体調整物を分析することもできる。本発明の実施に好ま
しい生物学的液体は、ヒト血清である。試験試料を希釈
しても、又は希釈しなくてもよい。

好ましい実施態様において、本発明は、おそらくCK-MM
及びCK-BBをも含む生物学的液体中のクレアチンキナー
ゼのイソエンチーム、例えばクレアチンキナーゼ−MBを
選択的に測定する免疫化学的方法に関する。他のイソエ
ンチームは同様に測定することができる。一般に、本発
明方法は、分析すべき液体を本発明の分析要素（詳細は
以下に記載する）と接触させることを含む。イソエンチ
ームの分析には、その接触前、又はその接触と同時に、
液体試料を試料中に存在する問題のイソエンチーム、例
えばCK-MM及びCK-MBイソエンチーム中のＭサブユニット
の酵素活性と優先的に反応しうるか又はＭサブユニット
の酵素活性を優先的に阻害しうる１種以上の抗体と接触
させる。この例で、CK-MBイソエンチームのＢサブユニ
ットは、抗体の存在によって理想的に影響されず、従っ
て、検出可能な変化を生ずる多数の反応式のいずれかで
自由に反応する。このような分析において、CK-BBの量
は、一般に無視しうると考えられる。次に、生ずる検出
可能な変化を直接、液体試料中のCK-MBイソエンチーム
の量に相関させる。

検出可能な変化は、その変化がクレアチンホスフェート
の反応、又は正反応の方向での式（１）の反応による反
応生成物から起こる限り、電位差の変化又は光学濃度の
変化であってよい： 最も簡単な形態では、分析は、例えばPCT出願82/2213号
明細書に記載されているように、クレアチンホスフェー
トの消失又はクレアチンの出現を測定することができ
る。

しかしながら、一般に、式（１）の反応は、ATP又はそ
の反応生成物が更に反応した結果として電位差の変化又
は光学濃度の変化を生じる他の酵素反応を１種以上伴
う。電位差の変化を発生する場合には、イオン感知電極
を用いて電気的出力の変化割合を測定することによって
クレアチンキナーゼ又はそのイソエンチームを測定す
る。例えば、米国特許第4,042,462号明細書は、前記の
式（１）の反応と組み合わせて、下記の式（２）〜
（４）の酵素反応列の結果としての酸素の吸収を測定す
るため電位差滴定を開示している： 前記式中、NADP（NADPH）はニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフェート（同じものの還元された形）
であり、G-6-DPHはグルコース−６−ホスホデヒドロゲ
ナーゼであり、ETAは電子移動剤である。

CK又はそのイソエンチームは、本発明において、光学濃
度の変化を測定することによって測定するのが好まし
い。この変化は、比色法、螢光測定法又は光度測定法上
の変化であってよく、光の出現割合、光学濃度の増加又
は減少の割合及び一つの波長から別の波長への吸収にお
ける移動の割合を含むことを意味する。例えば、米国特
許第4,235,961号明細書には、前記の式（１）の反応
を、検出可能な発光を生じる下記の式（５）の反応と組
み合わせる光度測定分析が記載されている： 前記の式中PPiはピロホスフェートを表す。

更に詳述すれば、200〜900nmの波長で光学濃度の変化を
測定する比色法によって総CK又はイソエンチーム、例え
ばCK-MBを測定する。NADH（すなわち、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド、還元形）又はNADPHを下記の
連続する酵素反応式により測定する場合のように、400n
m以下の波長では、一般に電磁スペクトルの紫外領域で
測定する。

前記の式（１）、（２）及び（３）の反応は、J.Clin.C
hem.Clin.Biochem.15巻255〜260頁（1977）及び米国特
許第4,220,714号明細書に記載されているように、一緒
に使用することができる。

式（１）の反応で始まり、下記の（６）及び（７）の反
応にNADHを使用する同様の連続反応列は、米国特許第4,
352,881号明細書に記載されている。

他の比色分析は、無色のテトラゾリウム塩を還元し、式
（８）の反応により着色色素を形成することによって更
に式（３）又は（７）の反応を実施する： このような分析法は、例えば米国特許第4,012,286号及
び同第4,247,633号明細書に記載されている。

前記の分析に必要な試薬及び酵素は、市場で入手しう
る。それぞれの場合に、指示薬組成物は分析に必要な非
酵素試薬を含む。

本発明の好ましい実施態様においては、総CK、又はイソ
エンチーム、CK-MB活性を下記の反応列によって測定す
る： これらの組み合わせた反応において、比色法で検出可能
な種の形成割合は、液体試料中のクレアチンキナーゼ又
はイソエンチーム活性の割合に直接比例する。この反応
列の詳細は、前記の米国特許第4,547,461号明細書に記
載されている。

前記の反応列の第一の反応は、水性液体試料中でクレア
チンキナーゼの存在でクレアチンホスフェートとADPと
が反応してクレアチン及びATPを形成する反応である。
文献に周知のとおり、この反応は通常、酵素補助因子、
例えば２価金属イオンの存在で進行する。補助因子の例
を以下に記載する。クレアチンホスフェートは、多数の
出所から市販されている生物学的化合物である。クレア
チンホスフェートは、反応の進行に化学量論的に必要な
量より過剰の量で本発明の実施に使用する。

ADPは、ヌクレオチドATPの加水分解された形である。分
析に使用するADPの量を、以下に更に詳述する。

前記の（２）式の反応で示したように、グリセロールキ
ナーゼは、ATPの存在でグリセロールをホスホリル化し
てＬ−α−グリセロホスフェートにする反応を触媒す
る。一般に、任意のグリセロールキナーゼが本発明の有
効な実施に有用であるが、大腸菌（E.coli）及びカンジ
ダ・ミコデルマ（Candida mycoderma）から得られるも
のが好ましい。他の資源からのグリセロールキナーゼ酵
素は、文献に周知である。

本発明の実施に有用なグリセロールは、市場で容易に入
手しうるか、又は文献に周知の技法を用いて製造するこ
とができる。グリセロールは、遊離形で、又はグリセロ
ールの脂肪酸エステル（例えばトリグリセリド）として
得られる。本発明の実施には、遊離グリセロールを使用
するのが好ましい。

反応列における次の工程は、Ｌ−α−グリセロホスフェ
ートオキシダーゼ及び一般に、電子受容体を酸化して比
色法で検出しうる種を生成する反応に関する。この種
は、液体試料中に含まれる被分析物に定量的に関係す
る。

Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼは、種々の
資源から誘導されうる微生物酵素である。この酵素の詳
細な説明及び資源の例示は、米国特許第4,241,178号明
細書に記載されている。

Ｌ−α−グリセロホスフェートの酸化は、電子受容体の
存在で起こる。ホスフェートをオキシダーゼで酸化して
同時に比色法で検出可能な種を生成しうる任意の電子受
容体が本発明に使用するのに適当である。

一つの実施態様では、電子受容体は、色原体（以下に更
に詳述する）を含む指示薬組成物であってよい。このよ
うな色原体を還元して光学濃度の変化（前記のような）
を生ずることができる。次いで、これらの変化の割合を
監視して被分析物の活性を測定することができる。一定
のインドフェノール類、フェリシアン化カリウム及び一
定のテトラゾリウム塩は、この実施態様の実施に電子受
容体として有用である。例えば、単独又はフェナジンメ
トスルフェート若しくはフェナジンエトスルフェート
（すなわち、電子移動剤）と併用した2,6−ジクロロフ
ェノールインドフェノール、並びに単独又はフェナジン
メトスルフェートと併用した２−（ｐ−インドフェニ
ル）−３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−2H
−テトラゾリウムクロリドが、特に有用である。

別の好ましい実施態様では、電子受容体がホスフェート
を酸化して中間体の種を生成し、これを次いで下記の反
応式により指示薬組成物と反応させて比色法で検出可能
な種を生成させる： 中間体種＋比色用指示薬組成物→ 比色法で検出可能な種・・・・・・・・・（10b） この好ましい実施態様を実施する際の総クレアチンキナ
ーゼの定量は、電子受容体として酸素並びに（１）過酸
化物活性を有する物質及び（２）色原体を含む比色指示
薬組成物を使用して達成される。このような場合に、式
（10a）の反応により、ジヒドロキシアセトンホスフェ
ート及び過酸化水素を生じる。

式（10b）の反応で過酸化水素と反応する比色指示薬組
成物は、文献に周知である。一般に、このような組成物
は、過酸化物活性を有する物質を含む。この物質はペル
オキシダーゼであるのが好ましい。

ペルオキシダーゼは、過酸化水素が別の物質を酸化する
反応を触媒する酵素である。一般に、ペルオキシダーゼ
は、鉄ポルフィリンを含む共役蛋白質である。ペルオキ
シダーゼは、西洋わさび、バレイショ、いちじくの樹液
及びかぶら中（植物ペルオキシダーゼ）、ミルク中（ラ
クトペルオキシダーゼ）及び白血球中（ベルドペルオキ
シダーゼ）に存在する。ペルオキシダーゼは、微生物中
にも存在し、醗酵によって製造される。ある種の合成ペ
ルオキシダーゼ、例えばTheorell及びMaehlyによってAc
ta Chem.Scand.、４巻422〜434頁（1950）に記載された
ものも有用である。好ましいペルオキシダーゼは、西洋
わさびから得られるものである。

ヘミン、メトヘモグロビン、オキシヘモグロビン、ヘモ
グロビン、ヘモクロモゲン、アルカリヘマチン、ヘミン
誘導体、チオシアン酸鉄、タンニン酸鉄、フェロシアン
化鉄、クロム酸塩（例えばクロム硫酸カリウム）のよう
な物質をシリカゲル等に吸収させたものも、有用である
が、前記のもの程ではない。

比色指示薬組成物は、定量可能な比色変化を直接又は間
接的に生じ、その変化の割合を定量的に測定しうる着色
又は無色の物質である色原体を含む。色原体は、色素、
色素形成剤又は色素前駆物質であってよい。色原体の反
応によって生ずる色は、電磁スペクトルの可視範囲（す
なわち400〜900nm）にある。

本発明に有用な過酸化水素及びペルオキシダーゼの存在
で発色する色原体は（必要に応じて発色カプラーと共
に）、モノアミン、ジアミン、フェノール、ポリフェノ
ール、芳香族酸、ロイコ染料、トリアリールメタン色素
等を含む。

ペルオキシダーゼの存在で酸化されうる物質を含み、比
色法で検出可能な種を生じうる他の色原体は、ある種の
色素形成組成物を含む。一つの態様では、このような色
原体は、ペルオキシダーゼによって酸化されたときに、
それ自体と又はその還元形と結合して色素を生じうる化
合物を含む。このような自己結合化合物は、文献に周知
の種々のヒドロキシル化化合物を含む。

別の態様では、検出可能な種は、カプラー、例えばフェ
ノール基又は活性メチレン基を含むカプラーと酸化縮合
を受けうる、ペルオキシダーゼで酸化可能な化合物を、
このようなカプラーと一緒に含む色原体によって得られ
る。このような酸化可能な化合物の代表的なものは、ベ
ンズインデン及びその同族体、ｐ−フェニレンジアミ
ン、ｐ−アミノフェノール、４−アミノアンチピリン等
である。多数の自己結合（又はカップリング）化合物を
含めて広範なこの種のカプラーが文献に記載されてい
る。自己結合化合物を含めて広範な着色カプラー（N,N
−ジ置換トルイジン、ジヒドロインドール及びテトラヒ
ドロキノリンを含む）が文献に公知である。

更に別の好ましい態様では、比色法で検出可能な種は、
ロイコ色素をペルオキシダーゼで誘発される酸化で対応
する色素形を生じることによって得られる。

米国特許第4,241,178号（前記参照）及び同第4089747号
明細書に記載されているものを含めて種々のロイコ色素
が、本発明の実施に色原体として有用である。本発明に
使用するのに最も好ましいロイコ色素は、米国特許第4,
089,747号明細書のトリアリールイミダゾール類であ
る。

特に有用なロイコ色素は、２−（3,5−ジメトキシ−４
−ヒドロキシフェニル）−4,5−ビス（４−ジメチルア
ミノフェニル）イミダゾール、２−（４−ヒドロキシ−
３−メトキシフェニル）−4,5−ビス（ｐ−ジメチルア
ミノフェニル）1H−イミダゾール及び２−（３−エトキ
シ−４−ヒドロキシフェニル−4,5−ビス（ｐ−ジメチ
ルアミノフェニル）−1H−イミダゾールを含む。

好ましい比色用指示薬組成物を含めて、本発明の実施に
有用な試薬、基質及び酵素の量は、試料中のクレアチン
キナーゼ−又はイソエンチームの濃度、検出装置の精巧
さ及び生じる検出可能な変化に著しく左右される。量
は、文献の教示から臨床化学の当業者によって容易に決
定されうる。

１種以上のアデニレートキナーゼ阻害剤を本発明の実施
に使用することができる。このような阻害剤及び一般的
に使用される量は、文献に公知である。

本発明の分析要素は、更に、CK活性剤、金属イオン補助
因子（例えばマグネシウム、カルシウム及び鉄イオ
ン）、溶剤、緩衝剤、界面活性剤等を含めて、総CK又は
CK-MBの測定に一般的に使用される他の試薬又は添加剤
を含んでいてよい。完全なクレアチンキナーゼ活性を発
揮させるCK活性剤を１種以上含むのが特に望ましい。こ
のような活性剤はメルカプト基含有化合物（チオール含
有化合物又はスルフヒドリル化合物としても知られてい
る）、例えばチオグルコース、ジチオトレイット、ジチ
オエリトリット、メルカプトエタノール、グルタチオ
ン、Ｎ−アセチルシステイン、システイン、チオグリセ
ロール、チオグリコール酸等を臨床化学における当業者
に公知の量で含む。

要素は、カルシウムイオンの阻害作用を抑制することに
よってCK感度を改良するため適当な量のエチレンビス
（オキシエチレンニトリロ）四酢酸を含むのが有利であ
る。

CKイソエンチームを測定するため本発明の実施に有用な
抗体は、Ｂ又はＭサブユニットに対して特異的であって
よく、抗血清から公知の操作を使用して製造することが
できる。抗体を、使用前に抗血清から単離するか、又は
未精製抗血清を使用することができる。抗血清は、一般
に、適当に接種したサル、豚、馬、山羊、兎、ラット、
マウス、鶏、牛及びこの目的に有用であることの知られ
ている他の動物から得られる。好ましい抗体源は、適当
に接種された山羊である。抗体は、一般に適当な担体上
に固定した形で使用する。本発明の分析には、要素自体
内に１種以上の抗体を必要に応じて、付加的な担体物質
を用いずに固定するか、又は分析の間に試験試料の前に
或いはそれと同時に要素に添加することができる。CK-M
Bの測定のため有用な抗体及び担持物質の更に詳細なこ
とは、例えば、米国特許第4,237,044号及び同第4,260,6
78号明細書に記載されている。

本発明方法を、乾式多層分析要素を用いて実施すること
もできる。要素は、非多孔性支持体とその上に順次、液
体接触で、記録層及び等方性に多孔性の拡散層を有して
成る。試薬及び／又は抗体を多孔性拡散層中に、浸漬、
含浸、被覆又は他の適当な技法によって混入することが
できる。一般には、これらを被覆組成物中に混入する
が、抗体は、既に被覆された帯域中に浸漬又は薄め被覆
によって混入する。

多孔性拡散層を作るため有用な吸収性担持物質は、不溶
性であり、水又は生物学的液体、例えば全血若しくは血
清にさらされてもその構造的一体性を保有する。有用な
要素は、紙、多孔性粒状構造体、多孔性ポリマーフィル
ム、セルロース、木材、ガラス繊維、織布及び不織布
（合成及び非合成）等から製造することができる。この
ような層を製造するのに有用な物質及び操作は、文献に
良く知られている。

多孔性拡散層は、任意の適当な繊維状又は非繊維状物質
又はその一方若しくは両方の混合物から製造することが
できる。この層の空隙率及び平均孔径は、意図する用途
に応じて変動することができる。例えば、高分子量物質
を含む全血又は他の液体試料を分析する場合には、空隙
率及び平均孔径は一般に血清又は尿を分析すべき場合よ
り大きい。

繊維状物質を、米国特許第4,292,272号明細書に記載さ
れているように、適当な結合剤物質と混合するか又は布
に織り込んで用いて有用な拡散層を製造することができ
る。また、ポリマー組成物（例えばブラッシュポリマ
ー）又は粒状物質、例えば、結合接着剤を用いて又は用
いずに一緒に結合されたビーズから、米国特許第3,992,
158号、同第4,258,001号及び同第4,430,436号明細書並
びに日本特許出願公開第57（1982）‐101760号公報に記
載されているようにして、拡散層を製造するのが好まし
い。拡散層は等方性に多孔性である、すなわち、孔度が
粒子、繊維、ポリマーストランド等の間の連続空間又は
孔によって生じるように、層のどの方向でも同一である
のが望ましい。

支持体は、任意の適当な寸法安定性で、200〜900nmの波
長の電磁線を透過する、好ましくは非多孔性で透明な
（輻射線透過性）物質である。有用な支持体は、紙、金
属箔、ポリスチレン、ポリエステル〔例えばポリ（エチ
レンテレフタレート）〕、ポリカーボネート、セルロー
スエステル（例えば酢酸セルロース）等から作ることが
できる。

本発明の要素は、多孔性拡散層の下に記録層を有する。
記録層は分析に必要な試薬若しくは酵素１種以上、界面
活性剤、緩衝剤等を含んでいてよいが、このような物質
を含まなくてもよい。記録層は、１種以上の親水性結合
剤物質（例えば、処理したか若しくは未処理のゼラチン
及び他のコロイド状物質、多糖類、ビニルピロリドンポ
リマー、アクリルアミドポリマー等）を含む。他の結合
剤物質の例は、当業者に知られている。層は、標準硬化
剤で硬化されたゼラチンを含むのが好ましい。

この要素の安定性を改良するために、記録層が少なくと
も8g/m²（乾燥重量）の結合剤物質、好ましくは少なく
とも10g/m²（乾燥重量）の結合剤物質を含むことが重要
である。被覆量は、通常の被覆及び乾燥工程の後に、
「乾燥重量」として測定される。しかし、若干の結合剤
物質は乾燥後にも若干の水分を保有することが知られて
いる。例えば、好ましい結合剤物質であるIV型脱イオン
ゼラチンは、「乾燥重量」被覆量に約20重量％の水分を
含む。

要素は、１個以上の他の層、例えば付加的拡散層、輻射
線遮断若しくはフィルター層、下塗層、バリヤー層、試
薬層等を有していてよい。層は、一般に、相互に液体接
触〔液体、試薬及び反応生成物（例えば着色色素）が隣
接層の重なった領域の間を通過又は移動しうることを意
味する〕している。

本発明の好ましい実施態様は、支持体上に、前記の指示
薬組成物（例えば比色指示薬組成物）を含む記録層、ク
レアチンホスフェート、AMP、ADP及びポリホスフェート
アデニレートキナーゼ阻害剤を含む試薬層、場合により
下塗層及び場合により、CK活性剤又はＭサブユニットに
対する抗体少なくとも１種又はその両方を含む多孔性拡
散層を順次、液体接触状態で有する、CK-MBの測定に有
用な多層要素である。試薬層は、一般に１種以上の親水
性結合剤物質（例えばゼラチン、ビニルピロリドンポリ
マー、アクリルアミドポリマー等）、界面活性剤及び他
の添加剤を含む。下塗層は当業者に公知の下塗物質、例
えばビニルピロリドンポリマー、アクリルアミドポリマ
ー等を１種以上含んでいてよい。

前記の、好ましい比色指示薬組成物を使用する場合に
は、記録層は更にα−グリセロホスフェートオキシダー
ゼを含み、試薬層は更にグリセロール及びグリセロール
キナーゼを含む。

場合により、本発明の要素は、要素の最外層である第二
の多孔性拡散層を含んでいてもよい。第二の多孔性拡散
層は、第一の多孔性拡散層のそれと同一又は異なる物質
から構成することができる。例えば第一の拡散層は、米
国特許第3,992,158号明細書（前記）により製造された
ブラッシュポリマーを含み、第二の拡散層は米国特許第
4,258,001号明細書（前記）により製造された粒状物質
から構成することができる。

本発明により、分析方法に応じて異なる種々の要素を製
造することができる。任意の所望の幅の長いテープ、シ
ート、スライド又はチップを含めて種々の形で要素を形
成することができる。

本発明の分析は、手操作で又は自動的にすることができ
る。一般に、乾式要素を使用する場合、要素を供給ロー
ル、チップ包装物又は他の供給源から採取し、試験すべ
き液体試料（例えば１〜200μｌ）と物理的に接触させ
ることによって総CK又はCKイソエンチームを測定する。
このような接触は、任意の適当な方法で、例えば要素を
試料中に浸漬するか、又は好ましくは適当な分配手段を
用いて一滴の試料を手又は機械で要素に落とすことによ
って達成される。

試料を施した後、要素をコンディショニング、例えばイ
ンキュベーション、加熱等、任意の試験結果を得るのを
促進又は容易にするのに望ましい処理に付す。インキュ
ベーションの前に、CK−活性剤及びＭ−サブユニットに
対する抗体が要素内に混入されていない場合には、これ
らを要素に個々に又は一緒に添加することもできる。

試験試料中の要素に添加されたCK又はイソエンチーム
は、ADPとクレアチンホスフェート基質との反応を試料
中に存在する被分析物の量に基づいた割合で触媒する。
クレアチンホスフェートの反応又は反応生成物（例えば
ATP）の形成による検出可能な変化（例えば色素形成）
の割合は、反射若しくは透過分光光度測定、電位差滴定
又は光度測定用の適当な検出装置が設けられている帯域
に要素を導通することによって定量することができる。
適当な検出装置及び操作は、文献に公知である。

下記の実施例は、本発明の実施を説明するものである。

この明細書に使用するI.U.は、酵素活性に関する国際単
位を表し、酵素に関する標準pH及び温と条件下に１分当
たりに１マイクロモルの基質の変換を触媒するのに必要
な酵素活性の量を1I.U.と定義する。

例１ クレアチンキナーゼ−MBの分析 この例では、本発明の多層分析要素を使用してCK-MBを
測定した。本発明の範囲外の対照要素を使用した分析
を、本発明の要素を用いた分析と比較した。

評価したすべての要素は、下記の一般的構造及び成分を
有していた。対照要素Ａは、同様に試験した。これは、
拡散層に抗−CK-MMを更に含む以外は、総クレアチンキ
ナーゼのため現在市販されている要素と同様にして製造
した。対照要素は、その記録層が5.4g/m²（乾燥被覆
量）のゼラチン結合剤被覆量を有する以外は、本発明の
要素と同様であり、本発明の要素は、記録層にゼラチン
を10.8g/m²（乾燥被覆量）含んでいた。

抗血清を、使用するブラッシュポリマー被覆組成物中に
ボールミリングして、各要素の多孔性拡散層を形成させ
た。

要素を下記の方法で安定性について試験した。両方の要
素を25℃、相対湿度50％又は、−18℃、相対湿度15％の
いずれかで11日間、保持した。各要素について、低湿度
に保持した要素に対比して、高湿度に保持した要素につ
いて、高濃度及び低濃度CK-MB液体で測定したイソエン
チーム活性における速度差を測定することによって感度
保有％を計算した。換言すれば、感度保有％は下記の等
式で得られる： 〔高湿度での（Rate₂−Rate₁）÷ 低湿度での（Rate₂−Rate₁）〕×100 〔式中Rate₂は、約178 I.U./lのCK-MBを含む液体を使用
して測定したイソエンチーム活性を表し、Rate₁は、約1
2 I.U./lのCK-MBを含む液体を使用して測定したイソエ
ンチーム活性を表す〕。

高湿度は少なくとも50％の相対湿度（25℃で）、低湿度
は15％以下の相対湿度（−18℃で）である。CK-MB液体
のスポットを要素の拡散層上にスポット付けし、６分後
37℃で分光光度計を用いて要素の応答を監視した。

下記の第Ｉ表に、得られた安定性のデータを纏める。記
録層に多量の結合剤物質を含む本発明の要素は、高湿度
保持条件下で従来の対照要素Ａより著しく安定であっ
た。

第Ｉ表 要素 感度保有％ 対照Ａ 73 例 １ 93 例2: 薄め被覆した抗血清を用いたクレアチンキナーゼ
の測定 ７日間の保存試験を行うこと及び要素の既に被覆し、乾
燥した多孔性拡散層中に抗血清を薄め被覆（wash coa
t）した以外は、例１により分析要素を製造し、試験し
た。対照要素Ｂを同様に製造し、試験した。対照要素
は、記録要素に5.4g/m²（乾燥被覆量）のゼラチン結合
剤を含むが、本発明の要素は、記録層に10.4g/m²（乾燥
被覆量）の結合剤を含む。下記の第II表に、両方の要素
に関する安定性試験の結果をまとめる。本発明の要素が
対照要素Ｂより改良された安定性を示すことが判る。

第II表 要素 感度保有％ 対照Ｂ 36 例 ２ 42 例3: ビード拡散層を有する要素を使用するクレアチン
キナーゼ−MBの測定 多孔性拡散層を下記の組成を有するビード構造体とした
以外は例１と同様にしてクレアチンキナーゼ−MBの測定
に有用な分析要素を製造した： ポリ（ビニルトルエン−コ−p-t−ブチルスチレン−コ
−メタクリル酸）（61:37:2、重量比）のビード、 ポリ（アクリル酸メチル−コ−２−アクリルアミド−２
−メチルプロパンスルホン酸−コ−２−アセトアセトキ
シエチルメタクリレート）（85:10:5重量比）接着剤、 ゾニル（Zonyl）FSN（商標）界面活性剤、 Ｎ−アセチルシステイン及び抗血清。

記録層は、10.8g/m²（乾燥被覆量）のIV型脱イオンゼラ
チン結合剤を含んでいた。

記録層にゼラチン結合剤を5.4g/m²（乾燥被覆量）しか
含まない以外は同様にして対照要素Ｃを製造した。

下記の第III表には、例１に記載した操作により要素に
関して得られた安定性データをまとめる。本発明の要素
は、対照要素Ｃより著しく高い安定性を有することが判
る。

第III表 要素 感度保有％ 対照Ｃ 56 例 ３ 92 例４ 総クレアチンキナーゼの測定 抗血清を省いた以外は、例１の操作により総クレアチン
キナーゼ測定用の分析要素を製造し、試験した。この要
素は、記録層にゼラチン結合剤を10.8g/m²（乾燥被覆
量）含んでいた。対照要素Ｄを同様にして製造し、試験
した。この要素はイーストマン コダック カンパニー
（ニューヨーク州ロチェスター）によって総CK分析用に
現在、市販され、前記の米国特許第4,547,461号明細書
に記載されているものと類似である。これは記録層にゼ
ラチン結合剤を5.4g/m²（乾燥被覆量）しか含まない。
第IV表には、試験液体が１種より多くのCKイソエンチー
ムを含む以外は例１の操作により得られた安定性試験の
結果をまとめる。本発明の要素が従来の対照要素Ｄより
著しく改良された安定性を有することが判る。

第IV表 要素 感度保有％ 対照Ｄ 20 例 ４ 82 〔発明の効果〕 このような要素の記録層における結合剤物質の被覆量を
著しく増す、すなわち、少なくとも8g/m²（乾燥被覆
量）に増すと、要素は高湿度条件下で著しく安定になる
ことが判明した。従って、要素は、生産時に一般に遭遇
する高湿度条件下で改良された室温保存性を有する。要
素は、更に、要素貯蔵における使用者の過失により不正
確な結果を生じ易くはない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ギャリー エドワード ノートン アメリカ合衆国 ニューヨーク 14612 ロチェスター，エジメアー ドライブ 140 (56)参考文献 特開 昭59−135900（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−108942（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−120957（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも8g/m²の被覆量で存在する結合
   剤物質を含む記録層を有する総クレアチンキナーゼ又は
   そのイソエンチームの測定用の多層分析要素。
2. 【請求項２】（Ａ）クレアチンキナーゼに対する基質、
   該基質とクレアチンキナーゼとの反応に応答して検出可
   能な変化を生じる指示薬組成物及び少なくとも8g/m²の
   被覆量で存在する結合剤物質を含む記録層を有する分析
   要素と、クレアチンキナーゼ又はそのイソエンチームを
   含むと思われる液体の試料を接触させる工程、及び （Ｂ）クレアチンキナーゼ又はそのイソエンチームの存
   在により起こる検出可能な変化を測定する工程を含む総
   クレアチンキナーゼ又はそのイソエンチームの測定方
   法。