JPS60233100A - ヒトγ―インターフェロン活性を有するポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトｒ−インターフェロンの生物活性および
免疫活性を示すポリペプチドの製造方法、これらのはプ
チドをコードする化学合成遺伝子およびこれらポリペプ
チドの発現に適したベクター構造および宿主生物に関す
る。本発明はまたｒ−インターフェロンとは区別される
対照的な点として、生物活性に本質的でない部分配列を
欠失させた新規ポリペプチドに関する。ｒ−インターフ
ェロンに比べこれらのポリペプチドは安定性または＃解
性が＾〈また抗ビールス活性の特異性の点では様々であ
るが、それらは抗ビールス、抗ａｍ、抗新生物または免
疫調節剤として利用可能であるという点ではすべてｆ−
インターフェロンに類似している。

ｒ−インターフェロン（以前は免疫インターフェロンと
かタイプ夏インターフェロンと呼にれていた。本明細書
では工ＦＮ−ｊと略記される）は１９６５年にエフ・ホ
イーロックＣＦ、Ｗｈｅｅｌｏａｋ）〔ホイーロツク（
Ｗｈｅｅｌｏｃｋ）；サイエンス（８ｃｉｅｎａｅ）１
４９（１９６５）、３１０参照〕によシ発見され、彼に
よりて工ＦＮ−γがある棟のａ胞をビールス感染から保
−しうることか示された。ヒトエＦＮ−７（基礎的な情
報については、ダブりニー・イー・スチュアート（Ｗｊ
！ｆ、ｓｔｅｗａｒｔ）、■、ザ・インターフエｏ　：
／　＠システム（Ｔｈｅ工ｎｔｓｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓ
ｔｅｍ）ｓスプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｔ）発行（第
２版、１９８１年）参照〕は天然的にグリコジル化され
ている１４６個のアミノ酸から溝底されるポリはプチド
でらる〔グレイ（Ｇｒａｙ）ほか、ネイチャー□１ａｔ
ｕｒｅ）２９５（１９８２）、５０６番照〕。この糖タ
ン／ぞりは約６３，０００〜７３，０００の分子瀘を有
し〔ベスト力（Ｐｅｓｔｋａ）ほか、ジエイ・／シイオ
ル・ケム（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、　）２５８　（１
９８３）、９７０６参照〕またでの機能型は四重体でお
ろうと思われる。

工ＦＮ−ｒのグリコジル化はその機能に必要ではなく、
シたがって工ＦＮ−７をグリコシダーゼを処理してもヒ
ト繊維芽細胞の細胞培養においてその抗ビールス活性が
低下することはない〔ケルカー　（Ｋｅｌｋｅｒ）ほか
、ジエイ・パイオル・ケム（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、２５８　（１９８３）、８０１０
参照〕。

更にまた、α−インターフェロン類およびβ−インター
フェロンとは対照的に、工ＰＩ−ｒｔｉｐ’２で不安定
であシま良熱（６０℃）によシネ勧化される。セルライ
ンの細胞培養からの、あるいは白血球（血液銀行貯蔵血
液）からのヒトエＩＰＮ−ｒの単離は可能ではあるが収
率はほんのわずかでめシ、また生成物の純度も低い。本
発明はｒ−インターフェロンに類似の性實を有するポリ
はプチドの遺伝子工学的方法による製造に関する。ヒト
エＦＨ−ｒは次の堅ゾチド配列を有する〔デボス（Ｄｅ
ｖｏｓ）ほか、ニュクル・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃ
ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＠ａｒｃｈ　１０（１９８２）
、２４８７参照）： ｅｙｅ’　−Ｔｙｒ−Ｏｙｓ−Ｃｋｔｎ−Ａｓｐ−）’
ｒｏ−Ｔｙｒ　−Ｖａｔ−Ｌｙｓ４ｔｕ　”−Ａｔ＆−
Ｇ＆−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｅ　−Ｔｙ
ｒ　−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ　−Ａｌａ　２Ｏ−Ｇｔｙ−Ｈ
ｌｓ−８ｏｒ−Ａｓｐ−Ｖａｔ−ＡムーＡｓｐ−Ａｓｎ
−Ｇｔｙ−Ｔｈｒ”−Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−Ｌｅｕ−Ｇｔｙ
−■ｔｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ　
４〇−Ｇム−Ｇｔｕ−８ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−エム−Ｍｅ、ｔ　４ムーＳｅｒ”’−Ｇｌｎ−工ｔｅ
　−Ｖａｔ−８ｅｒ　−Ｐｈｅ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ　
−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　６　Ｇ　−Ｌｙａ−Ａｓ
ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｔｎ−Ｂｅ
ｒ４Ｌｅ−Ｇｔｎ”　−Ｌｙｅ−８ｅｒ−Ｖａｔ−Ｇ＆
−Ｔｈｒ−工＃−Ｌｙｓ＝Ｇ＆−Ａｓｐ−Ｍｅｔ”−Ａ
ｓｎ−Ｖａｎ−Ｌｙｅ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−８ａ
ｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｅ−Ｌｙｅ　９０−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｔｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｈｒ−Ａｓｎ”’−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｖａｎ−Ｇｔｕ−Ａｒｇ”　
０−Ｌｙｓ４ムーエｔｅ−Ｈ１ｓ４ム−Ｌｅｕ−工ｔｅ
−Ｇｔｎ”Ｖａｔ−Ｍｅｔ’　”−ＡムーＩＭｕ−Ｌｅ
ｕ−８ｏｒ−Ｐｒｏ−ＡＡａ−ＡムーＬｙｓ　−Ｔｈｒ
−Ｇｔｙｌ　５０−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
８ｅｒ−Ｇｔｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ”’
−Ｇｔｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａムー５ｅｒ−Ｇｔｎ　０
本発明は一向におい℃ヒトエＰＨ−７の生物活性部分配
列、特に前記配列の部分配列１〜１２７．５〜１４６お
よび５〜１２７の調製に関する。

遺伝暗号が「縮退」していること、すなわち単一のヌク
レオチド配列によって暗号化されているのは２種類のア
ミノ酸に過ぎず、残シの１８８種類遺伝暗号化しうるア
ミノ酸には２〜６個のトリブレットが対応しうろことは
知られている。更に、異なる生物種の宿主細胞がこれＫ
よシ生じる可能なバリエーションを常に同じ様に用いる
とは限らない。このように、遺伝子合成には、極めて広
範にわたる様々なコドン可能性が存在する。今般、アミ
ン＃！１〜１４６全体をコードするＤＮＡ配列工（本文
末に付し九配列の記載を参照されたい）およびそれよＪ
ｌ１４かれるＤＮＡ配列工Ａ１よりおよび工０が工ＦＮ
−ｒ活性を有するポリ堅プチドの遺伝子工学的方法によ
る合成に特に有利でるることを見出した。ＤＮＡ配列工
の暗号鎖５′末端においてはメチオニンに対するコドン
（［トリプレットＡＯＪ）および上流方向に例えば制限
エンドヌクレアーゼＢｃｏ　ＲＩＫ相当する［突出Ｊ　
ＤＮＡ配列が続き、一方、その暗号鎖の３′末端には１
個の停止コドン、または好ましくは２個の停止コドンお
よび−その直後にまたはめるＤＮＡ配列を隔てて一制限
酵素に特有の配列、例えば制限酵素Ｓａｔ　工に相当す
る一本鎖突出配列が続く。異なる認識配列は所望の配列
方向でのＤＮＡのプラスミドへの挿入を確保する。

暗号鎖の５末端におけるアミノ酸メチオニンに幻するコ
ドンは＃ｌＩＩ胞質からの所望のポリペプチドの分泌を
生起させ、またこの排泄過程で宿主細胞中に天然に存す
るシグナルペプチダーゼにより除去されるａＪ菌タン／
ぐりまたは宿主に固有の他のタン／セフの一プレ配列（
シグナルまたはリーダー配列とも呼ばれる）によジ置換
することλ　きる〔総括論文ＨＡ−ル”ｆン（Ｐｅｒｌ
ｍａｎ）およびハルボルソン（Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ）　
；ジェイ０モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１
６７　（１９８３）、３９１参照〕。

制限酵素Ｂａｍ　Ｈ工およびＨｌｎｄａｔに対する２つ
の内部の独特な制限部位（それぞれ暗号鎖のコドン３４
および９７、および非暗号鎖のコドン３５および９８）
は十分に研究されているクローニング・ベクター例えば
ｐＢＲ３２２またはｐＵｏ　８などに取込むことができ
る３つの遺云子断片工ＦＮ−１，１７Ｎ−［およびＩＦ
Ｎ　−［１（ＤＮＡ配列１参Ｊｌｆ［）Ｏサブクローニ
ングを可能にする。更に、制限酵素に対する多くの他の
特有認識配列が構造遺伝子内に取込まれるが、これらは
一方では工ＦＮ−ｒの部分配列へのアクセスを提供し、
他方では次のメリエーションの導入を可能にする。すな
わち１ Ａｖａｌｌａ）　２０ ＡＡｕｌｂ）　３９ Ｈ１ｎｆ　Ｊａ）　１３４ Ｄａｅｌｃ）　１５９ Ａｈａｌｌｌｃ）　１９９ Ｔａｑ　Ｉｃ）　２９４ Ｓｓｔ　ｌａ）　５５７ Ａｈａｌｌｌｄ）　３２７ Ｂｓｔ　Ｎｌ＋１）　３６２ ＰＲｔ　ｌａ）　５８Ｂ Ｂｂｖｌａ）　３９８ Ｓｓｔｌｌａ）　４３０ Ｄｄｅｌｄ）　４４４ ａ）全ＤＮＡ配列１に％Ｎ ｂ）部分配列１ＦＮ−１に％有 Ｃ）部分配列工ＦＮ−用に％Ｍ ｄ）部分配列１ＦＮ−１ｌｌに％有 その末端な・ｉ−めたＤＮＡ　ｎピグ１１は１８〜６３
１固のヌクレオチド長を有する３４個のオリゴヌクレオ
チド（ＤＮＡ配列配列層参照後者をまず化学合成し次い
でそれらを４〜６個のヌクレオチドのＦ粘着末端」を介
して酵素的に連結することによる）から構築することが
できる。

更に、　ＤＮＡ配列Ｉにおいて、いくつかのコドンが対
応しうるアミノ酸に対し、それらコドンが等価ではなく
逆に個々の宿生細胞、例えば大腸菌（Ｂ、ａｏｌｉ）に
おいて異なる優先性を示すように注意を払った。吏Ｋま
た、回文配列は敲小眼にとどめた。

このように、ＤＮＡ配列ｌの遺伝子構造は比較的小さな
構造単位から容易に製造でき、またそれは５つの遺伝子
断片の周知ベクターへのサブクローニングを可能にし、
そしてそれはそれら断片を結合して全遺伝子とすること
を可能にすると共にその全遺伝子の改変をｉＩ　ＩＩＢ
にする。ずなわち配列Ｉの遺伝子をクローニング後、そ
れよ、９　ＤＮＡ部分配列、特にアミノ酸１〜１２７．
５〜１４６および５〜１２７に相当するインターフェロ
ン部分配列をコードする部分配列ＩＡ％ＩＢおよび工０
をある種の制限酵素によシ切断することによシ傅ること
ができる。

部分配列の１例は工ＦＮ−ｒの最初の１２７個のアミノ
酸を有するポリペプチドを尋（ＤＮＡ配列ＩＡによって
与えられ、　ＤＮＡ配列■は１個の停止トリプレットま
たは好ましくは２個の停止トリプレットおよび制限酵素
に特有の配列、例えば１ｌＦＩｌ限＃素ｓａｔ　Ｉに対
する突出末端がトリプレット４１２７に直接に接続され
るように改変される。

一方、　ＤＮＡ配列Ｉを制限エンドヌクレアーゼＡｖａ
　ｌで切断しそしてこのようにし℃得られる大断片をア
ダプター配列と連結すると工ＦＮ−ｒの最初の４ｍのア
ミノ酸に対するコドンが欠失した。すなわちメチオニン
がアミノ酸４５（アスパラギン酸）のすぐ上流に位置し
ているＤＮＡ配列ＩＢが得られる。工ＦＮ−７のアミノ
酸５〜１２７を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列１０はこのＤＮＡ配列ＩＢからＰｓｔ　ｌ制限部位
を介して生成させることができる。

合成遺伝子または遺伝子断片のクローニングベクター中
への、例えば商業的に入手しうるプラスミドｐＵｏ　８
およびｐＢＲ３２２中への、あるいは他の一般的に入手
しうるプラスミド、例えばｐｔａｃ　１１およびｐｋｋ
１７７．３中への取込みは自体既知の方法で行われる。

予め化学合成遺伝子にタンパクの発現を可能にする適当
な化学合成調節領域を付与することも可能である。これ
に関連してマニアチス（Ｍａｎｉ＆ｔｉａ）によるテキ
ストブック〔モレキュラー・りａ−ユング（ＭｏｌθＣ
ｕｌａｒ０１ｏｎｉｎｇ）、マニアテスほか、コールド
・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｅｌｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ）　１９８２　〕を参照しうる。このよう
にして得られたハイブリッドプラスミドの適当な宿生生
物、有利には大腸菌への形質転換も同様にして自体知ら
れており、また前述のテキストブックに詳述されている
。発現タンパクの単離およびその精製も同様に記載され
ている〔ジェイ・エイ・ジョージエイズ（Ｊ、Ａ、Ｇｅ
ｏｒｇｉａｄｅｓ）、テキサス・レボーツ・イン・バイ
オロジー・アンド・メデイスン（’ｒａｍｓＲｅｐｏｒ
ｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）４１（１９８１）１７９；ケイム（Ｃａｍｅ）およ
びカーター（Ｃａｒｔｅｒ）１１１者）、ｒインターフ
ェロンズ・アンド・ゼアｅアプリケーションズ（工ｎｔ
ｅｒｆｅｒｏｎｓ　ａｎｄ　ＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ　）Ｊ、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）
発行、１９８４年参照〕。

本発明によシ得られまたＤＮＡ配列ＩＡ％ＩＢおよび１
ａ従ってｒ−インターフェロン活性を有するポリペプチ
ドは新規であシ、そして本発明はそれらに関する。同様
のことが新規ＤＮＡ配列１がら改変されたＤＮＡ配列、
これらの配列から得られるｒ−インターフェロンアナロ
グ、遺伝子断片工ＦＮ−１、工ＦＮ−ｉおよび１ＦＮ−
４ｌｌおよびそれらの改変物、それらを用いて得られた
ハイブリッドシラスミドおよび形質転換宿主生物にもあ
てはまる。

本発明の更に他の１１４様は特許請求の範囲く述べられ
ている。

本発明のいくつかの態様を以下の実施例に＃述するが、
これよシ多くの改変および組合せが可能であることは当
業者にとって明白である。

これらの実施例において係データは特に断らなければ重
量に関するものである。

実施例 １、　一本領オリゴヌクレオチドの化学合成遺伝子の構
造単位の合成を、暗号鎖のヌクレオチド１〜２５よりな
る遺伝子の構造単位ＩａＯ例を用いて説明する。既知の
方法〔エム・ジエイ・ゲイト（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ）＃ｔ
か、ニュクレイック・アシズ・リス（Ｎｕｏｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）８　（１９８０）１０８１〜１
０９６参照〕、３１末端に位置するヌクレオシド、すな
わち、この場合にはシチジン（ヌクレオチド＆２３）を
６′−ヒドロキシル基を介してシリカゲル（ＰＲＡＯＴ
Ｏ８Ｉ造、メルク社製）に共有結合する。このためには
、シリカゲルをまず３−（トリエトキシシリル）プロピ
ルアミンと反応させてエタノールを脱離させ５ｌ−ｏ−
ｓｉ結合を生成させる。そのシチジンをＮ４−ベンゾイ
ル−ｓ’−ｏ−スクシンイル−５′−ジメトキシトリチ
ルエーテルの形でｐ−ニトロフェノールとＮ、Ｎ’−ジ
シクロへキシルカルボジイミドの存在下にその変性キャ
リアーと反応させるとスクシノイル基の遊離カルボキシ
ル基はプロピルアミノ基のアミノ基をアシル化する。

以後の合成段階において、塩基成分は５’−０−ジメト
キシトリチルヌクレオシド−６１−亜シんばのモノメチ
ルエステルのジアルキルアミドまたはり胃ライドとして
用いられ、アデニンはＮ６−ベンゾイル化合物の形とし
、シトシンはＮ４−ベンゾイル化合物の形とし、グアニ
ンはＮ２−イソブチリル化合物の形としそしてチミンは
アミノ基を含まず、保護基はない。

一２μモルの結合シトシンをｔ有する５０ｑの重合体キ
ャリアーを次の試剤で順次処理する：ａ）ニトロメタン
、 ｂ）　１％の水を含Ｍするニトロメタン中の臭化亜鉛飽
和溶液、 Ｃ）メタノール、 ｄ）テトラヒドロフラン、 ｅ）アセトニトリル、 ｆ）α５−の無水アセトニトリル中の４０μモルの適当
なヌクレオ７ドホスフアイトおよび２００μモルのテト
ラゾール（５分間）％ｇ）４０％ルチジンおよび１０％
ジメチルアミノピリジンを含有するテトラヒドロフラン
中の２０％酢酸無水物（２分）。

ｈ）テトラヒドロ７ラン、 １）２０％水および４０％ルチジンを含有するテトラヒ
ドロフラン、 ｊ）コリジン／水／テト２ヒドロフ２ン（容量比５：４
：１）中の３％沃素、 ｋ）テトラヒドロフラン、および １）メタノール。

この場合において「ホスファイト」の用語は、デオキシ
リボース−３１−七ノ亜シん戚のモノメチルエステルで
あって第５原子価が塩素または第６級アミノ基、例えば
モルホリノ基によシ飽和されているものを意味するもの
と理解されるべきである。この合成における個々の段階
の収車は各場合について脱トリチル化反応ｂ）後に分′
光光度測定法によシジメトキシトリチル陽イオンの４．
９ｄｓｍの波長における吸収を測定することによシ測定
することができる。

オリゴヌクレオチドの合成の完了後、オリゴマーのメチ
ルホスフェート保護基をｐ−チオクレゾールおよびトリ
エチルアミンを用いて脱離する。

次に、オリゴヌクレオチドを３時間アンモニア処理する
ことによシ固体キャリアーから除去する。それらオリゴ
マーを２〜５日間日間シアンモニア処理と塩基の７ミノ
保護基が足置的に脱離する。このようにして得られた粗
製生成物を高速液体クロマドグ２フイ（ＨＰＬＯ）また
はポリアクリルアミドゲル電気泳動によシ精製する。

遺伝子の他の構造単位１ｔｒＪｌもま九全く相応に合成
され、それらのヌクレオチド配列はＤＮＡ配列Ｈから導
かれる。

２、一本領オリゴヌクレオチド類の噂素的遅結による遺
伝子断片工ＦＮ−１、工ＦＮ−１および工ＦＮ−Ｊｌの
生成 ５１末端のオリゴヌクレオチドのホスホリル化のために
、オリゴヌクレオチドＪａおよびｌｂの各々１ｍモルお
よび５ｍモルの７デノシン三シん酸を、２０ａＬの５０
　ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＯＩ稜衝液（ｐＨ７，６）、１０
ｍＭの塩化マグネシウムおよび１０ｍＭのジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）中の４単位のＴ４−ポリヌクレオチド
キナーゼで５０分間３７℃で処理する〔シー・シー・リ
チャードソン（０、Ｏ、Ｒｌａｈａｒｄ−ａｏｎ）、プ
ログレス・イン・ニュークルーアシズーリ　ス　（Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｎｕａｌ、Ａｃ１ｄａ　Ｒｅｓ、
）２　（１９７２）８２５参照〕。その酵素を９５℃で
５分間加熱することによシ失活させる。次いでオリゴヌ
クレオチドＩａおよび１ｂを、それらを水性溶液中で９
５℃で２分間加熱し次に５℃に徐冷することによシ相互
にハイブリッド化する。

同様にして、オリゴヌクレオチドＩＣと１ｄ。

１ｍと１ｆまたは１ｇとＩｈ、および１１とＩｊをホス
ホリル化し対合させる。オリゴヌクレオチドｌａとｌｂ
・・・ｌｋとｊｌｌのホスホリル化および対合をサブフ
ラグメントエＦＮ−１に対して行い、そしてオリゴマー
１１１ａ　トｌ１ｌｂ・・・ｌ［ｋとｍｌのホスホリル
化および対合をサブフラグメントエｙｎ−ＩＢＫ対して
行う。

このようＫして得られる５対のオリゴヌクレオチド（遺
伝子断片工ＦＮ−１について）および６゛対のオリゴヌ
クレオチド（遺伝子断片工ＦＮ−１およびＩＦＮ−［７
について）を各々について次のようＫして連結する。

二本鎖ヌクレオチドを組合せそして各々、４０１１１の
５０　ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＯＬ緩衝液、２０ｍＭ塩化マ
グネシウムおよび１０ｍ１Ｍ　ＤＴＴ中で１００年位の
７４、ＤＮＡ　’）ガーゼを用いて１５℃で１６時間か
けて連結する。

遺伝子断片工ＦＮ−１〜工ＦＮ−１の精製は１０％ポリ
アクリルアミドゲル（尿累無添加ｓ　２０Ｘ４０ｔｘ、
１酊厚）でのゲル電気泳動によシ行う。用いたマーカー
動員はＨｌｎｆ　１で切断されたψＸ１７４ＤＮＡ（ｆ
ｌＲＬ　製）またはＨａｅ　ｍで切断されたｐＢＲ３２
２である。

！Ｌ　、Ｒ伝子断片工ＦＮ−１、、工ＦＮ−３１および
工ＦＮ−１を含有するハイブリッドプラスミドの―製 ａ）遺伝子断片工ＦＮ−１のｐＢＲ５２２への取込み商
業的に人手しうるプラスミドｐＢＲ５２２を既知の方法
によシ制限エンドヌクレアーゼｊＤｃＯＲ１およびＢａ
ｎ　Ｈｌを製造元のデータに従って用いて開裂する。切
断混合物を既知の方法によ９５％ポリアクリルアミドゲ
ルでの電気泳動によシ分画し、そしてそれら断片を臭化
エチジウム染色または放射能標識（マニアチスの「ニッ
クトランスレーション」法、前＃ｂ）によシ可視化する
。

次にプラスミド帯をアクリルアミドゲルから切ｐ出しそ
して電気泳動によシボリアクリルアミドから分離する。

切断混合物の分画けまた（実施例６ａ）に記載の如く）
２％低融点アガロースゲルで行うこともできる。

次に１μｇのプラスミドを１６℃で一夜１０ｎｇの遺伝
子断片工ＩＰＭ−ｊと連結する。第１図に示されたハイ
ブリッドプラスミドが得られる。

ｂ）遺伝子断片工ＦＮ−ＨのｐＵｏ　ｆ３への取込みａ
）と同様にして、商業的に入手しうるプラスミドｐＵｏ
　８をＢａｍ　ＨｌおよびＨｌｎｄ　ＩＩＩを用いて開
裂しそして遺伝子断片工ＦＮ−１と連結する。第２図に
示されるハイブリッドプラスミドが得られる。

Ｃ）遺伝子断片ＩＦＮ−［１のｐＵｏへの取込みａ）と
同様にして、プラスミドｐＵｏ　８を１ｎｎｄｌ［Ｉお
よびＳａ４１を用いて開裂しそして遺伝子断片工ＦＮ−
Ｉｌｌと連結する。第５図に示される）−イブリッドプ
ラスミドが得られる。

４、完全遺伝子の合成 ａ）形質転換および増幅 このようにして得られるハイブリッドシラスミドを大腸
菌に形質転換する。このために大腸菌に１２株を７０ｍ
Ｍ塩化カルシウム溶液処理によシコンピテントにしそし
℃、塩化カルシウム濃度が７０ｍＭの１０　ｚＭ　ｔｒ
ｉｓ　ＨＯＬ緩衝液（ｐＨ７，５）中のハイブリッドプ
ラスミドの懸濁液ン添加する。形質転換株は幇法によシ
、プラスミドによシ与えられる抗生物質に対する抵抗性
または感受性を利用して選別し、そしてハイブリッドベ
クターを増幅する。菌株を殺した後にハイブリッドプラ
スミドを阜離し、最初に用いた制限酵素を用いて開裂さ
せ、そして遺伝子所片工ＦＮ−１、■ＩＦＮ−１および
工ＦＮ−１［をゲル電気泳動によシ率離する。

ｂ）遺伝子断片の連結 増幅によシ得られるサブフラグメントエＦＮ−ｉ、工Ｆ
Ｎ−３１および工ＦＮ−１１１Ｑ冥施例２に記載されて
いる如くに酵素的に連結し、そしてこのようにして得ら
れそしてＤＮＡ配列１を有する合成遺伝子をクローニン
グベクターｐｔｒａ　８に導入する。第４図に示される
ようなハイブリッドプラスミドが得られる。

５、ＤＮＡ配列ＩＡ　、　ＩＢおよび１０馨ざ有丁勾ハ
イプリッドプ２スミドの合成 ａ）挿入ＩＢ含有ハイブリッドプラスミドＤＮＡ配列１
を含有する串４図に示されるようなハイブリッドプラス
ミドを制限酵素ｆｆｃｏ　ＲＪおよび５ａｔＩを用いて
既知の方法によシ開裂し、ｍａｏ　Ｒ１およびＢａｔ　
ｌ小断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動によシ除去
し、次に酵素ＡＶＩＬ　ｌを用いて切断する。次のアダ
プター、すなわち５’　ＡＡ　ＴＴＯＡＯＯＡＴＧ　３
’３’　Ｇ　Ｔ（）Ｇ　ＴＡＯＯＴＧ　５’Ｋｃｏ　Ｒ
Ｉ　Ａｖａ　１ を用い、そして職に作られた大ＤＮＡ断片と連結した後
に、ＤＭＡ配列ＩＢ挿入部を言むノ・イブリッドプラス
ミドが得られる（第５図参照）。

ｂ）挿入ＩＡ含Ｍノ島イブリッドプラスミド制限酵素Ｐ
ｓｔ　１を製造元のデータに従って用いてＤＮＡ配列１
を切断し、そしてｌ１ｔｃｏ　ｆｉｌ−Ｐｓｔｌ断片な
単離する。更に、商業的に入手しうるプラスミドｐ００
８を制限＃累Ｅｃｏ　Ｒ１および１３ｍａ　Ｉを用いて
開裂させ、そして既に単離された断片を次のアダプター
、すなわち、 ５’　ＧＯＴ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　０００５’５’　Ａ　
ＯＧＴ　ＯＧＡ　ＡＴＯＡＴＴ　ＧＧＧ　５’Ｐｓｔ　
ｌ　Ｓｍａ　ｌ を用いて挿入すると第６図に示されるようなハイブリッ
ドプラスミドが得られる。

Ｃ）挿入１０含有ハイブリッドプラスミド実施例５ａか
ら得られるハイブリッドプラスミドをｌｃｏ　Ｒ１およ
びＰｓｔ　Ｉで切断する。単離された（Ｊｌｆｃｏ　Ｒ
１−Ｐｓｔ　ｌ）＃片を５ｂ）と同様にして連結して今
度はＤＮＡ配列ＩＣの挿入部を言有する新しいハイブリ
ッドプラスミドを得る（第７図参照）。

６、ＤＮＡ配列ＩＡ％ＩＢおよびＩｏの発現用ハイプリ
ッドプラスミドの構築 ａ）　、ｐＫＫ　１７７．３への取込み発現プラスミド
ｐＫＫ１７７．３（プラスミドｐｔａｃＩＩ（アマン（
Ａｍｍａｎ）　１１か、ジーン（Ｇｏｎｏ）２５（１９
８３）１６７のｊ！ｔｃｏＲＩ認１ｍ部位に８ａｔＩ制
限部位を含む配列を合成的に取込ませたもの）を制限酵
素ｌｃｏ　Ｒ１および５ａｔｌを用いて開裂する。制限
酵素ＦｆｃＯＲ１および５ａｔｌを用いて第５図に相当
するプラスミドから挿入ＩＢを切シ出す。（やや長目の
）挿入部ＩＡ　およびＩＣ＊もまた同様に単離される。

何故ならばｐＵｏ　８において、制限酵素Ｓｍａ　Ｉの
制限部位により％機付けられる２つの遺伝子断片の実際
の末端のわずか数ヌクレオチド下流に５ａｌｌ制限部位
が位置しているからでめる（第６図および第７図参照）
。

帥■片ＩＡ”％ＩＢおよびｌＯ＊を２％低融点アガロー
スに〃）け、プラスミドＤＮＡから分離し、そして挿入
部は、そのケ゛ルを（！！造元の説明に従って）高めら
れた温度で溶解することにょシ回収する。ｑ！ｒＪ８合
について発現または調節領域が挿入部の上流に組込まれ
たハイブリッドシラスミドは開裂したプラスミドｐＫＫ
１７７．３を断片ＩＡ＊およびＩＢまたはＩＯ＊と連結
することによシ得られる。適当な誘導物質例えばイソプ
ロピル−β−チオガラクトピラノシド（工ＰＴＧ）の添
加後、ｍＲＮＡが形成され、そしてこの結果ＤＮＡ配列
ＩＡおよびＩＢまたはＩＣに相当するメチオニルポリペ
プチドが発現する。

ｂ）ｐＭＸ２への取込み 発現プラスミドＩ）ＭＸ　２は２１ヌクレオチド分短縮
されそして次のようにして調製されるｐｔｒｃ８プラス
オドよシなる。

ｐＵｏ　’８を開眼エンドヌクレアーゼｌａｏ　Ｒ１を
用いて開裂し次いでＥｃｏ　Ｒ１制限部位の両側で約２
゜ヌクレオチドの脱離を可能にする条件下にエキソヌク
レアーゼＢａｔ　３１で処理する（Ｍａｎｉａｔｉｓ、
前掲）。次に、このように処理されたプラスミドのすべ
ての突出末端をフレノウ（Ｋｌθｎｏｗ）ＤＮＡボリメ
２−ゼを用いて埋め、次にそのプラスミドヲ制限エンド
ヌクレアーゼＩ（ｉｎｄ　ＩＩＩを用い℃切断しそして
製造元の説明に従って１％低融点アガロースゲルでＮ製
する。もともとｐＵＣ！　５に存在しそし℃恥ｏ　Ｒ１
およびＨｌｎａ　ｍ制限酵素切断部位によ、０１［１１
Ｊ限されまた前述の操作によシ破壊されたポリリンカー
化プラスミドに再挿入する。

そのために、ｐＵｏ　８を制限酵素ｇｃｏ　Ｒ１を用い
て開裂しそして突出末端をクレノウボリメラーゼおよび
５２ｐ−標識ヌクレオシドトリホスフェートを用いて狸
める。次にそのポリリンカーを割ｐＪｉ酵素Ｈ１ｎｄ　
ＩＩＩを用いてプラスミドから切り出しそして１０％ア
クリルアミドゲルでの磁気泳動によシブラスミドから除
去する。オートラジオグラフィを用い℃ポリリンカー帝
を確認後、アクリルアミド残留物を電気溶出（ｅｌｅｔ
ｒｏｅｌｕｔｌｏｎ）によってポリリンカーから除き、
そしてそれを短縮されたｐυ０８プ２スミドに連結する
。このように構築したプラスミドｐＭＸ　２を次に制＠
酵素ＦＩＯＱ　Ｒ１および５ａｔＩを用いて開裂しそし
て末端がｌ１ｌｃｏ　Ｒ１および５ａｔＩ　ｍ臓配列を
有するｒ−インターフェロン遺伝子断片ＩＡ″およびＩ
Ｂまたは■０＊と連結して発現プラスミドｐＭＸ　２を
得る（第８図〜第１０図）。次に高力１曲のインターフ
ェロンを示すクローンを生物活性の測定によシ確認する
。

ｌ　ハイブリッドプラスミドの形質転換コンピテント大
腸菌細胞をＩＡまたはＩＢまたはＨａの配列を官む０．
１〜１μｇのノ１イプリツドブ２スミドを用いて形質転
換しそしてアンビシリン含有寒天乎板に置床する。次い
でＤＮＡ迅速後処理により適宜のプラスミド中に正しく
組込まれたｒ−インターフェロン遺伝子配列をｔ有する
クローンを確認できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ　、前掲）。

ａ　ｒ−インターフェロン活性を示すポリ投フチドの発
椀 前述のハイブリッドプラスミドを大腸菌に形質転換後発
現されるポリはプチドは適切なｒ−インターフェロンア
ミノ酸配列のほかにアミノ末端に付加的なメチオニル基
を有するもの、すなわちＩＡの構成にあってはｎｅｔ−
（工ＩＰＮ−ｒ　ｓアミノ酸１１２７）、１Ｂの構成に
あってはＭｅｔ−（工ＰＨ−ｒ　ｓアミノ酸５−１４６
　）および１０の構成にあってはＭｅｔ−（工ＦＮ−γ
、アミノ酸５−１２７　＞である。

ρ　後処理および精製 所望の破過な密度となるまでｊ＠養された菌株を過当な
誘導物質、例えばＩＰＴＧと共に十分な時間、例えば２
時間インキュベートする。次いで１体をα１％クレゾー
ルおよび０．１　ｍＭベインルスルホニルフルオライド
を用いて殺菌する。遠心分離またはｐ通抜その生物塊を
緩衝溶液（５０ｍＭ　ｔｒｉｍ　、５０　ｍＭ　Ｊ！！
ＤＴＡ　ｓ　ｐＨ７，５）にとシそして例えばフレンチ
（Ｆｒｅｎｃｈ）ブレスま九はダイン（ＤＹＮＯ、商標
名）ミル〔クイリー・パツコファ−（ｆｉｌｌｙ　Ｂａ
ａｈｏｆｅｒ）社、バーセル（Ｂａｓｅｌ）　）を用い
て機械的に破壊し、次いで遠心分離によシネ溶性成分を
除去する。ｒ−インターフェロン活性な片むタンパクχ
常法によシ上清から精製する。イオン交換、吸層および
ゲル濾過カラムまたは抗体に基づくアフイニテイクロマ
トグ２フイカ２ムが適している。生成物の濃装置および
＃１１度をドデシル憾虚ナトリウム／アクリルアミドゲ
ルまたはＨＰＬＯを用いた分析によシチェックする。

インジケータ・セルライン、例えばベロ（Ｖｅｒｂ）細
胞をｒ−インターフェロン活性についての生成物の生物
学的特徴付けに既知の方法で用い、そしてインター７エ
ｐンを有細菌抽出物の連続希釈物と共にインキュベート
する。次いでＶＳＶ（小水痙性口内炎ビールス）などの
ビールスで感染させることＫよシ、細菌抽出物によるベ
ロ細胞の前処理が抗ビールス状態を横得しうる最高自釈
段階のチェックを行う。評価は顕微鏡によシ、またはニ
ュートラルレッドの取込みの測定によシ行うことができ
る。

更にまたｒ−インターフェロンｌ占性はｓｒ”インター
フェロンに対するモノクローナル抗体に基づく商業的に
入手しうる２ジオイムノアツセイ〔セルチック・リミテ
ッド（Ｏｅｌｌｔｅｃｋ　Ｌｔｄ、）社〕を用いて測定
することもできる。

１０、　ＤＮＡ配列の改変 ａ）１０２位のセリンがグルタミン酸に置換されている
ｒ−インターフェロンアナログを調製するために、次の
ヌクレオチドを実施例１および２と同様にして合成する
。

ｔｕ ５’　ＡＧ　ＯＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＯＴＡＯＧＡＡ　Ｇ
ＴＴムＯＴ　ＧＡＴ　ＴＴ３　’　Ａ　ＴＧＡ　ＴＴＧ
　ＡＴＧ　ＯＴＴ　ＯＡＡ　ＴＧＡ　ＯＴＡ　ＡＡＨｌ
ｎｄ　ＩＩＩ　Ａｈａ　［１ 遺伝予断片工ＦＮ−［１を制限酵素Ａｈａ　［１で切断
しそして大きい方の断片を取出して前述のヌクレオチド
と連結する。ｐＵｏ　８への取込みは実施例３Ｃ）と同
様にして行う。実施例４ａ）と同様にして形質転換およ
び増幅を行った後、改変配列ｍトｍをマキサム−ギルバ
ート配列決定法によって確認する。この改変サブフラグ
メントを実施例４と同様にして遺臥子断片工ＦＮ−５お
よび工ＦＮ−１と連結しそして実施例５〜９と同様の手
順を続けることによ！１７４１０２位のセリンに代えて
グルタミン酸が組み込まれている改変ｒ−工ＦＮが得ら
れる。この生成物は抗ビールス活性を示す。

ｂ）アミノ酸配列１〜１３６に続けてシステインヲ有す
るｒ−インターフェロンアナログヌクレオチド ５’　ＧＯＴ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　Ｃｊ
（ＪＴ　ＡＡＡ３’　Ａ　ＯＧＴ　ＯＧＡ　ＴＴＴ　Ｔ
ＧＡ　ＯＯＡ　ＴＴＴ　ＧＯＡ　ＴＴＴｓｔ　Ｉ Ｏｙｅ ５’　ＯＧＴ　Ｔｏｏ　ＯＡＧ　ＴＧＣ！　ＴＡＡ　Ｔ
ＡＧ３’　ＧＯＡ　ＡＧＧ　ＧＴＯＡＯＧ　ＡＴＴ　Ａ
ＴＯＡＧＯＴａｔ１ を実施例１および２と同様にして台底する。断片ＩＦＮ
−１［を制限酵素Ｐｓｔ　ｌを用いて切断しそして大き
い方の断片を分離する。これを前述のヌクレオチドと連
結し、そして前記と同様の手順を続ける。アミノ酸１〜
１５６およびカルボキシ末端にシスティンを富む改変ｒ
−インターフェロンが４られる。このｒ−インターフェ
ロンアナログは内部的に安定化しておシ、また後処理の
際に天然ｒ−インターフェロンよシもよシ容易にクロマ
トグラフィによシ操作されうる。

ＤＮＡ配列　１　ここに示されるように、アミノ末鴻に
ｇｃｏＲＩＫ対する特徴的な配列および「トリプシンｔ
Ｊ６ＤＪを有し、またカルボキシ末端に２個の停止トリ
プレットおよび５ａｔＩに対する特徴的な配列を有する
。

トリプレットＡ　０　１２３４５ アミノ酸　Ｍｅｔ　Ｏｙｅ　Ｔｙｒ　Ｏｙｓ　Ｇｔｎ　
Ａｓｐヌクレオチｖｓ　１　１０　２０ １！１号鎖　５’　ＡＡ　ＴＴＯＡＴＧ　ＴＧＯＴＡＯ
Ｔ（）ＯＯＡＧ　ＧＡＯ非暗号鎖　３　’　Ｇ　ＴＡＯ
ＡＯＧ　ＡＴＧ　ＡＯＧ　ＧＴＯ０ＴＧ６　７　８　９
　１０　１１　１２　１３　１４　１５Ｐｒｏ　Ｔｙｒ
　ＶａｔＬｙｅ　Ｇｔｕ　Ａム　Ｇｂｘ　Ａｓｎ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｙｓ３０　４０　５０ ｑＯＧ　ＴＡＯＧＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＯＴ　ＧＡ
Ａ　ＡＡＯＯＴＧ　ＡＡＡＧＧＯＡＴＧ　ＯＡＡ　ＴＴ
Ｔ　ＯＴＴ　ＯＧＡ　ＯＴＴ　ＴＴＧ　ＧＡＯＴＴＴ１
６　１７　１８　１９　２０　２１　２２　２３　２４
・　２５Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｔａ　Ｇ
ｔｙ　Ｈｌｓ　１３ｅｒ　Ａｓｐ　ＶａＬ６０　７０　
８０ ’　ＡＡＡ　ＴＡＣＴＴＯＡＡＯＧＯＴ　ＧＧＴ　ＯＡ
Ｔ　ＴＯＴ　ＧＡＯＧＴＴＴＴＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　Ｔ
ＴＧ　ＯＧＡ　ＱＣ！Ａ　ＧＴＡ　ＡＧＡ　ＯＴＧ　０
ＡＡ２６　２７　２８　２９　３０　３１　３２　３３
　３４　３５Ａｔａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｔｙ　Ｔｈｒ
　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｓｕ　Ｇｔｙ　工１ｅ９０　１０
０　１１０ ＧＯＴ　ＧＡＯＡＡＴ　ＧＧＴ　ＡＯＴ　ＯＴＧ　ＴＴ
ＯＯＴＧ　ＧＧＧ　ＡＴＯＯＧＡ　ＯＴＧ　ＴＴＡ　Ｏ
ＯＡ　ＴＧＡ　ＧＡＯＡＡＧ　ＧＡＯ０００ＴＡＧ３６
　３７　３８　５９　４０　４１　４２　４３　４４　
４５Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａａｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｔｕ
　Ｇｔｕ　８ｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ１２０　１３０　１
４０ ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＯＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡ
Ａ　ＴＯＴ　ＧＡＯ０ＧＴＧＡＯＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＯ
Ｃ！　ＴＴＴ　ＯＴＴ　ＯＴＴ　ＡＧＡ　ＯＴＧ　ＧＣ
Ａ・　４６　４７　４８　４９　５０　５１　５２　５
３　５４　５５Ｌｙｓ　工ｔｏ　Ｍｅｔ　Ｇｔｎ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｔｎ　工１ｅ　Ｍａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ１５０　
１６０　１７０ ＡＡＡ　ＡＴＯＡＴＧ　ＯＡＡ　ＴＯＴ　ＯＡＧ　ＡＴ
ＯＧＴＴ　ＴＣＴ　ＴＴＯＴＴＴ　ＴＡＧ　ＴＡＯＧＴ
Ｔ　ＡＧＡ　ＧＴＯＴＡＧ　ＯＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＧ５
６　５７　５８　５９　６０　６１　６２　６３　６４
　６５Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙ
ｓ　Ａｌ３ｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ１８０　１９０
　２００ ＴＡＯＴＴＯＡＡＡ　ＯＴＧ　ＴＴＯＡＡＡ　ＡＡＯＴ
ＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＯＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＧＡＯ
ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＣＴＧ６６
　６７　６８　６９　７０　７１　７２　７３　７４　
７５Ａｓｐ　ＧＬｎ　Ｂａｒ　工ｔｅ　Ｇｔｎ　Ｌｙｓ
　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｇｔｕ　Ｔｈｒ２１０　２２０　２
５０ ＧＡＯＯＡＧ　ＴＯＴ　ＡＴＯＯＡＧ　ＡＡＡ　ＴＯＴ
　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴＯＴＧ　ＧＴＯＡＧＡ　ＴＡ
Ｇ　ＧＴＯＴＴＴ　ＡＧＡ　ＯＡＡ　ＯＴＴ　ＴＧＡ７
６　７７　７８　７９　８０　８１　８２　８３　８４
　８５工ｔｅ　Ｌｙｅ　Ｇｔｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓ
ｎ　ＶａｔＬｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ２４０　２５０　２
６０ ＡＴＯＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＣ！　ＡＴＧ　ＡＡＯＧＴ
Ｔ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＴＴＯＴＡＧ　ＴＴＯＯＴＴ　Ｏ
ＴＧ　ＴＡＣＴＴＧ　ＯＡＡ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ
８６　８７　８８　８９　９０　９１　９２　９３　９
４　９５Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＩＪ７５１
　Ｌｙｔｌ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ２７０　
２８０　２９０ ＡＡＯＴＯＴ　ＡＡＯＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＯＧＴ
　ＧＡＯＧＡＣＴＴＯＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＴＴＴ
　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＧＯＡ　ＯＴＧ　ＯＴＧ　ＡＡＧ９
６　９７　９８　９９　１００　１０１　１０２　１０
３　１０４　１０５Ｇｔｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ３０
０　３１０　３２０ ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＯＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＯＴＡＯＴＯＴ
　ＧＴＴ　ＡＯＴ　ＧＡＴＯＴＴ　ＴＴＯＧＡＡ　ＴＧ
Ａ　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＯＡＡ　ＴＧＡ　０ＴＡ
１０６　１０７　１０８　１０９　１１０　１１１　１
１２　１１３　１１４　１１５Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｔ
Ｇｔｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａ、４ａ　工Ｌｅ　Ｈｌｓ　
Ｇｔｕ３３０　５４０　３５０ ＴＴＡ　ＡＡＯＧＴＴ　ＯＡＡ　ＯＧＴ　ＡＡＡ　ＧＯ
Ｔ　ＡＴＯＣ！ＡＯＧＡＧＡＡＴ　ＴＴＧ　ＯＡＡ　Ｇ
ＴＴ　ＧＯＡ　ＴＴＴ　ＯＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＧ　０Ｔ
Ｃ１１６１１７１１８１１９１２０１２１１２２１２６
１２４１２５Ｌｓｕ　Ｉｔｅ　Ｇｔｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ
　Ａｈａ　Ｇｔｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

３６０　３７０　３８０ ０ＴＯＡＴＯＯＡＧ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＯＴ　ＧＡＡ
　ＯＴＧ　ＴＯＴ　０ＯＴＧＡＧ　ＴＡＧ　ＧＴＯＯＡ
Ａ　ＴＡＯＯＧＡ　ＯＴＴ　ＧＡＯＡＧＡ　ＧＧＡ１２
６　１２７　１２８　１２９　１３０　１３１　１３２
　１３３　１３４　１３５Ａｔａ　Ａｔａ　Ｌｙｅ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｔｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　５ｅ
ｒ３９０　４００　４１０ ＧＯＡ　ＧＯＴ　ＡＡＡ　ＡＯＴ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　Ｏ
ＧＴ　ＡＡＡ　ＯＧＴ　Ｔｏ。

ＯＧＴ　ＯＧＡ　ＴＴＴ　ＴＧＡ　ＯＯＡ　ＴＴＴ　Ｇ
ＯＡ　ＴＴＴ　ＧＯＡ　ＡＧＧ１３６　１３７　１３８
　１３９　１４０　１４１　１４２　１４３　１４４　
１４５Ｇｔｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇ９
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｔａ　５ｅｒ４２０　４３０　４
４０ ０ＡＧ　ＡＴＧ　ＯＴＧ　ＴＴＯＯＧＯＧＧＴ　ＯＧＴ
　ＯＧＴ　ＧＯＴ　ＴＯＴＧＴＯＴＡＯＧＡＯＡＡＧ　
ＧＯＧ　ＯＯＡ　ＧＯＡ　ＧＯＡ　ＯＧＡ　ＡＧＡ４６ Ｇｔｎ ５０ ０ＡＧ　ＴＡＡ　ＴＡＧ　５’ ＧＴＯＡＴＴ　ＡＴＯＡＧＯＴ　５’ ＤＮＡ配列ＩＡ：ことに示されるように、アミノ末端に
ｊ！ｔｃｏ　Ｒ１に対し特徴的な配列および「トリプレ
ットＡＯＪを令しまたカルボキシ末端に２個の停止トリ
ブレットおよびＳｍａ　ｌに対し特徴的な配列を有する
。

Ｍｅｔ（アミノｌ！１１！　１−１２７）　８ｔｐ　Ｓ
ｔｐ５ ５’　ＡＡ　ＴＴＯＡＴＧ（ヌクレオチド９−３８９）
　ＴＡＧ　ＴＡＡ　０００３’Ｇ　ＴＡＯ（相補ヌクレ
オチド）　ＡＴＯＡＴＴ　ＧＧＧＤＮＡ配列ＩＢ：こと
に示さｎるように、アミン末端にＥｃｏ　Ｒ１に対し特
徴的な配列および「トリプレットＩ６０」を有しまたカ
ルボキシ末瑞忙２個の停止トリブレットおよび５ａｔｌ
に対し特徴的な配列を有する。

Ｍｅｔ（アミノ酸５−１４６）　８ｔｐ　５ｔｐ５’　
ＡＡ　ＴＴＯＡＴＧ（ヌクレオチド２ｌ−４４６）　Ｔ
ＡＡ　ＴＡＧ　３’Ｇ　ＴＡＯＡＴＴ　ＡＴＣ！　ＡＧ
ＯＴ５’ＤＮＡ配列ＩＯ：ここに示されるように７ミノ
末趨にｆ！ｃｏ　Ｒ１に対し特徴的な配列および「トリ
プレットＡＯＪを有しまたカルボキシ末端にＳｍａ　Ｉ
に対し特徴的な配列を有する。

Ｍｅｔ（アミノ酸５−１２７）　８ｔｐ　５ｔｐ５’　
ＡＡ　ＴＴＯＡＴＧ（ヌクレオチド２１７５８９）ＴＡ
Ｇ、ＴＡＡ　ｃａＣ３！Ｇ　ＴＡＯＡＴＯＡＴＴ　ＧＧ
Ｇ ＤＮＡ配列… 工ＦＮ−１： Ｂｔｕｎ　Ｈ３

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＢＲ５２２中に遺伝子断片工Ｆ’Ｎ−１を含
有するハイブリッドプラスミド、 第２図はｐｔｒｏ　ａ中に遺伝子断片工ＦＮ−１を含有
するハイブリッドプラスミド。 第３図はｐＵｏ　ａ中に遺伝子断片工ＦＮ−［１を含有
するハイブリッドプラスミド、 第４図はｐＵｏ　８中にＤＮＡ配列Ｉを含有するハイブ
リッドプラスミド、 第５図はｐＵｏ　８中にＤＮＡ配列ＩＢＹ含Ｍするハイ
ブリッドプラスミド、 第６図はｐＵｏ　Ｂ中にＤＮＡ配列ｌＡを含有するハイ
ブリッドプラスミド、 第７図はｐＵｏ　８中にＤＮＡ配列１ａを含有する）１
イブリツドプラスミド、 第８図はｐＭＸ　２中に遺伝子断片ＩＡ″を首府するハ
イブリッドプラスミド、 第９図）；ｉ　ｐＭＸ　Ｚ中に遺伝子断片ＩＢを含有す
るハイブリッドプラスミド、 耐１０図はｐＭＸ　Ｒ中に遺伝子断片ＩＣ＊を含有する
ハイブリッドプラスミドな示す。 特許出願人　ヘキスト・アクチェンゲセルシャフト外２
名 第１図　第２図 第３図　第４図 第５図 第６図　第７図 第８図　第９図 第１０図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アミノ酸配列５〜１２７．１〜１２７および５〜１
   ４６よシなるヒトｒ−インターフェロン（工ＰＩ−ｙ）
   の部分配列。 ２）　ｒ−インターフェロン活性を有し、そして天然ア
   ミノ酸配列がアミノ酸の交換、導入または脱離によシ改
   変されている特許請求の範囲第１ＪＪ配ｇのヒトｒ−イ
   ンターフェロンの類似体。 ５）式 ％式％ （式中Ｘ％ｙおよび２は相互に独立的に０ま、たは１を
   表わすが、ＸがＭｅｔ　−Ｇｙｅ　−Ｔｙｒ　−０ｙｓ
   　４１１１であるときはｙと２は同時には１ではなく１
   またＰｒ％Ｘ％ＲおよびＹは次のアミノ酸またはアミノ
   酸配列をコード、すなわち、 Ｐｒは宿主生物または試験管内で脱離されるポリペプチ
   ドを、 ＸはＭｅｔ　、　Ｍｅｔ−Ｏｙｅ−Ｔｙｒ−Ｏｙｓ−Ｇ
   ｔｎまたはＨ−０ｙａ−Ｔｙｒ−Ｏｙｅ−Ｇｌｎを、Ｒ
   はアミノ酸５〜１２７またはこのアξ）酸配列の改変形
   を、 ＹはアミノｒＩＲ１２８〜１４６またはこのアミノ酸配
   列の改変形をコードし、そして ２は１個または２個の停止コドンを表わｆ）で表わされ
   るＤＮＡを有する合成遺伝子の宿生生物中での発現を鍔
   起することよ）なるｔ特許請求の範囲第１項または第２
   項記載の配列の遺伝子工学的製造方法。 ４）　Ｚが２個のコドンを表わす特許請求の範囲第５項
   記載の方法。 ５）宿主生物が大腸菌である特許請求の範Ｂ第３項また
   は第４項記載の方法。 ６）式 〔式中（工ｙｍ−ｒ１−１２７）Ｊｄ工ＦＭ−ｊのアミ
   ノ酸１−１２７またはこのアミノ酸配列の改変形に対す
   るコドンを表わす〕 で表わされるＤＮＡ配列。 ７）弐Ｂ ５’　ＡＡ　ＴＴＯＡ’ｌｔにヌクレオチド２ｌ−４４
   ６）ＴＡＡ　ＴＡＧ　３’（日 ３　’　Ｇ　ＴＡＯＡＴＴ　ＡＴＯＡＧＯＴ５　’〔式
   中（工ｙＨ−ｒ５−１４６）はＩＩＦＮ−ｒ０７ミ／酸
   ５−１４６またはこのアきノ酸配列の改変形に対するコ
   ドンな表わす〕 で表わされるＤＮＡ配列。 ８）式０ ％式％ 〔式中（工ｐｘ−ｒ５−１２７）は工ＦＮ−ｊのアミノ
   酸５−１２７またはこのアミノ酸配列の改変形に対する
   コドンを表わす〕 で表わされるＤＮＡ配列。 ９）　ＤＮＡ配列ＩＡ　、　■Ｂおよび■０゜１０）　
   Ｋｃｏ　Ｒ１制限部位とＳｍａ　ｌ制限部位との間に特
   許請求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列を含有するハイブ
   リッドプラスミド。 １１）　Ｉｃｏ’Ｒ１制限部位と８ａｌｌ制限部位１と
   の間に特許請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列を含有す
   るハイブリッドプラスミド。 １２）　Ｅａｏ　Ｒ１制限部位とＳｍａ　ｌ制限部位と
   の間に特許請求の範囲第８項記載のＤＮＡ配列を含有す
   るハイブリッドプラスミド。 １３）　Ｂａｏ　ｆｉｌ制眼部位とインターフェロン配
   列の第１アミノ酸に対するコドンとの間にプレ配列を含
   有する特許請求の範囲第９墳〜第１２項のいずれかに記
   載のハイブリッドプラスミド。 １４）特許請求の範囲第９項記載のＤＮＡ配列を含有す
   るハイブリッドプラスミド。 １５）％許請求の範囲第１０項〜第１４項のいずれかに
   記載のハイブリッドプラスミドを含有する宿主生物。 １６）　％許請求の範囲第１０１１−１１４項のいずれ
   かに記載のハイブリッドプラスミドを含有する大腸菌。 １７）特許請求の範囲第１項または第２項記戦のポリペ
   プチドを含有する医薬。