JPS62187491A - プロタミン塩類の採取方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、魚の白子からプロタミン塩類を採取する方法
に関する。

従来技術− プロタミンは分子量（約４０００〜約１００００）の比
較的小さい塩基性蛋白質であり、ニシン、サケ、マスな
どの魚の精子中に核酸（ＤＮＡ）と結合した核蛋白とし
て存在する。

プロタミン塩類、特にその硫酸塩は、ヘパリンの血液凝
固を阻止する作用や、インシュリンの薬効を持続させる
働き、酵素を安定化する働きあるいは抗生物質を安定化
する働き等が知Ｃ１れており、それらの性質を利用して
各種医薬品等に使用されている。

従来、魚の白子からプロタミン塩類を得る方法としては
、白子を硫酸等の希鉱酸の水溶液で処理し、プロタミン
およびその他の蛋白（以下、他の蛋白を「夾雑蛋白」と
いう）を抽出しく以下、以上の過程を「抽出工程」とい
い、該工程で得られた溶液を「抽出液」という）、次い
で該抽出液にメタノール等のアルコールを添加して硫酸
プロタミンおよびその他の夾雑蛋白を沈澱させ、次にそ
の沈澱物を分離、乾燥し、さらに得られた固体を温水に
より抽出し、該温水を冷却してプロタミン塩類を析出さ
せて、その析出物を溶液から分離しく以下、以上の過程
を「分離工程」という）、さらに分離した固体を精製（
以下、この］：程を「精製工程」と云う）する方法が知
られている。

従来の分離工程においては、抽出液にアル：ｊ−ルを添
加して沈澱させたプロタミン塩類（以下、代表的な硫酸
プロタミンについて説明する）はそれを一旦取り出して
アルコールを留去し乾燥させねばならないため、操作が
繁雑でありかつ作業の流れが非常に悪い。

また沈澱の際、硫酸プロタミンのみならず、夾雑蛋白も
一緒に沈澱してくるためにさらに硫酸プロタミンと夾雑
蛋白を分離しなければならない。

硫酸プロタミンは、前記の沈澱物を温水により抽出し該
溶液を冷却し析出させることにより夾雑蛋白から分離さ
れるが、その時同時に夾雑蛋白も程度の差はあれ同じ様
に温水に抽出されそれが冷却されると析出してくるため
、得られた硫酸プロタミンは必然的に夾雑蛋白が混入し
た純度の悪いものとなる。実用に耐ええる程度の純度を
有する硫酸プロタミンを得るにはさらに精製工程が必要
である。硫酸プロタミンは、冷却される温度においても
ある程度の溶解度があるために希鉱酸で抽出された硫酸
プロタミンをすべて回収することはできず収量が悪くな
るという問題点らある。

さらに従来方法において収量を上げるためには、該沈澱
物の温水による抽出を繰り返さなければならないため、
操作が繁雑であるという問題点も存在する。

硫酸プロタミンを分離する別の方法としては、たとえば
特公昭５９−３１５１９号公報、特公昭５９−３１５１
８号公報、特開昭５５−２６０３号公報、特開昭５５−
２６１２号公報あるいは特開昭５５−２６３４号公報等
に一連に記載されている。

これらに開示された分離工程は、抽出液に縮合リン酸塩
を加えて難溶性のプロタミンリン酸塩として沈澱させ、
この沈澱物を高濃度の硫酸アンモニウム溶液で複分解し
て硫酸プロタミンを分離ずろ方法である。

しかしこの方法はプロタミンリン酸塩として一旦取り出
さなければならいため、作業の流れが悪く、工程が繁雑
になるという欠点がある。

縮合リン酸塩を使用して抽出液から蛋白質を沈澱させる
と、プロタミンのみならず他の多量の夾雑蛋白も一緒に
沈澱してくる。そのためにそれを複分解して得た硫酸プ
ロタミンはどうしても夾雑蛋白を含有し純度が非常に悪
いものとなる。そのために実用に供する程度の純度を有
した硫酸プロタミンを得るには、分離工程の後に必ず精
製工程を必要とした。精製工程は分離された硫酸プロタ
ミンの酸性希薄水溶液を吸着剤で処理した後、有機溶剤
で分別沈澱させる繁雑なものである。

発明が解決しようとする間ＭＡ 本発明者らは硫酸プロタミンをより高純度高収率で得る
方法を鋭意検討した結果、硫酸プロタミンおよび夾雑蛋
白は、無機塩の濃度によりその溶解性を著しく異にする
ことを発見した。この新たな知見を利用することにより
　前記のような問題点をすべて解消し、純度の高い硫酸
プロタミンを簡便にしかも効率良く得ることのできる方
法を完成するに至った。

問題点を解決するための手段 すなわち本発明は、魚の白子を希鉱酸で処理して徂プロ
タミン塩抽出液を得、これに少量の無機塩類を加えて生
成する沈澱物を除去し、上澄み液中に更に多量の無機塩
類を加えてプロタミン塩を析出採取することを特徴とす
るプロタミン塩類の採取方法に関する。

本発明に使用しうる魚の白子は、プロタミンを含有する
魚の白子、たとえばニシン、サケ、マスあるいはサバ等
の白子であればよく特に限定されるものではない。

白子は希鉱酸により処理する。処理は一般に摩砕した白
子、あるいは摩砕していない白子を希鉱酸、たとえば、
硫酸等の水溶液に浸漬することにより行えばよく、この
方法自体、公知の抽出方法を採用すればよい。

希鉱酸としては硫酸水溶液が望ましい。

希鉱酸の濃度は３〜２０、特に６〜１４が適当であり、
処理温度は３０℃以下、特に２０〜３０℃が好ましい。

処理時間は３時間以内が好ましい。

希鉱酸の白子に対する割合は１〜５倍量である。

得られたプロタミン抽出液は夾雑蛋白を多量に含んでい
るため、これに少量の無機塩類を加えて、夾雑蛋白を沈
澱させる（この工程を以下、［分離工程１」と云う）。

使用できる塩類は硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、
塩化ナトリウム、リン酸二カリウム、クエン酸ナトリウ
ム等があるが、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等の
硫酸塩が特に望ましい。

塩類はそのままで、あるいは濃厚な水溶液として抽出液
中に添加する。添加はを攪拌しながら徐々に行うのが望
ましく、添加に従い夾雑蛋白が沈澱してくる。

塩類の濃度は抽出液の種類および抽出液中のプロタミン
の濃度により適宜調節すれば良い。本発明では塩類を添
加することにより夾雑蛋白は沈澱するが、プロタミン塩
類は沈澱しない範囲の低濃度にすることが重要である。

たとえば希硫酸で処理して得られた抽出液の硫酸プロタ
ミン濃度が１重Ｍ％以下の場合、硫酸アンモニウムは２
０〜３０℃の液温の抽出液１リツトルに対して１．６〜
２．６モル、好ましくは１．６〜１．９モル含まれるよ
うに添加する。１．６モルより小さいと夾雑蛋白の除去
が不充分となる。２．６モルより太きいと硫酸プ１！タ
ミンら沈澱する。（イＣ酸ナトリウムを使用する時は、
同様に抽出液１リツトルに対して０．８〜１．４モル、
好ましくは０．８〜１．０モルの濃度に成るように添加
する。０．８モルより小さいと夾雑蛋白の除ノーが不充
分となる。１．０モルより大きいと硫酸プロタミンも沈
澱する。

抽出液の硫酸プロタミン濃度が１重量％以上の場合、硫
酸アンモニウムは３０〜５０℃の液温の抽出液ｌＱに対
して１．６〜２．６モル、好ましくは１．９〜２．４モ
ル含まれるように添加する。硫酸ナトリウムを使用する
時は、同様に抽出液ｌＱに対して０．８〜１．４モル、
好ましくは１．０〜１゜２モルの濃度に成るように添加
する。

抽出液の温度は１０〜５０℃に調整する。１０℃より低
いとプロタミンが硫酸塩として沈澱する。

５０℃より高いと夾雑蛋白を沈澱物として充分に取り除
く事ができない。

塩類を添加した抽出液のｐＨは特に調整する必要はない
。調製しない時、抽出液のｐｌ（は通常ｌである。調製
する場合は塩類を添加する前にｐＨ。

８以下、好ましくは１）８２〜７に調整する。ｐＨが２
より小さいと装置に与える損傷が大きくなるばかりでな
く、作業の安全性も良くない。ｐＨが８より大きいとプ
ロタミンの安定性上、好ましくない。

抽出液に塩類を添加した後、直ぐに次の操作に移れる。

上記分離工程ｌにより、抽出液中に含まれる夾雑蛋白質
をほとんど総て除去できる。

沈澱した夾雑蛋白は、遠心分離等により抽出液から分離
される。

本発明に従えば沈澱した蛋白を遠心分離等により分離し
た後、該抽出液をすぐに次の工程に使用できるため作業
の流れが流動的で中断されることがなく作業性が非常に
良い。

分離工程ｌの後、夾雑蛋白を分離した抽出液に無機塩類
を多量に加え、抽出液を無機塩の高濃度溶液（以下、こ
の溶液を「高濃度溶液」という）にすることによりプロ
タミンの塩類を塩析、沈澱させ分離する（以下、この段
階の操作を「分離工程２」という）。

本発明の分離工程２に使用できろ無機塩類は分離工程ｌ
で用いた塩類と同じものを用いもよいが、一般には硫酸
塩が好ましい。硫酸塩は硫酸アンモニウム塩あるいは硫
酸ナトリウム等である。

無機塩類の濃度は、硫酸プロタミンがほとんど塩析する
濃度であれば良い。たとえば分離工程１および分離工程
２の両工程の無機塩として硫酸アンモニウムを使用する
場合、分離工程１を経た後の抽出液ｌリットルに対して
硫酸アンモニウムが３モル以上、好ましくは３．０〜３
．３モル含まれるように添加する。３モルより少ないと
硫酸プロタミンを充分塩析し沈澱させることが出来ない
。

同様に硫酸ナトリウムを使用する場合、溶液１リツトル
に対して硫酸ナトリウムが１．５モル以上、好ましくは
！、５〜１．８モル含まれるように添加する。１．５モ
ルより少ないと硫酸プロタミンを充分塩析させることが
出来ない。

高濃度溶液の温度は１０〜３０℃に調整する。

３０℃より高いと沈澱したプ〔Ｉタミン硫酸塩が再び溶
解する。１０℃より低くしても、それに相当する効果は
なく、エネルギーの而からも好ましくない。

高濃度溶液のｐＨは、特に調整する必要はないが、調製
する場合は硫酸塩を添加する前にＩ）Ｉ−１８以下、好
ましくはｐＨ２〜５に調整することが望ましい。ｐ　Ｉ
−［が２より小さいと装置に与える損傷が大きくなるば
かりでなく、作業の安全性も良くない。ｐＨが８より大
きいとプロタミンの安定性上、好ましくない。

高濃度溶液は無機塩類添加後直ぐに次の操作に移っても
よい。

沈澱したプロタミン塩類は、遠心分離等により高濃度溶
液から分離することにより透明油状の物質として得られ
、それを乾燥することにより白色の粉末として得られる
。

以上のようにして得られたプロタミン塩類は、さらに精
製しなくても充分実用に供することのできる程度の純度
を有している。

本発明の分離方法における作用を以下に述べる。

第１図および第２図に硫酸水溶液１リツトルに対して硫
酸アンモニウムが低モル含まれている時の硫酸プロタミ
ンの溶解度（重量％）曲線を示した。

図中実線、破線および一点破線はそれぞれ溶液の温度が
３０℃、２０℃および５℃の時の硫酸プロタミンの溶解
度を示す。第１図は５％硫酸水溶液を、第２図は１０％
硫酸水溶液を使用した時の溶解度曲線である。

抽出溶液は通常硫酸プロタミンを０．５〜７重量％含む
ものである。本発明における分離工程１は、第１図およ
び第２図かられかるように硫酸アンモニウムを１．６〜
１．９モルを含む５％あるいは１０％硫酸水溶液中では
硫酸プロタミンは完全に溶解しているが、そのような低
濃度範囲てし夾雑蛋白は充分沈澱することを利用したも
のである。−力木発明による分離工程２は３．０モル以
上の高濃度では硫酸プロタミンが完全に塩析すること（
図示せず）を利用したものである。

本発明で得られた硫酸プロタミンのさらに高純度の硫酸
プロタミンが必要であれば、分離工程２で得られた硫酸
プロタミンを少量の硫酸塩、たとえば硫酸アンモニウム
あるいは硫酸ナトリウムとと乙に温水に溶解させ、その
後、該溶液を冷却しプロタミン硫酸塩を析出させ、該溶
解から透明油状のプロタミン硫酸塩を分離し、それを乾
燥すればよい（以後、以上の操作を「精製工程」という
）。

精製工程における硫酸プロタミンの濃度は濃厚な程良い
。

精製工程に使用する温水は、溶解させる硫酸プロタミン
が溶゛解する温度であればよい。

精製工程に使用する硫酸塩は温水ｌリットルに対して０
．０５〜０．２モルの量を添加する。０゜０５モルより
少ないかあるいは０．２モルより多いと温水を冷却後硫
酸プロタミンを効率良く析出させることができない。

温水は１０℃以下、好ましくは５℃以下に冷却する。１
０℃より高いと硫酸プロタミンを効率良く析出させるこ
とができない。

温水のｐＨは特に調整する必要はない。調整する場合は
、硫酸プロタミンを添加復硫酸塩を添加する前にＩ）８
２〜７の範囲にすることが望ましい。

精製を行うことにより、分離工程２の硫酸プロタミンの
沈澱物に付着する塩、酸および夾雑蛋白を除去できる。

本発明の精製工程は、硫酸プロタミンの溶解性が溶液１
（２に対して硫酸アンモニウムあるいは硫酸ナトリウム
の０．０５〜０．２モル溶けた極めて低い濃度域の溶液
中で最小になるという新たな知見に基づくものである。

表１に水温５℃、ｐＨ２，５の水溶液中における硫酸プ
ロタミンの溶解度（重量％）と塩濃度の関係を表した。

表中、濃度は溶液１１に対して溶かした塩のモル数を表
す。

表！ 表１より硫酸プロタミンの溶解度は塩の濃度が０．０５
〜０．２モルの範囲で最小になるのがわかる。

本発明に従い抽出液に少量の塩類を加えることにより抽
出溶液中から夾雑蛋白をプロタミンの損失なく除去でき
るのである。

以下に本発明を実施例を用いて説明する。

実施例１ 迫−量 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子１００ｇを５％（ＩＮ）硫酸５００ｍ
１に添加し、室温（２４°Ｃ）で１時間攪拌した。

攪拌後、残渣を遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分）に
より取り除き硫酸プロタミン抽出液５５０ｍ１を得た。

外−艮 該抽出液に攪拌下、室温２４℃で濃アンモニア水３０ｍ
１を添加し、ｐ　［−１を３に調整し、さらに龍酸アン
モニウム１２４ｇを少量ずつ添加し、夾雑蛋白を沈澱さ
せた。該夾雑蛋白沈澱物を遠心分離により取り除き上澄
み液６３０ｍ１を得た。

該上澄み液に攪拌下、室温２４℃で硫酸アンモニウム１
３０ｇを徐々に添加し硫酸プロタミンを塩析させた。塩
析した硫酸プロタミンを遠心分離により分離し、白色飴
状の硫酸プロタミン１０゜４　（ｗｅｔ）ｇを得た。

鼠−盟 さらに以上のようにして得られた白色飴状の硫酸プロタ
ミン１０．４ｇを１０Ｏｎ＋ｌの温水（４０〜５０℃）
に溶解し、該溶液１リツトル当り０．０９モルの硫酸ア
ンモニウムの濃度とした。その後溶液を５℃に冷却しそ
の温度で２日間放置し硫酸プロタミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除き
、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それを凍結乾燥し
白　色の硫酸プロタミン４．７６ｇを得た（収率４．７
６％）。

実施例２ 冷凍した鮭の白子を解凍、水洗い、水切りを行い摩砕し
た。

摩砕した鮭の白子１００ｇを５％（ＩＮ）硫酸５００ｍ
１に添加し、室温２６℃１時間攪拌した。攪拌後、残渣
を遠心分離により取り除き硫酸プロタミン抽出液５５０
ｍ１を得た。

該抽出液に攪拌下、室温２７℃で硫酸ナトリウム８２．
５ｇを少量ずつ添加し夾雑蛋白を沈澱させた。該夾雑蛋
白沈澱物を遠心分離により取り除き上澄み液５８０ｍ１
を得た。　該上澄み液に攪拌下、室温２４℃で硫酸ナト
リウム５５．０ｇを徐々に添加し硫酸プロタミンを塩析
させた。塩析した硫酸プロタミンを遠心分離により分離
し、白色飴状の硫酸プロタミン９」５ｇを得た。

さらに以上のようにして得られた白色飴状の硫酸プロタ
ミン９．１５ｇを５０ｍ１の温水（４０〜５０℃）に溶
解し、該溶液ｉリットル当たり０．１５モルの量の硫酸
ナトリウムの濃度にした。その後溶液を５℃に冷却しそ
の温度で２日間放置し硫酸プロタミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除き
、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それをアセトンに
より脱水し、固化してさらに減圧乾燥し白色の硫酸プロ
タミン４．７０ｇを得た（収率４，７０％）。

実施例３ 実施例１の肋を行わない以外は実施例１と同様に行った
。

得らたれ白色飴状の硫酸プロタミンを凍結乾燥し、白色
の硫酸プロタミン６．３０９（収率６．３０％）を得た
。

比較例（従来法） 実施例１と同様にして硫酸プロタミン抽出液５５０ｍ１
を得た。

該抽出液にメタノール２７５０ｍ１を添加し、５°Ｃで
一夜放置し硫酸プロタミンと夾雑蛋白を沈澱させた。沈
澱物を遠心分離により分離し、減圧下メタノールを留去
し乾燥させた。

乾燥した沈澱物を１００ｍ１の温水（３０〜４００Ｃ）
で２回、５０ｍ１の温水で１回抽出した。その抽出水溶
液を室温で遠心分離（１００００ｒｐｍ、２時間）抽出
されなかった固体から分離し、濁液１８０ｍ１を得た。

濁液を５℃に冷却しその温度で２日間放置し硫酸プロタ
ミンを析出させた。

析出した硫酸プロタミンの上澄み液を傾瀉して取り除き
、透明油状の硫酸プロタミンを得た。それを凍結乾燥し
白色の硫酸プロタミン４．３０ｇを得た（収率４．３０
％）。

実施例４ 実施例１〜３および比較例で得た硫酸プロタミンを試料
とし、その純度を測定した。

純度はクロマトグラフィー、吸光分析、硫酸プロタミン
を水に溶かしｆこ時の溶液の溶状および抗菌活性により
検討した。

クロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィーを使
用した。試料の純度は和光補薬工業製硫酸プロタミン（
鮭製）を標品とし、その純度を１．００として比較しＨ
Ｐ　Ｌ　Ｃ純度として示した。またＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ純度
と試料の収率を掛けたものを標品換算収率として示した
。ここで標品換算収率とは白子１００ｇから得られる硫
酸プロタミンの量を標品程度の純度を有した硫酸プロタ
ミン量に換算した場合の収率を言い、硫酸プロタミンの
分離効率比較の尺度と考えて良い。それらの結果を表２
中に示した。

１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ純度を比較すると、例えば、実施例
１で本発明に従い得られた硫酸プロタミンの純度は、市
販品のものより約１．１倍もよく、従来法により得られ
たものよりも約１．２倍ら良いことがわかる。また、標
品換算純度を比較すると従来法に比べ約１．４倍も高効
率で分離できることがわかる。

抗菌活性は和光補薬工業製硫酸プロタミン（鮭製）を標
品に使用し、ペーパーディスク法において枯草菌（Ｂ、
　５ｕｂｔｉｌｉｓ　　Ｉ　ＡＭ　　Ｉ　０６９株）に
対する抗菌活性を１．００として比較し抗菌力比活性と
して示した。また抗菌力活性と試料の収率を掛けたムの
を標品換算活性収率として示した。

標品換算活性収率とは白子１００ｇから得られる硫酸プ
ロタミンの量に対して同等の抗菌力を示すために必要と
する標品の量に換算した場合の収率を言い硫酸プロタミ
ンの分離効率比較の尺度と考えて良い。それらの結果を
表２中に示した。抗菌力比活性を比較すると、例えば実
施例１で本発明に従い得られた硫酸プロタミンは、市販
品よりも約１．１倍らよく、従来法により得られたもの
よりら約１．２倍ら良いことがわかる。また、標品換算
活性収率を比較すると従来法に比べ約１．３倍高効率で
分離できることがわかる。

表２ 吸光分析は、核酸に起因する２６０ｎｍおよび夾雑蛋白
質に起因する２８０ｎｍでの吸光度を測定した。測定は
試料の濃度ｏ、ｔｉ量％の水溶液を温度２０℃で行なっ
た。その結果を表３中に示した。

純粋な硫酸プロタミンは２２０ｎｍ以上の光に対しては
吸収がない。表２かられかるように本発明に従い得られ
た硫酸プロタミンは従来法により得られた硫酸プロタミ
ンに比べ、夾雑物の１１が非常に少ないことがわかる。

表３ 溶液状態の目視観察は、各試料の２％水溶液（２０’Ｃ
）で行なった。本発明に従い得られた硫酸プロタミンは
完全に溶解するのに対して、従来法で得られた硫酸プロ
タミン完全に溶解せず不溶物の存在が認められた。

発明の効果 本発明に従うと魚の白子から純度のよい硫酸プロタミン
を効率よく、しかも簡便な工程で、連続的に分離できる
。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は硫酸プロタミンの溶解度を示す図
である。 特許出願人　株式会社上野製薬応用研究所代　理　人　
弁理士　前出　葆　ほか２名第１図 硫酸７　’／　′ｆ：ニウη濃皮 （モル／ソリトル５％Ｈ２Ｓ０４） 第２図 ０　　０．５　　１．０　　１．５　　２．０胱蔽アン
モニウム濃度

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、魚の白子を希鉱酸で処理して粗プロタミン塩抽出液
   を得、これに少量の無機塩類を加えて生成する沈澱物を
   除去し、上澄み液中に更に多量の無機塩類を加えてプロ
   タミン塩を析出採取することを特徴とするプロタミン塩
   類の採取方法。