JPH0699401B2 - 化学発光性アクリジン誘導体 - Google Patents

化学発光性アクリジン誘導体

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JPH0699401B2
JPH0699401B2 JP62206622A JP20662287A JPH0699401B2 JP H0699401 B2 JPH0699401 B2 JP H0699401B2 JP 62206622 A JP62206622 A JP 62206622A JP 20662287 A JP20662287 A JP 20662287A JP H0699401 B2 JPH0699401 B2 JP H0699401B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は化学発光性アクリジン誘導体およびそれらの製
造方法に関する。
発光性化合物はすでに、広範にわたる様々な用途を有し
ている。それらはバイオアツセイ、酵素イムノアツセイ
および発光イムノアツセイにおけるインジケータとして
用いられる〔W.P.Collins著「Alternative Immunoassay
s」,John Wiley＆Sons Ltd発行（1985）参照〕ほか、核
酸ハイブリダイゼーシヨンアツセイにも用いられる〔J.
A.Matthews他著「Analytical Biochemistry」,151、205
〜209（1985）参照〕。化学発光性化合物は更に、「フ
ロー・インジヨクシヨン分析」、液体クロマトグラフイ
のカラム後検出器、フロー研究におよび人工光源に用い
られている。
化学発光イムノアツセイにおいては、特に２種類の構造
タイプ化学発光マーキング物質が比較的重要性の高いも
のとなつている。一方において、これらはH.R.Schroede
r他著「Methodsin Enzymology」,Academic Press Inc.
発行、Vol.LVII（1978）424以降、および英国特許第2,0
08,247号および第2,042,920号、西独特許第2,618,419号
および第2,618,511号、および欧州特許出願第135,071号
に記載されているルミノールおよびイソルミノール誘導
体である。発光インジケータとしてのイソルミノール化
合物の実際の使用についての総括はW.G.Wood著、「J.Cl
in.Chem.Clin.Biochem.」22（1984）,905〜918にみるこ
とができる。
他方において、アクリジニウムエステル化合物も化学発
光マーキング物質として用いられている。かかるアクリ
ジニウムエステルは米国特許第3,352,791号、英国特許
第1,316,363号および第1,461,877号および欧州特許出願
第82,636号により知られている。イムノアツセイにおい
てアクリジニウムエステルをマーキング物質として用い
ることはWeeks他著「Clin.Chem.」29/8（1983）、1474
〜1479に記載されている。発光イムノアツセイにおいて
フエナンスリジニウムエステルをマーキング物質として
用いることはすでに欧州特許出願第170.415号により知
られている。
アクリジニウムエステルの化学発光はアルカリ性H2O2溶
液の添加におり開始することができる。化学発光のメカ
ニズムについての説明はF.McCapra著「Acc.Chem.Res.」
9,201（1976）において行なわれている。すなわち、離
脱基の性質が光量子収率および加水分解安定性のいずれ
に対しても明らかに決定的である。
ルミノールおよびイソルミノール化合物に比べ、すでに
今日まで知られているアクリジニウムエステルは光量子
収率が高くしかもその収率がインジケータに結合したタ
ンパクによつて悪化することがない点で有利である〔We
eks他著「Clin.Chem.」29/8（1983）、1474〜1479参
照〕。
欧州特許出願第82,636号により知られるアクリジニウム
フエニルエステルは、化学発光を緩和な酸化剤で刺激し
た場合、検出感度が高い点で優れているが、実用化の妨
げとなる欠点を有している。特に、フエニルエステル結
合は水性系において、室温においてさえ、極めて不安定
である。更に、そこに述べられた酸化条件下では、発光
はわずか約10秒後に大部分、すなわち95％以上も消失す
る。これに比較して、他の非アイソトープアツセイ法は
測定時間がはるかに短く、それ故にサンプルの処理量の
増加を可能にする。
従つて、本発明の目的は高い光量子収率と共により速い
反応速度を有し、それにより発光イムノアツセイ測定時
間を短縮できる新しいアクリジニウム誘導体を提供する
ことにある。
今般、これらの目的が式Ｉ 〔式中、R1は水素、１〜10個の炭素原子を有するアルキ
ル、アルケニルもしくはアルキニル基、またはベンジル
もしくはアリール基であり、R2およびR3は水素、１〜４
個の炭素原子を有するアルキル基、置換もしくは未置換
アミノ基、カルボキシル、アルコキシ、シアノもしくは
ニトロ基またはハロゲンであり、R4はスルホンアミド基
がその窒素原子を介してカルボニル基に直接結合してい
る基であるか、または式II −Ｓ−Ｘ−R5 （II） ｛式中、Ｘは分枝状もしくは非分枝状脂肪族基または芳
香族基（それはまたヘテロ原子を有することもできる）
であり、そしてR5は緩和な条件下に生物学的に重要な物
質中のアミノ、カルボキシルもしくはチオール基または
その他の官能基と選択的に結合され得る反応性基であ
る｝で示されるチオアルキルもしくはチオアリール基で
あり、そしてＡ は化学発光を妨げない陰イオンであ
る〕で示される化学発光性アクリジニウム誘導体により
達成されることが見出された。
生物学的に重要な物質とは、抗原と理解すべきである。
この用語はホルモン、ステロイド、医薬、医薬代謝物、
毒素、アルカロイドそして抗体なども包含する。
化学発光を妨げない陰イオンはテトラフルオボレート、
パークロレート、ハライド、アルキルサルフエート、ハ
ロスルホネート、アルキルスルホネートまたはアリール
スルホネート陰イオンであつてよい。化学発光を消失し
または弱めなければその他の任意の陰イオンを用いるこ
ともできる。
アリールとは芳香族炭化水素、特にフエニルおよびナフ
チルであると理解すべきである。ヘテロ原子を有する芳
香族基とは窒素原子または酸素原子を有する芳香族炭化
水素、特にキノリン、インドール、ピロールおよびピリ
ジンなどであると理解すべきである。ハロゲンとは弗
素、塩素、臭素および沃素である。
置換アミノ基は好ましくはC1〜C4アルキルまたはC1〜C4
ジアルキルアミンであり、またそれらアルキル基の方も
例えばヒドロキシルによりモノ置換されていてもよい。
置換アミンはモルホリン基であつてもよい。R2およびR3
について記載されたアルコキシ基はアルキル部分に１〜
４個の炭素原子を有するものが好ましい。
Ｘについて記載された分枝状または非分枝状脂肪族基は
好ましくは、C1〜C5−アルキレン基である。
一般的には、Ｘがメチレン、エチレン、プロピレンまた
はオルト−、メタ−もしくはパラ−フエニレン基である
アクリジニウム誘導体が選択される。これらの基はアク
リジニウム誘導体の水溶性を向上させるべく、ヘテロ原
子を有する親水性置換分を有していてもよい。
本発明によるアクリジニウム誘導体を使用する際特に重
要なのは置換分R5である。この基を適切に選択すること
により、検出される生物学的物質の官能基に対し緩和な
条件下に選択的に結合され得るような高い反応性をその
アクリジン誘導体に与えることができる。適当な反応性
基の例を以下に列挙する。
ｄ）−SO2−CH＝CH2 ｆ）−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ 多くの場合、本発明のアクリジニウム誘導体の中でR5が
式III で示される基であるものが適していることが判つてい
る。
そのほか、R1がメチル基であるアクリジニウム化合物も
好ましい。それ故、式IV （式中、ＡおよびＸは前記の意味を有する）に相当する
本発明のアクリジニウム化合物が特によく用いられる。
本発明のアクリジニウム誘導体中の基R4がスルホンアミ
ド基である場合には、それは、式Ｖ または式VI 〔式中、ＸおよびR5は前記の意味を有し、そして式Ｖの
R6は１〜10個の炭素原子を有するアルキルもしくはアル
ケニル基、好ましくはC1−C4−アルキルによりモノ−も
しくはジ置換されたアミノ基、またはモルホリノ、ベン
ジルもしくはアリール基（これらはヒドロキシル、アミ
ノ、１〜４個の炭素原子を有するアルコキシまたはアリ
ールオキシにより置換されていてもよい）であり、そし
て式VIのR6はそのほかに水素を表わすこともできる〕 で示されるのが好ましい。
本発明のこのアクリジニウム誘導体の典型的代表例は式
VII （式中、ＡおよびＸは前記の意味を有する）で示され
る。
本発明は２つの新しいアクリジニウム化合物群を提供す
るが、その一方の群はチオエステル基により区別され、
他方はスルホンアミド構造により区別される。従来より
知られているアクリジニウムフエニルエステル化合物よ
りも、アクリジニウムアシルスルホンアミド誘導体は高
い安定性を有し、そしてチオールエステルは速い反応速
度を有する。さらにこれらの化合物群は共により高い光
収率を与える点で優れている。
欧州特許出願第82,636号により知られるアクリジニウム
フエニルエステルと比較した場合、チオールエステル含
有離脱基を有する本発明のアクリジニウム化合物の著し
い長所は発光の反応速度が相当に速い点である。従つ
て、実施例１に従つて製造された本発明のアクリジニウ
ムチオエステル（化合物６）は同じ酸化条件下に１秒の
測定時間で10倍高い光収率を有した。この高い光収率お
よび同時に短い測定時間はルミノメータにおいて一段と
高いサンプル処理量を可能にする。
従つて、第１図は実施例１により製造されたアクリジニ
ウムチオエステル（化合物６）の抗体接合体の発光速度
を示し、そして第２図は４−（２−スクシンイミジル−
オキシカルボニルエチル）フエニル−10−メチルアクリ
ジニウム９−カルボキシレートメトサルフエート（欧州
特許出願第82,636号明細書、第10頁）の抗体接合体を示
す。個々のトレーサ溶液100μｌを350μｌの0.05M KCl/
NaOH緩衝液（pH13）＋0.1％のH2O2を添加することによ
り刺激して化学発光させ、そして10秒間にわたり記録す
る。
第１図において、0.66秒後にすでに最大発光に達し、0.
88秒後にはすでに再び半減している。これに対し、第２
図においては、1.77秒後にやつと最大発光に達しそして
2.88秒後になつてやつと再び半減している。
アクリジニウム９−カルボン酸アミドはアクリジニウム
９−カルボン酸エステルとは対照的に化学発光を全く示
さない〔F.McCapra、W.CarruthersおよびJ.K.Sutherlan
d著「Progress in Organic Chem.」Vol.8,231〜277（19
73）Butterworth社発行参照〕ことから、そのアミド窒
素がスルホニルにより置換されたアクリジニウム９−カ
ルボン酸アミドが優れた化学発光を呈することは全く予
想外のことである。
本発明によるアルクジニウム９−カルボン酸チオエステ
ルは次の方法により製造できる： アクリジンまたはその縮合フエニル環にR2および／また
はR3を有する誘導体を、LehmstedtおよびHundertmarkに
よる、Ber.63,1229（1930）に記載の方法によりエタノ
ール／氷酢酸およびシアン化カリウム中で９−シアノア
クリジンに変換する。再結晶後、この生成物をLehmsted
tおよびWirthによる、Ber.61,2044（1928）に記載の方
法に従つて硫酸および亜硝酸ナトリウムと反応させるこ
とによりアクリジン−９−カルボン酸またはR2／R3−置
換アクリジン−９−カルボン酸が得られる。アクリジン
−９−カルボン酸またはR2／R3−置換アクリジン−９−
カルボン酸をチオニルクロライドと反応させることによ
り、式VIII （式中、Ｙは塩素を表わす） で示される化合物が得られる。ハロゲンに代えて、オキ
シカルボニル−C1−C5−アルキル、オキシカルボニルア
リールまたはイミダゾリド基を化合物VIIIのＹとして導
入することもできる。
R2／R3−置換アクリジン誘導体は文献に知られる方法に
より簡単に合成できる。このような合成法は例えば「Co
mprehensive Heterocyclic Chemistry」、A.Katritzky,
C.W.Ress編、Vol.2,395以降、Pergamon Press Ltd.発
行、（1984）または「Heterocyclic Compounds」Vol.9,
“Acridines and Cond."第２版、R.M.Acheson著、John
Wiley＆Sons Ltd.発行（1973）に記載されている。
前記酸クロライド（VIII）を次いで式IX HS−Ｘ−COOH （IX） で示されるチオールカルボン酸、例えば２−メルカプト
安息香酸とアルカリ性条件下に反応させるとチオールエ
ステルカルボン酸が得られ、これを次いで基R5の製造に
適した化合物、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドで
エステル化する。そのアクリジン化合物を次に、文献に
知られる方法により10位においてアルキル化する。特
に、トリメチルオキソニウムテトラフルオボレートがメ
チル化に適しているが、ジメチルサルフエート、メチル
フルオロスルホネート、メチルトルエンスルホネートま
たはメチルトリフルオロメタンスルホネートを用いても
化学発光性アクリジニウム化合物が良好な収率で得られ
る。
本発明によるアクリジニウムスルホンアミド誘導体の製
造にはアクリジン−９−カルボン酸クロライド（VIII）
も同様に出発物質として用いられる。次いでこの化合物
を第１または第２スルホンアミド、好ましくは式Ｘ または式XI （式中、ＸおよびR6は前記の意味を有し、そしてＺはカ
ルボキシル基を保護し、後で除去される基である） で示される保護されたスルホンアミドカルボン酸と反応
させる。例えばＮ−ベンゼンスルホニルグリシンベンジ
ルエステルをこの反応の保護基として用いることができ
る。保護基を除去した後に形成される酸は次いで、適当
な化合物、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用い
て基R5に変換される。この生成物の10位の窒素を文献に
知られる方法によりアルキル化することによつて化学発
光性アクリジニウム化合物が得られる。
得られたアクリジニウム化合物は、次いで、生物学的に
重要な物質、例えば抗原、抗体、ホルモン、医薬、医薬
代謝物、毒素またはアルカロイドと反応させて発光性化
合物とすることができる。アクリジニウム誘導体は、そ
れによつて直接に、または架橋分子例えばポリリジン、
ポリグルタミン酸またはポリビニルアミンを介して、生
物学的に重要な物質に結合されて安定な免疫学的に活性
な接合体を形成する。この接合体もまたトレーサと呼ば
れ、後述の発光イムノアツセイに用いられる。拮抗法ま
たはサンドイツチ法による液体サンプル中の抗原物質を
測定するための本発明の発光イムノアツセイには固相に
固定された少くとも一つの免疫学的に活性な成分と前記
発光性トレーサが必要である。発光イムノアツセイは現
在、様々な方法で行うことができる。
一つの可能性は、抗原と特異的に反応する固定された抗
体を、検査対象液のサンプルおよび抗原と化学発光アク
リジニウム誘導体との接合体（抗原トレーサ）と共にイ
ンキユベートし、サンプルと非結合トレーサを分離し、
結合トレーサを酸化剤と混合して発光させ、次いで測定
された発光強度から抗原の存在量を測定することであ
る。
もう一つの可能性は、抗原と特異的に反応する固定され
た抗体を、検査対象後のサンプル、特異的に反応する第
２抗体と化学発光性アクリジニウム誘導体との接合体と
共にインキユベートし、そのサンプルと非結合の標識接
合体を分離し、結合した標識接合体を酸化剤と混合して
発光させ、そして測定された発光強度から抗原の存在量
を測定することよりなる。
前述の発光イムノアツセイは標識接合体を添加する前
に、検査対象液を固定された抗体から分離することによ
り行うこともできる。
本発明により行うことができるその他の発光イムノアツ
セイにおいては、抗体ではなく抗原の方を固定する。す
なわち、抗体と特異的に反応する固定された抗原を検査
対象液のサンプルおよび抗体と化学発光性アクリジニウ
ム誘導体との接合体の溶液と共にインキユベートし、次
いでサンプルと非結合の標識接合体を分離し、そして結
合した標識接合体を次いで酸化剤と混合することができ
る。次いで発光が生じ、その強度から抗原の存在量を測
定することができる。
もう一つの変法は抗体と特異的に反応する固定された抗
原を、抗体と化学発光性アクチジニウム誘導体との接合
体の溶液と共にインキユベートし、未反応の標識接合体
を分離し、検査対象液のサンプルを添加し、次いでサン
プルを再び分離し、結合した標識接合体を酸化剤と混合
して発光させ、次いでこの発光から抗原の存在量を測定
することよりなる。
最後に、抗体と特異的に反応する固定された抗原を抗体
と化学発光性アクリジニウム誘導体との接合体の溶液と
共にインキユベートし、検査対象液のサンプルを添加
し、サンプルと非結合接合体を分離し、結合した標識接
合体を酸化剤と混合し、そして次に測定された発光から
抗原の存在量を測定する方法によつて発光イムノアツセ
イを行うこともできる。
本発明によるアクリジニウム化合物の製造例を実施例１
〜３に示す。
実施例１ ９−シアノアクリジン（１） 3.3mlの氷酢酸をエタノール45ml中のアクリジン（10g）
に添加し、5.25gのシアン化カリウムの水8ml中の溶液を
滴加し、反応混合物を２時間還流加熱しそして冷却し、
そして揮発性成分を真空留去する。残留物を30mlの2N N
aOHと共に攪拌し、吸引過し、2N NaOHおよび水で２回
洗浄し、そして湿つた状態で大気中にしばらく放置す
る。粗製生成物をメチレンクロライド中に攪拌混合し、
非溶解物質を吸引過し、メチレンクロライドで洗浄
し、合一した有機相を濃縮し、そして粗製９−シアノア
クリジンをｎ−ブチルアセテートから再結晶する。
収率:50％、融点:183−５℃ IR:2230cm-1 アクリジン−９−カルボン酸（２） ９−シアノアクリジン（5g）を40mlの濃H2SO4に少量ず
つ徐々に添加し、そしてその混合物を90〜95℃で２時間
加熱し、また8.5gのNaNO2を添加後にこの温度で更に２
時間攪拌する。その熱溶液を素早く攪拌しながら620ml
の氷水に注ぎ、そして沈殿を吸引過し、できるだけ少
量の2N NaOHに溶解する。溶液を過し、液を50％強
度H2SO4で酸性化し、そして析出したアクリジン−９−
カルボン酸を吸引過しそして真空乾燥する。
収率:95％、融点:288−９℃ IR:3440（br）,3200（br）,2600−2500（br）,1980;165
0;1605;1420cm-1 アクリジン−９−カルボン酸クロライド塩酸塩（３） アクリジン−９−カルボン酸（5g）を50mlの用時蒸留し
たSOCl2に少量ずつ添加し、そしてその混合物を５時間
還流加熱する。その時点で透明となつている溶液を沈殿
形成が始まるまで蒸留により濃縮し、そしてシクロヘキ
サンの添加および冷却により沈殿を完了させる。沈殿を
吸引過しそして真空乾燥してアクリジン−９−カルボ
ン酸クロライド塩酸塩を得る。
収率:90％、融点:223℃ 元素分析（C14H9ClNO×HClとして計算） 計算値 C60.5 H2.8 N5.0 Cl25.5 実測値 C59.4 H3.3 N5.0 Cl25.2 （フエニル−２′−カルボン酸）アクリジン−９−チオ
カルボキシレート（４） アクリジン−９−カルボン酸クロライド塩酸塩（30g）
を720mlのメチレンクロライドに懸濁し、チオサリチル
酸（17.7g）および50mlのトリエチルアミンを添加し、
そして透明となつている溶液を次いで室温で10分間攪拌
する。溶媒を除去後、35gの炭酸ナトリウムおよび1400m
lの水を残留物に添加し、得られる溶液を沈殿が現れる
まで濃縮し、そしてこれを吸引過する。液をNaClで
飽和し、そしてそれにより分離する沈殿を同様に吸引
過する。合一した沈殿の水性溶液を80℃で氷酢酸を用い
て酸性化し、そして析出した生成物を吸引過しそして
真空乾燥する。
収率:80％、融点:261−５℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝7.6−8.4ppm,コンプレツクス
マルチプレツト IR:1680cm-1（ｓ）,1720（ｍ）1260（ｓ） ２′−（スクシンイミドイルオキシカルボニル）フエニ
ルアクリジン−９−チオカルボキシレート（５） 3.2gのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを10gのチオール
エステルカルボン酸の乾燥テトラヒドロフラン190ml中
の懸濁液（０℃）に添加し、次いで6.9gのジシクロヘキ
シルカルボジイミド（DCC）を−20℃で添加し、次にそ
の混合物を−20℃で２時間攪拌した後室温で一夜攪拌す
る。0.28mlの氷酢酸を添加後、その混合物を１時間攪拌
し、次いで酢酸エチル（25ml）を添加し、そして沈殿を
過する。液を濃縮しそしてクロロベンゼンから再結
晶すると淡黄色の２′−（スクシンイミドイルオキシカ
ルボニル）フエニルアクリジン−９−チオカルボキシレ
ートが得られる。
収率:80％、融点:198−200℃ IR:1810cm-1,1780,1745,1225,1205 NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、7.7−8.4p
pm（m,12H） ２′−（スクシンイミドイルオキシカルボニル）フエニ
ル−10−メチルアクリジニウム−９−チオカルボキシレ
ートテトラフルオボレート（６） 3gのＮ−ヒドロキシスクシンイミド−エステル（５）を
40mlの1,2−ジクロロエタン中7.8gのトリメチルオキソ
ニウムテトラフルオボレートと共に80℃で８時間加熱
し、そしてその混合物を次いで室温で一夜攪拌する。沈
殿を過し、そして1,2−ジクロロエタンと共に沸騰さ
せることにより抽出する。合一した有機相を濃縮しそし
て残留物をアセトン−ジイソプロピルエーテルから再結
晶する。
収率:40％、融点:245℃ IR:3440cm-1（br）,1800,1780,1740（ｓ）,1670,1065
（ｓ） NMR（DMSO,100MHz）：δ＝3.0ppm（s,4H）、4.95ppm
（s,やや拡散,3H）、7.9−8.6（m,10H）、9.9ppm（d,2
H） 実施例２ 酸クロライド（３）およびチオグリコール酸から出発す
るスクシンイミドイルオキシカルボニルメチル−10−メ
チルアクリジニウム９−チオカルボキシレートテトラフ
ルオボレートの製造を（６）の合成と同様にして行う。
生成物（７）〜（９）の個々の合成工程の収率および分
光法による特性を下記に示す： カルボキシメチルアクリジン−９−チオカルボキシレー
ト（７） 収率:60％ 融点:218℃（分解） IR:3440cm-1（br）、2400（br）、1950（br）、1710
（ｍ）、1660（ｓ）、1070（ｍ） NMR（DMSO,100MHz）：δ＝4.25ppm（s,2H）;7.6−8.4
（m,8H） スクシンイミドイルオキシカルボニルメチルアクリジン
−９−チオカルボキシレート（８） 収率:80％ IR:3440cm-1（br）、2930、1820、1785、1740（ｓ）、1
205、1165 NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、4.77ppm
（s,2H）、7.6−8.3ppm（m,8H） スクシンイミドイルオキシカルボニルメチル−10−メチ
ルアクリジニウム９−チオカルボキシレートテトラフル
オボレート（９） 収率:40％ 融点:250℃ IR:3440cm-1（br）、1810、1780、1735（ｓ）、1538、1
350、1060 NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.9ppm（s,4H）、4.8（s,2
H）、4.9ppm（s,3H）、7.7−9.0（m,8H） 実施例３ Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｎ−（ベンジルオキシカルボ
ニルメチル）アクリジン−９−カルボン酸アミド（10） 130gの４−（ジメチルアミノ）−ピリジンおよび6mlの
トリエチルアミンを110mlのテトラヒドロフラン中の3.3
gのＮ−ベンゼンスルホニルグリシンベンジルエステル
に添加し、3gのアクリジン−９−カルボン酸クロライド
塩酸塩を10分後に添加し、そして生じた懸濁液を６時間
還流加熱する。沈殿を吸引過し、溶媒を除去しそして
残留物をメチレンクロライドにとりそして2N NaOHで短
時間攪拌する。MgSO4で乾燥後、有機相を濃縮しそして
得られる残留物をトルエン／ヘプタンから再結晶する。
収率:70％ 融点:58℃ IR:3440cm-1（br）、1735、1680、1357、1165 NMR（DMSO,100MHz）、δ＝5.2ppm（s,2H）、5.3ppm（s,
2H）、7.0−8.4ppm（m,18H） Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｎ−（カルボキシメチル）ア
クリジン−９−カルボン酸アミド（11） 60mlの氷酢酸中の1gのＮ−ベンゼンスルホニル−Ｎ−
（ベンジルオキシカルボニルメチル）アクリジン−９−
カルボン酸アミドを室温および常圧で2mlの濃HClおよび
Pd/C（10％）を添加して水素添加する。反応が終了した
ら、触媒を吸引過し、そして液を濃縮するとカルボ
ン酸が黄色固形物として得られる。
NMR（DMSO,100MHz）：δ＝5.0ppm（s,2H）、7.1−8.5pp
m（m,13H） 化合物（11）を（５）の製造と同様にしてＮ−ヒドロキ
シスクシンイミドと反応させてＮ−ベンゼンスルホニル
−Ｎ−（スクシンイミドイルオキシカルボニルメチル）
アクリジン−９−カルボン酸アミド（12）とする。（1
2）を（６）についての記載と同様にしてトリメチルオ
キソニウムテトラフルオボレートで４級化すると、Ｎ−
ベンゼンスルホニル−Ｎ−（スクシンイミドイルオキシ
カルボニルメチル）−10−メチルアクリジニウム９−カ
ルボン酸アミドテトラフルオボレート（13）が得られ
る。
実施例４ Ｎ−フエニル−Ｎ（４−ベンジルオキシカルボニルベン
ゼンスルホニル）アクリジン−９−カルボン酸アミド
（14） 360mgの４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよび16.6ml
のトリエチルアミンを300mlのメチレンクロライド中の1
1gのベンジル４−（Ｎ−フエニルスルフアミド）ベンゾ
エートに添加し、10分後に8.34gのアクリジン−９−カ
ルボン酸クロライド塩酸塩（３）を添加しそしてその混
合物を16時間還流加熱する。冷却溶液を2N NaOHと共に
短時間攪拌し、そして有機相を分離し、水洗し、Na2SO4
で乾燥しそして濃縮する。残留物をトルエン／ヘプタン
から再結晶する。
収率:70％ 融点:161−163℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝5.5ppm（s,2H）、δ＝6.8−
8.6ppm（m,22H） Ｎ−フエニル−Ｎ−（４−カルボキシベンゼンスルホニ
ル）アクリジン−９−カルボン酸アミド臭化水素酸塩
（15） 8.58gのＮ−フエニル−Ｎ−（４−ベンジルオキシカル
ボニルベンゼンスルホニル）−アクリジン−９−カルボ
ン酸アミド（14）を氷酢酸中の33％強度HBr30ml中で60
℃に２時間加熱し、そして冷却後60mlのジイソプロピル
エーテルを添加し、そして沈殿を吸引過しそして真空
乾燥する。
収率:95％ 融点:255℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝6.8−9ppm（ｍ） Ｎ−フエニル−Ｎ−（４−スクシンイミドイルオキシカ
ルボニルベンゼンスルホニル）−アクリジン−９−カル
ボン酸アミド（16） 2.8mlのトリエチルアミンを250mlのテトラヒドロフラン
中の5.63gのＮ−フエニル−Ｎ−（４−カルボキシベン
ゼンスルホニル）アクリジン−９−カルボン酸アミド臭
化水素酸塩（15）に添加し、その混合物を−15℃に冷却
し、そして0.96mlのエチルクロロホルメートを添加す
る。その混合物を次いで20分間攪拌し、1.15gのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドを添加し、そして混合物を−15
℃で３時間攪拌し、室温まで放置して暖め、次いで一夜
攪拌する。沈殿を吸引過し、液を濃縮し、残留物を
メチレンクロライドにとり、そして得られた溶液を水、
NaHCO3および水で洗浄し、そしてNa2SO4で乾燥する。有
機相を濃縮し、そして残留物をトルエンから再結晶す
る。
収率:50％ 融点:226℃（分解） NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、δ＝6.8−
8.7ppm（m,17H） Ｎ−フエニル−Ｎ−（４−スクシンイミドイルオキシカ
ルボニルベンゼンスルホニル）−10−メチルアクリジニ
ウム−９−カルボン酸アミドフルオロスルホネート（1
7） 1.16gのＮ−フエニル−Ｎ−（４−スクシンイミドイル
オキシカルボニルベンゼンスルホニル）アクリジン−９
−カルボン酸アミド（16）を60mlの1,2−ジクロロエタ
ン中で0.3mlのメチルフルオロスルホネートと共に室温
で24時間攪拌し、そして分離した沈殿を吸引過しそし
て真空乾燥する。
収率:65％ IR:3420cm-1（br）、3100（br）、1805（ｗ）、1770
（ｍ）、1745（ｓ）、1700（ｍ）、1385（ｍ）、1280
（ｍ）、1255（ｓ）、1230（ｓ）、1205（ｓ） NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、δ＝4.75p
pm（s,br,3H）、δ＝7.0−9.0ppm（m,17H） マススペクトル:m/z＝594:M+（陽イオン） 実施例５ ベンジル４−〔４−（４′−メトキシフエニル）スルフ
アミド〕−ベンゾエートおよびアクリジン−９−カルボ
ン酸クロライド塩酸塩（３）から出発するＮ−（４−メ
トキシフエニル）−Ｎ−（４−スクシンイミドイルオキ
シカルボニルベンゼンスルホニル）−10−メチルアクリ
ジニウム９−カルボン酸アミドフルオロスルホネート
（21）の製造を（17）の合成（実施例４参照）と同様に
して行う。個々の合成工程の収率および分光法による特
性を以下に記載する。
Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（４−ベンジルオ
キシカルボニル−ベンゼンスルホニル）−アクリジン−
９−カルボン酸アミド（18） 収率:70％ 融点:182−183℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝3.5ppm（s,3H）、δ＝5.5ppm
（s,2H）、δ＝6.35−6.63ppm（ｄ、br、2H）、δ＝7.0
5−7.2ppm（d,br,2H）、δ＝7.35−8.5ppm（m,17H） Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（４−カルボキシ
ベンゼンスルホニル）アクリジン−９−カルボン酸アミ
ド臭化水素酸塩（19） 収率:95％ 融点:273℃（分解） NMR（DMSO,100MHz）：δ＝3.5ppm（s,3H）、δ＝6.4−
6.6ppm（ｄ、br、2H）、δ＝7.05−7.2ppm（d,br,2
H）、δ＝7.7−8.5ppm（m,12H） Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（４−スクシンイ
ミドイルオキシカルボニルベンゼンスルホニル）アクリ
ジン−９−カルボン酸アミド（20） 収率:50％ 融点:232−234℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、δ＝3.5pp
m（s,3H）、δ＝6.4−6.6ppm（ｄ、br、2H）、δ＝7.05
−7.25ppm（d,br,2H）、δ＝7.8−8.6ppm（m,12H） IR:3050cm-11805（ｗ）、1780（ｍ）、1740（ｓ）、170
0（ｍ）、1505（ｍ）、1370（ｍ）、1250（ｍ）、1200
（ｓ）、1185 Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（４−スクシンイ
ミドイルオキシカルボニルベンゼンスルホニル）−10−
メチルアクリジニウム−９−カルボン酸アミドフルオロ
スルホネート（21） この物質は反応時には析出せず、溶液を濃縮して残留物
をジイソプロピルエーテルと共に攪拌することにより得
られる。
収率:80％ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、δ＝3.5pp
m（s,3H）、δ＝4.8ppm（s,br,3H）、δ＝6.45−6.7ppm
（d,br,2H）、δ＝7.2−7.4ppm（d,br,2H）、δ＝7.7−
9ppm（m,12H） マススペクトル:m/z＝624M+（陽イオン） IR:3440cm-1（br）、3100、2950、1805（ｗ）、1775
（ｍ）、1740（ｓ）、1695（ｍ）、1610（ｍ）、1505
（ｍ）、1375（ｍ）、1280（ｍ）、1250（ｓ）、1205
（ｓ） 実施例６ ベンジル３−〔Ｎ−（４′−メトキシフエニルスルフア
ミド〕−ベンゾエートおよびアクリジン−９−カルボン
酸クロライド塩酸塩（３）から出発するＮ−（４−メト
キシフエニル）−Ｎ−（３−スクシンイミドイルオキシ
カルボニルベンゼンスルホニル）−10−メチルアクリジ
ニウム９−カルボン酸アミドフルオロスルホネート（2
5）の製造を（17）の合成（実施例４参照）と同様にし
て行う。個々の合成工程の収率および分光法による特性
を以下に記載する。
Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（３−ベンジルオ
キシカルボニルベンゼンスルホニル）アクリジン−９−
カルボン酸アミド（22） 収率:70％ 融点:168−170℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝3.5ppm（s,3H）、δ＝5.45pp
m（s,2H）、δ＝6.5ppm（s,br,2H）、δ＝7.1ppm（br,2
H）、δ＝7.3−8.8ppm（m,17H） Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（３−カルボキシ
ベンゼンスルホニル）アクリジン−９−カルボン酸アミ
ド臭化水素酸塩（23） 収率:90％ 融点:264℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝3.5ppm（s,3H）、δ＝6.4−
6.6ppm（d,br,2H）、δ＝7.0−7.2ppm（d,br,2H）、δ
＝7.6−8.8ppm（m,12H） Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（３−スクシンイ
ミドイルオキシカルボニルベンゼンスルホニル）アクリ
ジン−９−カルボン酸アミド（24） 収率:50％ 融点:223−225℃ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、δ＝3.5pp
m（s,3H）、δ＝6.4−6.6ppm（d,br,2H）、δ＝7.0−7.
2ppm（d,br,2H）、δ＝7.4−8.9ppm（m,12H） IR:3500cm-1（br）、3060、2950、2840、1805（ｗ）、1
785（ｍ）、1740（ｓ）、1700（ｍ）、1510（ｍ）、138
0（ｍ）、1250（ｍ）、1205（ｍ）、1165（ｍ） Ｎ−（４−メトキシフエニル）−Ｎ−（３−スクシンイ
ミドイルオキシカルボニルベンゼンスルホニル）−10−
メチルアクリジニウム９−カルボン酸アミドフルオロス
ルホネート（25） 収率:90％ NMR（DMSO,100MHz）：δ＝2.95ppm（s,4H）、δ＝3.55p
pm（s,3H）、δ＝4.8ppm（d,br,3H）、δ＝6.45−6.7
（d,br,2H）、δ＝7.05−7.3ppm（d,br,2H）、δ＝7.5
−8.9ppm（m,12H） IR:3500cm-1（br）、3080、2950、1805（ｗ）、1780
（ｍ）、1740（ｓ）、35 1700（ｍ）、1610（ｍ）、151
0（ｍ）、1380（ｍ）、1250（ｓ）、1205（ｓ）、1170
（ｓ） マススペクトル:m/z＝624M+（陽イオン） 実施例７ α−フエトタンパク化学発光イムノアツセイ用トレーサ
調製 100μｌの抗体（1mg/ml）、11.5μｌの実施例１により
製造されたアクリジニウムチオエステル（化合物６）
（DMSO中1mg/ml）および600μｌの接合反応用緩衝液
（0.01Mホスフエート、pH8.0）を15分間インキユベート
する。次に200μｌのリジン（10mg/ml）を添加し、そし
てその混合物を更に15分間インキユベートする。このバ
ツチをPD10カラム（Sephadex G25媒質、0.1Mホスフエー
ト、pH6.3を移動相とする）に移す。10滴／画分を集め
る。個々の画分を適宜希釈後その化学発光活性について
試験する（酸化剤350μl:0.1N NaOH中の0.1％H2O2）。
トレーサ画分（第１活性ピーク）をプールし４℃で貯蔵
する。
実施例８ α−フエトタンパク化学発光イムノアツセイ法 50μｌのスタンダード／サンプルおよび150μｌの緩衝
液（ホスフエート;0.1M pH6.3、１％Tween20、0.1％牛
血清アルブミン、0.1M NaCl、0.01％NaN3）をモノクロ
ーナル抗−AFP抗体で被覆された試験管中で15分間振盪
する。次に２×1mlずつの緩衝液で洗浄する。200μｌの
トレーサを適宜希釈して添加し、そしてその混合物を15
分間振盪する。再度1mlずつの緩衝液で２回洗浄する。
化学発光測定を350μｌの酸化剤（0.1N NaOH中0.1％H2O
2、測定時間２秒）を用いて開始する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のアクリジニウム誘導体例の抗体接合
体の発光速度を示す。 第２図は、従来のアクリジニウム誘導体例の抗体接合体
の発光速度を示す。 第３図は、α−フエトタンパク（AFP）についてのイム
ノ化学発光測定アツセイ（ICMA）の標準曲線の典型例を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘニング・リユバース ドイツ連邦共和国デー−6231シユヴアルバ ハ・アム・タウヌス．シユペヒトシユトラ ーセ17 (72)発明者 ヘルムート・シユトレツカー ドイツ連邦共和国デー−6102プフングシユ タト・オーデンヴアルトシユトラーセ56 (72)発明者 ゲルト・シユノル ドイツ連邦共和国デー−6268バートヴイル ベル．アウフデムラテイヒコプフ23 (72)発明者 トーニオ・キンケル ドイツ連邦共和国デー−6230フランクフル ト・アム・マイン80．ヘールゼルベルクシ ユトラーセ１

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式Ｉ 〔式中、R1は水素、１〜10個の炭素原子を有するアルキ
    ル、アルケニルもしくはアルキニル基、またはベンジル
    もしくはアリール基であり、R2およびR3は水素、１〜４
    個の炭素原子を有するアルキル基、置換もしくは未置換
    アミノ基、カルボキシル、C1〜C4−アルコキシ、シアノ
    またはニトロ基またはハロゲンであり、R4は式II −Ｓ−Ｘ−R5 （II） ｛式中Ｘは分枝状もしくは非分枝状脂肪族基または芳香
    族基（それはまたヘテロ原子を含むこともできる）であ
    り、そしてR5は穏やかな条件下に生物学的に重要な物質
    中のアミノ、カルボキシルもしくはチオール基またはそ
    の他の官能基と選択的に結合され得る反応性基である｝
    で示されるチオアルキルもしくはチオアリール基である
    か、または式ＶもしくはVI ｛式中ＸおよびR5は前記と同じ定義を有し、そして式Ｖ
    のR6は１〜10個の炭素原子を有するアルキルもしくはア
    ルケニル基、置換アミノ基、またはモルホリノ、ベンジ
    ルもしくはアリール基（これらはヒドロキシル、アミ
    ノ、１〜４個の炭素原子を有するアルコキシまたはアリ
    ールオキシにより置換され得る）であり、そして式VIの
    R6は前記置換分のほかに水素を表わすこともできる｝で
    示される置換スルホンアミド基であり、そしてＡ は化
    学発光を妨げない陰イオンである〕で示される化学発光
    性アクリジニウム誘導体。
  2. 【請求項２】Ｘがメチレン、エチレン、プロピレンまた
    はオルト−、メタ−もしくはパラ−フェニレン基である
    特許請求の範囲第１項記載のアクリジニウム誘導体。
  3. 【請求項３】R5が式III で示される基である特許請求の範囲第１項記載のアクリ
    ジニウム誘導体。
  4. 【請求項４】式IV （式中、ＡおよびＸは特許請求の範囲第１項における定
    義を有する）で示される特許請求の範囲第３項記載のア
    クリジニウム誘導体。
  5. 【請求項５】式VII （式中、ＡおよびＸは特許請求の範囲第１項における定
    義を有する）で示される特許請求の範囲第１項記載のア
    クリジニウム誘導体。
  6. 【請求項６】式Ｉ 〔式中、R1は水素、１〜10個の炭素原子を有するアルキ
    ル、アルケニルもしくはアルキニル基、またはベンジル
    もしくはアリール基であり、R2およびR3は水素、１〜４
    個の炭素原子を有するアルキル基、置換もしくは未置換
    アミノ基、カルボキシル、C1〜C4−アルコキシ、シアノ
    またはニトロ基またはハロゲンであり、R4は式II −Ｓ−Ｘ−R5 （II） ｛式中、Ｘは分枝状もしくは非分枝状脂肪族基または芳
    香族基（それはまたヘテロ原子を含むこともできる）で
    あり、そしてR5は穏やかな条件下に生物学的に重要な物
    質中のアミノ、カルボキシルもしくはチオール基または
    その他の官能基と選択的に結合され得る反応性基であ
    る｝で示されるチオアルキルもしくはチオアリール基で
    あり、そしてＡ は化学発光を妨げない陰イオンであ
    る〕で示される化学発光性アクリジニウム誘導体を製造
    するにあたり、まず式VIII （式中Ｙはハロゲンまたはオキシカルボニル−C1〜C5−
    アルキル、オキシカルボニルアリールもしくはイミダゾ
    リド基を表わす）で示されるアクリジン化合物を式IX HS−Ｘ−COOH （IX） （式中Ｘは前記と同じ定義を有する）で示されるチオー
    ルカルボン酸と反応させ、次いで得られる酸を所望の基
    R5含有アクリジン誘導体に変換し、次いで更にこの誘導
    体のアクリジン骨格の窒素を４級化することより成る、
    前記アクリジニウム誘導体の製造方法。
  7. 【請求項７】式Ｉ 〔式中、R1は水素、１〜10個の炭素原子を有するアルキ
    ル、アルケニルもしくはアルキニル基、またはベンジル
    もしくはアリール基であり、R2およびR3は水素、１〜４
    個の炭素原子を有するアルキル基、置換もしくは未置換
    アミノ基、カルボキシル、C1〜C4−アルコキシ、シアノ
    またはニトロ基またはハロゲンであり、R4は式Ｖもしく
    は VI ｛式中Ｘは分枝状もしくは非分枝状脂肪族基または芳香
    族基（それはまたヘテロ原子を含むこともできる）であ
    り、そしてR5は穏やかな条件下に生物学的に重要な物質
    中のアミノ、カルボキシルもしくはチオール基またはそ
    の他の官能基と選択的に結合され得る反応性基である｝
    で示されるチオアルキルもしくはチオアリール基であ
    り、そして式ＶのR6は１〜10個の炭素原子を有するアル
    キルもしくはアルケニル基、置換アミノ基、またはモル
    ホリノ、ベンジルもしくはアリール基（これらはヒドロ
    キシル、アミノ、１〜４個の炭素原子を有するアルコキ
    シまたはアリールオキシにより置換され得る）であり、
    そして式VIのR6は前記置換分のほかに水素を表わすこと
    もできる｝で示される置換スルホンアミド基であり、そ
    してＡ は化学発光を妨げない陰イオンである〕で示さ
    れる化学発光性アクリジニウム誘導体を製造するにあた
    り、まず式VIII （式中R2およびR3は前記の定義を有し、Ｙはハロゲンま
    たはオキシカルボニル−C1〜C5−アルキル、オキシカル
    ボニルアリールもしくはイミダゾリド基を表わす）で示
    されるアクリジン化合物を式Ｘ または式XI （式中Ｘは前記の定義を有し、式ＸのR6は前記式ＶのR6
    の定義を有し、式XIのR6は前記式VIのR6の定義を有し、
    Ｚはカルボキシル基を保護し、後で除去される基を表わ
    す）で示される保護されたスルホンアミドカルボン酸と
    反応させ、次いで生成物を所望の基R5含有アクリジン誘
    導体に変換し、次いで更にこの誘導体のアクリジン骨格
    の窒素を４級化することより成る、前記アクリジニウム
    誘導体の製造方法。
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