JPH0699476B2 - プロタミン塩類の採取方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、魚の白子からプロタミン塩類を採取する方法
に関する。

従来技術 プロタミンは分子量（約4000〜約10000）の比較的小さ
い塩基性蛋白質であり、ニシン、サケ、マスなどの魚の
精子中に核酸（DNA）と結合した核蛋白として存在す
る。

プロタミン塩類、特にその硫酸塩は、ヘパリンの血液凝
固を阻止する作用や、インシュリンの薬効を持続させる
働き、酵素を安定化する働きあるいは抗生物質を安定化
する働き等が知られており、それらの性質を利用して各
種医薬品等に使用されている。

従来、魚の白子からプロタミン塩類を得る方法として
は、白子を硫酸等の希鉱酸の水溶液で処理し、プロタミ
ンおよびその他の蛋白（以下、他の蛋白を「夾雑蛋白」
という）を抽出し（以下、以上の過程を「抽出工程」と
いい、該工程で得られた溶液を「抽出液」という）、次
いで該抽出液にメタノール等のアルコールを添加して硫
酸プロタミンおよびその他の夾雑蛋白を沈澱させ、次に
その沈澱物を分離、乾燥し、さらに得られた固体を温水
により抽出し、該温水を冷却してプロタミン塩類を析出
させて、その析出物を溶液から分離し（以下、以上の過
程を「分離工程」という）、さらに分離した固体を精製
（以下、この工程を「精製工程」と云う）する方法が知
られている。

従来の分離工程においては、抽出液にアルコールを添加
して沈澱させたプロタミン塩類（以下、代表的な硫酸プ
ロタミンについて説明する）はそれを一旦取り出してア
ルコールを留去し乾燥させねばならないため、操作が繁
雑でありかつ作業の流れが非常に悪い。

また沈澱の際、硫酸プロタミンのみならず、夾雑蛋白も
一緒に沈澱してくるためにさらに硫酸プロタミンと夾雑
蛋白を分離しなければならない。硫酸プロタミンは、前
記の沈澱物を温水により抽出し該溶液を冷却し析出させ
ることにより夾雑蛋白から分離されるが、その時同時に
夾雑蛋白も程度の差はあれ同じ様に温水に抽出されそれ
が冷却されると析出してくるため、得られた硫酸プロタ
ミンは必然的に夾雑蛋白が混入した純度の悪いものとな
る。実用に耐ええる程度の純度を有する硫酸プロタミン
を得るにはさらに精製工程が必要である。硫酸プロタミ
ンは、冷却される温度においてもある程度の溶解度があ
るために希鉱酸で抽出された硫酸プロタミンをすべて回
収することはできず収量が悪くなるという問題点もあ
る。

さらに従来方法において収量を上げるためには、該沈澱
物の温水による抽出を繰り返さなければならないため、
操作が繁雑であるという問題点も存在する。

硫酸プロタミンを分離する別の方法としては、たとえば
特公昭59-31519号公報、特公昭59-31518号公報、特開昭
55-2603号公報、特開昭55-2612号公報あるいは特開昭55
-2634号公報等に一連に記載されている。

これらに開示された分離工程は、抽出液に縮合リン酸塩
を加えて難溶性のプロタミンリン酸塩として沈澱させ、
この沈澱物を高濃度の硫酸アンモニウム溶液で複分解し
て硫酸プロタミンを分離する方法である。

しかしこの方法はプロタミン酸塩として一旦取り出さな
ければならないため、作業の流れが悪く、工程が繁雑に
なるという欠点がある。

縮合リン酸塩を使用して抽出液から蛋白質を沈澱させる
と、プロタミンのみならず他の多量の夾雑蛋白も一緒に
沈澱してくる。そのためにそれを複分解して得た硫酸プ
ロタミンはどうしても夾雑蛋白を含有し純度が非常に悪
いものとなる。そのために実用に供する程度の純度を有
した硫酸プロタミンを得るには、分離工程の後に必ず精
製工程を必要とした。精製工程は分離された硫酸プロタ
ミンの酸性希薄水溶液を吸着剤で処理した後、有機溶剤
で分別沈澱させる繁雑なものである。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは硫酸プロタミンをより高純度高収率で得る
方法を鋭意検討した結果、硫酸プロタミンおよび夾雑蛋
白は、無機塩の濃度によりその溶解性を著しく異にする
ことを発見した。この新たな知見を利用することによ
り、前記のような問題点をすべて解消し、純度の高い硫
酸プロタミンを簡便にしかも効率良く得ることのできる
方法を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 すなわち本発明は、魚の白子を希鉱酸で処理して粗プロ
タミン塩抽出液を得、これに該抽出液１リットルに対し
硫酸アンモニウム1.6〜2.6モルあるいは硫酸ナトリウム
0.8〜1.4モルの濃度となるように無機塩類を加えて生成
する沈澱物を除去し、上澄み液中に該上澄み液１リット
ルに対し、硫酸アンモニウム３モル以上あるいは硫酸ナ
トリウム1.5モル以上の濃度となるように無機塩類を加
えてプロタミン塩を析出採取することを特徴とするプロ
タミン塩類の採取方法に関する。

本発明に使用しうる魚の白子は、プロタミンを含有する
魚の白子、たとえばニシン、サケ、マスあるいはサバ等
の白子であればよく特に限定されるものではない。

白子は希鉱酸により処理する。処理は一般に摩砕した白
子、あるいは摩砕していない白子を希鉱酸、たとえば、
硫酸等の水溶液に浸漬することにより行えばよく、この
方法自体、公知の抽出方法を採用すればよい。

希鉱酸としては硫酸水溶液が望ましい。

希鉱酸の濃度は３〜20％、特に６〜14％が適当であり、
処理温度は30℃以下、特に20〜30℃が好ましい。処理時
間は３時間以内が好ましい。

希鉱酸の白子に対する割合は１〜５倍量である。

得られたプロタミン抽出液は夾雑蛋白を多量に含んでい
るため、これに該抽出液１リットルに対し硫酸アンモニ
ウム1.6〜2.6モルあるいは硫酸ナトリウム0.8〜1.4モル
の濃度となるように無機塩類を加えて、夾雑蛋白を沈澱
させる（この工程を以下、「分離工程」１と云う）。

塩類はそのままで、あるいは濃厚な水溶液として抽出液
中に添加する。添加は攪拌しながら徐々に行うのが望ま
しく、添加に従い夾雑蛋白が沈澱してくる。

塩類の濃度は抽出液の種類および抽出液中のプロタミン
の濃度により適宜調節すれば良い。本発明では塩類を添
加することにより夾雑蛋白は沈澱するが、プロタミン塩
類は沈澱しない範囲の低濃度にすることが重要である。
たとえば希鉱酸で処理して得られた抽出液の硫酸プロタ
ミン濃度が１重量％以下の場合、硫酸アンモニウムは20
〜30℃の液温の抽出液１リットルに対して1.6〜2.6モ
ル、好ましくは1.6〜1.9モル含まれるように添加する。
1.6モルより小さいと夾雑蛋白の除去が不充分となる。
2.6モルより大きいと硫酸プロタミンも沈澱する。硫酸
ナトリウムを使用する時は、同様に抽出液１リットルに
対して0.8〜1.4モル、好ましくは0.8〜1.0モルの濃度に
成るように添加する。0.8モルより小さいと夾雑蛋白の
除去が不充分となる。1.0モルより大きいと硫酸プロタ
ミンも沈澱する。抽出液の硫酸プロタミン濃度が１重量
％以上の場合、硫酸アンモニウムは30〜50℃の液温の抽
出液１に対して1.6〜2.6モル、好ましくは1.9〜2.4モ
ル含まれるように添加する。硫酸ナトリウムを使用する
時は、同様に抽出液１に対して0.8〜1.4モル、好まし
くは1.0〜1.2モルの濃度に成るように添加する。

抽出液の温度は10〜50℃に調整する。10℃より低いとプ
ロタミンが硫酸塩として沈澱する。50℃より高いと夾雑
蛋白を沈澱物として充分に取り除く事ができない。

塩類を添加した抽出液のpHは特に調整する必要はない。
調製しない時、抽出液のpHは通常１である。調製する場
合は塩類を添加する前にpH8以下、好ましくはpH2〜７に
調整する。pHが２より小さいと装置に与える損傷が大き
くなるばかりでなく、作業の安全性も良くない。pHが８
より大きいとプロタミンの安定性上、好ましくない。

抽出液に塩類を添加した後、直ぐに次の操作に移れる。

上記分離工程１により、抽出液中に含まれる夾雑蛋白質
をほとんど総て除去できる。

沈澱した夾雑蛋白は、遠心分離等により抽出液から分離
される。

本発明に従えば沈澱した蛋白を遠心分離等により分離し
た後、該抽出液をすぐに次の工程に使用できるため作業
の流れが流動的で中断されることがなく作業性が非常に
良い。

分離工程１の後、夾雑蛋白を分離した抽出液に無機塩類
を多量に加え、抽出液を無機塩の高濃度溶液（以下、こ
の溶液を「高濃度溶液」という）にすることによりプロ
タミンの塩類を塩析、沈澱させ分離する（以下、この段
階の操作を「分離工程２」という。） 本発明で使用する無機塩類は硫酸アンモニウムあるいは
硫酸ナトリウムである。

無機塩類の濃度は、硫酸プロタミンがほとんど塩析する
濃度であれば良い。分離工程１を経た後の抽出液１リッ
トルに対して、硫酸アンモニウム３モル以上あるいは硫
酸ナトリウム1.5モル以上の濃度で添加する。これより
低い濃度では硫酸プロタミンを充分塩析させることが出
来ない。

高濃度溶液の温度は10〜30℃に調整する。30℃より高い
と沈澱したプロタミン硫酸塩が再び溶解する。10℃より
低くしても、それに相当する効果はなく、エネルギーの
面からも好ましくない。

高濃度溶液のpHは、特に調整する必要はないが、調製す
る場合は硫酸塩を添加する前にpH8以下、好ましくはpH2
〜５に調整することが望ましい。pHが２より小さいと装
置に与える損傷が大きくなるばかりでなく、作業の安定
性も良くない。pHが８より大きいとプロタミンの安定性
上、好ましくない。

高濃度溶液は無機塩類添加後直ぐに次の操作に移っても
よい。

沈澱したプロタミン塩類は、遠心分離等により高濃度溶
液から分離することにより透明油状の物質として得ら
れ、それを乾燥することにより白色の粉末として得られ
る。

以上のようにして得られたプロタミン塩類は、さらに精
製しなくても充分実用に供することのできる程度の純度
を有している。

本発明の分離方法における作用を以下に述べる。第１図
および第２図に硫酸水溶液１リットルに対して硫酸アン
モニウムが低モル含まれている時の硫酸プロタミンの溶
解度（重量％）曲線を示した。図中実線、破線および一
点破線はそれぞれ溶液の温度が30℃、20℃および５℃の
時の硫酸プロタミンの溶解度を示す。第１図は５％硫酸
水溶液を、第２図は10％硫酸水溶液を使用した時の溶解
度曲線である。

抽出溶液は通常硫酸プロタミンを0.5〜７重量％含むも
のである。本発明における分離工程１は、第１図および
第２図からわかるように硫酸アンモニウムを1.6〜1.9モ
ルを含む５％あるいは10％硫酸水溶液中では硫酸プロタ
ミンは完全に溶解しているが、そのような低濃度範囲で
も夾雑蛋白は充分沈澱することを利用したものである。
一方本発明による分離工程２は3.0モル以上の高濃度で
は硫酸プロタミンが完全に塩析すること（図示せず）を
利用したものである。

本発明で得られた硫酸プロタミンのさらに高純度の硫酸
プロタミンが必要であれば、分離工程２で得られた硫酸
プロタミンを少量の硫酸塩、たとえば硫酸アンモニウム
あるいは硫酸ナトリウムとともに温水に溶解させ、その
後、該溶液を冷却しプロタミン硫酸塩を析出させ、該溶
解から透明油状のプロタミン硫酸塩を分離し、それを乾
燥すればよい（以後、以上の操作を「精製工程」とい
う）。

精製工程における硫酸プロタミンの濃度は濃厚な程良
い。

精製工程に使用する温水は、溶解させる硫酸プロタミン
が溶解する温度であればよい。

精製工程に使用する硫酸塩は温水１リットルに対して0.
05〜0.2モルの量を添加する。0.05モルより少ないかあ
るいは0.2モルより多いと温水を冷却後硫酸プロタミン
を効率良く析出させることができない。

温水は10℃以下、好ましくは５℃以下に冷却する。10℃
より高いと硫酸プロタミンを効率良く析出させることが
できない。

温水のpHは特に調整する必要はない。調整する場合は、
硫酸プロタミンを添加後硫酸塩を添加する前にpH2〜７
の範囲にすることが望ましい。

精製を行うことにより、分離工程２の硫酸プロタミンの
沈澱物に付着する塩、酸および夾雑蛋白を除去できる。

本発明の精製工程は、硫酸プロタミンの溶解性が溶液１
に対して硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウムの
0.05〜0.2モル溶けた極めて低い濃度域の溶液中で最小
になるという新たな知見に基づくものである。

表１に水温５℃、pH2.5の水溶液中における硫酸プロタ
ミンの溶解度（重量％）と塩濃度の関係を表した。表
中、濃度は溶液１に対して溶かした塩のモル数を表
す。

表１より硫酸プロタミンの溶解度は塩の濃度が0.05〜0.
2モルの範囲で最小になるのがわかる。

本発明に従い抽出液に抽出液１リットルに対し硫酸アン
モニウム1.6〜2.6モルあるいは硫酸ナトリウム0.8〜1.4
モルの濃度となるように塩類を加えることにより抽出溶
液中から夾雑蛋白をプロタミンの損失なく除去できるの
である。

以下に本発明を実施例を用いて説明する。

実施例１ 抽出 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子100gを５％（1N）硫酸500mlに添加
し、室温（24℃）で１時間攪拌した。攪拌後、残渣を遠
心分離（8000rpm、20分）により取り除き硫酸プロタミ
ン抽出液550mlを得た。

分離 該抽出液に攪拌下、室温24℃で濃アンモニア水30mlを添
加し、pHを３に調整し、さらに硫酸アンモニウム124gを
少量ずつ添加し、夾雑蛋白を沈澱させた。該夾雑蛋白沈
澱物を遠心分離により取り除き上澄み液630mlを得た。

該上澄み液に攪拌下、室温24℃で硫酸アンモニウム130g
を徐々に添加し硫酸プロタミンを塩析させた。塩析した
硫酸プロタミンを遠心分離により分離し、白色飴状の硫
酸プロタミン10.4（wet）ｇを得た。

精製 さらに以上のようにして得られた白色飴状の硫酸プロタ
ミン10.4gを100mlの温水（40〜50℃）に溶解し、該溶液
１リットル当り0.09モルの硫酸アンモニウムの濃度とし
た。その後溶液を５℃に冷却しその温度で２日間放置し
硫酸プロタミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除
き、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それを凍結乾燥
し白色の硫酸プロタミン4.76gを得た（収率4.76％）。

実施例２ 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子100gを５％（1N）硫酸500mlに添加
し、室温26℃１時間攪拌した。攪拌後、残渣を遠心分離
により取り除き硫酸プロタミン抽出液550mlを得た。

該抽出液に攪拌下、室温27℃で硫酸ナトリウム82.5gを
少量ずつ添加し夾雑蛋白を沈澱させた。該夾雑蛋白沈澱
物を遠心分離により取り除き上澄み液580mlを得た。該
上澄み液に攪拌下、室温24℃で硫酸ナトリウム55.0gを
徐々に添加し硫酸プロタミンを塩析させた。塩析した硫
酸プロタミンを遠心分離により分離し、白色飴状の硫酸
プロタミン9.15gを得た。

さらに以上のようにして得られた白色飴状の硫酸プロタ
ミン9.15gを50mlの温水（40〜50℃）に溶解し、該溶液
１リットル当たり0.15モルの量の硫酸ナトリウムの濃度
にした。その後溶液を５℃に冷却しその温度で２日間放
置し硫酸プロタミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除
き、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それをアセトン
により脱水し、固化してさらに減圧乾燥し白色の硫酸プ
ロタミン4.70gを得た（収率4.70％）。

実施例３ 実施例１の精製を行わない以外は実施例１と同様に行っ
た。

得られた白色飴状の硫酸プロタミンを凍結乾燥し、白色
の硫酸プロタミン6.30g（収率6.30％）を得た。

比較例（従来法） 実施例１と同様にして硫酸プロタミン抽出液550mlを得
た。

該抽出液にメタノール2750mlを添加し、５℃で一夜放置
し硫酸プロタミンと夾雑蛋白を沈澱させた。沈澱物を遠
心分離により分離し、減圧下メタノールを留去し乾燥さ
せた。

乾燥した沈澱物を100mlの温水（30〜40℃）で２回、50m
lの温水で１回抽出した。その抽出水溶液を室温で遠心
分離（10000rpm、２時間）抽出されなかった固体から分
離し、濁液180mlを得た。

濁液を５℃に冷却しその温度で２日間放置し硫酸プロタ
ミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除
き、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それを凍結乾燥
し白色の硫酸プロタミン4.30gを得た（収率4.30％）。

実施例４ 実施例１〜３および比較例で得た硫酸プロタミンを試料
とし、その純度を測定した。

純度はクロマトグラフィー、吸光分析、硫酸プロタミン
を水に溶かした時の溶液の溶状および抗菌活性により検
討した。

クロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィーを使
用した。試料の純度は和光純薬工業製硫酸プロタミン
（鮭製）を標品とし、その純度を1.00として比較しHPLC
純度として示した。またHPLC純度と試料の収率を掛けた
ものを標品換算収率として示した。ここで標品換算収率
とは白子100gから得られる硫酸プロタミンの量を標品程
度の純度を有した硫酸プロタミン量に換算した場合の収
率を言い、硫酸プロタミンの分離効率比較の尺度と考え
て良い。それらの結果を表２中に示した。

HPLC純度を比較すると、例えば、実施例１で本発明に従
い得られた硫酸プロタミンの純度は、市販品のものより
約1.1倍もよく、従来法により得られたものよりも約1.2
倍も良いことがわかる。また、標品換算純度を比較する
と従来法に比べ約1.4倍も高収率で分離できることがわ
かる。

抗菌活性は和光純薬工業製硫酸プロタミン（鮭製）を標
品に使用し、ペーパーディスク法において枯草菌（B.su
btilis IAM 1069株）に対する抗菌活性を1.00として比
較し抗菌力比活性として示した。また抗菌力活性と試料
の収率を掛けたものを標品換算活性収率として示した。
標品換算活性収率とは白子100gから得られる硫酸プロタ
ミンの量に対して同等の抗菌力を示すために必要とする
標品の量に換算した場合の収率を言い硫酸プロタミンの
分離効率比較の尺度と考えて良い。それらの結果を表２
中に示した。抗菌力比活性を比較すると、例えば実施例
１で本発明に従い得られた硫酸プロタミンは、市販品よ
りも約1.1倍もよく、従来法により得られたものよりも
約1.2倍も良いことがわかる。また、標品換算活性収率
を比較すると従来法に比べ約1.3倍高効率で分離できる
ことがわかる。

吸光分析は、核酸に起因する260nmおよび夾雑蛋白質に
起因する280nmでの吸光度を測定した。測定は試料の濃
度0.1重量％の水溶液を温度20℃で行なった。その結果
を表３中に示した。純粋な硫酸プロタミンは220nm以上
の光に対しては吸収がない。表２からわかるように本発
明に従い得られた硫酸プロタミンは従来法により得られ
た硫酸プロタミンに比べ、夾雑物の量が非常に少ないこ
とがわかる。

溶液状態の目視観察は、各試料の２％水溶液（20℃）で
行なった。本発明に従い得られた硫酸プロタミンは完全
に溶解するのに対して、従来法で得られた硫酸プロタミ
ン完全に溶解せず不溶物の存在が認められた。

発明の効果 本発明に従うと魚の白子から純度のよい硫酸プロタミン
を効率よく、しかも簡便な工程で、連続的に分離でき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は硫酸プロタミンの溶解度を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特公 昭49−24209（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭59−31518（ＪＰ，Ｂ２) 日本化学会編「新実験化学講座20生物化 学工」丸善（昭53−６−30）Ｐ．14〜Ｐ. 19

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】魚の白子を希鉱酸で処理して粗プロタミン
   塩抽出液を得、これに該抽出液１リットルに対し硫酸ア
   ンモニウム1.6〜2.6モルあるいは硫酸ナトリウム0.8〜
   1.4モルの濃度となるように無機塩類を加えて生成する
   沈澱物を除去し、上澄み液中に該上澄み液１リットルに
   対し、硫酸アンモニウム３モル以上あるいは硫酸ナトリ
   ウム1.5モル以上の濃度となるように無機塩類を加えて
   プロタミン塩を析出採取することを特徴とするプロタミ
   ン塩類の採取方法。