JPH0698037B2 - 試料中の分析対象物の目視試験用のレインボーカラー発色試験組成物及び試験具 - Google Patents

試料中の分析対象物の目視試験用のレインボーカラー発色試験組成物及び試験具

Info

Publication number
JPH0698037B2
JPH0698037B2 JP62077645A JP7764587A JPH0698037B2 JP H0698037 B2 JPH0698037 B2 JP H0698037B2 JP 62077645 A JP62077645 A JP 62077645A JP 7764587 A JP7764587 A JP 7764587A JP H0698037 B2 JPH0698037 B2 JP H0698037B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
indicator
reduced
disulfide
test
hue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP62077645A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS62239054A (ja
Inventor
ジェームス・ピー・アルバレラ
スチーブン・シー・チャールトン
ジェームス・ダブリュ・ラインシュ
マリー・エラン・ワーチャル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Corp
Original Assignee
Miles Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Miles Inc filed Critical Miles Inc
Publication of JPS62239054A publication Critical patent/JPS62239054A/ja
Publication of JPH0698037B2 publication Critical patent/JPH0698037B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/525—Multi-layer analytical elements
    • G01N33/526—Multi-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Indicating And Signalling Devices For Elevators (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
  • Spinning Or Twisting Of Yarns (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Apparatuses For Bulk Treatment Of Fruits And Vegetables And Apparatuses For Preparing Feeds (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 I.発明の分野 本発明は、分析対象物の種々の濃度に対して種々の色相
を発し得る試験組成物及び試験具に関する。臨床的分析
対称物の目視試験が本発明の焦点である。
詳細には、本発明はレインボーカラー（RAINBOW）を発
する（多色呈色性の）、体液中の分析対象物、例えばグ
ルコースを測定するための自己表示試験具を提供する。
II.用途 比色試験は、目視試験として好都合に用いられており、
それを用いれば、比較的未熟練の者でも適切なカラー・
チャートとの単なる比較により、結果を経営的に得るこ
とができる。目視試験は、測定機器を必要としないため
安価で軽便である。現在、目視試験は尿試料中の、多く
の診断上重要な分析対称物の日常的なスクリーニング
に；糖尿病患者による、尿又は血液グルコースの家庭用
試験に；またその他の分野、例えば水の鉄含有料の試験
に用いられている。
しかしながら、現在入手可能な試験手段は、ある特定の
色の強度を分析対象物の濃度に関係づけるものである。
例えば、ある試験具は、グルコース濃度の増加に伴い、
無色から除々に淡青色を経て濃い青色に変化する。単色
の種々の濃淡よりも、一定範囲の（種々の）色相によっ
て示されたならば、視認が大巾に可能となり、それに伴
って正確度も増す。したがって、分析対称物の異った濃
度に対して異った色を発する試験組成物の方が使用が容
易であり、より正確な目視結果を与える。
グルコースのより高い濃度間の目視による識別を可能と
するために、現在入手可能な製品の多くは、２個の試薬
パッドを使用する方法をとっており、それらの片方が、
高い濃度域においてより良好な色差を示す。さもない
と、かかる製品は、150mg/dLを越えるグルコース濃度に
は極めて僅かに変化する濃い青色（又は濃い緑色）の濃
淡を示すのみである。対照的に、本発明の試験具は、０
〜800mg/dLの範囲に亘って、青色から海緑色、淡黄色、
更には赤色へと劇的な色変化を示す。
本発明は、特に臨床的に重要な分析対象物に対して一定
範囲の色相を生じせしめるために用いることのできる組
成物を提供する。特に、虹のスペクトル全ての色相を示
すことができる、全血のような体液中のグルコース測定
のための試験具を示す。
III.情報の開示 米国特許第4,490,465号は、測定範囲が拡大された、グ
ルコース測定用の試験系を開示している。上記系には、
少くとも１個のピリジン結合デヒドロゲナーゼと１個の
非ピリジン結合デヒドロゲナーゼが含まれている。その
一例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ／ニコチン
アデニンジヌクレオチド／ジアホラーゼ／テトラゾリウ
ム塩とグルコースデヒドロゲーゼ／ジクロロフェノール
インドフェノールとの複合系を用いたグルコース測定法
が挙げられる。バックグラウンド染料の使用によって、
得られた色素の中に黄色成分が、取入れられる。
DE32 11 167号は、それぞれが、触媒として作用する
ことにより基質を直接又は間接的に変換するとができる
少くとも２種の酵素系を請求している。上記明細書は
「互いに独立して」と限定しているが、これは基質と反
応する２つの系の存在下に、第１の系の補酵素の大部分
が消耗された後にのみ第２の系による反応が起こること
を意味するものである。
DE 32 47 894号は還元されたニコチンアデニンジヌ
クレオチドの測定のための試験系及び方法を開示してお
り、これにより、NAD（Ｐ）Ｈ、又はNAD（Ｐ）Ｈの形成
又は消耗下に反応する基質もしくは酵素の測定に、拡大
された測定範囲が提供される。上記系は、電気化学ポテ
ンシャルを異にし、かつNAD（Ｐ）Ｈの電子受容体とし
て互いに独立して作用する、数個の物質を同時に包含し
ていることを特徴とする。電子受容体の具体例として
は、ジクロロフェノールインドフェノール及びINT［塩
化２−（４−インドフェニル）−３−（４−ニトロフェ
ニル）−５−フェニルテトラゾリウム］が挙げられる。
上記明細書によれば、上記試験系は吸収材に含浸せしめ
ることができる。黄色成分が、バックグラウンド染料の
チタンイエローを包含せしめることによって、見られる
色素に加えられる。
1984年６月19日に公開された特開昭59−106299号公報に
は、グルタチオンレダクターゼと発色剤の存在下に、酸
化グルタチオンを用いてNAD（Ｐ）Ｈを評価する方法を
開示している。上記発色剤の例としては、5,5′−ジチ
オビス−（２−ニトロ安息香酸）、Ｎ−（１−アニリノ
ナフチル−４）マレイミド、β−ヒドロキシエチル−2,
4−ジニトロフェニルジスルフィド、2,2−ジチオピリジ
ン及びベンズイミダゾリルマレイミドが挙げられる。
欧州特許願第０−153−872号は、NAD（Ｐ）Ｈを、
（１）ペルオキシダーゼ又は酸化チオールレダクター
ゼ；及び（２）ジアホラーゼ又は電子キャリアと、色原
体の存在下に反応させることにより形成された色素（pi
gment）を測定することを伴うニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ホスフェート）の還元体を定量するた
めの方法を開示している。これら２つの反応は共通の基
質に対して作用しない。
これらの開示はいずれも、一方が、その場で生成される
黄色成分をはじめとする、レインボーの全スペクトを与
えることができるジスルフィドレダクターゼ系であると
共に、特定の最終的色相が分析対象物の濃度に依存する
２種の独立した触媒系から成る系を提供するものではな
い。
IV.発明の要約 本発明は、（ａ）対象の分析対象物との反応により、還
元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生成
せしめ得る触媒系；（ｂ）還元されたニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドとの反応により、還元された第１
の指示薬を生成せしめ得る第１の独立触媒系；及び
（ｃ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドとの反応により、第２の指示薬成分の色相変化を生じ
させ得る第２の独立触媒系から成り、該第２の独立触媒
系は、 （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ii）ジスルフィド基質；及び （iii）チオール指示薬を包含し、 ここで、上記ジスルフィドレダクターゼは、還元された
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド
基質との反応に触媒として作用して反応生成物を生成
し、この反応生成物が上記チオール指示薬を還元して、
還元された第２の指示薬を生成し、還元された第１及び
第２の指示薬の生成が実質的に同時に起って、特定の最
終的色相が分析対象物の濃度に依存して生ずることを特
徴とする、流体試料中の分析対称物の濃度を目視測定す
るための試験組成物を提供する。
系の１つが黄色の色相を与えることが好ましい。１つの
好ましい系においては、チオール指示薬が還元されて、
黄色の第２の指示薬を生成する。
上記成分は、溶解せしめて試験溶液とすることができ、
またキャリアマトリックス中に包含せしめて試験具のフ
ォーマット（形態）とすることもできる。
好ましい実施態様は、その場で作られる黄色をはじめと
する虹の全スペクトルを示すことができ、試験具の特定
の最終的色相が試料中のグルコースの濃度に応じて与え
られる全血グルコース試験具である。
V.発明の具体的説明 目視的色合わせ法は便利であり、高価な測定機器を必要
とせずに、分析対象物の濃度を十分正確に測定すること
を可能にする。色は彩度、明度及び色相のような要素に
分解することができる。色相（hue）は、通常、色（col
or）（例えばあるものが、青、赤又は黄色に「見える」
というように）とよばれている。本明細書では全て“色
相（hue）”を用いた。
一般的に、１つの色相は、ある形の単一指示薬と関連づ
けて考えられる。したがって、一定範囲の色相を発色さ
せるには、多くの異った指示薬分子が必要とされる。可
能な色相変化は限りない。指示薬は、１つの色相から他
の色相へ、１つの色相から無色へ、また無色から、ある
色相へと変化することができる。また、指示薬自体は色
相変化せずに、試験組成物を包含する試験具の形態が、
分析対称物を含有する試料と接触したときに試験具の色
相に明らかな変化が生ずるようにすることもできる。例
えば、指示薬の色相は、試験組成物と分析対象物との反
応前には不可視であるが、その反応が生じた後には可視
となる。試験具によって示される、１つの分析対称物濃
度と他の分析対象物濃度とに対する最終的色相変化は使
用者にとって可及的に明確であることが望ましいので、
無色から、ある色相へ、またある色相から無色への変化
が好ましいとされている。２種以上の指示薬を用いる場
合、少くとも１の指示薬成分がある色相から無色に変化
するのが好ましい。さもなければ、試験組成物又は試験
具の最終的色相は、発生する色相の種類が多くなるに従
って黒色に近づく。ある状態で原色、つまり赤、黄、
青、の１色を示す指示薬の生成及び／又は消失を調整す
ることがに望ましい。２種の指示薬成分を含む組成物を
用いることができる一方、３種の指示薬成分の使用が有
利であることが判明した。
下記の順序で下記の色相変化を示す指示薬を含有する試
験組成物を例にとって考えてみよう。
指示薬１） 青色から無色 指示薬２） 無色から黄色 指示薬３） 無色から赤色 上記指示薬が逐次反応するならば、試験組成物の見掛け
の色相は青色から無色、更に橙色（黄色＋赤色）となる
であろう。
しかしながら、指示薬２の色相が、指示薬１の色相変化
と同時に変化し、指示薬３の色相変化が後で起こる場合
には、試験組成物の見掛けの色相は、青色から緑色（青
色＋黄色）、黄色、橙色（黄色＋赤色）、更に赤色とな
るであろう。同様の例として下記のものが挙げられる。
指示薬１） 赤色から無色 指示薬２） 無色から黄色 指示薬３） 無色から青色 指示薬が逐次反応するならば、試験組成物の見掛けの色
相は赤色から無色、黄色、更に緑色（青色＋黄色）とな
ろう。もし、２種の指示薬の変化が同時に生じ、第３の
変化が後で起こるように上記のように指示薬を反応させ
たならば、試験組成物の見掛けの色相は赤色から橙色
（赤色＋黄色）、黄色、緑色（黄色＋青色）、更に青色
となるであろう。
色相の同時変化を伴う上記仕組みは、どちらも虹（レイ
ンボー）の全スペクトルを与えることができる。かかる
レインボーは、分析対象物の濃度間の差を理解し易いも
のとするために用いることができる。最も広い範囲の可
視色を与えるので望ましい。
問題は、１）最大の色相変化を独立して与える、色相変
化が惹起される指示薬を選択し；かつ２）これらの指示
薬が分析対象物の濃度にのみ対応して順次正しく反応す
ることを確実にするという２点である。
各々が、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（NADH）に対して反応性を有し、色相において１以
上の変化を与える、２種の独立した触媒系を用いること
により、一定範囲の色相が得られることが今や判明し
た。上記系はそれぞれNADHと実質的に同時に反応する。
分析対象物の特定濃度によって与えられる色相は、試験
組成物中の成分及び触媒の濃度の相対的増減によって調
整することができる。
各々の独立触媒系は、NADHの存在下に１以上の指示薬と
相互作用して指示薬（１又は複数の）の色相変化を引き
起こすことが可能な系である。ある系は少くとも酸化指
示薬と、NADHの存在下における上記酸化指示薬の還元を
促進することができる触媒とを包含する。また他の系
は、少くともジスルフィド基質、チオール指示薬及びジ
スルフィドレダクターゼ（触媒）を包含する。上記ジス
ルフィドレダクターゼ系は下記の３つの一般的方法： １） チオール指示薬をNADHとジスルフィド基質との反
応によって形成された生成物と相互作用して、第２の指
示薬の色相変化を生じさせる； ２） チオール指示薬を還元して、還元された第２の指
示薬を形成する；及び ３） その第２の指示薬が、いずれの場合も黄色の色相
を有する によって作用する。その場で黄色の色相を発色させるの
は特に困難であることが証明された。
「触媒（catalyst）及び「触媒の（catalytic）」とい
う用語はここでは従来の意味で用いられている。“触
媒”反応とは、「触媒」の添加によって反応速度は変化
するが、触媒自体は変化しない反応のことである。ここ
で述べる触媒反応は通常酵素反応であるが、メト硫酸フ
ェナジンを触媒とするような非酵素反応をも含む。「独
立して」という表現は、反応時間中に一方の触媒系で還
元される酸化指示薬と、他方の触媒系で還元される酸化
指示薬とが平衡ではないことを意味する。
NADHは、通常酵素の触媒系により、問題の分析対象物か
ら発生せしめる。表１は、臨床的に興味深い分析対象物
及びNADHを生成せしめ得る、有用な酵素系を示す。これ
らの反応及び反応に必要な成分は周知であり、現在、分
析対象物の濃度に応答して、単一色相の強度における変
化をひき起こす、多くの診断用反応の基本である。問題
の分析対象物からNADHを生成せしめ得る酵素系は、通
常、デヒドロゲナーゼ系であるが、NADHを生成し得るも
のであればどのような系を用いてもよい。
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元体（NAD
H）は特に有用な共通基質（commonsubstrate）であるこ
とが判明した。本明細書は、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（NAD）及びその還元体（NADH）のみに限
定して記載しているが、その開示するところは、ホスホ
リル化されたNAD（Ｐ）及びNAD（Ｐ）Ｈに対しても同様
に適合するものと理解すべきである。
ジアホラーゼ又はジアホラーゼ様活性を有する触媒例え
ばメト硫酸フェナジン及びメト硫酸１−メトキシフェナ
ジンをベースとする、共通基質NADHにとって有用な触媒
系について次に詳細に説明する。
ジアホラーゼ系は、明らかな色相変化を示す、２種の酸
化された指示薬が容易に入手可能であるため、１つの経
路（pathway）として有用でであることが判明した。DCI
P（2,6−ジクロロインドフェノール）は青色の化合物で
あり、ジアホラーゼとNADHの存在下に還元されると無色
となる。INT（塩化２−（４−インドフェニル）−３−
（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウ
ム）は酸化された形では無色であるが、ジアホラーゼ及
びNADHの存在下に還元されると赤色になる。上記の２つ
の色相変化は逐次的に起る。ジアホラーゼとNADHとに反
応するその他の指示薬を用いることもできる。例えば、
便宜上TR−１と呼ばれるＮ−（2,3−ジメチル−５−オ
キソ−１−フェニル−３−ピラゾリン−４−イル）−２
−クロロ−６−スルホ−４−イミノベンゾキノン及びこ
こではNBTと呼ばれる塩化ｐ−ニトロブル−テトラゾリ
ウムをDCIPとINTの代わりに用いることができる。その
他のインドフェノール類並びに同族の置換アルキル、ニ
トロ、ハロゲン及びハロゲノイド（pseudohalogen）誘
導体を、NADHの存在下に還元され得る、還元電位を有す
る同様なその他の指示薬以外にも、DCIPの代わりに用い
ることができる。その他のテトラゾリウムをINTの代わ
りに用いることができる。多くのものが当業界で公知で
あり、“An Introduction to the Use of Tetrazolium
Salts in Quantitative Enzyme Chemistry",F.P.Altma
n,Koch-light Lanora-tories,Ltd.,Colnbrook,England,
1972;及び“The Chemistry of Formazans and Tetrazol
ium Salts",A.W.Nineham,Chem.Rev.,55:355（1955）の
ような評論誌に収録されている。
第２の、同様の手段が、ジスルフィドレダクターゼをベ
ースとする、第２の独立触媒系によって与えられる。下
記表２に種々のレダクターゼ系を示す。
ジスルフィドレダクターゼ系は、ジスルフィド基質、ジ
スルフィド基質とNADHの反応を促進し得るジスルフィド
レダクターゼ及びジスルフィド基質とNADHとの反応の生
成物と相互作用して、第２の指示薬の色相変化をもたら
し得るチオール指示薬の３成分から成る。好ましいジス
ルフィド基質はリポアミド及びその類縁体であり、これ
らはリポアミドデヒドロゲーゼと共に用いることができ
る。ジスルフィドレダクターゼ系は、試験組成物によっ
て発生せしめられる色相の範囲に黄色を導入するのに特
に有用である。
チオール指示薬はチオール（−SH化合物）と相互作用し
て視認可能な色を与えるものであればどのような物質で
あってもよい。好ましいチオール指示薬は、相互作用の
後に黄色になる無色の指示薬である。一般に、チオール
指示薬は、ジスルフィド基質とNADHとの反応の生成物の
存在下に還元されて還元された第２の指示薬（黄色であ
ってもよいが、必ずしも黄色である必要はない）を生成
する酸化指示薬である。しかしながら、色素を生成する
他の種類の相互作用も考えられる。例えば、チオール指
示薬はニトロプルシドのようなキレート剤であってもよ
く、これはジスルフィド基質/NADH反応の生成物と相互
作用して赤色の色相を呈する。パラジウム複合体を用い
て赤色を発色させることもできる。黄色の色相は、チオ
ール指示薬とジスルフィド基質/NADH反応の生成物との
相互作用、もし上記生成物がシステインであるならばア
ルキル化によって発色せしめられる。また、システイン
生成物は、ノルアドレノクロムと反応せしめて黄色を発
色せしめることもできる。
他の一般的種類のチオール指示薬は所望の色相、好まし
くは黄色の発色団であり、不透明遮断層（バリヤー）の
背後に固定化される。ジスルフィド基質/NADH反応の生
成物との反応により、上記発色団はその結合部位から解
放されて不透明バリヤーに拡散して、観測者に見えるよ
うな位置まで移行する。
一般に、還元されるチオール指示薬はジスルフィド化合
物である。特に、ここではDTNBと呼ぶ下記の構造： の5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の類縁
体が好ましい。DTNBは、通常エルマン試薬（Ellman′s
reagent）と呼ばれる。カルボン酸ヒドロキシ基におけ
る変化が有用であることが判明している。下記の構造： ［Ｒは、エステル又はアミド結合を与えるような多くの
基、例えば： の基を表わすことができる。］ のDTNBの類縁体（ここではDTNBの位置異性体を含むもの
とする）が好ましい。
上記のような水可溶化基がゼラチンマトリックスの形態
においては好ましいが、本明細書中で後述する区分化フ
ォーマット（compartmentalized format）においては水
不溶性の類縁体を用いることができる。
好ましい水溶性類縁体化合物は下記の構造： の３−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボキサ
ミド−４−ニトロフェニルジスルフィドであり、その合
成については実施例中で詳述する。上記化合物は、本明
細書では、以後、便宜上３−NDと呼ばれる。この化合物
は、酸化された形態では無色であり、リポアミド、NADH
及びリポアミドデヒドロゲナーゼの存在下に黄色にな
る。
特に有用な指示薬の色相を下記の表３に示す。
表 ３ 酸化状態 還元状態 DCIP 青色 無色 INT 無色 赤色 TR-1 赤色 無色 NBT 無色 青色 DTNB 無色 黄色 ３−ND 無色 黄色 EA1 無色 黄色 発色遅延剤を組成物中に加えてもよいことが判明した。
発色遅延剤は、使用者にとって見える色相には実質的影
響を与えないが、これを包含せしめることによって、個
々の系の触媒効果が遅延されることにより、酸化指示薬
の還元が遅延され、したがって分析対象物のある特定の
濃度に対して発色せしめられる最終的色相に変化をもた
らす。有用な発色遅延剤としてはフェリシアン化カリウ
ム及びヨウ化１−Ｎ−エチル−４−メチルキノリニウム
並びにそれらの類縁体又はこれらの化合物の混合物が挙
げられるが、フェリシアン化カリウムが好ましい。発色
遅延剤は、組成物の測定範囲を有効に変化させることが
できる。
緩衝剤、界面活性剤中及びポリマーのようなその他の成
分を組成物中に加えることができる。通常、pHは試薬に
良好な性能及び安定性を与えるように選ばれ、緩衝剤に
よって調節される。緩衝剤の使用は、酵素がpH6.0〜８
の範囲でより良好に作用するので好ましい。緩衝剤の選
択方法は、当該技術の範囲で行なわれる。有用な緩衝剤
としては、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′
−２−エタンスルホン酸（HEPES）、２−［トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチル］アミノエタンスルホン酸（TE
S）、２−［Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸（ME
S）及び［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸］（MOPS）が挙げられるが、これらに限定されること
はない。界面活性剤及びポリマーは、酸化指示薬として
カチオン性テトラゾリウム塩を含む配合物（formulatio
n）において特に有用である。なぜならば、トリトン（T
RITON ）Ｘ−100の商標でシグマケミカル社（Sigma Ch
emical Co.）から入手可能なポリオキシエチレンエーテ
ルのような界面活性剤及びPVP K30としてアルドリッチ
・ケミカル社（Aldrich Chemical Co.）から入手可能な
ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンのよう
なポリマーは、カチオン性指示薬の可溶化を助け、試験
組成物中の他の指示薬との相互作用を防止するからであ
る。界面活性剤はまた、乾燥相を有する形態の（dry ph
ase formulation）試験具の湿潤性を高める。酵素安定
剤、例えば牛血清アルブミンを加えることもできる。
本発明の試験組成物は、成分を溶解せしめて溶液として
用いるか又はキャリアマトリックス中に包含せしめて、
ポリエステル片のような支持部材に取り付けて、診断法
において周知の乾燥試薬片とする。これらの試験片は、
持ち運びや保管に便利で、糖尿病患者のような、家庭で
の使用者にとって特に有用なフォーマットを提供する。
本発明の好ましい組成物は約10分以内で、ある特定の分
析対象物濃度と関連づけることができる最終的色相を呈
する。
用いられるキャリアマトリックスは、上記組成物が包含
せしめられ、発色に必要な反応を妨害しない限り、当業
界公知の数種のマトリックスのいずれかを用いてもよ
い。これらのマトリックスとしては、紙及び天然ポリマ
ー、ラテックス、ポリウレタン、シリコーン又はこれら
の混合物から成るフィルムが挙げられる。
最も明澄な色を得るためには、透明なキャリアマトリッ
クスが好ましいとされていた。本発明に共通の分析対象
物は、体液中に見られるような水溶性化合物であるた
め、水を含むことのできるキャリアマトリックス、例え
ば親水性キャリアが好ましい。好適な親水性キャリアと
しては、アガロース、ゼラチン、ポリ（ビニル）アルコ
ール、ポリ（プロピルイミン）、カラゲナン及びアルギ
ン酸が挙げられる。その他のキャリアを用いてもよい。
試験成分が区分化される場合には、吸収性不透明マトリ
ックス、例えば紙及び親水性（例えばゼラチン）キャリ
ア層から成る混合多層キャリアを用いるのが有利であ
る。
好ましい実施態様において、カルボジイミドの1.25％溶
液を、多層ゼラチンキャリアマトリックスの架橋に用い
た。これにより、試験具の表面を拭き取ることによって
血液試料の除去を可能にする全血用グルコース試験手段
に好適なフォーマットが得られる。当業界周知のその他
の被覆剤を用いて、必要に応じて、有色試料を除去する
ために試験具を洗浄又は拭き取ることを可能にしてもよ
い。
親水性キャリア層はポリスチレン、ポリエステル等のよ
うな硬質支持体又は支持部材上に塗布することによって
得られる。上記支持体は不透明でも透明であってもよい
が、一般には白濁支持体が目視読取試験用としては好ま
しい。
前記の独立触媒系に用いることができる成分の数及び種
類は、試験具フォーマット中に、非相容性であるかもし
れない成分を区分化することによって増加することがき
る。区分化は種々の形態をとることができる。成分は、
そのあるものを別の層中に配置すること；エマルジョン
の一方の相中に可溶化せしめること；析出；封入等によ
って分離される。利用可能な方法のあるものを実施例中
で詳細に述べる。
多層ゼラチンキャリアが区分化には好ましい。INTは他
の指示薬成分とは別の層中に配置することができる。種
々の層中に成分を位置させることにより、使用者に見え
る、特定の分析対象物濃度における色相が変化せしめら
れ、したがって、示される色相を調整する別の手段とな
ることが判明した。試験具の見掛けの色相は施層の順序
又は層の厚さを変えることによって変化させ得る。成分
を異った層に区分化することにより、使用者に視認可能
な色相に与える影響を下記に詳述する。
グルコース分析用レインボー（虹色）試験具は、次に示
す個々の触媒反応を用いて、調製される。
NADH生成系： グルコース（分析対象物） グルコースデヒドロゲナーゼ（酵素） NDA（添加成分） 第１の独立触媒系： ジアホラーゼ（触媒） DCIP（酸化された第１の指示薬，青色） INT （酸化された第３の指示薬，無色） DCIPを、まずNADHによって還元する。したがって第１の
独立触媒系は青色から無色へ、次いで無色から赤色へ
と、使用者にとって視認可能な色相の変化をもたらす。
第２の独立触媒系： リポアミド（ジスルフィド基質） リポアミドデヒドロゲナーゼ（ジスルフィドレダクター
ゼ） DTNB（チオール指示薬：酸化された第２の指示薬、無
色） 酸化指示薬の区分化、例えば上記指示薬を別々のゼラチ
ン層中に配置することにより、試験成分の濃度が同一で
あっても、異ったグルコース濃度において見られる色相
を有効に変化させることができる。一例として、指示薬
は異った層に配備されているが、試験組成物全体の成分
の濃度は同一にして、３種類のフィルムを作成した。
ゼラチンにおいては、DTNBにようなある種の水溶性分子
は、水性試料と接触した後にゼラチン中に拡散するが、
他のもの、例えばINTは容易に移行しない。
フィルムＡにおいては、グルコースが酵素と反応し、次
に、生成されたNADHが個々の触媒系と反応してDCIP及び
DTNBが還元される。しかしながら、INTの還元は、NADH
が下層フィルムに拡散するまで遅延される。グルコース
濃度250mg/dLでフィルムＡは黄橙色を示す。
フィルムＢにおいては、グルコースは、酵素に到達し、
反応してNADHを生成する前にINT層に拡散しなければな
らない。NADHの生成に伴い、DCIPは還元されるが、INT
の還元は、INTが還元される前にNADHが上層に逆拡散し
なければならないため遅延される。したがって、グルコ
ース250mg/dLでフィルムＢは黄緑色を示す。INTを酵素
及びその他の指示薬成分の上層に区分化することによ
り、この特定のグルコース濃度において観察される色を
変化させる。
フィルムＣにおいては、グルコースは上層の酵素と反応
する。NADHがINT層中に移行するに伴い、還元された小
量のINTによる僅かな赤色化がもたらされる。NADHが下
層に移行するに伴い、DCIP及びDTNBが還元される。最後
にNADHは、選ばれた成分の濃度により、その全部が還元
されるわけではないので、INTと反応する。グルコース2
50mg/dLで、フィルムＣは赤橙色を示す。
本発明の最終目標は、異る分析対象物濃度において明確
に異る色相を発生させることである。この目標は本発明
の組成物を用い、下記に要約した種々の方法によって達
成し得ることが明らかになった。
１） 還元した際に所望の色相を発色するか又は無色と
なる酸化指示薬を選択する。
２） 特定の触媒系における反応シーケンスを制御する
異る還元電位を有する指示薬を選択する。
３） 個々の触媒系における成分の量を、１つの反応シ
ーケンスに関与する成分が、特定の分析対象物濃度にお
いて実質的に消耗されるように調節する。
４） １つの系における触媒の量を増加（又は減少）さ
せることにより、その系による、指示薬成分の相互作用
又は還元の速度を上昇（又は低下）させ、それにより、
特定の分析対象物の見掛け色相を変化させる。
５） 試験具中の反応系の諸成分を区分化する。区分化
の利点としては、たとえ成分濃度が同一であっても試験
具の最終的な見掛けの色相を変化させ得ること；非相容
性指示薬又は水不溶性指示薬を活用できること；及び通
常チオール指示薬によって阻害される酵素系を活用でき
ることが挙げられる。
６） 個々の触媒系の反応を遅延させる発色遅延剤を添
加する。
上記に例示した方法を合わせ用いることもできる。
本発明を下記実施例により説明するが、それにより本発
明を制限するものではない。
VI.実施例 略 号 MPMS メト硫酸１−メトキシフェナジン PMS メト硫酸フェナジン DCIP 2,6-ジクロロインドフェノール TR-1 N-（2,3-ジメチル‐5-オキソ‐1-フェニル‐3-ピ
ラゾリン‐4-イル）‐2-クロロ‐6-スルホ‐4-イミノベ
ンゾキノン（製造方法については実施例1Aを参照） INT 塩化2-（4-インドフェニル）‐3-（4-ニトロフェ
ニル）‐5-フェニルテトラゾリウム NBT 塩化p-ニトロブルーテトラゾリウム DTNB 5,5′‐ジチオビス（2-ニトロ安息香酸） ３−ND ジ硫化3-N-（3-ジメチルアミノプロピル）カル
ボキサミド‐4-ニトロフェニル（製造方法については実
施例1Bを参照） EA1 5,5′‐ジチオビス‐（2-ニトロ安息香酸）ジブチ
ル（製造方法については実施例2Cを参照） NAD+ ニコチンアミド‐アデニンジヌクレオチド，リチ
ウム塩 HEPES 緩衝剤,N-2-ヒドロキシエチルピペラジン‐Ｎ′
‐2-エタンスルホン酸 MES 緩衝剤,2-（N-モルホリノ）‐エタンスルホン酸） TAPS0 緩衝剤,3-（N-トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ルアミノ）‐2-ヒドロキシプロパンスルホン酸 TRIS 緩衝剤，トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン トリトン 界面活性剤，ポリオキシエチレン‐ X-100 エーテル シグマ・ケミカル社から入手 GDH グルコースデヒドロゲーゼ（EC 1.1.147）NADH産
生 LipDH リポアミドヒドデロゲナーゼ LDH 乳酸デヒドロゲナーゼ Ｕ 国際単位、酵素活性の尺度（1Uは、特定の温度及び
pH条件下に、１分につき、基質１マイクロモルの変換反
応に触媒として作用するために必要な酵素活性を表わ
す。） PET ポリエチレンテレフタレート FMN フラビンモノヌクレオチド PE 310 ポリエチレン被覆紙 BSA 牛血清アルブミン PVK K30 ポリビニルピロリドン，分子量:40,000,アル
ドリッチ・ケミカル社から入手 dL デシリットル mL ミリリットル μＬ マイクロリットル ｇ グラム mm Hg マーキュリーミリメートル，圧力表示 mp 融点 μ ミクロン RT 室温、通常25℃ 実施例1:化合物の製造 A. Ｎ−（2,3−ジメチル−５−オキソ−１−フェニル
−３−ピラゾリン−４−イル）−２−クロロ−６−スル
ホ−４−イミノベンゾキノン（TR−１） TR−１は、酸化された状態では赤色であり、還元される
と無色となる指示薬である。これはDCIPと同様の還元電
位を有し、レインボーの色を“逆転”させるのに用いら
れる。TR−１は下記のようにして製造した。
水酸化アンモニウム（1N,10mL）を、４−アミノアンチ
ピリン0.4g（1.9ミリモル）と水50mL中の２−ヒドロキ
シ−3,5−ジクロロベンゼンスルホン酸二ナトリウム塩
0.5g（1.7ミリモル）との混合物に加えた。短時間の攪
拌後、フェリシアン化カリウム（K3Fe（CN）６）1.3g
（3.8ミリモル）を加え、室温にて１時間攪拌して反応
を行った。上記混合物を過すると暗褐色の固体0.2g
（21％）が得られた。この生成物は薄層クロマトグラフ
ィー（シリカゲル、クロロホルム／メタノール4:1を使
用）上では均一であり、アルカリ塩とアンモニウム塩と
の混合物でであることが明らかであった。
分析 C17H10ClN3O5Naについての計算値： C,47.54;H,3.04;N,9.72. 実測値:C,46.10;H,3.61;N,11.001 H NMR（D6DMSO）δ:7.80−7.20（m,7H）,3.40（s,3
H）,2.53（s,3H）,IR（KCl）:1660,1630,1400cm-1. B.3−Ｎ（３−ジメチルアミノプロピル）カルボキサミ
ド−４−ニトロフェニルジスルフィド（３−ND） 5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）の水溶性類
縁体を、チオール指示薬として用いるために製造した。
これは、酸化状態では無色であって、還元されると黄色
を示すジスルフィドレダクターゼ系と併用して好ましい
指示薬である。上記化合物３−NDは下記のようにして製
造した。
３−カルボキシ−４−ニトロフェルジスルフィド7.93g
（20ミリモル）、乾燥N,N−ジメチルホルムアミド1.2mL
（1.55ミリモル）、塩化チオニル11.7mL（60.3ミリモ
ル）及びジクロロメタン（CH2Cl2）400mLを含む懸濁液
を４時間還流し、周囲温度で一晩攪拌した。得られた明
澄な溶液を真空蒸発（12mmHg次いで0.1mmHg）して黄色
の固体を得た。上記残渣をアルゴン雰囲気下に置き、CH
2Cl2200mL中に溶解し、０℃に冷却してから３−ジメチ
ルアミノプロピルアミン10.1mL（80ミリモル）で処理し
た。上記反応混合物は暗橙色となり沈澱が形成された。
得られた溶液を一晩周囲温度まで加温した。次いで、上
記反応混合物を５％重炭酸ナトリウム溶液200mLづつで
４回、水200mLで２回及び塩水（ブライン）で１回逐次
抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、過
し、濃縮して暗橙色の油状物9.39gを得た。この混合物
を、次に、SiO2−60［70−230メッシュ，シリカゲール
−60としてメルク社（Merck＆Co.）から入手］500g上の
フラッシュクロマトグラフィーに付し、平衡化しジクロ
ロメタン／メタノール濃水酸化アンモニウムの50:10:1
溶媒混合物で溶出した。精製された生成物を含むフラク
ション110〜205をプールし、真空濃縮すると橙色固体7.
06gが得られた。上記粗生成物をノーライトのような粉
砕カーボンブラック及びケイ藻土［コロラド州、デンバ
ーのマンビル・プロダクツ社（Manvilie Products Cor
p.）からセライト（Celite ）の商標で入手される過
助剤］による処理を行いながら酢酸エチルで再結晶し
た。55℃で乾燥した後、淡黄色結晶（粒径0.1mm）5.47g
が得られた。収率＝48.4％、mp152〜156℃ 分析 C24H32N6O6S2についての計算値:C,51.05;H,5.71;N,14.8
8. 実測値:C,51.05;H,5.5;N,14.62 PMR（60MHz,CDCl3）δ1.73（５重線,J＝6Hz,4H）； 2.17（s,12H）； 2.45（t,J＝6Hz,4H）； 3.53（q,J＝6Hz,4H）； 7.57（s,2H）； 7.65（dd,J＝7Hz,2Hz,2H）； 8.02（m,2H,N−Ｈ）； 8.03（d,J＝7Hz,2H）． IR（KBr）cm-1:3260,3060,2940,2870,2820,2790,1650,1
560,1530,1470,1345. 質量スペクトル（FAB）m/e: 565（Ｍ＋1,13.6％）． C. 5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）ジブ
チル（EA−１） ここでEA1と呼ぶ上記化合物は、5,5′−ジチオビス−
（２−ニトロ安息香酸）の親油性類縁体である。これを
チオール指示薬として用いるため、下記のようにして製
造した。
5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）6.85g（1
7.25ミリモル）、塩化チオニル3.46mL、N,N−ジメチル
ホルムアミド0.346mL及びジクロロメタン350mLを含む懸
濁液を３時間間加熱還流した。更に塩化チオニル（3.46
mL）及びN,N′−ジメチルホルムミドを加え還流を２時
間続行した。明澄で淡緑色の溶液が得られ、これはビス
−酸クロリドへの完全なる変換を示すものである。溶媒
を真空下に除去し、得られた淡緑色固体をアルゴン雰囲
気下に置いた。残渣を、次に、ピリジン100mL中に懸濁
せしめｎ−ブタノール20mLで処理した。若干の発熱及び
暗色化が生じたが、均一な反応物が得られ、これを一晩
攪拌した。反応溶媒を真空下に除去し、残渣をクロロホ
ルム300mL中に溶解せしめた。次に有機層を0.1NHCl200m
Lで３回、５％NaHCO3溶液200mLで２回、及び塩水200mL
で逐次抽出した。乾燥（MgSO4）、過、溶媒の除去を
行って油状物12.79gを得、これを酢酸エチル中に溶解せ
しめて、真空下に少量のSiO2−60に吸着せしめた。上記
の含浸を行った固体を、ヘキサン−酢酸エチル8:1で平
衡化されたSiO2−60（230−400メッシュ）500gが充填さ
れたカラムに載置した。次に上記カラムを、この溶媒混
合物を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、フ
ラクション25mLを採取した。フラクション190〜270をプ
ールし濃縮すると生成物8.07gが油状物として得られ、
静置しておくと、固化した。（収率92％） 分析 計算値:C,51.96;H,4.76;N,5.08. 実測値:C,52.49;H,4.88;N,5.45. PMR（60MHz,CDCl3）δ： 0.97（t,J＝7Hz,6H,CH3−CH2）;1.2−1.9（m,8H,−CH2
−CH2−）;4.37（t,J＝6Hz,4H,−Ｏ−CH2−CH2−）7.77
（s,2H,C6H）； 7.83（AB ４重線,J＝8Hz,4H,C3H,C4H）． IR（KBr）cm-1: 質量スペクトル:E.I.（70EV） m/e＝508（37％,M+）． D. 5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）ジメ
チル この化合物は、5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息
香酸）の親油性類縁体であり、チオール指示薬として用
いるために下記のようにして製造した。
5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）7.93g（20
ミリモル）、N,N−ジメチルホルムアミド1.2mL、塩化チ
オニル11.7mL及びジクロロメタン400mLを含有する懸濁
液を、明澄な淡緑色の溶液が得られるまで４時間還流し
た。次に溶媒を真空蒸発すると黄色固体が得られた。こ
れをアルゴン雰囲気下に置き、ジクロロメタン200mL中
に溶解し、０℃に冷却した。上記混合物を攪拌し、次に
乾燥ピリジン4.03mL（50ミリモル）次いでメタノール30
mLで処理した。次に、得られた混合物を一晩周囲温度に
加温した。次に、上記反応混合物を％NAHCO3溶液300mL
で３回、1Mクエン酸300mLで３回、及び塩水300mLで逐次
抽出した。乾燥（MgSO4）、過及び溶媒の除去を行っ
て黄色固体8.29gを得、これをトルエンで２回に分けて
再結晶して収率92％の淡黄色固体を得た。mp103〜104.5
℃ 分析 計算値:C,45.28;H,2.86;N,6.60. 実測値:C,45.74;H,3.01;N,6.25. PMR（60MHz,CDCl3）δ:3.93（s,6H,−Ｏ−CH3）;7.8
（s,2H,C6H）； 7.83（AB4重線,J＝8Hz,4H,C3H,C4H）． IR（KRr）cm-1: 質量スペクトル:EI（70EV）m/e:424.3（M+,67.7％）． E. 3,6−ジオキサオクチル−5,5′−ジチオ−（２−ニ
トロベンゾエート） この化合物は、5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息
香酸）の水溶性類縁体であり、チオール指示薬として用
いるために下記のようにして製造した。
5,5′−ジチオ−（２−ニトロ安息香酸）7.93g（10ミリ
モル）、N,N−ジメチルホルムアミド1.17g、塩化チオニ
ル11.7mL、及びジクロロメタン400mLを含有する懸濁液
を攪拌下に２時間加熱還流し、明澄な溶液を得た。溶媒
を真空下に除去すると淡緑色固体が得られた。これをア
ルゴン雰囲気下に置き、０℃に冷却し、乾燥ピリジン12
0mL中に攪拌下に懸濁せしめた。次にカルビトール（Car
bitol ）（20mL）を加えると、１時間のの反応時間
後、得られた混合物は橙赤色の均一な溶液となった［カ
ルビトールはダウ・ケミカル社（Dow Chemical Co.）の
商標であり、化学名は２−（２−エトキシエトキシ）エ
タノールである］。上記混合物を一晩周囲温度まで戻し
た。上記試料を、次に、真空蒸発して黒っぽい油状物を
得、これをカラムに充填されたSiO2−60（230〜400メッ
シュ）500gでのフラッシュクロマトグラフィーに付し、
0.5％メタノール−クロロホルム溶媒混合物で溶出し
た。フラクション25mLが採取された。フラクション150
〜186をプールして濃縮すると黄色油状物7.86gが得られ
た。次に、試料をエーテルに溶解せしめ、ノーリット4g
で処理し、セライトで過すると、濃厚な黄色油状物が
ヘキサンと共に沈澱した。溶媒を傾瀉し、残与の溶媒を
真空下に40℃（0.1mm）にて１時間除去すると粘稠な黄
色油状物5.48gが得られた。（収率44％） 分析 計算値:C,49.67;H,5.13;N,4.46. 実測値;C,49.41;H,5.09;N,4.37. PMR（60MHz,CDCl3）δ： 1.2（t,J＝7Hz,6H,CH3−CH2−Ｏ−）;3.5（q,J＝7Hz,4
H,CH3−CH2−Ｏ−）； 3.6（s,8H,−CH2−CH2−Ｏ−）;3.8（m,4H, 4.55（m,4H, 7.8（s,2H,C6H）;7.82（AB4重線,J＝8Hz,4H,C3H,C
4H）． IR（CHCl3）cm-1: F. 5,5′−ジチオ−（２−ニトロ安息香酸）3,6,9,12
−テトラオキサドデシル及びその1,12−環式ジエステル これらの両化合物は、5,5′−ジチオビス−（２−ニト
ロ安息香酸）の水溶性類縁体であり、チオール指示薬と
して用いるために下記のようにして製造した。
5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）7.93g（20
ミリモル）塩化チオニル11.7mL及びN,N−ジメチルホル
ムアミド1.2mLを含む懸濁液を２時間加熱還流して明澄
な黄色溶液を得た。溶媒を真空下に除去すると淡緑色固
体が得られ、これをジクロロメタン50mLとピリジン5mL
との混合物中に溶解せしめた。この溶液を、アルゴン雰
囲気下にジクロロメタン100mL中のテトラエチレングリ
コール34.5mL（38.8g,200ミリモル）溶液に０℃で徐々
に加えた。上記反応混合物を一晩周囲温度に戻した。溶
媒を真空蒸発することにより褐色油状物が得られ、これ
をクロロホルムと水とに分配した。水層を再びクロロホ
ルムで抽出し、有機層を合わせて塩水で洗浄し乾燥（Na
2SO4）した。過及び溶媒の真空蒸発により、橙色油状
物が得られ、これをカラムに充填されたSiO2−60（230
〜400メッシュ）のフラッシュクロマトグラフィーに付
し、５％メタノール−クロロホルム溶媒混合物で溶出し
た。フラクション25mLが採取された。フラクション24〜
38をプールし濃縮すると、黄色のガラス状物2.21gが得
られた。これは、5,5′−ジチオビス−（２−ニトロ安
息香酸）の1,12−環式−3,6,9,12−テトラオキサウンデ
シルエステルと同定された。環式エステルの収率は20％
であった。13 C NMR（22.5MHz,CDCl3）δ:66.8,68.3,70.4（すべて
−Ｏ−CH2−CH2−Ｏ−）； 128.8,142.4, 146.3（アリールＣ）； IR（CHCl3）cm-1: フラクション91−101をプールし濃縮すると、所望の3,
6,9,12−テトラオキサドデシルジエステル3.94gが得ら
れた。（収率26％）13 C NMR（22.5MHz,CDCl3）δ:61.6,65.6,68.3,70.2,7
0.5,72.4（すべて−Ｏ−CH2−CH2−Ｏ−）； 129.0,142.4, 146.5（アリールＣ）； PMR（60MHz,CDCl3）：脂肪族プロトンの芳香族プロトン
に対する積分比＝5.6 IR（CHCl3）cm-1: 3600−3350（−CH2−OH−伸縮）： 実施例2:グルコース用組成物 全血の試験に有用なグルコース試験具は下記のようにし
て製造した。還元されたニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを共通基質とし、グルコースデヒドロゲナーゼ
によりグルコースから生成した。レインボーカラーを発
色するグルコース配合物に対する一般化学は、下記に模
式図により示す。チオール指示薬、DTNBは、一般にエル
マン試薬と呼ばれている。
A. 経路1:ジアホラーゼ/NBT/TR−１ 経路2:LiPDH/リポアミド/DTNB 操作：各々の溶液の成分を上記の順序に従って40℃で合
わせた。溶液を塗布する前に脱泡した。層１をポリエス
テル支持体上に塗布し乾燥した。層２を層１上に塗布、
乾燥し、残りの層も同様にして塗布、乾燥した。試験具
は最終的に、ポリエステル支持体上の３つのゼラチン層
で構成された。カルボジイミドの塗布によりゼラチンが
架橋されて表面が硬化され、試験具の表面の拭取り操作
を可能にする。
用量応答：グルコース濃度が50〜600m/dLの範囲で増加
するに伴い、カラーシーケンスは淡赤色から、オリーブ
グリーンを経て青黒色を示した。
B. 経路1:MPMS/DCIP/INT 経路2:グルタチオンレダクターゼ／グルタチオン/D
TNB 実施例2Aと同様に操作して、配合及び試験具のテストを
行った。
用量応答： グルコース（mg/dL） 色 110 ピーコック青 140 緑青色 180 くすんだ淡い水色 250 くすんだバラ色 300 くすんだバラ色 400 バラ色 500 バラ色 600 暗バラ色 800 バーガンディー （暗紅色） 青から、バラ色を経るバーガンディーまでの色相は、容
易に視認可能であった。
C. 経路1:MPMS/DCIP/INT- 経路2:LipDH/リポアミド/DTNB 実施例2Aと同様に操作して配合及び試験具のテストを行
った。
用量応答： グルコース（mg/dL） 色 20 ピーコック青 40 ピーコック青 70 水色 110 ティールグリーン （暗青色がかった緑色） 140 ミントグリーン 180 海緑色 250 緑金色 300 金色 400 橙金色 500 橙色 600 暗橙色 800 深い暗橙色 青、緑、金及び橙の色は明確に視認された。
D. 経路1:DCIP/INT/MPMS 経路2:LipDH/リポアミド/3-ND 実施例2Aと同様に操作して配合及び試験具のテストを行
った。
用量応答： グルコース（mg/dL） 色 40 ピーコック青 70 ティールグリーン 110 ミントグリーン 140 淡いミント 180 海緑色 250 黄褐色 300 暗黄褐色 400 薄茶色 500 錆色 600 錆色 800 暗赤色 この配合物により、DTNB誘導体３−NDを用いた場合、使
用者にとって視認可能な、試験具の最終的色相の発色は
８分で完了した。
E. 経路1:MPMS/DCIP/INT 経路2:LipDH/リポアミド/3−ND 用量応答： グルコース（mg/dL） 発色した色相 0 青色 20 暗青緑色 40 青緑色 70 淡緑色 110 黄緑色 140 金色 180 金橙色 250 橙色 400 赤橙色 800 暗赤色 この試験具は、青、緑、金、橙及び赤色のレインボーの
全スペクトルを発色する。グルコースの濃度に応じて使
用者に視認可能な色相が７〜８分で発色する。
F. 全血中グルコース用レインボー試験具 経路1:ジアホラーゼ/DCIP/INT 経路2:LipDH/リポアミド/3−ND 試験具の作成に用いた操作は実施例2Aに記載したと同様
のものである。YSIグルコース分析器を用いて分析され
た所望のグルコース濃度に調整された全血試料について
試験を行った。用量応答のデータを下記に示す。成層す
ることによりゼラチンキャリア中に区分された本発明の
試験組成物を含む試験具は、グルコース濃度０〜800mg/
dLの範囲に亘ってレインボーの全スペクトルを発色し
た。上記組成物は正常な血液グルコースの範囲に対して
は緑の色相を発色するように意図されたものである。
用量応答： グルコース（mg/dL） 発色した色相 0 青色 40 淡青色 70 青緑色 110 海緑色 140 薄緑色 180 淡黄色 250 黄橙色 400 橙赤色 800 赤色 G. レインボー試験具：酵素濃度の異るもの 下記の例は酵素の濃度を変化させることにより、最終的
に得られた色相がいかに調整され得るかを示すためのも
のである。
経路1:ジアホラーゼ/DCIP/INT 経路2:LipDH/リポアミド/3−ND 実施例2Aに記載のようにフィルムを作成して試験を行っ
た。
実施例3:紙製レインボー試験具 多層ゼラチンが、レインボー試験具にとっての好ましい
マトリックスであるが、紙をキャリアとして用いて試験
具を製造することができる。下記の組成及び表示の順序
に従って溶液を調製した。
緩衝液はpH7.4のTAPSOを用いた。ポリビニルアルコール
（PVA）と試薬の添加順序は本実施例において重要であ
った。PVA濃度１〜1.5％で、紙製マトリックス中の、DC
IPとINTとの共沈が防止された。
ホワットマン（Whatman）31ET紙にこの溶液を含浸せし
め50℃で乾燥した。乾燥した紙を切断しプラスチック支
持体上に固定して試験片を作成した。NADHを用いて上記
試験片の試験を行ったところ下記の結果が得られた。
実施例4:チオール試薬に感受性の酵素を含むNADH生成系 上記のチオール検出試薬系に係る一般的問題点は、チオ
ール指示薬が蛋白質系と反応して、酵素の不活性化を引
起こす場合が多いことである。DNTBによる、多くのその
ような酵素の阻害は文献に記載されている。２つの一般
的溶液があり、両者ともチオール試薬を： （１） 有機層中に又は不溶性粒子の形で隔離してお
く、又は （２） チオール試薬に感受性の酵素とチオール試薬と
を、後者を固定化することにより、物理的に分離してお
くことにより、区分化することが必要である。
A. 方法（１）試薬の隔離 DTNBの水不溶性類縁体であるEA1を用いた（製造方法に
ついては実施例1Cを参照）。
試薬を隔離するには２つの方法がある。
（ａ） EA1を油に溶解し、ゼラチンフィルム中にエマ
ルジョン状に分散せしめる方法 有機相:EA1（300mM）をトリオクチルアミン（１％）を
含むリン酸トリクレシル中に溶解した。
水性相 最終濃度 ゼラチン 10％ リン酸カリウムpH7.5 50mM DCIP 1.5mM 油性相をウェアリング・ブレンダー（Waring Blender）
中で水性層をいて、最終濃度が５％となるように乳化し
た。リポアミドデヒドロゲーゼ（シグマIII型、13.3U/m
L）を上記エマルジョンに加えた。エマルジョンをプラ
スチック製支持体（170μ）上に塗布し、室温で乾燥し
た。
乾燥したフィルムをNADH/リポアミド（約1mM）、pH8.5
（トリス緩衝液）で処理することにより、DCIPの青色が
極めて急速に漂白されてEAI試薬による黄色が発色し
た。NADHを用いない場合には、反応は生じなかった。
DTNBにより阻害される乳酸デヒドロゲナーゼ酵素（LD
H）をこのフィルムを用いて試験した。LDH（約150U/m
L）及び約250mM乳酸塩（pH8.5）中のポリアミド（約1m
M）により黄色が約10分間で発色した。LDHを用いないブ
ランクは発色が見られなかった。結論は、油溶性のチオ
ール指示薬の使用により、油性エマルジョン中にこれを
区分化することにより、チオール試薬に対して感受性を
有すると通常思われている酵素の使用が可能になるとい
うことである。
（ｂ） EA1を直接紙に含浸せしめる方法 EA1を、濃度が5.7mMとなるようにトルエンに溶解した。
ホワットマン31ET紙にこの溶液を含浸せしめ、50℃で乾
燥した。第２の溶液を下記の成分により調製した。
最終濃度 トリトン X-100 0.1％ （トリス）２硫酸塩pH8.5 0.2M PVA（98.5％加水分解） 0.62％ MPMS 0.25μＭ リポアミド 0.25mM LipDH 30 U/mL NAD 0.5mM DCIP 0.8mM （トリス）硫酸塩は、硫酸を用いて所望のpHに調整され
たトリス緩衝液である。
上記の乾燥した紙を第２の溶液に浸漬し、再び50℃で乾
燥してプラスチック製支持体に取り付けた。
LDHのための試験薬は、Ｌ−乳酸塩（167mM）、（トリ
ス）２硫酸塩pH8.5（0.33M）及びLDH酵素（兎の筋肉、
シグマ２型）を含み、下記表に示す試験結果が得られ
た。
種々のLDH濃度範囲に亘って極めて良好な色が視認され
た。
アルコール検出用試験溶液 この区分化フィルムフォーマットの、チオール試薬に感
受性の酵素の使用が要求される試験の操作能を更に、ア
ルコールデヒドロゲーゼを用いて試験した。
種々の濃度の硫酸エタノール、（トリス）２緩衝液0.5
M、pH8.5及びアルコールデヒドロゲナーゼ（製パン用イ
ースト、シグマ社カタログNo.7011、22.5U/mL）を含む
試験溶液を調製した。
上記のように作成した試験片を用いた。試験結果を下記
の表に示す。
アルコールの濃度に応じて極めて良好な視認が得られ
た。
これらの実験の結論として、チオールル検出試薬を用い
たレインボーシステムは、チオール試薬感受性の酵素と
共に使用し得ることが明らかになった。
B. 方法2:チオール試薬感受性酵素とチオール試薬の後
者を固定することによる物理的分離方法 DTNBはより大きい分子に共有結合せしめるか又は小さい
分子のみの浸透を許すゼラチンのようなマトリックス中
に物理的に捕足することができる。したがって、酵素と
チオール試薬との直接的相互作用が起こる可能性はな
い。
固定化DTNBの製造 DTNBを、水溶性のカルボジイミド試薬を用い、カルボキ
シの作用により、ヒト血清アルブミンに結合せしめた。
30％ヒト血清アルブミン溶液をリン酸ナトリウム中で0.
2MとしpHを4.57に調整した。これを希釈して4.8％アル
ブミンとした。DTNB（10.7mM）及び１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDA
C、10.7mM）を小量のエタノール中に溶解し、急激に攪
拌しながら０℃に保持された上記アルブミン溶液に加え
た。２〜３時間後、やゝゲル化した物質を透析チューブ
に移し、水で十分透析し、次に凍結乾燥した。
皮殻質の黄色固体を微粉末に粉砕し、10％ゼラチン中に
１％の濃度に分散せしめた。被膜が得られ（170μ）、
室温で乾燥した。
下記の試験混合物を用いてフィルムを評価した。
最終濃度 乳酸リチウム 250mM リン酸カルシウム 250mM 緩衝剤,pH7.5 グルタチオン 0.5mM グルタチオンレダクターゼ 9U/mL NAD 0.2mM LDH 5U/mL 上記フィルムは、この溶液と接触すると、１分以内に明
澄な黄色を発色した。LDHを用いない対照溶液は発色を
示さなかった。結論として、チオール試薬を固定化する
ことにより、チオール試薬に感受性を有する酵素を用い
た試験が可能となる。
総合的結論としては、文献によれば、アルコールデヒド
ロゲナーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼのよう
な多くの酵素はDTNBによって阻害されるが、かかる阻害
を回避する多くの方法ももあるということである。結
局、チオール指示薬が関与する第２の触媒系は、通常NA
DHの試験に中間体として適用することができ、分析対象
物としてのアルコール又はコレステロールの測定に用い
ることができる。
実施例5:拡散性／非拡散性色素反応 レインボーカラーを発色せしめるための別の方法は、試
験組成物の色相を分散の結果として発現せしめることに
ある。例えば、指示薬が、マトリックスに共有結合して
いるために分散し得ず、かつこのマトリックスが不透明
層で被われている場合は、上記指示薬は上面からは視認
不可能である。反応の結果、もし指示薬のマトリックス
への共有結合が切断されると、指示薬は不透明層を通し
て上方へ拡散し視認可能になる。
一例として、実施例4Bに記載のようにフィルムを作成
し、このフィルムにおいては、DTNBをアルブミンに共有
結合せしめ、次にこれをゼラチンマトリックスに包含せ
しめた。ホワットマン31ETに下記成分を含む溶液を含浸
せしめた。
最終濃度 リン酸カリウム,pH7.5 160mM グルタチオン 0.4mM グルタチオンレダクターゼ 36U/ML 上記の含浸を行った紙を50℃で乾燥した。乾燥した紙片
を切断し、ゼラチンフィルム上に置いた。この紙は全く
不透明であった。NADH溶液を、このようにして作成した
多層試験具に加え、対照として用いる別の試験具には水
を加えた。約20秒でNADHと接触した試験具は黄色に変化
し始め、急速に深い黄色が発色した。対照パッドは無色
であった。
LDH試験を下記の溶液を用いて行った。
最終濃度 リン酸カリウム,pH7.5 250mM 乳酸リチウム 250mM NAD 0.2mM LDH（約5U/mL）をこの溶液に加え、この溶液30μＬを上
記の紙／ゼラチン製多層試験具の１つに加えた。
約5 1/2分後、上記LPDパッドは、かすかではあるが確か
に黄色を示した。LDHを用いない対照は無色であった。
結論は、指示薬は、分析対称物の濃度の関数として分散
可能にせしめられるということである。
本方法において、指示薬分子は、色相決定（発色団）部
分と反応性（開裂可能な）部分とが組合わされたもので
ある。これらの部分は、定着結合の開裂が指示薬の色相
を大きく変化させることがないように電子工学的に単離
される。指示薬の量又は強度は、還元的開裂に伴う触媒
系の活性によって調節され、発色せしめられた色相は、
上記分子の発色団性部分により、別個に測定される。こ
のことは、所望の最終的色相を発色する、色相と反応性
との適切な組合せを備えた指示薬を見出すことは困難で
あるため、かなりの利点である。
酸化による、チオール指示薬の固定化が可能な他のマト
リックスは、チオールアガロース又は２官能性の試薬、
例えばジチオビス−（プロピオン酸スクシンイミジル）
であるローマント（Lomant′ｓ）試薬を用いた蛋白質な
らばどのようなものであってもよい。
これらの実施例から、本発明の精神及び範囲から離れる
ことなく、変形ないし修正が種々なされ得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジェームス・ダブリュ・ラインシュ アメリカ合衆国、インヂアナ 46514、エ ルクハート、フウィットフィールド・コー ト−ディー 3421 (72)発明者 マリー・エラン・ワーチャル アメリカ合衆国、インヂアナ 46561、オ セオラ、ジェファーソン・ロード 10272

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】流体試料中の分析対象物を目視測定するた
    めの試験組成物であって、 （ａ）分析対象物から、還元されたニコチンアミドアデ
    ニンジヌクレオチドを生成せしめ得る触媒系； （ｂ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
    ドとの反応により、還元された第１の指示薬を生成せし
    め得る第１の独立触媒系；及び （ｃ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
    ドとの反応により、還元された第２の指示薬を生成せし
    め得る第２の独立触媒系からなり、該第２の独立触媒系
    が、 （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ii）ジスルフィド基質；及び （iii）チオール指示薬を包含し、 上記ジスルフィドレダクターゼは、還元されたニコチン
    アミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド基質との
    反応に触媒として作用して反応生成物を生成し、この反
    応生成物が上記チオール指示薬を還元して、還元された
    第２の指示薬を生成し、還元された第１及び第２の指示
    薬の生成が実質的に同時に起って、特定の最終的色相が
    分析対象物の濃度に依存して生ずることを特徴とする試
    験組成物。
  2. 【請求項２】第１又は第２の独立触媒系が、還元された
    第３の指示薬を生成せしめ得る酸化された第３の指示薬
    を包含する特許請求の範囲第１項記載の試験組成物。
  3. 【請求項３】少なくとも１つの指示薬成分の還元が、あ
    る色相から無色への変化ともたらす特許請求の範囲第２
    項記載の試験組成物。
  4. 【請求項４】発色遅延剤を更に含む特許請求の範囲第１
    項記載の試験組成物。
  5. 【請求項５】最終的色相の発色が、約10分未満で実質的
    に完了する特許請求の範囲第項記載の試験組成物。
  6. 【請求項６】還元された第２の指示薬が、黄色である特
    許請求の範囲第１項記載の試験組成物。
  7. 【請求項７】チオール指示薬が、ジスルフィドである特
    許請求の範囲第１項記載の試験組成物。
  8. 【請求項８】ジスルフィドが、5,5′−ジチオビス−
    （２−ニトロ安息香酸）の類縁体である特許請求の範囲
    第７項記載の試験組成物。
  9. 【請求項９】水性流体試料中のグルコースを目視測定す
    るための試験組成物であって、 （ａ）グルコースとの反応により、還元されたニコチン
    アミドアデニンジヌクレオチドを生成せしめ得る触媒
    系； （ｂ）ジアホラーゼ活性を有する触媒；並びに還元され
    たニコチンアミドアデニンジヌクレオチドと、前記触媒
    の存在下に反応して、還元された第１及び第３の指示薬
    を生成することができる酸化された第１及び第３の指示
    薬からなる第１の独立触媒系；及び （ｃ）ジスルフィドレダククターゼ、ジスルフィド基質
    及びチオール指示薬からなる第２の独立触媒系からな
    り、 ジスルフィドレダクターゼは、還元されたニコチンアミ
    ドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド基質との反応
    に触媒として作用して反応生成物を生成し、この反応生
    成物がチオール指示薬を還元して、還元された第２の指
    示薬を生成し、還元された第11及び第２の指示薬の生成
    が実質的に同時に起って、特定の最終的色相が試料中の
    グルコース濃度に依存することを特徴とする試験組成
    物。
  10. 【請求項１０】第１、第３及びチオール指示薬のうちの
    少なくとも一つが、還元によってある色相から無色へ変
    化する特許請求の範囲第９項記載の試験組成物。
  11. 【請求項１１】試験組成物の最終的色相の発色が、約10
    分未満で実質的に完了する特許請求の範囲第９項記載の
    試験組成物。
  12. 【請求項１２】流体試料中の分析対象物を目視測定する
    ための試験具であって、 （イ）キャリアマトリックス；及び （ロ）該マトリックスに包含させた試験組成物であっ
    て、該試験組成物が、 （ａ）分析対象物から、還元されたニコチンアミドアデ
    ニンジヌクレオチドを生成せしめ得る触媒系； （ｂ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
    ドとの反応により、還元された第１の指示薬を生成せし
    め得る第１の独立触媒系；及び （ｃ）還元されニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
    との反応により、黄色の第２の指示薬を生成せしめ得る
    第２の独立触媒系からなり、 該第２の独立触媒系が （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ii）ジスルフィド基質；及び （iii）チオール指示薬を包含し、 上記ジスルフィドレダクターゼは、還元されたニコチン
    アミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド基質との
    反応に触媒として作用して反応生成物を生成し、この反
    応生成物が上記チオール指示薬と相互作用して黄色の第
    ２の指示薬を生成し、還元された第１及び第２の指示薬
    の生成が実質的に同時に起って、特定の最終的色相が分
    析対象物の濃度に依存して生ずることを特徴とする試験
    具。
  13. 【請求項１３】第１又は第２の独立触媒系が、還元され
    た第３の指示薬を生成せしめ得る第３の酸化指示薬を含
    む特許請求の範囲第12項記載の試験具。
  14. 【請求項１４】第１及び第３の酸化指示薬の少なくとも
    一つが、還元によって該指示薬の色相を無色へ変化させ
    る特許請求の範囲第13項記載の試験具。
  15. 【請求項１５】第１、第３の酸化指示薬及びチオール指
    示薬の少なくとも一つが、キャリアマトリックス内に区
    分化されている特許請求の範囲第14項記載の試験具。
  16. 【請求項１６】体液試料中のグルコースを目視測定する
    ための多層試験具であって、 （イ）不活性支持部材；及び （ロ）該部材に積層された親水性キャリアからなる少な
    くとも２つの層からなり、 （ａ）その第１の層が第１及び第３の酸化指示薬のどち
    らか一方を含有し、 （ｂ）第２の層が （ｉ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド； （ii）グルコースとの反応により還元されたニコチンア
    ミドアデニンジヌクレオチドを生成せしめ得るグルコー
    スデヒドロゲナーゼ； （iii）ジスルフィド基質； （iv）前記で含有されなかった、第１もしくは第３の酸
    化指示薬； （ｖ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
    ドと第１及び第３の酸化指示薬との反応を促進して、還
    元された第１及び第３の指示薬を生成せしめ得るジアホ
    ラーゼ活性を有する触媒； （vi）ジスルフィドレダクターゼ；及び （）チオール指示薬を含み、 該ジスルフィドレダクターゼは、還元されたニコチンア
    ミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド基質との反
    応に触媒として作用して反応生成物を生成し、この反応
    生成物が還元された第２のチオール指示薬を生成し、還
    元された第１及び第２の指示薬の生成が実質的に同時に
    起って、特定の最終的色相が試料中のグルコースの濃度
    に依存して生ずることを特徴とする多層試験具。
  17. 【請求項１７】親水性キャリアがゼラチンであり、各層
    がコーティングによって取り付けられている特許請求の
    範囲第16項記載の多層試験具。
  18. 【請求項１８】一方の層が、発色遅延剤を更に含む特許
    請求の範囲第16項記載の多層試験具。
  19. 【請求項１９】発色着延剤が、フェリシアン化カリウ
    ム、ヨウ化１−Ｎ−エチル−４−メチル−キノリニウム
    又はそれらの類縁体から選ばれる特許請求の範囲第18項
    記載の多層試験具。
  20. 【請求項２０】チオール指示薬が、水溶性ジスルフィド
    である特許請求の範囲第16項記載の多層試験具。
  21. 【請求項２１】水溶性ジスルフィドが、還元により黄色
    に発色する特許請求の範囲第20項記載の多層試験具。
  22. 【請求項２２】水溶性ジスルフィドが、5,5′−ジチオ
    ビス−（２−ニトロ安息香酸）の類縁体である特許請求
    の範囲第21項記載の多層試験具。
JP62077645A 1986-04-04 1987-04-01 試料中の分析対象物の目視試験用のレインボーカラー発色試験組成物及び試験具 Expired - Lifetime JPH0698037B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84870686A 1986-04-04 1986-04-04
US848706 1992-03-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62239054A JPS62239054A (ja) 1987-10-19
JPH0698037B2 true JPH0698037B2 (ja) 1994-12-07

Family

ID=25304059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62077645A Expired - Lifetime JPH0698037B2 (ja) 1986-04-04 1987-04-01 試料中の分析対象物の目視試験用のレインボーカラー発色試験組成物及び試験具

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0239926B1 (ja)
JP (1) JPH0698037B2 (ja)
AT (1) ATE90970T1 (ja)
AU (1) AU579507B2 (ja)
CA (1) CA1295216C (ja)
DE (1) DE3786286T2 (ja)
DK (1) DK169040B1 (ja)
ES (1) ES2041251T3 (ja)
FI (1) FI871450L (ja)
IE (1) IE60583B1 (ja)
NO (1) NO175218C (ja)
ZA (1) ZA871361B (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4855228A (en) * 1987-09-11 1989-08-08 Miles Inc. Multiple oxidative indicator system for visual determination of hydrogen peroxide
AU602277B2 (en) * 1988-02-10 1990-10-04 Miles Inc. Self-indicating and improved resolution analyses employing stoichiometric chemical substraction
CA2127172C (en) * 1993-08-05 1998-07-14 Amy H. Chu Analyte detection device and process
AU2002366025B2 (en) 2001-11-21 2007-08-23 Unitika Ltd ATP measurement method allowing visual judgement and reagent therefore
US6958039B2 (en) 2003-05-02 2005-10-25 Oculir, Inc. Method and instruments for non-invasive analyte measurement
US6975892B2 (en) 2003-10-21 2005-12-13 Oculir, Inc. Methods for non-invasive analyte measurement from the conjunctiva
US6968222B2 (en) 2003-05-02 2005-11-22 Oculir, Inc. Methods and device for non-invasive analyte measurement

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3211167A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Testsystem und verfahren zur bestimmung von substanzen in fluessigkeiten
DE3247894A1 (de) * 1982-12-24 1984-06-28 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Testsystem und verfahren zur bestimmung von nad(p)h
EP0160847A1 (de) * 1984-04-09 1985-11-13 Akademie der Wissenschaften der DDR Analystisches Element zur Bestimmung von Glucose, glucosehaltigen Oligosacchariden und Harnsäure
US4898813A (en) * 1986-04-04 1990-02-06 Albarella James P Catalytic test composition intended to produce a range of colors

Also Published As

Publication number Publication date
DK169040B1 (da) 1994-08-01
DK171087A (da) 1987-10-05
NO175218C (no) 1994-09-14
DK171087D0 (da) 1987-04-03
DE3786286D1 (de) 1993-07-29
AU579507B2 (en) 1988-11-24
ZA871361B (en) 1987-08-20
NO871222D0 (no) 1987-03-24
FI871450A0 (fi) 1987-04-02
EP0239926A3 (en) 1990-11-07
JPS62239054A (ja) 1987-10-19
NO175218B (ja) 1994-06-06
FI871450A7 (fi) 1987-10-05
IE60583B1 (en) 1994-07-27
AU7103587A (en) 1987-10-08
FI871450L (fi) 1987-10-05
EP0239926A2 (en) 1987-10-07
CA1295216C (en) 1992-02-04
ES2041251T3 (es) 1993-11-16
EP0239926B1 (en) 1993-06-23
DE3786286T2 (de) 1993-09-30
ATE90970T1 (de) 1993-07-15
IE870866L (en) 1987-10-04
NO871222L (no) 1987-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4898813A (en) Catalytic test composition intended to produce a range of colors
JP2922003B2 (ja) 過酸化活性物質の検定のための組成物、用具及び方法の改良
ES2250472T3 (es) Tiras de ensayo con membranas cargadas positivamente para analisis con tetrazolio.
US6586199B2 (en) Stabilized tetrazolium reagent compositions and methods for using the same
US5326697A (en) Composition and method of assaying for D-β-hydroxybutyrate
JPH0687790B2 (ja) 分析物を測定する方法及び測定試薬
US4975367A (en) Catalytic test composition intended to produce a range of colors
JP5301156B2 (ja) 全血を用いる血液成分測定方法及び測定キット
JP2017530098A (ja) レドックス指示薬
EP0239926B1 (en) Rainbow test device
US5041658A (en) Carboxamido nitrobenzene disulfide compound
US5220035A (en) Dithiol-(2-nitrobenzoate) indicators
JP3980683B2 (ja) 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬および測定方法
JPS60210998A (ja) 無機リン酸塩の酵素学的測定用試験組成物、試験具及び試験方法
JPS6024199A (ja) 疾病関連物質の定量法
JPH06197795A (ja) 過酸化水素の測定方法
JPS6344167A (ja) 試験手段の製造方法
JPH03503121A (ja) テオフィリンの酵素での定量
JP2000319238A (ja) 被酸化性発色試薬用色原体、及びこれを用いる測定方法並びに測定試薬