NO171725B

NO171725B - Kjemiluminescerende acridinderivater

Info

Publication number: NO171725B
Application number: NO873520A
Authority: NO
Inventors: Peter Molz; Hans-Juergen Skrzipczyk; Henning Luebbers; Helmut Strecker; Gerd Schnorr; Tonio Kinkel
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1986-08-22
Filing date: 1987-08-20
Publication date: 1993-01-18
Also published as: JPH07179428A; DE3752357D1; IE74678B1; JPS6357572A; FI873609A7; CA1341402C; DE3751659D1; NO873520L; DK437187A; IE872245L; EP0647628B1; EP0257541A2; FI873609A0; ES2182835T3; JP2766780B2; DE3628573A1; IE960911L; FI90542C; ATE223903T1; NO873520D0

Description

Oppfinnelsens gjenstand er kjemiluminescerende acridinderivater.

Luminescerende forbindelser har allerede en utbredt anvendelse. De anvendes som indikatorer i bioanalyser, enzymimmu-noanalyser og luminescensimmunoanalyser (sammenlign W.P. Collins "Alternative Immunoassays", Verlag John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 1985), de anvendes imidlertid også i nukleinsyre-hybridiseringsanalyser (sammenlign J.A. Matthews et al. "Analytical Biochemistry", 151, 205-209, 1985). Dessuten anvendes kjemiluminescerende forbindelser ved "flow injection analysis", i "post-column"-detektorer i vaeske-kromatografi, i strømningsforskning og i kunstige lyskilder.

Ved kjemiluminescensimmunoanalyser har spesielt to struktur-typer av kjemiluminescerende markeringsstoffer fått større betydning. Det dreier seg herved på den ene side om luminol-henholdsvis isoluminolderivater, som er beskrevet ved H.R. Schroeder et al., "Methods in Enzymology", Academic Press Inc., New York, Vol. LVII, 1978, 424 og følgende, samt i GB-PS 2 008 247 og 2 041 920, i DE-PS 26 18 419 og 26 18 511, samt i EP-publ. 135 071. Et oversyn over den praktiske anvendelse av isoluminolforbindelser som luminescens-indikatorer finnes hos W.G. Wood, "J. Cl in. Chem. Cl in. Biochem." 22, 1984, 905-918.

På den annen side har også acridiniumesterforbindelser funnet anvendelse som kjemiluminescerende markeringsstoffer. Slike acridiniumestere er kjent fra US-PS 3 352 791, GB-PS 1 316 363 og 1 461 877, samt f ra EP-publ. 82 636. Anvendelsen av acridiniumestere som markeringsstoffer i immunoanalyser er omtalt i weeks et al., "Clin. Chem." 29/8 (1983), 1474-1479. Også anvendelsen av fenantridiniumestere som markeringsstoff i luminisensimmunoanalyser er allerede kjent fra EP-publ. 170 415.

Kjemiluminescensen av acridiniumestere kan startes ved tilsetning av alkalisk EtøC^-oppløsning. For mekanismen av kjemiluminescensen har F. McCapra, "Acc.Chem.Res." 9, 201, 1976, gitt en overbevisende forklaring. Derved er tydelig typen av den avspaltbare gruppe avgjørende så vel for lyskvant-utbyttet som også for den hydrolytiske stabilitet.

De hittil allerede kjente acridiniumestere har i forhold til luminol- og isoluminolforbindelsene den fordel en høyere lyskvant-utbytte, som også ikke påvirkes av til indikatoren bundne proteiner (sammenlign Weeks et al., "Clin. Chem." 29/8

(1983), 1474-1479).

Skjønt de fra den EP-søknad 82 636 kjente acridiniumfenyl-estere ved energisering av kjemiluminescensen ved milde oksydasjonsmidler, utmerker seg ved en høy påvisningsfølsom-het, har de for den praktiske anvendelse forstyrrende ulemper. Fremfor alt er fenylesterbindingene i vandige systemer også allerede ved romtemperatur meget labil. Dertil kommer at under de der angitte oksydasjonsbetingelsene viser acridiniumfenylesterene en lysemisjon som er først sterkt avsluttet efter ca. 10 sek. , det vil si til over 95%. Sammenlignet med dette har andre ikke-isotopiske analysefrem-gangsmåter meget kortere måletider, og muliggjør derved en høyere prøveproduksjon.

Oppfinnelsens oppgave var derfor å stille til disposisjon nye acridiniumderivater som ved høy lyskvant-utbytte har en hurtigere reaksjonskinetik og dermed muliggjør kortere måletider for en luminescensimmunoanalyse.

Det ble nå funnet at disse krav oppfylles av kjemiluminescerende acridiniumderivater med formel I

der R<1>er hydrogen, Ci-C4-alkyl, R<2>ogR<3>er hydrogen, R<4>er en substituert sulfonamidgruppe med formel V eller med formel VI eller en tioalkyl- eller tioarylrest med formel II

hvorved

X er en metylen-, etylen-, propylen- eller en orto-, meta-eller parafenylengruppe og R^ er en reaktiv gruppe,

A~ er et anion som ikke påvirker kjemiluminescensen, og R^ i formel V og VI er fenyl eller naftyl som også kan være substituert med C^^alkoksy.

Anionene som ikke påvirker kjemiluminescensen kan være et tetrafluoroborat-, perklorat-, halogenid-, alkylsulfat-, halosulfonat-, alkylsulfonat- eller arylsulfonatantion. Også et hvert annet anion kan anvendes så vidt det ikke slukker eller svekker kjemiluminescensen.

Dessuten foretrekkes også acridiniumforbindelser hvori R<*>er en metylgruppe. Spesielt ofte anvendes acridiniumforbindelser ifølge oppfinnelsen som tilsvarer formel IV

hvori A og X har ovennevnte betydning.

Typiske representanter av disse klasser av acridiniumderivater ifølge oppfinnelsen tilsvarer formel VII

hvori A og X har ovennevnte betydninger.

Ved foreliggende oppfinnelse stilles det altså til disposisjon to ny klasser av acridiniumforbindelser, i det den ene klasse utmerker seg ved en tiolestergruppering og den andre ved en sulfonamidstruktur. Acridiniumacylsulfonamid-derivatene har en høyere stabilitet, tiolesteren en hurtigere kinetik enn de tidligere kjente acridiniumfenylesterforbind-elsene. Begge forbindelsesklasser utmerker seg dessuten ved et høyere lysutbytte.

En betydelig fordel ved acridiniumforbindelsen ifølge oppfinnelsen med tiolesterholdige avspaltbare grupper, i forhold til de i fra EP-søknad 82 636 kjente acridinium- fenylestere, ligger i den vesentlig hurtigere reaksjonskinetik av lysemisjonen. Således gir den ifølge eksempel 1 fremstilte acridiniumtioester ifølge oppfinnelsen (forbindelse 6) ved 1 sekunds måletid, et rundt faktor 10 høyere lysutbytte under de samme oksydasjonsbetingelsene. Dette høye lysutbytte ved samtidig korte måletider, muliggjør et vesentlig høyere prøveproduksjon til luminometeret.

Således viser fig. 1 kinetiken av lysemisjonen av antistoff-konjugat fra den ifølge eksempel 1 fremstilte acridiniumtioester (forbindelse 6) og fig. 2 denne av antistoffkonjugatet av 4-(2-succinimidyl-oksykarbonyletyl)-fenyl-10-metylacridinium-9-karboksylat-metosulfat (EP-søknad 82 636, side 10). 100 jjI av traceroppløsningene energiseres ved tilsetning av 350 pl (0,05 m KC1/NaOH-buf f er, pH 13 + 0, 1% H202til kjemiluminescens og opptegnes over et tidsrom på 10 sekunder.

I fig. 1 oppnås den maksimale lysemisjon allerede efter 0,66 sek. og er efter 0,88 sek. allerede falt igjen til halvparten. Derimot oppnås i fig. 2 den maksimale lysemisjon først efter 1,77 sek. og er først efter 2,88 sek. igjen falt til halvparten.

Helt uventet er at på amidnitrogenet sulfonylsubstituerte acridinium-9-karboksylsyreamider har en utmerket kjemiluminescens, for det er kjent at acridinium-9-karboksylsyreamid i motsetning til acridinium-9-karboksylsyreesteren ikke viser kjemiluminescens (se F. McCapra i W. Carruthers og J.K. Sutherland: "Progress in Organic Chem.", vol. 8, 231-277, 1973, Butterworth, London).

Acridinium-9-karboksylsyretioesterene ifølge oppfinnelsen lar seg fremstille på følgende måte: Acridin eller dets derivater med R<2>og/eller R<3>i de påkon-denserte fenylringer omsettes efter den av Lehmstedt og Hundertmark i "Ber." 63, 1229 (1930) angitte fremgangsmåte i etanol/iseddik med kaliumcyanid til 9-cyanacridin. Herav fremstilles efter omkrystallisering ved omsetning med svovelsyre og natriumnitrit tilsvarende den av Lehmstedt og Wirth i "Ber." 61, 2044, (1928), omtalte fremgangsmåte acridin-9-karboksylsyre henholdsvis R<2>/R<3->substituerte acridin-9-karboksylsyre. Ved omsetning av acridin-9-karbok-sylsyren respektiv R<2>/R<3->ubstituerte acrIdin-9-karboksylsy-ren med tionylklorid fremstilles forbindelsen med formel VIII

hvori Y betyr klor. I stedet for et halogen kan det i forbindelsen VIII for Y også innføres en oksykarbonyl-C^-Cs-alkyl-, oksokarbonylaryl- eller imidazolidgruppe.

De R<2>/R<3->substituerte acridinderivater kan enkelt fremstilles efter litteraturkjente fremgangsmåter. Slike synteser er eksempel omtalt i: "Comprehensive Heterocyclic Chemistry"; Editors Å. Katritzky, C.W. Rees, vol. 2, s. 395ff; "Pergamon Press", 1984; eller "Heterocyclic Compounds", vol. 9, "Acridines and Cond." 2<nd>Edition, R.M. Acheson, John Wiley and Sons, 1973.

Syrekloridet (VIII) omsettes derefter med en tiolkarboksyl-syre med formel IX,

for eksempel med 2-merkaptobenzosyre under alkaliske betingelser til tiolesterkarboksylsyre, som derefter forestres med en for fremstilling av resten R^ egnet

forbindelse, for eksempel med N-hydroksysuccinimid. Derefter alkyleres acridinforbindelsene efter litteraturkjente fremgangsmåter i 10-stilling. For en metylering egner seg fremfor alt trimetyloksoniumtetrafluoroborat, Imidlertid får man også med dimetylsulfonat, metylfluorsulfonat, toluensul-fonsyremetylester eller trifluorometansulfonsyrmetylester gode utbytter av den kjemiluminescerende acridiniumfor-bindelse.

Til fremstilling av acridiniumsulfonamid-derivatene ifølge oppfinnelsen går man likeledes ut fra acridin-9-karboksyl-syreklorid (VIII). Denne forbindelse omsettes derefter med et primært eller sekundært sulfonamid, fortrinnsvis med en beskyttet sulfonamidkarboksylsyre med formel X

eller formel XI

hvori X og R<*>>har ovennevnte betydning og at Z betyr en rest som beskytter karboksygruppen og som derefter avspaltes. For eksempel kan det for denne reaksjon som beskyttelsesgruppe anvendes en benzensulfonylglycinbenzylester. Den efter avspaltning av beskyttelsesgruppen dannede syre, overføres derefter med en egnet, eksempelvis med N-hydroksysuccinimid til resten R^. Herav fremstilles de kjemiluminescerende acridiniumforbindelser ifølge litteraturkjente fremgangsmåter ved alkylering ved nitrogenet I 10-stilling.

De dannede acridiniumforbindelser lar seg derefter omsette med et stoff av biologisk interesse, for eksempel et antigen, et antistoff, et hormon, et legemiddel, en legemiddel-metabolitt, et toksin, eller et alkaloid til en lumin escerende forbindelse. Derved bindes acridiniumderivatet enten direkte eller over et bromolekyl, som polylysin, polyglutaminsyre eller polyvinylamid, til det biologiske interessante stoff under dannelse av et stabilt immunologisk aktivt konjugat. Dette konjugat betegnes også som tracer og anvendes i den nedenfor omtalte luminescensimmunoanalyse.

Fremstillingen av acridiniumforbindelsen ifølge oppfinnelsen vises ved eksemplene 1 til 6.

EKSEMPEL 1

9- cvanacridin ( 1)

Til acridin (10 g) i 45 ml etanol setter man 3,3 ml iseddik og dråpevis en oppløsning av 5,25 g kaliumcyanid i 8 ml vann, oppvarmer reaksjonsblandingen i 2 timer under tilbakeløp, avkjøler og fjerner de flyktige bestanddeler i vakuum. Resten røres ut med 30 ml 2 N NaOH, suges fra og, efter to gangers vasking med 2 N NaOH og vann, hensettes noen tid fuktig i luften. Råproduktet røres ut i metylenklorid, uoppløst stoff suges fra og vaskes med metylenklorid, de forenede organiske faser sammenføres og det urene 9-cyanacridin omkrystalliseres fra n-butylacetat.

Utbytte: 50% Smeltepunkt: 183-5°C.

IR: 2 230cm_<1>.

Acridin- 9- karboksylsvre ( 2 )

9-cyanacridin (5 g) has langsomt porsjonsvis til 40 ml konsentrert H2SO4og blandingen oppvarmes i 2 timer ved 90-95°C, efter tilsetning av 8,5 g NaN02»og omrøres ytterligere i 2 timer ved denne temperatur. Den varme oppløsning helles under hurtig omrøring i 620 ml isvann, utfellingen suges fra og oppløses i minst mulig 2 N NaOH. Oppløsningen filtreres og surgjøres med 50#-ig H2SO4, den utfelte acridin-9-karbok-sylsyre suges fra og tørkes under vakuum.

Ubytte: 95% Smeltepunkt: 288-9°C.

IR: 3440(br), 3200(br), 2600-2500(br), 1980; 1650; 1605; 1420"<1>.

Acridln- 9- karboksvlsvreklorid- hvdroklorld ( 3) Acridln-9-karboksylsyre (5 g) has porsjonsvis til 50 ml nydestlllert SOCI2og oppvarmes 1 5 timer under tilbakeløp, den derefter klare oppløsning konsentreres ved destillering inntil begynnende utfelling, utfellingen fullstendiggjøres ved cykloheksantilsetning og avkjøling. Frasugning av utfellingen og tørking under vakuum gir acridin-9-karboksyl-syrekloridhydroklorid.

Utbytte: 90% Smeltepunkt: 233°C

Elementanalyse (beregnet som C14H9CINO x HC1)

( Fenvl- 2'- karboksvlsvre) acridin- 9- tiokarboksvlat ( 4 ) Acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (30 g) suspenderes i 720 ml metylenklorid, tilsettes tiosalicylsyre (17,7 g) og 50 ml trietylamin, oppløsningen som er blitt klar omrører man i 10 minutter ved værelsestemperatur. Efter fjerning av oppløsningsmidlet blandes resten med 35 g soda og 1 400 ml vann, den resulterende oppløsning dampes inn inntil opptreden av en utfelling, denne suges fra. Filtratet mettes med NaCl og den derved dannede utfelling suges likeledes fra. Den vandige oppløsning av de forenede utfellinger surgjøres ved 80°C med iseddik og det dannede produkt suges fra og tørkes under vakuum.

Utbytte: 80% Smeltepunkt: 261-5°C

NMR (DMS0, 100 MHz): S = 7,6-8,4 ppm, kompleks multiplett

IR: 1680 cm-<1>(s), 1720 (m) 1260 (s).

2 ' - ( succinimidoyl oksykarbonyl ) fenylacridin- 9- tlokarboksylat 151

Til en suspensjon av 10 g av tiolesterkarboksylsyren i 190 ml tørr tetrahydrofuran setter man ved 0°C 3,2 g N-hydroksysuccinimid, derefter ved -20"C 6,9 g dicykloheksyl-karbodiimid (DCC) og lar det efteromrøre ved -20"C i 2 timer, og derefter over natt ved romtemperatur. Efter tilsetning av 0,28 ml iseddik omrøres det i 1 time, derefter tilsettes eddikester (25 ml) og utfellingen filtreres fra. Filtratet dampes inn og gir efter omkrystallisering fra klorbenzen et blekgult 2'(succinimidoyloksykarbonyl)fenylacridin-9-tiokarboksylat.

Utbytte: 80% Smeltepunkt: 198-200°C.

IR: 1810 cm-<1>, 1780, 1745, 1225, 1205

NMR (DMSO), 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), 7,7-8,4 pm (m, 12H). 2 ' ( succinimidoyloksykarbonyl) fenyl- 10- metylacrldinlum- 9-tlokarboksylat- tetrafluoroborat ( 6) 3 g N-hydroksysuccinimidester (5) oppvarmes med 7,8 g trimetyloksoniumtetrafluoroborat i 40 ml 1,2-dikloretan I 8 timer ved 80° C og efteromrøres over natten ved romtemperatur. Utfellingen filtreres fra og kokes ut med 1,2-dikloretan. De forenede organiske faser dampes inn og omkrystalliseres fra aceton:diisopropyleter.

Utbytte: 4 0% Smeltepunkt: 245°C.

IR: 3440 cm-<1>(br), 1800, 1780, 1740 (s), 1670, 1065 (s), NMR (DMSO, 100 MHz); S = 3,0 ppm (s, 4H), 4,95 ppm (s, svakt utbredt, 3H), 7,9-8,6 (m, 10H), 9,9 ppm (d, 2H).

EKSEMPEL 2

Fremstillingen av succinimidoyloksykarbonylmetyl-10-metylacridinium-9-tiokarboksylat-tetrafluoroborat, fra syreklorid (3) og tioglykolsyre foregår analogt fremstillingen av (6). Utbyttene av de enkelte syntesetrinn, samt den spektro skopiske karakterisering av produkt (7) til (9) er angitt nedenfor:

Karboksvmetvlacridin- 9- tiokarboksylat ( 7)

Utbytte: 6056 Smeltepunkt: 218° C (under spaltning) IR: 3440 cm-<1>(br), 2400(br), 1950(br), 1710(m), 1660(s), 1070(m)

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 4,25 ppm (s, 2H); 7,6-8,4 (m, 8H).

Succinimldo. vloksykarbon. ylmetylacridin- 9- tlokarboksylat ( 8) Utbytte: 80%

IR: 3440 cm-<1>(br), 2930, 1820, 1785, 1740(s), 1205, 1165 NMR (DMSO, 100 MHz); S = 2,95 ppm (s, 4H), 4,77 ppm (s, 2H), 7,6-8,3 ppm (m, 8H).

Succinimldoyloksykarbonylmetyl- 10- metylacridinium- 9- tiokarboksylat- tetrafluoroborat ( 9)

Utbytte: 40% Smeltepunkt: 250°C

IR: 3440 cm-<1>(br), 1810, 1780, 1735(s), 1538, 1350, 1060 NMR (DMSO, 100 MHz): S =2,9 ppm (s, 4H), 4,8 (s, 2H), 4,9 ppm, (s, 3H), 7,7-9,0 (m, 8H).

EKSEMPEL 3

N- benzensulfonyl- N-( benzyloksykarbonylmetyl ) acrldln- 9-karboksylsyreamid ( 10)

3,3 g N-benzensulfonylglycinbenzylester blandes i 110 ml tetrahydrofuran med 130 mg 4(dimetylamino)-pyridin og 6 ml trietylamid, efter 10 minutter tilsetter man 3 g acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid og oppvarmer den dannede suspensjon i 6 timer under tilbakeløp. Utfellingen suges fra, oppløsningsmidlet fjernes, resten tas opp i metylenklorid og røres kort ut med 2 N NaOH. Den organiske fase dampes inn efter tørking over MgS04og den resulterende rest omkrystalliseres fra toluen:heptan.

Utbytte: 70% Smeltepunkt: 58°C

IR: 3440 cm-<1>(br), 1735, 1680, 1357, 1165

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 5,2 ppm (s, 2H), 5,3 ppm (s, 2H), 7,0-8,4 ppm (m, 18H).

N- benzensulfonvl- N-( karboksvmetvl) acr idin- 9- karboksvlsvreamid Lill 1 g N-benzensulfonyl-N(benzyloksykarbonylmetyl)acridin-9-karboksylsyreamld 1 60 ml iseddlk hydrogeneres under tilsetning av 2 ml konsentrert HC1 og Pd/C (1056) ved romtemperatur og normaltrykk; efter reaksjonens avslutning frasuges katalysatoren, fra filtratet får man med inndampning karbok-sylsyren som gult faststoff.

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 5,0 ppm (s, 2H), 7,1-8,5 ppm (m, 13H).

N- benzensulfonvl- N-( succinimidovioksvkarbonylmetvi) acridin- 9-karboksvlsvreamid (12)

501 mg av forbindelse 11 i 25 ml tørr tetrahydrofuran er behandlet med 277 pl trietylamin, avkjøles til -15°C og behandles med 96 pl klormaursyreetylester. Man omrører i 1 time ved denne temperatur, tilsetter så 115 mg N-hydroksysuccinimid, lar det hele langsomt oppvarmes til romtemperatur og omrører reaksjonsblandingen ved denne temperatur over natten. Bunnfallet suges av, filtratet dampes inn under vakuum og resten tas opp i eddiksyreetylester. Den resulterende oppløsning ekstraheres med vann, NaHC03-oppløsning og vann, tørkes med natriumsulfat og oppløsningsmidlet destil-leres av under vakuum. Efter behandling av den oljeaktige rest med diisopropyleter oppnår man et svakt gult pulver.

Utbytte: 40% ; Smeltepunkt: 196°C (dekomponering).

NMR (DMSO, 100 MHz): S (ppm) = 2,94 (s, 4H); 5,65 (s, 2H); 7,0-8,4 (m, 13H).

N- benzensulfon. vl- N-( succinimidovioksykarbonylmetyl )- 10-metvlacridinium- 9- karboksylsvre- amldfluorsulfonat (13 )

497 mg av forbindelse 12 omrøres i 25 ml 1,2-dikloretan med 503 pl metylfluorsulfonat i 18 timer ved romtemperatur hvorefter det dannede gule bunnfall suges av og tørkes under vakuum.

Utbytte: 45%.

NMR (DMSO, 100 MHz): S (ppm) = 2,90 (s, br, 2H); 4,95 (s, br, 3H); 5,75 (s, br, 2H); 6,73-9,1 (m, 13H).

EKSEMPEL 4

N- fenyl- N( 4- benzyloksykarbonylbenzensulfonyl ) acridin- 9-karboksylsyreamid ( 14) 11 g 4(N-fenylsulfamido)benzosyrebenzylester blandes i 300 ml metylenklorid med 360 mg 4(dimetylamino)pyridin og 16,6 ml trietylamin, efter 10 minutter tilsetter man 8,34 g acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (3) og oppvarmer i 16 timer under tilbakeløp. Den avkjølte oppløsning utrøres kort med 2 N NaøH, den adskilte organiske fase vaskes med vann, tørkes over Na2S04og inndampes. Resten omkrystalliseres fra toluen:heptan.

Utbytte: 70% Smeltepunkt: 161-163°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 5,5 ppm (s, 2H), S = 6,8-8,6 ppm (m, 22H).

jj- f enyl - N-( 4- karboksybenzensulfonyl ) acridin- 9- karboksylsyreamid- hydrobromid ( 15)

8,58 g N-fenyl-N-(4-benzyloksykarbonylbenzensulfonyl )acridin-9-karboksylsyreamid (14) oppvarmes i 30 ml 33% HBr i iseddik i 2 timer ved 60°C, efter avkjøling tilsetter man 60 ml diisopropyleter, suger fra utfellingen og tørker i vakuum.

Utbytte: 9556 Smeltepunkt 255° C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 6,8-9 ppm (m)

N- fenyl- N-( 4 - suks in Imi dovi ok syk arb on yl benzen sul f on vi )-acrldin- 9- karboksvlsvreamid ( 16)

5,63 g N-fenyl-N-(4-karboksybenzensulfonyl)acridin-9-karboksylsyreamid-hydrobromid (15) i 250 ml tetrahydrofuran blandes med 2,8 ml trietylamin og avkjøles til -15°C og blandes så med 0,96 ml klormaursyreetylester. Man efteromrører i 20 minutter, tilsetter 1,15 g N-hydroksysuksinimid, omrører i 3 timer ved -15°C, lar det tine til romtemperatur og efter-omrører natten over. Utfellingen suges fra, filtratet dampes inn, resten opptas med metylenklorid, den resulterende oppløsning vaskes med vann, NaHC03-oppløsning og vann og tørkes over Na2S04. Den organiske fase dampes inn og resten omkrystalliseres fra toluen.

Utbytte: 5056 Smeltepunkt: 226°C (under spaltning). NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S = 6,8-8,7 ppm (m, 17H).

N- fenyl- N-( 4- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl )- 10-metvlacridinium- 9- karboks. vlsyreamid- f luorosulfonat ( 17 )

1,16 g N-fenyl-N-(4-succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl)-acridin-9-karboksylsyreamid (16) omrøres i 60 ml 1,2-dikloretan med 0,3 ml metylf luorosulfonat i 24 timer ved romtemperatur, den dannede utfelling suges fra og tørkes i vakuum.

Utbytte: 6556

IR: 3420 cm"<1>(br), 3100(br), 1805(w), 1770(m), 1745(s), 1700(m), 1385(m), 1280(m), 1255(s), 1230(s), 1205(s)

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S = 4,75 ppm (s, br, 3H), S = 7,0-9,0 ppm (m, 17H)

Massespektrum: m/z = 594 : M<+>(kation).

EKSEMPEL 5

Fremstillingen av N-(4-metoksyfenyl)-N-(4-succinimidoyloksy-karbonylbenzensul f onyl) -10-metylacridinium-9-karboksylsyreamid-fluorosulfonat (21), fra 4-[N-(4'-metoksyfenyl)sulf-amido]-benzosyrebenzylester og acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (3), foregår analogt fremstillingen av (17) (se eksempel 4). Utbyttene av de enkelte syntesetrinn samt den spektroskop!ske karakterisering er angitt i det følgende.

N - ( 4- metoksyf enyl ) - N- ( 4 - benzvloksvkarbonvl- benzensulf onyl )-acridin- 9- karboksylsyreamid ( 18)

Utbytte: 70% Smeltepunkt: 182-183°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 3,5 ppm (s, 3H), S = 5,5 ppm (s, 2H), S = 6,35-6,63 ppm (d, br, 2H), S = 7,05-7,2 ppm (d, br, 2H), S - 7,35-8,5 ppm (m, 17H).

N-( 4- metoksyfenyl)- N-( 4- karboksybenzensulfonyl ) acridln- 9-karboksylsyreamid- hydrobromid ( 19)

Utbytte: 95% Smeltepunkt 273°C (under spaltning) NMR (DMSO, 100 MHz): S = 3,5 ppm (s, 3H), S = 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,05-7,2 ppm (d, br, 2H), S = 7,7-8,5 ppm (m, 12H).

N - ( 4- metoksyf enyl ) - N- ( 4 - succlnimidoyloksykarbonylbenzensul-fonyl) acridln- 9- karboksylsyreamid ( 20)

Utbytte: 50* Smeltepunkt: 232-234°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S = 3,5 ppm (s, 3H), S 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,05-7,25 ppm (d, br, 2H), S 7,8-8,6 ppm (m, 12H).

IR: 3050 cm-<1>, 1805(w), 1780(m), 1740(s), 1700(m), 1505(m), 1370(m), 1250(m), 1200(s), 1185.

N- ( 4- metoksyf enyl ) - N- ( 4 - succlnimldoyloksykarbonylbenzensul-fonyl ) - 10- metylacridinlum- 9- karboksylsyreamid- fluorosulfonat 1211

Stoffet faller ikke ut ved reaksjonen, det utvinnes ved inndampning av oppløsning og utrøring av resten med diisopropyleter.

Utbytte: 80*

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S - 3,5 ppm (s, 3H), S = 4,8 ppm (s, br, 3H), S = 6,45-6,7 ppm (d, br, 2H), S = 7,2-7,4 ppm (d, br, 2H); S = 7,7-9 ppm (m, 12H).

Massespektrum: m/z = 624 M<+>(kation)

IR: 3440 cm-<1>(br), 3100, 2950, 1805(w), 1775(m), 1740(s), 1695(m), 1610(m), 1505(m), 1375(m), 1280(m), 1250(s), 1205(s ).

EKSEMPEL 6

Fremstillingen av N-(4-metoksyfenyl)-N-(3-succinimidoyloksykarbonyl -benzensulfonyl)-10-metylacridinium-9-karboksylsyreamid-fluorsulfonat (25) fra 3-[N-(4'-metoksyfenyl)sulf-amido]-benzosyrebenzylester og acridin-9-karboksylsyreklorid-hydroklorid (3) foregår analogt til fremstillingen av (17)

(se eksempel 4). Utbyttet av de enkelte syntesetrinn, samt den spektroskopiske karakterisering er angitt i det følgende.

N-( 4- metoksyf enyl )- N- ( 3- benzy loksykarbonylbenzensulf onyl )-acridin- 9- karboksylsyreamid ( 22)

Utbytte: 70* Smeltepunkt: 168-170°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 3,5 ppm (s, 3H), S = 5,45 ppm (s, 2H), S = 6,5 ppm (s, br, 2H), S = 7,1 ppm (br, 2H), S = 7,3-8,8 ppm (m, 17H).

N-( 4- metoksyfenyl )- N-( 3- karboksybenzensulfonyl) acridln- 9-karboksylsyreamid- hydrobromid ( 23)

Utbytte: 90* Smeltepunkt: 264°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 3,5 ppm (s, 3H), S = 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,0-7,2 ppm (d, br, 2H), å = 7,6-8,8 ppm (m, 12H).

N- ( 4- metoksvf enyl ) - N- ( 3- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl) acridln- 9- karboksylsyreamld ( 24)

Utbytte: 50* Smeltepunkt: 223-225°C

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S = 3,5 ppm (s, 3H), S = 6,4-6,6 ppm (d, br, 2H), S = 7,0-7,2 ppm (d, br, 2H), S = 7,4-8,9 ppm (m, 12H).

IR: 3500 cm-<1>(br), 3060, 2950, 2840, 1805(w), 1785(m), 1740(s), 1700(m), 1510(m), 1380(m), 1250(m), 1205(m), 1165(m).

N- ( 4- metoksyf enyl ) - N- ( 3- succinimidoyloksykarbonylbenzensulfonyl )- 10- metylacrldlnlum- 9- karboksylsyreamid- fluorosulfonat 1251

Utbytte: 90*

NMR (DMSO, 100 MHz): S = 2,95 ppm (s, 4H), S = 3,55 ppm (s, 3H), S = 4,8 ppm (s, br, 3H), S = 6,45-6,7 (d, br, 2H), 5 = 7,05-7,3 ppm (d, br, 2H), S = 7,5-8,9 ppm (m, 12H).

IR: 3500 cm-<1>(br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 1740(s), 35 1700(m), 1610(m), 1510(m), 1380(m), 1250(s), 1205(s), 1170(s).

Masse: m/z = 624 M<+>(kation)

Claims

1. Kjemiluminescerende acridiniumderivat med formel I,

derR<1>er hydrogen, Ci-C4-alkyl,R<2>ogR3 er hydrogen, R<4>er en substituert sulfonamidgruppe med formel V

eller med formel VI

eller en tioalkyl- eller tioarylrest med formel II

hvorved X er en metylen-, etylen-, propylen- eller en orto-, meta-eller parafenylengruppe og R<5>er en reaktiv gruppe, A~ er et anion som ikke påvirker kjemiluminescensen, og R*> i formel V og VI er f enyl eller naftyl som også kan være substituert med Ci_4alkoksy.

2. Acridiniumderivat ifølge krav 1,karakterisertved formel IV

der A og X har den i krav 1 angitte betydning.