JPH07100037B2 - ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ - Google Patents
ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡInfo
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- JPH07100037B2 JPH07100037B2 JP5217335A JP21733593A JPH07100037B2 JP H07100037 B2 JPH07100037 B2 JP H07100037B2 JP 5217335 A JP5217335 A JP 5217335A JP 21733593 A JP21733593 A JP 21733593A JP H07100037 B2 JPH07100037 B2 JP H07100037B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトγ−インターフェ
ロンの生物活性および免疫活性を示すポリペプチドをコ
ードする化学合成遺伝子およびこれらポリペプチドの発
現に適したベクター構造および宿主生物に関する。本発
明により得られるポリペプチドはγ−インターフェロン
とは区別される生物活性に本質的でない部分配列を欠失
させた新規ポリペプチドである。γ−インターフェロン
に比べこれらのポリペプチドは安定性または溶解性が高
くまた抗ビールス活性の特異性の点では様々であるが、
それらは抗ビールス、抗腫瘍、抗新生物または免疫調製
剤として利用可能であるという点ではすべてγ−インタ
ーフェロンに類似している。
ロンの生物活性および免疫活性を示すポリペプチドをコ
ードする化学合成遺伝子およびこれらポリペプチドの発
現に適したベクター構造および宿主生物に関する。本発
明により得られるポリペプチドはγ−インターフェロン
とは区別される生物活性に本質的でない部分配列を欠失
させた新規ポリペプチドである。γ−インターフェロン
に比べこれらのポリペプチドは安定性または溶解性が高
くまた抗ビールス活性の特異性の点では様々であるが、
それらは抗ビールス、抗腫瘍、抗新生物または免疫調製
剤として利用可能であるという点ではすべてγ−インタ
ーフェロンに類似している。
【０００２】
【従来の技術】γ−インターフェロン（以前は免疫イン
ターフェロンとかタイプIIインターフェロンと呼ばれて
いた。本明細書ではＩＦＮ−γと略記される）は１９６
５年にエフ・ホイーロック（F. Wheelook）〔ホイーロ
ック（Wheelook）；サイエンス（Science）149（196
5），310参照〕により発見され、彼によってＩＦＮ−γ
がある種の細胞をビールス感染から保護しうることが示
された。ヒトＩＦＮ−γ〔基礎的な情報については、ダ
ブリュー・イー・スチュアート（W. E. Stewart）、I
I、ザ・インターフェロン・システム（The Interferon
System）、スプリンガー（Springer）発行（第２版、19
81年）参照〕は天然的にグリコシル化されている１４６
個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである〔グレ
イ（Gray）ほか、ネイチャー（Nature）295（1982）、5
03参照〕。この糖タンパクは約６３,０００〜７３,００
０の分子量を有し〔ペストカ（Pestka）ほか、ジェイ・
バイオル・ケム（J. Biol. Chem.）258（1983）、9706
参照〕またその機能型は四量体であろうと思われる。
ターフェロンとかタイプIIインターフェロンと呼ばれて
いた。本明細書ではＩＦＮ−γと略記される）は１９６
５年にエフ・ホイーロック（F. Wheelook）〔ホイーロ
ック（Wheelook）；サイエンス（Science）149（196
5），310参照〕により発見され、彼によってＩＦＮ−γ
がある種の細胞をビールス感染から保護しうることが示
された。ヒトＩＦＮ−γ〔基礎的な情報については、ダ
ブリュー・イー・スチュアート（W. E. Stewart）、I
I、ザ・インターフェロン・システム（The Interferon
System）、スプリンガー（Springer）発行（第２版、19
81年）参照〕は天然的にグリコシル化されている１４６
個のアミノ酸から構成されるポリペプチドである〔グレ
イ（Gray）ほか、ネイチャー（Nature）295（1982）、5
03参照〕。この糖タンパクは約６３,０００〜７３,００
０の分子量を有し〔ペストカ（Pestka）ほか、ジェイ・
バイオル・ケム（J. Biol. Chem.）258（1983）、9706
参照〕またその機能型は四量体であろうと思われる。
【０００３】ＩＦＮ−γのグリコシル化はその機能に必
要ではなく、したがってＩＦＮ−γをグリコシダーゼを
処理してもヒト繊維芽細胞の細胞培養においてその抗ビ
ールス活性が低下することはない〔ケルカー（Kelker）
ほか、ジェイ・バイオル・ケム（J. Biol. Chem.）258
（1983）、8010参照〕。更にまた、α−インターフェロ
ン類およびβ−インターフェロンとは対照的に、ＩＦＮ
−γはpH２で不安定でありまた熱（６０℃）により不働
化される。セルラインの細胞培養からの、あるいは白血
球（血液銀行貯蔵血液）からのヒトＩＦＮ−γの単離は
可能ではあるが収率はほんのわずかであり、また生成物
の純度も低い。本発明はγ−インターフェロンに類似の
性質を有するポリペプチドの遺伝子工学的方法による製
造に関する。ヒトＩＦＮ−γは次のペプチド配列を有す
る〔デボス（Devos）ほか、ニュクル・アシッズ・リサ
ーチ(Nucl. Acids Research）10（1982）、2487参
照〕：
要ではなく、したがってＩＦＮ−γをグリコシダーゼを
処理してもヒト繊維芽細胞の細胞培養においてその抗ビ
ールス活性が低下することはない〔ケルカー（Kelker）
ほか、ジェイ・バイオル・ケム（J. Biol. Chem.）258
（1983）、8010参照〕。更にまた、α−インターフェロ
ン類およびβ−インターフェロンとは対照的に、ＩＦＮ
−γはpH２で不安定でありまた熱（６０℃）により不働
化される。セルラインの細胞培養からの、あるいは白血
球（血液銀行貯蔵血液）からのヒトＩＦＮ−γの単離は
可能ではあるが収率はほんのわずかであり、また生成物
の純度も低い。本発明はγ−インターフェロンに類似の
性質を有するポリペプチドの遺伝子工学的方法による製
造に関する。ヒトＩＦＮ−γは次のペプチド配列を有す
る〔デボス（Devos）ほか、ニュクル・アシッズ・リサ
ーチ(Nucl. Acids Research）10（1982）、2487参
照〕：
【０００４】 Cys1−Tyr−Cys−Gln−Asp−Pro−Tyr−Val−Lys−Glu10− Ala−Glu−Asn−Leu−Lys−Lys−Tyr−Phe−Asn−Ala20− Gly−His−Ser−Asp−Val−Ala−Asp−Asn−Gly−Thr30− Leu−Phe−Leu−Gly−Ile−Leu−Lys−Asn−Trp−Lys40− Glu−Glu−Ser−Asp−Arg−Lys−Ile−Met−Gln−Ser50− Gln−Ile−Val−Ser−Phe−Tyr−Phe−Lys−Leu−Phe60− Lys−Asn−Phe−Lys−Asp−Asp−Gln−Ser−Ile−Gln70− Lys−Ser−Val−Glu−Thr−Ile−Lys−Glu−Asp−Met80− Asn−Val−Lys−Phe−Phe−Asn−Ser−Asn−Lys−Lys90− Lys−Arg−Asp−Asp−Phe−Glu−Lys−Leu−Thr−Asn100− Tyr−Ser−Val−Thr−Asp−Leu−Asn−Val−Gln−Arg110− Lys−Ala−Ile−His−Glu−Leu−Ile−Gln−Val−Met120− Ala−Glu−Leu−Ser−Pro−Ala−Ala−Lys−Thr−Gly130− Lys−Arg−Lys−Arg−Ser−Gln−Met−Leu−Phe−Arg140− Gly−Arg−Arg−Ala−Ser−Gln146
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明はヒトＩＦＮ−γ
の前記アミノ酸配列の部分配列、５〜１４６をコードす
るＤＮＡに関する。さらに本発明は上記アミノ酸配列５
〜１４６をコードするＤＮＡ配列を含むハイブリッドプ
ラスミド、該ハイブリッドプラスミドを含む宿主細菌に
関する。遺伝暗号が「縮退」していること、すなわち単
一のヌクレオチド配列によって暗号化されているのは２
種類のアミノ酸に過ぎず、残りの１８種類の遺伝暗号化
しうるアミノ酸には２〜６個のトリプレットが対応しう
ることは知られている。更に、異なる生物種の宿主細胞
がこれにより生じる可能なバリエーションを常に同じ様
に用いるとは限らない。このように、遺伝子合成には、
極めて広範にわたる様々なコドン可能性が存在する。今
般、アミノ酸１〜１４６全体をコードするＤＮＡ配列Ｉ
（本文末に付した配列の記載を参照されたい）およびそ
れより導かれるＤＮＡ配列ＩＡ、ＩＢおよびＩＣがＩＦ
Ｎ−γ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的方法に
よる合成に特に有利であることを見出した。ＤＮＡ配列
Ｉの暗号鎖５′末端においてはメチオニンに対するコド
ン（「トリプレットＮｏ．０」）および上流方向に例え
ば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩに相当する「突
出」ＤＮＡ配列が続き、一方、その暗号鎖の３′末端に
は１個の停止コドン、または好ましくは２個の停止コド
ンおよび−その直後にまたはあるＤＮＡ配列を隔てて−
制限酵素に特有の配列、例えば制限酵素Ｓａｌ Ｉに相
当する一本鎖突出配列が続く。異なる認識配列は所望の
配列方向でのＤＮＡのプラスミドへの挿入を確保する。
の前記アミノ酸配列の部分配列、５〜１４６をコードす
るＤＮＡに関する。さらに本発明は上記アミノ酸配列５
〜１４６をコードするＤＮＡ配列を含むハイブリッドプ
ラスミド、該ハイブリッドプラスミドを含む宿主細菌に
関する。遺伝暗号が「縮退」していること、すなわち単
一のヌクレオチド配列によって暗号化されているのは２
種類のアミノ酸に過ぎず、残りの１８種類の遺伝暗号化
しうるアミノ酸には２〜６個のトリプレットが対応しう
ることは知られている。更に、異なる生物種の宿主細胞
がこれにより生じる可能なバリエーションを常に同じ様
に用いるとは限らない。このように、遺伝子合成には、
極めて広範にわたる様々なコドン可能性が存在する。今
般、アミノ酸１〜１４６全体をコードするＤＮＡ配列Ｉ
（本文末に付した配列の記載を参照されたい）およびそ
れより導かれるＤＮＡ配列ＩＡ、ＩＢおよびＩＣがＩＦ
Ｎ−γ活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的方法に
よる合成に特に有利であることを見出した。ＤＮＡ配列
Ｉの暗号鎖５′末端においてはメチオニンに対するコド
ン（「トリプレットＮｏ．０」）および上流方向に例え
ば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩに相当する「突
出」ＤＮＡ配列が続き、一方、その暗号鎖の３′末端に
は１個の停止コドン、または好ましくは２個の停止コド
ンおよび−その直後にまたはあるＤＮＡ配列を隔てて−
制限酵素に特有の配列、例えば制限酵素Ｓａｌ Ｉに相
当する一本鎖突出配列が続く。異なる認識配列は所望の
配列方向でのＤＮＡのプラスミドへの挿入を確保する。
【０００６】暗号鎖の５末端におけるアミノ酸メチオニ
ンに対するコドンは細胞質からの所望のポリペプチドの
分泌を生起させ、またこの排泄過程で宿主細胞中に天然
に存するシグナルペプチダーゼにより除去される細菌タ
ンパクまたは宿主に固有の他のタンパクのプレ配列（シ
グナルまたはリーダー配列とも呼ばれる）により置換す
ることができる〔総括論文：パールマン（Perlman）お
よびハルボルソン（Halvorson）；ジェイ・モル・バイ
オル(J. Mol. Biol.）167（1983)、391参照〕。
ンに対するコドンは細胞質からの所望のポリペプチドの
分泌を生起させ、またこの排泄過程で宿主細胞中に天然
に存するシグナルペプチダーゼにより除去される細菌タ
ンパクまたは宿主に固有の他のタンパクのプレ配列（シ
グナルまたはリーダー配列とも呼ばれる）により置換す
ることができる〔総括論文：パールマン（Perlman）お
よびハルボルソン（Halvorson）；ジェイ・モル・バイ
オル(J. Mol. Biol.）167（1983)、391参照〕。
【０００７】制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＨｉｎｄ III
に対する２つの内部の独特な制限部位（それぞれ暗号鎖
のコドン３４および９７、および非暗号鎖のコドン３５
および９８）は十分に研究されているクローニング・ベ
クター例えばｐＢＲ ３２２またはｐＵＣ ８などに取込
むことができる３つの遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−
IIおよびＩＦＮ−III（ＤＮＡ配列II参照）のサブクロ
ーニングを可能にする。更に、制限酵素に対する多くの
他の特有認識配列が構造遺伝子内に取込まれるが、これ
らは一方ではＩＦＮ−γの部分配列へのアクセスを提供
し、他方では次のバリエーションの導入を可能にする。
すなわち、
に対する２つの内部の独特な制限部位（それぞれ暗号鎖
のコドン３４および９７、および非暗号鎖のコドン３５
および９８）は十分に研究されているクローニング・ベ
クター例えばｐＢＲ ３２２またはｐＵＣ ８などに取込
むことができる３つの遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−
IIおよびＩＦＮ−III（ＤＮＡ配列II参照）のサブクロ
ーニングを可能にする。更に、制限酵素に対する多くの
他の特有認識配列が構造遺伝子内に取込まれるが、これ
らは一方ではＩＦＮ−γの部分配列へのアクセスを提供
し、他方では次のバリエーションの導入を可能にする。
すなわち、
【０００８】
【表１】
【０００９】その末端を含めたＤＮＡ配列Ｉは１８〜３
３個のヌクレオチド長を有する３４個のオリゴヌクレオ
チド（ＤＮＡ配列II参照）（後者をまず化学合成し次い
でそれらを４〜６個のヌクレオチドの「粘着末端」を介
して酵素的に連結することによる）から構築することが
できる。更に、ＤＮＡ配列Ｉにおいて、いくつかのコド
ンが対応しうるアミノ酸に対し、それらコドンが等価で
はなく逆に個々の宿主細胞、例えば大腸菌（E. coli）
において異なる優先性を示すように注意を払った。更に
また、回文配列は最小限にとどめた。
３個のヌクレオチド長を有する３４個のオリゴヌクレオ
チド（ＤＮＡ配列II参照）（後者をまず化学合成し次い
でそれらを４〜６個のヌクレオチドの「粘着末端」を介
して酵素的に連結することによる）から構築することが
できる。更に、ＤＮＡ配列Ｉにおいて、いくつかのコド
ンが対応しうるアミノ酸に対し、それらコドンが等価で
はなく逆に個々の宿主細胞、例えば大腸菌（E. coli）
において異なる優先性を示すように注意を払った。更に
また、回文配列は最小限にとどめた。
【００１０】このように、ＤＮＡ配列Ｉの遺伝子構造は
比較的小さな構造単位から容易に製造でき、またそれは
３つの遺伝子断片の周知ベクターへのサブクローニング
を可能にし、そしてそれはそれら断片を結合して全遺伝
子とすることを可能にすると共にその全遺伝子の改変を
可能にする。すなわち配列Ｉの遺伝子をクローニング
後、それよりＤＮＡ部分配列、特にアミノ酸１〜１２
７、５〜１４６および５〜１２７に相当するインターフ
ェロン部分配列をコードする部分配列ＩＡ、ＩＢおよび
ＩＣをある種の制限酵素により切断することにより得る
ことができる。
比較的小さな構造単位から容易に製造でき、またそれは
３つの遺伝子断片の周知ベクターへのサブクローニング
を可能にし、そしてそれはそれら断片を結合して全遺伝
子とすることを可能にすると共にその全遺伝子の改変を
可能にする。すなわち配列Ｉの遺伝子をクローニング
後、それよりＤＮＡ部分配列、特にアミノ酸１〜１２
７、５〜１４６および５〜１２７に相当するインターフ
ェロン部分配列をコードする部分配列ＩＡ、ＩＢおよび
ＩＣをある種の制限酵素により切断することにより得る
ことができる。
【００１１】部分配列の１例はＩＦＮ−γの最初の１２
７個のアミノ酸を有するポリペプチドを導くＤＮＡ配列
ＩＡによって与えられ、ＤＮＡ配列Ｉは１個の停止トリ
プレットまたは好ましくは２個の停止トリプレットおよ
び制限酵素に特有の配列、例えば制限酵素Ｓａｌ Ｉに
対する突出末端がトリプレットNo. １２７に直接に接続
されるように改変される。
７個のアミノ酸を有するポリペプチドを導くＤＮＡ配列
ＩＡによって与えられ、ＤＮＡ配列Ｉは１個の停止トリ
プレットまたは好ましくは２個の停止トリプレットおよ
び制限酵素に特有の配列、例えば制限酵素Ｓａｌ Ｉに
対する突出末端がトリプレットNo. １２７に直接に接続
されるように改変される。
【００１２】一方、ＤＮＡ配列Ｉを制限エンドヌクレア
ーゼＡｖａ IIで切断しそしてこのようにして得られる
大断片をアダプター配列と連結するとＩＦＮ−γの最初
の４個のアミノ酸に対するコドンが欠失した。すなわち
メチオニンがアミノ酸No. ５(アスパラギン酸)のすぐ上
流に位置しているＤＮＡ配列ＩＢが得られる。ＩＦＮ−
γのアミノ酸５〜１２７を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列ＩＣはこのＤＮＡ配列ＩＢからＰｓｔ
Ｉ制限部位を介して生成させることができる。
ーゼＡｖａ IIで切断しそしてこのようにして得られる
大断片をアダプター配列と連結するとＩＦＮ−γの最初
の４個のアミノ酸に対するコドンが欠失した。すなわち
メチオニンがアミノ酸No. ５(アスパラギン酸)のすぐ上
流に位置しているＤＮＡ配列ＩＢが得られる。ＩＦＮ−
γのアミノ酸５〜１２７を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列ＩＣはこのＤＮＡ配列ＩＢからＰｓｔ
Ｉ制限部位を介して生成させることができる。
【００１３】合成遺伝子または遺伝子断片のクローニン
グベクター中ヘの、例えば商業的に入手しうるプラスミ
ドｐＵＣ８およびｐＢＲ ３２２中への、あるいは他の
一般的に入手しうるプラスミド、例えばｐｔａｃ １１
およびｐｋｋ １７７．３中への取込みは自体既知の方
法で行われる。予め化学合成遺伝子にタンパクの発現を
可能にする適当な化学合成調節領域を付与することも可
能である。これに関連してマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）によるテキストブック〔モレキュラー・クローニン
グ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、マニア
チスほか、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）１９８２〕を参照しう
る。このようにして得られたハイブリッドプラスミドの
適当な宿主生物、有利には細菌、特に大腸菌への形質転
換も同様にして自体知られており、また前述のテキスト
ブックに詳述されている。発現タンパクの単離およびそ
の精製も同様に記載されている〔ジェイ・エイ・ジョー
ジエイズ（Ｊ．Ａ．Ｇｅｏｒｇｉａｄｅｓ）、テキサス
・レポーツ・イン・バイオロジー・アンド・メディスン
（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｗｅｄｉｃｉｎｅ）４１（１９８１）１７
９；ケイム（Ｃａｍｅ）およびカーター（Ｃａｒｔｅ
ｒ）（編者）、「インターフェロンズ・アンド・ゼア・
アプリケーションズ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、スプリ
ンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）発行、１９８４年参照〕。
グベクター中ヘの、例えば商業的に入手しうるプラスミ
ドｐＵＣ８およびｐＢＲ ３２２中への、あるいは他の
一般的に入手しうるプラスミド、例えばｐｔａｃ １１
およびｐｋｋ １７７．３中への取込みは自体既知の方
法で行われる。予め化学合成遺伝子にタンパクの発現を
可能にする適当な化学合成調節領域を付与することも可
能である。これに関連してマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ）によるテキストブック〔モレキュラー・クローニン
グ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、マニア
チスほか、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）１９８２〕を参照しう
る。このようにして得られたハイブリッドプラスミドの
適当な宿主生物、有利には細菌、特に大腸菌への形質転
換も同様にして自体知られており、また前述のテキスト
ブックに詳述されている。発現タンパクの単離およびそ
の精製も同様に記載されている〔ジェイ・エイ・ジョー
ジエイズ（Ｊ．Ａ．Ｇｅｏｒｇｉａｄｅｓ）、テキサス
・レポーツ・イン・バイオロジー・アンド・メディスン
（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｗｅｄｉｃｉｎｅ）４１（１９８１）１７
９；ケイム（Ｃａｍｅ）およびカーター（Ｃａｒｔｅ
ｒ）（編者）、「インターフェロンズ・アンド・ゼア・
アプリケーションズ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、スプリ
ンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）発行、１９８４年参照〕。
【００１４】本発明により得られまたＤＮＡ配列ＩＡ、
ＩＢおよびＩＣ従ってγ−インターフェロン活性を有す
るポリペプチドは新規であり、そして本発明はそれらに
関する。同様のことが新規ＤＮＡ配列Ｉから改変された
ＤＮＡ配列、これらの配列から得られるγ−インターフ
ェロンアナログ、遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−IIお
よびＩＦＮ−IIIおよびそれらの改変物、それらを用い
て得られたハイブリッドプラスミドおよび形質転換宿主
生物にもあてはまる。本発明の更に他の態様は特許請求
の範囲に述べられている。本発明のいくつかの態様を以
下の実施例に詳述するが、これより多くの改変および組
合せが可能であることは当業者にとって明白である。こ
れらの実施例において％データは特に断らなければ重量
に関するものである。
ＩＢおよびＩＣ従ってγ−インターフェロン活性を有す
るポリペプチドは新規であり、そして本発明はそれらに
関する。同様のことが新規ＤＮＡ配列Ｉから改変された
ＤＮＡ配列、これらの配列から得られるγ−インターフ
ェロンアナログ、遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−IIお
よびＩＦＮ−IIIおよびそれらの改変物、それらを用い
て得られたハイブリッドプラスミドおよび形質転換宿主
生物にもあてはまる。本発明の更に他の態様は特許請求
の範囲に述べられている。本発明のいくつかの態様を以
下の実施例に詳述するが、これより多くの改変および組
合せが可能であることは当業者にとって明白である。こ
れらの実施例において％データは特に断らなければ重量
に関するものである。
【００１５】
【実施例】１． 一本鎖オリゴヌクレオチドの化学合成 遺伝子の構造単位の合成を、暗号鎖のヌクレオチド１〜
２３よりなる遺伝子の構造単位Ｉａの例を用いて説明す
る。既知の方法〔エム・ジェイ・ゲイト(M. J.Gait）ほ
か、ニュクレイック・アシズ・リス（Nucleic Acids Re
s.）8（1980）1081〜1096参照〕、３′末端に位置する
ヌクレオシド、すなわち、この場合にはシチジン（ヌク
レオチドNo. ２３）を３′−ヒドロキシル基を介してシ
リカゲル（FRACTOSILR、メルク社製）に共有結合する。
このためには、シリカゲルをまず３−（トリエトキシシ
リル）プロピルアミンと反応させてエタノールを脱離さ
せＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成させる。そのシチジンをＮ
4−ベンゾイル−３′−Ｏ−スクシノイル−５′−ジメ
トキシトリチルエーテルの形でｐ−ニトロフェノールと
Ｎ,Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下に
その変性キャリアーと反応させるとスクシノイル基の遊
離カルボキシル基はプロピルアミノ基のアミノ基をアシ
ル化する。
２３よりなる遺伝子の構造単位Ｉａの例を用いて説明す
る。既知の方法〔エム・ジェイ・ゲイト(M. J.Gait）ほ
か、ニュクレイック・アシズ・リス（Nucleic Acids Re
s.）8（1980）1081〜1096参照〕、３′末端に位置する
ヌクレオシド、すなわち、この場合にはシチジン（ヌク
レオチドNo. ２３）を３′−ヒドロキシル基を介してシ
リカゲル（FRACTOSILR、メルク社製）に共有結合する。
このためには、シリカゲルをまず３−（トリエトキシシ
リル）プロピルアミンと反応させてエタノールを脱離さ
せＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を生成させる。そのシチジンをＮ
4−ベンゾイル−３′−Ｏ−スクシノイル−５′−ジメ
トキシトリチルエーテルの形でｐ−ニトロフェノールと
Ｎ,Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下に
その変性キャリアーと反応させるとスクシノイル基の遊
離カルボキシル基はプロピルアミノ基のアミノ基をアシ
ル化する。
【００１６】以後の合成段階において、塩基成分は５′
−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシド−３′−亜りん
酸のモノメチルエステルのジアルキルアミドまたはクロ
ライドとして用いられ、アデニンはＮ6−ベンゾイル化
合物の形とし、シトシンはＮ4−ベンゾイル化合物の形
とし、グアニンはＮ2−イソブチリル化合物の形としそ
してチミンはアミノ基を含まず、保護基はない。
−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシド−３′−亜りん
酸のモノメチルエステルのジアルキルアミドまたはクロ
ライドとして用いられ、アデニンはＮ6−ベンゾイル化
合物の形とし、シトシンはＮ4−ベンゾイル化合物の形
とし、グアニンはＮ2−イソブチリル化合物の形としそ
してチミンはアミノ基を含まず、保護基はない。
【００１７】２μモルの結合シトシンを含有する５０mg
の重合体キャリアーを次の試剤で順次処理する： ａ） ニトロメタン、 ｂ） １％の水を含有するニトロメタンの中の臭化亜鉛
飽和溶液、 ｃ） メタノール、 ｄ） テトラヒドロフラン、 ｅ） アセトニトリル、 ｆ） ０.５mlの無水アセトニトリル中の４０μモルの
適当なヌクレオシドホスファイトおよび２００μモルの
テトラゾール（５分間）、 ｇ） ４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリ
ジンを含有するテトラヒドロフラン中の２０％酢酸無水
物（２分）、 ｈ） テトラヒドロフラン、 ｉ） ２０％水および４０％ルチジンを含有するテトラ
ヒドロフラン、 ｊ） コリジン／水／テトラヒドロフラン(容量比５：
４：１)中の３％沃素、 ｋ） テトラヒドロフラン、および ｌ） メタノール。
の重合体キャリアーを次の試剤で順次処理する： ａ） ニトロメタン、 ｂ） １％の水を含有するニトロメタンの中の臭化亜鉛
飽和溶液、 ｃ） メタノール、 ｄ） テトラヒドロフラン、 ｅ） アセトニトリル、 ｆ） ０.５mlの無水アセトニトリル中の４０μモルの
適当なヌクレオシドホスファイトおよび２００μモルの
テトラゾール（５分間）、 ｇ） ４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリ
ジンを含有するテトラヒドロフラン中の２０％酢酸無水
物（２分）、 ｈ） テトラヒドロフラン、 ｉ） ２０％水および４０％ルチジンを含有するテトラ
ヒドロフラン、 ｊ） コリジン／水／テトラヒドロフラン(容量比５：
４：１)中の３％沃素、 ｋ） テトラヒドロフラン、および ｌ） メタノール。
【００１８】この場合において「ホスファイト」の用語
は、デオキシリボーズ−３′−モノ亜りん酸のモノメチ
ルエステルであって第３原子価が塩素または第３級アミ
ノ基、例えばモルホリノ基により飽和されているものを
意味するものと理解されるべきである。この合成におけ
る個々の段階の収率は各場合について脱トリチル化反応
ｂ）後に分光光度測定法によりジメトキシトリチル陽イ
オンの４９６nmの波長における吸収を測定することによ
り測定することができる。オリゴヌクレオチドの合成の
完了後、オリゴマーのメチルホスフェート保護基をｐ−
チオクレゾールおよびトリエチルアミンを用いて脱離す
る。
は、デオキシリボーズ−３′−モノ亜りん酸のモノメチ
ルエステルであって第３原子価が塩素または第３級アミ
ノ基、例えばモルホリノ基により飽和されているものを
意味するものと理解されるべきである。この合成におけ
る個々の段階の収率は各場合について脱トリチル化反応
ｂ）後に分光光度測定法によりジメトキシトリチル陽イ
オンの４９６nmの波長における吸収を測定することによ
り測定することができる。オリゴヌクレオチドの合成の
完了後、オリゴマーのメチルホスフェート保護基をｐ−
チオクレゾールおよびトリエチルアミンを用いて脱離す
る。
【００１９】次に、オリゴヌクレオチドを３時間アンモ
ニア処理することにより固体キャリアーから除去する。
それらオリゴマーを２〜３日間濃アンモニア処理すると
塩基のアミノ保護基が定量的に脱離する。このようにし
て得られた粗製生成物を高速液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製する。遺伝子の他の構造単位Ｉｂ〜IIIｌもまた全
く相応に合成され、それらのヌクレオチド配列はＤＮＡ
配列IIから導かれる。
ニア処理することにより固体キャリアーから除去する。
それらオリゴマーを２〜３日間濃アンモニア処理すると
塩基のアミノ保護基が定量的に脱離する。このようにし
て得られた粗製生成物を高速液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製する。遺伝子の他の構造単位Ｉｂ〜IIIｌもまた全
く相応に合成され、それらのヌクレオチド配列はＤＮＡ
配列IIから導かれる。
【００２０】２． 一本鎖オリゴヌクレオチド類の酵素
的連結による遺伝子断片ＩＦＮ−１、ＩＦＮ−IIおよび
ＩＦＮ−IIIの生成 ５′末端のオリゴヌクレオチドのホスホリル化のため
に、オリゴヌクレオチドＩａおよびＩｂの各々１ｎモル
および５ｎモルのアデノシン三りん酸を、２０μｌの５
０mM ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（pH７.６）、１０mMの塩
化マグネシウムおよび１０mMのジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）中の４単位のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼで
３０分間３７℃で処理する〔シー・シー・リチャードソ
ン(C. C. Richardson）、プログレス・イン・ニョーク
ル・アシズ・リス（Progress in Nucl. Acids Res.）2
（1972）825参照〕。その酵素を９５℃で５分間加熱す
ることにより失活させる。次いでオリゴヌクレオチドＩ
ａおよびＩｂを、それらを水性溶液中で９５℃で２分間
加熱し次に５℃に徐冷することにより相互にハイブリッ
ド化する。
的連結による遺伝子断片ＩＦＮ−１、ＩＦＮ−IIおよび
ＩＦＮ−IIIの生成 ５′末端のオリゴヌクレオチドのホスホリル化のため
に、オリゴヌクレオチドＩａおよびＩｂの各々１ｎモル
および５ｎモルのアデノシン三りん酸を、２０μｌの５
０mM ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（pH７.６）、１０mMの塩
化マグネシウムおよび１０mMのジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）中の４単位のＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼで
３０分間３７℃で処理する〔シー・シー・リチャードソ
ン(C. C. Richardson）、プログレス・イン・ニョーク
ル・アシズ・リス（Progress in Nucl. Acids Res.）2
（1972）825参照〕。その酵素を９５℃で５分間加熱す
ることにより失活させる。次いでオリゴヌクレオチドＩ
ａおよびＩｂを、それらを水性溶液中で９５℃で２分間
加熱し次に５℃に徐冷することにより相互にハイブリッ
ド化する。
【００２１】同様にして、オリゴヌクレオチドＩｃとＩ
ｄ、ＩｅとＩｆまたはＩｇとＩｈ、およびＩｉとＩｊを
ホスホリル化し対合させる。オリゴヌクレオチドIIａと
IIｂ・・・・IIｋとIIｌのホスホリル化および対合をサブフ
ラグメントＩＦＮ−IIに対して行い、そしてオリゴマー
IIIａとIIIｂ・・・・IIIｋとIIIｌのホスホリル化および対
合をサブフラグメントＩＦＮ−IIIに対して行う。この
ようにして得られる５対のオリゴヌクレオチド（遺伝子
断片ＩＦＮ−Ｉについて）および６対のオリゴヌクレオ
チド（遺伝子断片ＩＦＮ−IIおよびＩＦＮ−IIIについ
て）を各々について次のようにして連結する。
ｄ、ＩｅとＩｆまたはＩｇとＩｈ、およびＩｉとＩｊを
ホスホリル化し対合させる。オリゴヌクレオチドIIａと
IIｂ・・・・IIｋとIIｌのホスホリル化および対合をサブフ
ラグメントＩＦＮ−IIに対して行い、そしてオリゴマー
IIIａとIIIｂ・・・・IIIｋとIIIｌのホスホリル化および対
合をサブフラグメントＩＦＮ−IIIに対して行う。この
ようにして得られる５対のオリゴヌクレオチド（遺伝子
断片ＩＦＮ−Ｉについて）および６対のオリゴヌクレオ
チド（遺伝子断片ＩＦＮ−IIおよびＩＦＮ−IIIについ
て）を各々について次のようにして連結する。
【００２２】二本鎖ヌクレオチドを組合せそして各々、
４０μｌの５０mM ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液、２０mM塩化
マグネシウムおよび１０mM ＤＴＴ中で１００単位のＴ
４−ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で１６時間かけて連
結する。遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ〜ＩＦＮ−IIIの精製は
１０％ポリアクリルアミドゲル（尿素無添加、２０×４
０cm、１mm厚）でのゲル電気泳動により行う。用いたマ
ーカー物質はＨｉｎｆ Ｉで切断されたφ×１７４ＤＮ
Ａ（ＢＲＬ製）またはＨａｅ IIIで切断されたｐＢＲ
３２２である。
４０μｌの５０mM ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液、２０mM塩化
マグネシウムおよび１０mM ＤＴＴ中で１００単位のＴ
４−ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で１６時間かけて連
結する。遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ〜ＩＦＮ−IIIの精製は
１０％ポリアクリルアミドゲル（尿素無添加、２０×４
０cm、１mm厚）でのゲル電気泳動により行う。用いたマ
ーカー物質はＨｉｎｆ Ｉで切断されたφ×１７４ＤＮ
Ａ（ＢＲＬ製）またはＨａｅ IIIで切断されたｐＢＲ
３２２である。
【００２３】３． 遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−II
およびＩＦＮ−IIIを含有するハイブリッドプラスミド
の調製 ａ） 遺伝子断片ＩＦＮ−ＩのｐＢＲ ３２２への取込
み 商業的に入手しうるプラスミドｐＢＲ ３２２を既知の
方法により制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩおよび
Ｂａｍ ＨＩを製造元のデータに従って用いて開裂す
る。切断混合物を既知の方法により５％ポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動により分画し、そしてそれら断片
を臭化エチジウム染色または放射能標識（マニアチスの
「ニックトランスレーション」法、前掲）により可視化
する。次にプラスミド帯をアクリルアミドゲルから切り
出しそして電気泳動によりポリアクリルアミドから分離
する。切断混合物の分画はまた（実施例６ａ）に記載の
如く）２％低融点アガロースゲルで行うこともできる。
次に１μｇのプラスミドを１６℃で一夜１０ngの遺伝子
断片ＩＦＮ−Ｉと連結する。図１に示されたハイブリッ
ドプラスミドが得られる。
およびＩＦＮ−IIIを含有するハイブリッドプラスミド
の調製 ａ） 遺伝子断片ＩＦＮ−ＩのｐＢＲ ３２２への取込
み 商業的に入手しうるプラスミドｐＢＲ ３２２を既知の
方法により制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩおよび
Ｂａｍ ＨＩを製造元のデータに従って用いて開裂す
る。切断混合物を既知の方法により５％ポリアクリルア
ミドゲルでの電気泳動により分画し、そしてそれら断片
を臭化エチジウム染色または放射能標識（マニアチスの
「ニックトランスレーション」法、前掲）により可視化
する。次にプラスミド帯をアクリルアミドゲルから切り
出しそして電気泳動によりポリアクリルアミドから分離
する。切断混合物の分画はまた（実施例６ａ）に記載の
如く）２％低融点アガロースゲルで行うこともできる。
次に１μｇのプラスミドを１６℃で一夜１０ngの遺伝子
断片ＩＦＮ−Ｉと連結する。図１に示されたハイブリッ
ドプラスミドが得られる。
【００２４】ｂ） 遺伝子断片ＩＦＮ−IIのｐＵＣ ８
への取込み ａ）と同様にして、商業的に入手しうるプラスミドｐＵ
Ｃ ８をＢａｍ ＨＩおよびＨｉｎｄ IIIを用いて開裂し
そして遺伝子断片ＩＦＮ−IIと連結する。図２に示され
るハイブリッドプラスミドが得られる。
への取込み ａ）と同様にして、商業的に入手しうるプラスミドｐＵ
Ｃ ８をＢａｍ ＨＩおよびＨｉｎｄ IIIを用いて開裂し
そして遺伝子断片ＩＦＮ−IIと連結する。図２に示され
るハイブリッドプラスミドが得られる。
【００２５】ｃ） 遺伝子断片ＩＦＮ−IIIのｐＵＣへ
の取込み ａ）と同様にして、プラスミドｐＵＣ ８をＨｉｎｄ II
IおよびＳａｌ Ｉを用いて開裂しそして遺伝子断片ＩＦ
Ｎ−IIIと連結する。図３に示されるハイブリッドプラ
スミドが得られる。
の取込み ａ）と同様にして、プラスミドｐＵＣ ８をＨｉｎｄ II
IおよびＳａｌ Ｉを用いて開裂しそして遺伝子断片ＩＦ
Ｎ−IIIと連結する。図３に示されるハイブリッドプラ
スミドが得られる。
【００２６】４． 完全遺伝子の合成 ａ） 形質転換および増幅 このようにして得られるハイブリッドプラスミドを大腸
菌に形質転換する。このために大腸菌Ｋ １２株を７０m
M塩化カルシウム溶液処理によりコンピテントにしそし
て、塩化カルシウム濃度が７０mMの１０mM ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ緩衝液（pH７.５）中のハイブリッドプラスミドの
懸濁液を添加する。形質転換株は常法により、プラスミ
ドにより与えられる抗生物質に対する抵抗性または感受
性を利用して選別し、そしてハイブリッドベクターを増
幅する。菌株を殺した後にハイブリッドプラスミドを単
離し、最初に用いた制限酵素を用いて開裂させ、そして
遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−IIおよびＩＦＮ−III
をゲル電気泳動により単離する。
菌に形質転換する。このために大腸菌Ｋ １２株を７０m
M塩化カルシウム溶液処理によりコンピテントにしそし
て、塩化カルシウム濃度が７０mMの１０mM ｔｒｉｓ Ｈ
Ｃｌ緩衝液（pH７.５）中のハイブリッドプラスミドの
懸濁液を添加する。形質転換株は常法により、プラスミ
ドにより与えられる抗生物質に対する抵抗性または感受
性を利用して選別し、そしてハイブリッドベクターを増
幅する。菌株を殺した後にハイブリッドプラスミドを単
離し、最初に用いた制限酵素を用いて開裂させ、そして
遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉ、ＩＦＮ−IIおよびＩＦＮ−III
をゲル電気泳動により単離する。
【００２７】ｂ） 遺伝子断片の連結 増幅により得られるサブフラグメントＩＦＮ−Ｉ、ＩＦ
Ｎ−IIおよびＩＦＮ−IIIを実施例２に記載されている
如くに酵素的に連結し、そしてこのようにして得られそ
してＤＮＡ配列Ｉを有する合成遺伝子をクローニングベ
クターｐＵＣ８に導入する。図４に示されるようなハイ
ブリッドプラスミドが得られる。
Ｎ−IIおよびＩＦＮ−IIIを実施例２に記載されている
如くに酵素的に連結し、そしてこのようにして得られそ
してＤＮＡ配列Ｉを有する合成遺伝子をクローニングベ
クターｐＵＣ８に導入する。図４に示されるようなハイ
ブリッドプラスミドが得られる。
【００２８】５． ＤＮＡ配列ＩＡ、ＩＢおよびＩＣを
含有するハイブリッドプラスミドの合成 ａ） 挿入ＩＢ含有ハイブリッドプラスミド ＤＮＡ配列Ｉを含有する図４に示されるようなハイブリ
ッドプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳａｌ Ｉ
を用いて既知の方法により開裂し、Ｅｃｏ ＲＩおよび
Ｓａｌ Ｉ小断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より除去し、次に酵素Ａｖａ IIを用いて切断する。次
のアダプター、すなわち
含有するハイブリッドプラスミドの合成 ａ） 挿入ＩＢ含有ハイブリッドプラスミド ＤＮＡ配列Ｉを含有する図４に示されるようなハイブリ
ッドプラスミドを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳａｌ Ｉ
を用いて既知の方法により開裂し、Ｅｃｏ ＲＩおよび
Ｓａｌ Ｉ小断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より除去し、次に酵素Ａｖａ IIを用いて切断する。次
のアダプター、すなわち
【表２】 を用い、そして既に作られた大ＤＮＡ断片と連結した後
に、ＤＮＡ配列ＩＢ挿入部を含むハイブリッドプラスミ
ドが得られる（図５参照）。
に、ＤＮＡ配列ＩＢ挿入部を含むハイブリッドプラスミ
ドが得られる（図５参照）。
【００２９】ｂ） 挿入ＩＡ含有ハイブリッドプラスミ
ド 制限酵素Ｐｓｔ Ｉを製造元のデータに従って用いてＤ
ＮＡ配列Ｉを切断し、そしてＥｃｏ ＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ断
片を単離する。更に、商業的に入手しうるプラスミドｐ
ＵＣ ８を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｍａ Ｉを用い
て開裂させ、そして既に単離された断片を次のアダプタ
ー、すなわち、
ド 制限酵素Ｐｓｔ Ｉを製造元のデータに従って用いてＤ
ＮＡ配列Ｉを切断し、そしてＥｃｏ ＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ断
片を単離する。更に、商業的に入手しうるプラスミドｐ
ＵＣ ８を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｍａ Ｉを用い
て開裂させ、そして既に単離された断片を次のアダプタ
ー、すなわち、
【表３】 を用いて挿入すると図６に示されるようなハイブリッド
プラスミドが得られる。
プラスミドが得られる。
【００３０】ｃ） 挿入ＩＣ含有ハイブリッドプラスミ
ド 実施例５ａから得られるハイブリッドプラスミドをＥｃ
ｏ ＲＩおよびＰｓｔＩで切断する。単離された（Ｅｃ
ｏ ＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ）断片を５ｂ）と同様にして連結し
て今後はＤＮＡ配列ＩＣの挿入部を含有する新しいハイ
ブリッドプラスミドを得る（図７参照）。
ド 実施例５ａから得られるハイブリッドプラスミドをＥｃ
ｏ ＲＩおよびＰｓｔＩで切断する。単離された（Ｅｃ
ｏ ＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ）断片を５ｂ）と同様にして連結し
て今後はＤＮＡ配列ＩＣの挿入部を含有する新しいハイ
ブリッドプラスミドを得る（図７参照）。
【００３１】６． ＤＮＡ配列ＩＡ、ＩＢおよびＩＣの
発現用ハイブリッドプラスミドの構築 ａ） ｐＫＫ １７７.３への取込み 発現プラスミドｐＫＫ １７７.３〔プラスミドｐｔａｃ
II（アマン（Amman）ほか、ジーン（Gene）25 (1983)
167のＥｃｏ ＲＩ認識部位にＳａｌ Ｉ制限部位を含む
配列を合成的に取込ませたもの）を制限酵素Ｅｃｏ Ｒ
ＩおよびＳａｌＩを用いて開裂する。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳａｌ Ｉを用いて図５に相当するプラスミ
ドから挿入ＩＢを切り出す。（やや長めの）挿入部ＩＡ
★およびＩＣ★もまた同様に単離される。何故ならばｐ
ＵＣ ８において、制限酵素ＳｍａＩの制限部位により
特徴付けられる２つの遺伝子断片の実際の末端のわずか
数ヌクレオチド下流にＳａｌ Ｉ制限部位が位置してい
るからである（図６および図７参照）。
発現用ハイブリッドプラスミドの構築 ａ） ｐＫＫ １７７.３への取込み 発現プラスミドｐＫＫ １７７.３〔プラスミドｐｔａｃ
II（アマン（Amman）ほか、ジーン（Gene）25 (1983)
167のＥｃｏ ＲＩ認識部位にＳａｌ Ｉ制限部位を含む
配列を合成的に取込ませたもの）を制限酵素Ｅｃｏ Ｒ
ＩおよびＳａｌＩを用いて開裂する。制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩおよびＳａｌ Ｉを用いて図５に相当するプラスミ
ドから挿入ＩＢを切り出す。（やや長めの）挿入部ＩＡ
★およびＩＣ★もまた同様に単離される。何故ならばｐ
ＵＣ ８において、制限酵素ＳｍａＩの制限部位により
特徴付けられる２つの遺伝子断片の実際の末端のわずか
数ヌクレオチド下流にＳａｌ Ｉ制限部位が位置してい
るからである（図６および図７参照）。
【００３２】断片ＩＡ★、ＩＢおよびＩＣ★を２％低融
点アガロースにかけ、プラスミドＤＮＡから分離し、そ
して挿入部は、そのゲルを（製造元の説明に従って）高
められた温度で溶解することにより回収する。各場合に
ついて発現または調節領域が挿入部の上流に組込まれた
ハイブリッドプラスミドは開発したプラスミドｐＫＫ１
７７.３を断片ＩＡ★およびＩＢまたはＩＣ★と連結す
ることにより得られる。適当な誘導物質例えばイソプロ
ピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加
後、ｍＲＮＡが形成され、そしてこの結果ＤＮＡ配列Ｉ
ＡおよびＩＢまたはＩＣに相当するメチオニルポリペプ
チドが発現する。
点アガロースにかけ、プラスミドＤＮＡから分離し、そ
して挿入部は、そのゲルを（製造元の説明に従って）高
められた温度で溶解することにより回収する。各場合に
ついて発現または調節領域が挿入部の上流に組込まれた
ハイブリッドプラスミドは開発したプラスミドｐＫＫ１
７７.３を断片ＩＡ★およびＩＢまたはＩＣ★と連結す
ることにより得られる。適当な誘導物質例えばイソプロ
ピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加
後、ｍＲＮＡが形成され、そしてこの結果ＤＮＡ配列Ｉ
ＡおよびＩＢまたはＩＣに相当するメチオニルポリペプ
チドが発現する。
【００３３】ｂ） ｐＭＸ ２への取込み 発現プラスミドｐＭＸ ２は２１ヌクレオチド分短縮さ
れそして次のようにして調製されるｐＵＣ ８プラスミ
ドよりなる。ｐＵＣ ８を制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏ ＲＩを用いて開裂し次いでＥｃｏＲＩ制限部位の両
側で約２０ヌクレオチドの脱離を可能にする条件下にエ
キソヌクレアーゼＢａｌ ３１で処理する（Maniatis、
前掲）。次に、このように処理されたプラスミドのすべ
ての突出末端をクレノウ（Klenow）ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて埋め、次にそのプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄ IIIを用いて切断しそして製造元の説明
に従って１％低融点アガロースゲルで精製する。もとも
とｐＵＣ ８に存在しそしてＥｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ
III制限酵素切断部位により制限されまた前述の操作に
より破壊されたポリリンカーをプラスミドに再挿入す
る。そのために、ｐＵＣ ８を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩを用
いて開裂しそして突出末端をクレノウポリメラーゼおよ
び32Ｐ−標識ヌクレオシドトリホスフェートを用いて埋
める。次にそのポリリンカーを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIを
用いてプラスミドから切り出しそして１０％アクリルア
ミドゲルでの電気泳動によりプラスミドから除去する。
オートラジオグラフィを用いてポリリンカー帯を確認
後、アクリルアミド残留物を電気溶出（electroelutio
n）によってポリリンカーから除き、そしてそれを短縮
されたｐＵＣ ８プラスミドに連結する。このように構
築したプラスミドｐＭＸ ２を次に制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ
およびＳａｌ Ｉを用いて開裂しそして末端がＥｃｏ Ｒ
ＩおよびＳａｌ Ｉ認識配列を有するγ−インターフェ
ロン遺伝子断片ＩＡ★およびＩＢまたはＩＣ★と連結し
て発現プラスミドｐＭＸ ２を得る（図８〜図１０）。
次に高力価のインターフェロンを示すクローンを生物活
性の測定により確認する。
れそして次のようにして調製されるｐＵＣ ８プラスミ
ドよりなる。ｐＵＣ ８を制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏ ＲＩを用いて開裂し次いでＥｃｏＲＩ制限部位の両
側で約２０ヌクレオチドの脱離を可能にする条件下にエ
キソヌクレアーゼＢａｌ ３１で処理する（Maniatis、
前掲）。次に、このように処理されたプラスミドのすべ
ての突出末端をクレノウ（Klenow）ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて埋め、次にそのプラスミドを制限エンドヌクレ
アーゼＨｉｎｄ IIIを用いて切断しそして製造元の説明
に従って１％低融点アガロースゲルで精製する。もとも
とｐＵＣ ８に存在しそしてＥｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ
III制限酵素切断部位により制限されまた前述の操作に
より破壊されたポリリンカーをプラスミドに再挿入す
る。そのために、ｐＵＣ ８を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩを用
いて開裂しそして突出末端をクレノウポリメラーゼおよ
び32Ｐ−標識ヌクレオシドトリホスフェートを用いて埋
める。次にそのポリリンカーを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIを
用いてプラスミドから切り出しそして１０％アクリルア
ミドゲルでの電気泳動によりプラスミドから除去する。
オートラジオグラフィを用いてポリリンカー帯を確認
後、アクリルアミド残留物を電気溶出（electroelutio
n）によってポリリンカーから除き、そしてそれを短縮
されたｐＵＣ ８プラスミドに連結する。このように構
築したプラスミドｐＭＸ ２を次に制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ
およびＳａｌ Ｉを用いて開裂しそして末端がＥｃｏ Ｒ
ＩおよびＳａｌ Ｉ認識配列を有するγ−インターフェ
ロン遺伝子断片ＩＡ★およびＩＢまたはＩＣ★と連結し
て発現プラスミドｐＭＸ ２を得る（図８〜図１０）。
次に高力価のインターフェロンを示すクローンを生物活
性の測定により確認する。
【００３４】７． ハイブリッドプラスミドの形質転換 コンピテント大腸菌細胞をＩＡまたはＩＢまたはＩＣの
配列を含む０.１〜１μｇのハイブリッドプラスミドを
用いて形質転換しそしてアンピシリン含有寒天平板に置
床する。次いでＤＮＡ迅速後処理により適宜のプラスミ
ド中に正しく組込まれたγ−インターフェロン遺伝子配
列を含有するクローンを確認できる（Maniatis、 前
掲）。
配列を含む０.１〜１μｇのハイブリッドプラスミドを
用いて形質転換しそしてアンピシリン含有寒天平板に置
床する。次いでＤＮＡ迅速後処理により適宜のプラスミ
ド中に正しく組込まれたγ−インターフェロン遺伝子配
列を含有するクローンを確認できる（Maniatis、 前
掲）。
【００３５】８． γ−インターフェロン活性を示すポ
リペプチドの発現 前述のハイブリッドプラスミドを大腸菌に形質転換後発
現されるポリペプチドは適切なγ−インターフェロンア
ミノ酸配列のほかにアミノ末端に付加的なメチオニル基
を有するもの、すなわちＩＡの構成にあってはＭｅｔ−
（ＩＦＮ−γ、アミノ酸１−１２７）、ＩＢの構成にあ
ってはＭｅｔ−（ＩＦＮ−γ、アミノ酸５−１４６）お
よびＩＣの構成にあってはＭｅｔ−（ＩＦＮ−γ、アミ
ノ酸５−１２７）である。
リペプチドの発現 前述のハイブリッドプラスミドを大腸菌に形質転換後発
現されるポリペプチドは適切なγ−インターフェロンア
ミノ酸配列のほかにアミノ末端に付加的なメチオニル基
を有するもの、すなわちＩＡの構成にあってはＭｅｔ−
（ＩＦＮ−γ、アミノ酸１−１２７）、ＩＢの構成にあ
ってはＭｅｔ−（ＩＦＮ−γ、アミノ酸５−１４６）お
よびＩＣの構成にあってはＭｅｔ−（ＩＦＮ−γ、アミ
ノ酸５−１２７）である。
【００３６】９． 後処理および精製 所望の最適な密度となるまで培養された菌株を適当な誘
導物質、例えばＩＰＴＧと共に十分な時間、例えば２時
間インキュベートする。次いで菌体を０.１％クレゾー
ルおよび０.１mMベンジルスルホニルフルオライドを用
いて殺菌する。遠心分離または濾過後その生物塊を緩衝
溶液（５０mM ｔｒｉｓ、５０mM ＥＤＴＡ、pH７.５）
にとりそして例えばフレンチ（French）プレスまたはダ
イノ（ＤＹＮＯ、商標名）ミル〔ウィリー・バッコファ
ー（Willy Bachofer）社、バーゼル（Basel）〕を用い
て機械的に破壊し、次いで遠心分離により不溶性成分を
除去する。γ−インターフェロン活性を含むタンパクを
常法により上清から精製する。イオン交換、吸着および
ゲル濾過カラムまたは抗体に基づくアフィニティクロマ
トグラフィカラムが適している。生成物の濃縮度および
純度をドデシル硫酸ナトリウム／アクリルアミドゲルま
たはＨＰＬＣを用いた分析によりチェックする。
導物質、例えばＩＰＴＧと共に十分な時間、例えば２時
間インキュベートする。次いで菌体を０.１％クレゾー
ルおよび０.１mMベンジルスルホニルフルオライドを用
いて殺菌する。遠心分離または濾過後その生物塊を緩衝
溶液（５０mM ｔｒｉｓ、５０mM ＥＤＴＡ、pH７.５）
にとりそして例えばフレンチ（French）プレスまたはダ
イノ（ＤＹＮＯ、商標名）ミル〔ウィリー・バッコファ
ー（Willy Bachofer）社、バーゼル（Basel）〕を用い
て機械的に破壊し、次いで遠心分離により不溶性成分を
除去する。γ−インターフェロン活性を含むタンパクを
常法により上清から精製する。イオン交換、吸着および
ゲル濾過カラムまたは抗体に基づくアフィニティクロマ
トグラフィカラムが適している。生成物の濃縮度および
純度をドデシル硫酸ナトリウム／アクリルアミドゲルま
たはＨＰＬＣを用いた分析によりチェックする。
【００３７】インジケータ・セルライン、例えばベロ
（Vero）細胞をγ−インターフェロン活性についての生
成物の生物学的特徴付けに既知の方法で用い、そしてイ
ンターフェロン含有細菌抽出物の連続希釈物と共にイン
キュベートする。次いでＶＳＶ（小水疱性口内炎ビール
ス）などのビールスで感染させることにより、細菌抽出
物によるベロ細胞の前処理が抗ビールス状態を獲得しう
る最高希釈段階のチェックを行う。評価は顕微鏡によ
り、またはニュートラルレッドの取込みの測定により行
うことができる。更にまたγ−インターフェロン活性
は、γ−インターフェロンに対するモノクローナル抗体
に基づく商業的に入手しうるラジオイムノアッセイ〔セ
ルテック・リミテッド（Cellteck Ltd.）社〕を用いて
測定することもできる。
（Vero）細胞をγ−インターフェロン活性についての生
成物の生物学的特徴付けに既知の方法で用い、そしてイ
ンターフェロン含有細菌抽出物の連続希釈物と共にイン
キュベートする。次いでＶＳＶ（小水疱性口内炎ビール
ス）などのビールスで感染させることにより、細菌抽出
物によるベロ細胞の前処理が抗ビールス状態を獲得しう
る最高希釈段階のチェックを行う。評価は顕微鏡によ
り、またはニュートラルレッドの取込みの測定により行
うことができる。更にまたγ−インターフェロン活性
は、γ−インターフェロンに対するモノクローナル抗体
に基づく商業的に入手しうるラジオイムノアッセイ〔セ
ルテック・リミテッド（Cellteck Ltd.）社〕を用いて
測定することもできる。
【００３８】１０． ＤＮＡ配列の改変 ａ） １０２位のセリンがグルタミン酸に置換されてい
るγ−インターフェロンアナログを調製するために、次
のヌクレオチドを実施例１および２と同様にして合成す
る。
るγ−インターフェロンアナログを調製するために、次
のヌクレオチドを実施例１および２と同様にして合成す
る。
【表４】 遺伝子断片ＩＦＮ−IIIを制限酵素Ａｈａ IIIで切断し
そして大きい方の断片を取出して前述のヌクレオチドと
連結する。ｐＵＣ ８への取込みは実施例３ｃ）と同様
にして行う。実施例４ａ）と同様にして形質転換および
増幅を行った後、改変配列ＩＦＮ−IIIをマキサム−ギ
ルバート配列決定法によって確認する。この改変サブフ
ラグメントを実施例４と同様にして遺伝子断片ＩＦＮ−
ＩおよびＩＦＮ−IIと連結しそして実施例５〜９と同様
の手順を続けることにより、１０２位のセリンに代えて
グルタミン酸が組み込まれている改変γ−ＩＦＮが得ら
れる。この生成物は抗ビールス活性を示す。
そして大きい方の断片を取出して前述のヌクレオチドと
連結する。ｐＵＣ ８への取込みは実施例３ｃ）と同様
にして行う。実施例４ａ）と同様にして形質転換および
増幅を行った後、改変配列ＩＦＮ−IIIをマキサム−ギ
ルバート配列決定法によって確認する。この改変サブフ
ラグメントを実施例４と同様にして遺伝子断片ＩＦＮ−
ＩおよびＩＦＮ−IIと連結しそして実施例５〜９と同様
の手順を続けることにより、１０２位のセリンに代えて
グルタミン酸が組み込まれている改変γ−ＩＦＮが得ら
れる。この生成物は抗ビールス活性を示す。
【００３９】ｂ） アミノ酸配列１〜１３６に続けてシ
スティンを有するγ−インターフェロンアナログ
スティンを有するγ−インターフェロンアナログ
【表５】 を実施例１および２と同様にして合成する。断片ＩＦＮ
−IIIを制限酵素ＰｓｔＩを用いて切断しそして大きい
方の断片を分離する。これを前述のヌクレオチドと連結
し、そして前期と同様の手順を続ける。アミノ酸１〜１
３６およびカルボキシ末端にシスティンを含む改変γ−
インターフェロンが得られる。このγ−インターフェロ
ンアナログは内部的に安定化しており、また後処理の際
に天然γ−インターフェロンよりもより容易にクロマト
グラフィにより操作されうる。
−IIIを制限酵素ＰｓｔＩを用いて切断しそして大きい
方の断片を分離する。これを前述のヌクレオチドと連結
し、そして前期と同様の手順を続ける。アミノ酸１〜１
３６およびカルボキシ末端にシスティンを含む改変γ−
インターフェロンが得られる。このγ−インターフェロ
ンアナログは内部的に安定化しており、また後処理の際
に天然γ−インターフェロンよりもより容易にクロマト
グラフィにより操作されうる。
【００４０】ＤＮＡ配列Ｉ：ここに示されるように、ア
ミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対する特徴的な配列および
「トリプレットNo. ０」を有し、またカルボキシ末端に
２個の停止トリプレットおよびＳａｌ Ｉに対する特徴
的な配列を有する。
ミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対する特徴的な配列および
「トリプレットNo. ０」を有し、またカルボキシ末端に
２個の停止トリプレットおよびＳａｌ Ｉに対する特徴
的な配列を有する。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】
【００４３】ＤＮＡ配列ＩＡ：ここに示されるように、
アミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対し特徴的な配列および
「トリプレットNo. ０」を有しまたカルボキシ末端に２
個の停止トリプレットおよびＳｍａ Ｉに対し特徴的な
配列を有する。
アミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対し特徴的な配列および
「トリプレットNo. ０」を有しまたカルボキシ末端に２
個の停止トリプレットおよびＳｍａ Ｉに対し特徴的な
配列を有する。
【表８】
【００４４】ＤＮＡ配列ＩＢ：ここに示されるように、
アミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対し特徴的な配列および
「トリプレットNo. ０」を有しまたカルボキシ末端に２
個の停止トリプレットおよびＳａｌ Ｉに対し特徴的な
配列を有する。
アミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対し特徴的な配列および
「トリプレットNo. ０」を有しまたカルボキシ末端に２
個の停止トリプレットおよびＳａｌ Ｉに対し特徴的な
配列を有する。
【表９】
【００４５】ＤＮＡ配列ＩＣ：ここに示されるようにア
ミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対し特徴的な配列および「ト
リプレットNo. ０」を有しまたカルボキシ末端にＳｍａ
Ｉに対し特徴的な配列を有する。
ミノ末端にＥｃｏ ＲＩに対し特徴的な配列および「ト
リプレットNo. ０」を有しまたカルボキシ末端にＳｍａ
Ｉに対し特徴的な配列を有する。
【表１０】
【００４６】
【表１１】
【００４７】
【表１２】
【００４８】
【表１３】
【図１】ｐＢＲ ３２２中に遺伝子断片ＩＦＮ−Ｉを含
有するハイブリッドプラスミドを示す図。
有するハイブリッドプラスミドを示す図。
【図２】ｐＵＣ ８中に遺伝子断片ＩＦＮ−IIを含有す
るハイブリッドプラスミドを示す図。
るハイブリッドプラスミドを示す図。
【図３】ｐＵＣ ８中に遺伝子断片ＩＦＮ−IIIを含有す
るハイブリッドプラスミドを示す図。
るハイブリッドプラスミドを示す図。
【図４】ｐＵＣ ８中にＤＮＡ配列Ｉを含有するハイブ
リッドプラスミドを示す図。
リッドプラスミドを示す図。
【図５】ｐＵＣ ８中にＤＮＡ配列ＩＢを含有するハイ
ブリッドプラスミドを示す図。
ブリッドプラスミドを示す図。
【図６】ｐＵＣ ８中にＤＮＡ配列ＩＡを含有するハイ
ブリッドプラスミドを示す図。
ブリッドプラスミドを示す図。
【図７】ｐＵＣ ８中にＤＮＡ配列ＩＣを含有するハイ
ブリッドプラスミドを示す図。
ブリッドプラスミドを示す図。
【図８】ｐＭＸ ２中に遺伝子断片ＩＡ★を含有するハ
イブリッドプラスミドを示す図。
イブリッドプラスミドを示す図。
【図９】ｐＭＸ ２中に遺伝子断片ＩＢを含有するハイ
ブリッドプラスミドを示す図。
ブリッドプラスミドを示す図。
【図１０】ｐＭＸ ２中に遺伝子断片ＩＣ★を含有する
ハイブリッドプラスミドを示す図。
ハイブリッドプラスミドを示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 オイゲーン・ウールマン アメリカ合衆国マサチユーセツツ州 （02178）ベルモント．ワシントンストリ ート287 (72)発明者 ヴオルフガング・ウルマー ドイツ連邦共和国デー−6230フランクフル ト・アム・マイン80．アム・カペレンベル ク14 (56)参考文献 特開 昭58−90514（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−51792（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−201995（ＪＰ，Ａ) 国際公開83／04053（ＷＯ，Ａ)
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒトγ−インターフェロンの下記のアミ
ノ酸配列５〜１４６をコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 ヒトγ−インターフェロンの下記のアミ
ノ酸配列５〜１４６をコードするＤＮＡ配列を含むハイ
ブリッドプラスミド。 - 【請求項３】 Ｅｃｏ ＲＩ開裂部位とＳａｌ Ｉ開
裂部位との間にヒトγ−インターフェロンの下記のアミ
ノ酸配列５〜１４６をコードするＤＮＡ配列を含む請求
項２に記載のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項４】 Ｅｃｏ ＲＩ開裂部位と前記インターフ
ェロン配列の第１アミノ酸に対するコドンとの間にプレ
配列を含む請求項３に記載のハイブリッドプラスミド。 - 【請求項５】 ヒトγ−インターフェロンの下記のアミ
ノ酸配列５〜１４６をコードするＤＮＡ配列を含むハイ
ブリッドプラスミドを含む宿主細菌。 - 【請求項６】 大腸菌である請求項５に記載の宿主細
菌。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843414831 DE3414831A1 (de) | 1984-04-19 | 1984-04-19 | Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet |
| DE3414831:0 | 1984-04-19 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP60081502A Division JPH0745516B2 (ja) | 1984-04-19 | 1985-04-18 | ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 |
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|---|---|
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| JPH07100037B2 true JPH07100037B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60081502A Expired - Lifetime JPH0745516B2 (ja) | 1984-04-19 | 1985-04-18 | ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 |
| JP5217335A Expired - Lifetime JPH07100037B2 (ja) | 1984-04-19 | 1993-09-01 | ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60081502A Expired - Lifetime JPH0745516B2 (ja) | 1984-04-19 | 1985-04-18 | ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 |
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|---|---|---|---|---|
| DE3409966A1 (de) * | 1984-03-19 | 1985-09-26 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-gammainterferon und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| DE3536939A1 (de) * | 1985-10-17 | 1987-04-23 | Hoechst Ag | Biologisch aktive derivate des human-(gamma)-interferons, ihre herstellung und arzneimittel, die solche derivate enthalten |
| GB8619725D0 (en) * | 1986-08-13 | 1986-09-24 | Hoffmann La Roche | Homogenous interferon fragments |
| DE3642096A1 (de) * | 1986-12-10 | 1988-06-16 | Boehringer Ingelheim Int | Pferde-(gamma)-interferon |
| US5157004A (en) * | 1986-12-27 | 1992-10-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Polypeptides and production thereof |
| JP2653061B2 (ja) * | 1986-12-27 | 1997-09-10 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
| CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
| SK8292002A3 (en) * | 1999-11-12 | 2002-12-03 | Maxygen Holdings Ltd | A conjugate exhibiting interferon gamma activity, nucleotide sequence encoding for a polypeptide fraction of conjugate, an expression vector and a host cell containing nucleotide sequence, pharmaceutical composition comprising the same and use thereof |
| US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
| US7038015B2 (en) * | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
| AU2003239774A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-23 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
| US20050003533A1 (en) | 2003-05-08 | 2005-01-06 | Pawel Kalinski | Mature type-1 polarized dendritic cells with enhanced IL-12 production and methods of serum-free production and use |
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| EP1877434A2 (en) * | 2005-05-04 | 2008-01-16 | Nautilus Biotech | Modified interferon-gamma polypeptides and methods for using modified interferon-gamma polypeptides |
| WO2008121461A2 (en) * | 2007-02-26 | 2008-10-09 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Vaccine for activating helper function of cd8+ tcells |
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| BG66517B1 (bg) * | 2008-04-08 | 2016-02-29 | Tigo Gmbh | Супресор на ендогенния човешки гама - интерферон |
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