JPH07102130B2 - 人工マトリックスを用いる制御された細胞移植による器官のキメラ新生形態形成 - Google Patents

人工マトリックスを用いる制御された細胞移植による器官のキメラ新生形態形成

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JPH07102130B2
JPH07102130B2 JP63500950A JP50095087A JPH07102130B2 JP H07102130 B2 JPH07102130 B2 JP H07102130B2 JP 63500950 A JP63500950 A JP 63500950A JP 50095087 A JP50095087 A JP 50095087A JP H07102130 B2 JPH07102130 B2 JP H07102130B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 これはJoseph P.Vacanti およびRobert S.Langerにより
1986年11月20日に出願された“人工マトリックスを用い
た器官のキメラ新生形態形成”という表題の米国特許出
願第993,018号の一部継続出願である。
米国政府は,NIH承認番号第6M 26698号の効力により本発
明の権利を持つ。
本発明は一般に医学および細胞培養の分野，特に生体適
合性の人工マトリックスで造られた移植可能な器官の分
野に関する。
器官の機能の損失は，先天性の欠損，損害あるいは病気
から起こりうる。
器官の機能の損失をもたらす病気の一例として，糖尿病
がある。真性糖尿病は，インシュリンを産生する膵臓の
ベータ細胞を破壊する。その結果として，糖代謝を要求
する細胞にグルコースが入ることができないため，血清
中のグルコースレベルが高値にまで上昇する。複雑な一
連の事象を経て起こる血管の変化に次いで全ての器官で
多くの問題が進行する。現在の治療方法は，外部からイ
ンシュリンを投与することを包含し，この治療方法は不
完全な血糖レベルの制御を結果する。糖尿病の合併症を
防止する成功の度合は，議論の余地を残している。
器官全体または器官の一部のいずれかとして膵臓組織を
糖尿患者へ移植することは，最近はまだ実験的アプロー
チである。この技術を用いたより生理的な方法におい
て，血清中のグルコースは制御されているらしく，それ
らによって合併症の進行は遅延される。長期間効力を発
揮することに成功しなかった以前の方法は，膵島細胞の
単離したクラスターを，肝臓の血管床への移植とともに
門脈循環系内に注入することにより膵島細胞を移植する
ことであった。より最近の実験方法は，宿主による免疫
的攻撃を防ぐために膵ベータ細胞のカプセル化，および
胎児へのベータ細胞を腎臓の被膜下に注入することを包
含する。短期間の機能の証拠はあるが，長期間の結果は
ほとんど満足のいくものではない（D.E.R.Sutherland,D
iabetologia 20,161−185（1981）;D.E.R.Sutherland,D
iabetologia 20,435−500（1981））。現在，膵臓器官
全体の移植が好適な治療法である。
その他，肝臓の重大な障害を引き起こす多くの病気があ
り，最終的には肝不全をもたらす。肝不全のための人工
的な支持システムがないので，移植が成功しない場合に
は，肝不全は常に患者の死を結果する。米国では毎年3
0,000人の人々が肝不全で死亡し，社会にかかる費用は
毎年140億ドルである。
“先天性の代謝異常”と呼ばれる多くの病気がある。こ
れらの病気は，タンパクの代謝の欠陥，アミノ酸代謝の
欠陥，ピリジンおよびプリン代謝の欠陥，脂質代謝の欠
陥および無機質代謝の欠陥を結果する遺伝子欠陥を包含
する。これらの病気の多くは，肝臓それ自体の欠陥に基
づく。これらの患者の多くは，診断される時点では，構
造的に正常な肝臓，または適度に正常な肝臓を持つ。事
実，これらの病気の多くは本来の肝臓に損傷を与えず，
むしろ傷害は中枢神経系のような他の組織でおこる。肝
臓移植のための通常の指標としては，急性激症肝不全，
活動性慢性肝炎，胆道閉鎖，特発性肝硬変，原発性胆汁
性肝硬変，硬化性胆道炎，先天性代謝異常，いくつかの
悪性の病気，およびその他のまれな指標がある。これら
の患者を処置するための唯一の方法は，肝臓が移植可能
となるまで患者を維持することである。肝臓全体の移植
は1980年代を通じて，だんだんと外科手術が成功するよ
うになり，これは主にThomas Starzl博士の努力によ
る。しかしながら，手術の技術的な複雑さ，多量の出
血，急性発作症状を伴う術後の経過，および肝臓移植の
多くの未知のことが，この手術を主要な医療センターで
のみ可能な費用のかかる技術としている。提供者の不足
のため，移植は，移植を必要とする患者の要求を決して
満たすものでないことがだんだんと明らかになってきて
いる。現在,1年間に約600人の患者が肝臓移植を受けて
いる。受け入れ人数がたとえ３倍になったとしても，末
期的な肝臓疾患で死亡していく30,000人の患者には不足
している。現在，移植を待つ患者を維持するための良い
人工肝臓はない。
肝臓病にかかっている別の患者のグループは，アルコー
ルにより引き起こされた肝臓病を持つ。現在，アルコー
ルを飲用したことによる末期肝臓病の患者には移植の方
法がない。これには，提供される器官の不足および複雑
な看護の受け入れ体制がないといういくつかの理由があ
る。米国だけにおいても，この患者人口は非常に大き
い。例えば,1973年のバルチモア地域では，全てのアル
コール性肝臓病の発生率を20歳以上の人口100,000人あ
たりに換算すると次のとおりであった：白人男性36.3
人，白人女性19.8人，白人でない男性60.0人，および白
人でない女性25.4人。肝硬変の疾病率は，工場勤労者の
調査では，アルコールを飲まない人よりも，深刻な問題
のあるアルコール飲用者の方が28倍高いことが報告され
ている。アルコール消費量と肝硬変の発生率の間には，
直接の相関関係がある。肝硬変による死亡率は国によっ
て大きな変動がある。変動の範囲は，フィンランドの10
0,000人あたり7.5人からフランスの100,000人あたり57.
2人までである。米国では，この傾向は，アルコール性
肝硬変の発生率および死亡率の増加によって警告されて
いる。1950〜1974年の間に，米国での肝硬変による死亡
者は，心臓血管の疾病による死亡者数が２％減少したの
に対して71.7％増加した。この時点では，これらの患者
は全く選択の権利を持たなかった。
失われた機能の置き換えまたは回復のための適切な方法
がない，多くのその他のの生体器官系が存在する。例え
ば，過去においては，腸の大半を失うことは致死的条件
であった。今日では，患者は静脈を介して栄養物補給を
完全に支持できるが，この技術に関連した多くの合併症
のために，該技術は“不十分な技術”と考えられてい
る。１つの問題は，完全非経口的栄養に頼る多くの患者
は，時間の経過とともに取り消しのできない肝臓病およ
び肝臓病による死に進行していくということである。他
の患者では，複数回の除去および交換を必要とする重大
な血流感染症へと発展する。結局，患者は利用可能な全
ての静脈がなくなり，栄養失調に倒れるか，または感染
により死亡する。
腸の移植は，被移植者に移植された腸に存在する多数の
リンパ球による大きな生物学的問題のために，現在まで
成功していない。これらは，“移植片対宿主”病と呼ば
れる免疫反応をおこす。この免疫反応において，移植さ
れた腸由来のリンパ球は患者は攻撃し，ついには患者を
死亡させる。
心臓および筋肉の疾病もまた，この国の罹病率および死
亡率の主な原因である。心筋が損傷を受けた心臓への心
臓移植は，次第に成功するように技術となってきてい
る。しかし，肝臓移植の場合のように，提供者および強
力な免疫抑制剤の使用が必要である。
器官移植および免疫生物学的科学の出現は，腎臓，心
臓，肝臓および他の器官の交換を可能にしている。しか
し，これらの複雑な手術を行う能力が向上するにつれ，
技術の限界がより明らかとなってきている。例えば，小
児の肝臓移植において，よりプログラムが明らかにされ
るにつれて，提供者の不足が増えてきている。米国で
は，肝不全の小児800〜1,000人／年に対して少数の提供
者しかいない。そして，移植をうけるこれらの子供たち
は，移植される肝臓が見つかった時点ではしばしばかな
り病気が重くなっているので，成功の可能性が少なくな
っている。手術は複雑であり，通常多量の出血を伴う。
保存時間は短いので，被移植者と遠く離れている提供者
とが一致するような多くの実施上の問題を結果する。こ
れらの理由から，この仕事は高価で集中的な仕事であ
り，第三次医療施設でのみ得られるような多くの資力の
投資を必要とする。
失われた機能を取り戻すために必要な実質成分だけを選
択的に細胞移植することが，全体または一部の器官を移
植する方法の代わりとして提唱されている（P.S.Russel
l,Ann.Surg.201（３）,255−262（1985）。この方法
は，出血をともなう大手術，麻酔の困難さ，および合併
症を回避することを包含するいくつかの魅力ある特徴を
持つ。この方法は，必要とされる機能を与える細胞のみ
を置き換えるので，導入される白血球，細胞に存在する
抗原，および拒絶反応を促進しうる細胞の型に関する問
題が避けられる。細胞培養技術を加えると，移植の方法
において助けとなる別の一連の手段が提供される。培養
で細胞を増殖させて細胞数を増やす能力は，理論的に
は，自分自身の組織の自己移植を可能にする。例えば，
肝機能を支持するための門脈循環系への肝細胞の注入が
試みられている。腹膜腔に注入する前に肝細胞をコラー
ゲンで被覆した微小担体ビーズに結合させるという最近
の新しい方法は，移植，移植された肝細胞を生存および
機能させることに成功したと報告されている。これは,
A.A.Demetriouら，Science 233,1190−1192（1986）に
記載されている。
筋肉あるいは神経組織のように機能する，その他のタイ
プの器官または組織の損失もまた，身体傷害および社会
的悲劇へと導き得る。筋肉および神経移植の方法が最近
の50年間を通して外科医たちにより開発されており，こ
の方法は着想が独創的である。神経機能を回復させるた
めの技術の一例として，神経中枢から死んだ神経繊維を
神経機能が失われた場所へ張る，という例がある。他の
多くの神経系の疾病は，適切な医療法が発見されていな
い。最近，神経細胞移植は，パーキンソン病およびアル
ツハイマー病のような神経系の成人病における治療方法
として提唱されている。副腎組織の自己移植，または脳
の中への胎児細胞懸濁液の注入が効果的であると考えら
れている。血管の損失，変形または閉鎖は，しばしば高
血圧または動脈瘤のような病気の原因となる。過去にお
いて，外科医らは最初にこの問題を，体の別の場所から
とった血管を損傷を受けた部位に移植することによっ
て，または永久的な置き換えとして布性の代用品を移植
することによって処理した。数回の手術を必要とするこ
とおよびそれに伴う患者の苦痛を包含する短所がある。
これらの技術には，肝臓または腸のような器官の移植に
関連する多くの問題点はないが，まだその結果はしばし
ば不完全である。
多くの方法において肝臓および腸のような器官とは異な
るが，皮膚もまた病気または傷害により損傷を受ける器
官材料であり，体液の損失および疾病から体を保護する
重要な役割を果たす。移植皮膚は動物の皮膚または患者
の皮膚から調製されているが，最近では培養された表皮
細胞によってつくられる“人口皮膚”が利用されてい
る。
人口皮膚をつくるための１つの方法は，表皮細胞と一緒
に繊維状の格子をシードすることによる。例えば,Bell
に与えられた米国特許第4,485,097号は，血小板および
繊維芽細胞のような収縮作用因子ならびにケラチノサイ
トのような細胞を組み合わせた場合に，コラーゲン水和
物の格子は，皮膚と類似した物質の生産に使われるとい
うことを開示している。Yannasらに与えられた米国特許
第4,060,081号は，合成皮膚として有用な多重層膜を開
示している。この合成皮膚は，コラーゲンおよびムコ多
糖の架橋組成物のように，体液および酵素の存在下でも
分解されない不溶性非免疫原物質からつくられており，
膜全体の水分の流れを制御するための合成ポリマーのよ
うな非毒性物質で被覆されている。Yannasらに与えられ
た米国特許第4,458,678号は，皮膚類似物質の製造工程
を開示している。この過程では，グリコサミノグリカン
で架橋されたコラーゲンからつくられる繊維状の格子が
表皮細胞といっしょにシードされている。最初の２つの
方法の短所は，マトリックスが“永久的な”合成ポリマ
ーでつくられているということである。'678特許は，皮
膚のような器官をつくる適当な細胞を用いたどのような
形状でもとれる生物分解性のマトリックス，という上述
の２つの特許にはない特徴を有する。あいにく，それら
は主にコラーゲンに基づいているので，後者のマトリッ
クスの組成および形状の制御を欠いている。さらに，コ
ラーゲンは酵素作用および時間の経過に伴う加水分解に
より分解されるので，該分解は非常に変動的である。さ
らに，マトリックスが患者に移植され，マトリックスの
全部の層を通って毛細血管が血管網状組織を形成した時
にのみ，マトリックスは完全に細胞に浸透し，水分制御
ポリマーの不在下で機能する。拡散の機能としてのこれ
らのマトリックスの限界は,YannasおよびBurkeのJ.Biom
ed.Mater.Res.,65−81（1980）,p.73の論文で考察され
ている。
上記の著者らは，マトリックスの孔径および厚みが生存
率と移植の成功を決める制御因子であると認識してい
た。しかし，その問題を無視して，移植の際にマトリッ
クスの内部部分に十分に栄養物が供給されないことを処
理する彼ら独自の方法は，マトリックス中に表皮細胞が
移るにつれて十分に毛細血管が伸長するのに移植片が十
分薄くて十分に浸透性であるものを望むか，またはマト
リックス内に十分な毛細血管伸長がおこってからさらに
表皮細胞を移植するかのどちらかであった。
皮膚は体の“器官”であると考えられる。しかし，人工
皮膚を製造するためのこれらの方法は，肝臓または膵臓
のような他のタイプの器官をつくるためには使用されて
いない。これは開示されたまたは同様の技術が上記器官
をつくるのに利用され得る，というこの特許における意
見を全て包含するにもかかわらずである。これらの方法
が肝臓または膵臓のような大きくて全体が三次構造をも
つ器官の構築に用いられた場合には，器官の中心部の細
胞は時間の経過とともに死滅する傾向があり，初期の増
殖速度は維持されないと仮定される。このことは，細胞
密度および厚みが増加するにつれ，成長する三次元構造
の中への栄養物質の拡散が減少して内部が壊死するよう
な，非常に大きな腫瘍で起こる状態と類似している。実
際,YannasおよびBurkeの見解では，マトリックスが皮膚
移植片と同じくらい薄いものであってもマトリックス内
での増殖は，比較的低い細胞密度でも血管新生がおこる
までは問題があるように思われる。
それゆえ，本発明の目的は，皮膚，肝臓，腎臓，血管，
神経，および筋肉を包含する，天然の器官に機能的に似
た種々の器官をつくるための方法および手段を開示する
ことにある。
本発明の他の目的は，細胞増殖および移植のための一時
的な足場として，人工マトリックスを設計，構築および
利用する方法ならびに手段を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は，その後直ちに移植を行う移
植器官の構造支持体として，インビトロおよびインビボ
での両方で細胞増殖に利用され得る，生物分解性，非毒
性のマトリックスを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は，細胞増殖のための支持体を
提供するだけでなく，血管新生および移植後の増殖細胞
集団の分化を高めるような生物分解性人工マトリックス
の形成および構築のための方法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は，細胞の行動ならびに他の細
胞，細胞物質および分子シグナルとの相互作用がインビ
トロで研究できるような，異なった構造のマトリックス
を提供することにある。
発明の要約 本発明は，機能的器官類似物を製造する方法および手段
に関する。この方法および手段により，所望の機能を持
つ細胞が細胞培養技術を用いてポリマーの足場で増殖さ
れ，次いで付着および平衡化のあとで付着，増殖および
機能するようにポリマー−細胞の足場が患者の適当な部
位に移植される。成功は，移植された細胞の周囲の環境
への付着および血管形成促進能力に依存する。栄養物質
および増殖因子は，付着，生存，または増殖させるのに
必要なだけ細胞の培養の間に供給される。
構造物を移植し，増殖および血管形成が行われた後に生
じる類器官は，与えられた組織の実質成分ならびに血管
およびマトリックス成分から形成されたキメラである。
最初の細胞培養に用いられるポリマーの足場は，時間と
共に分解する物質から構築される。それゆえ，このポリ
マーは，キメラの器官には存在しない。移植に続く，内
部への血管の成長は，移植された細胞の可溶性生成物を
制御する通常のフィードバック機構を与える。
マトリックスまたは支持構造体の形成に好適な物質は，
例えば，ポリグリコール酸，ポリオルトエステル，また
はポリアンヒドリドのような生物分解性の人工的ポリマ
ーである。このポリマーは，制御された速度で加水分解
により分解され，再吸収される。これらの物質は，分解
能力，扱いやすさ，大きさ，および形態を最大に制御す
る。いくつかの実施態様においてこれらの物質は，細胞
付着を促進するゼラチン，またはアガロースのような第
２の物質で重層される。ポリマーマトリックスは，付着
に適当な部位，ならびにマトリックスが移植され血管形
成が起こるまでの細胞の生残および増殖を維持するため
の細胞培養物からの栄養物質の適当な拡散の両方を与え
るような構造でなければならない。本発明に好適な器官
構築のための構造は，広い表面積を持つポリマー繊維で
形成される分枝した繊維の樹状構造である。この好適な
構造は，栄養物質，老廃物，およびガスの比較的狭い濃
度勾配を結果するので，細胞の一様な成長および増殖を
与える。最大の細胞付着の理論上の計算は，直径30ミク
ロン，長さ１センチメートルの繊維は125,000,000個の
細胞を支持でき，しかも全ての細胞への栄養物質の出入
りを提供することを示唆している。生物分解性物質の他
の利点は，マトリックスの分解の間のゆっくりした放出
により，マトリックスに化合物が取り込まれ得るという
ことである。例えば，栄養物，増殖因子，分化または脱
分化の促進剤，分泌産生物，免疫調節剤，炎症抑制剤，
退化因子，リンパ腺管網状組織または神経繊維の内部成
長を促進または可能にする生物学的に活性のある化合
物，および薬剤は，溶液で，または第２の生物分解性ポ
リマーマトリックスに取り込まれた形でマトリックス中
に取り込まれ得るか，またはマトリックスと共に供給さ
れ得る。
１つまたはそれ以上の型の細胞を，マトリックスで選択
および増殖させることができる。細胞をインビトロで培
養する際のマトリックスの構造，時間の長さおよび条件
は，細胞の付着（生細胞のみがポリマーに付着して残
る），増殖の程度，および移植の成功のパーセントを測
定することにより，細胞の各型にそれぞれ基づいて決定
される。移植に適切な細胞の例は，肝細胞および胆管細
胞，膵臓の島細胞，上皮小体細胞，甲状腺細胞ホルモン
を産生する生殖腺細胞を包含する副腎−視床下部−脳下
垂体系の細胞，上皮細胞，神経細胞，心筋細胞，血管細
胞，リンパ管細胞，腎臓細胞，および腸管細胞，骨およ
び軟骨形成細胞，平滑筋および骨格筋細胞を包含する。
培養における細胞の最初の増殖は，その後のマトリック
ス細胞構造物の移植に有益であり得る細胞の操作を可能
にする。現在利用できる技術は，肝臓タンパクの欠乏病
および膵嚢胞性繊維症のような代謝的欠損症から結果さ
れるようなタンパクをつくらせるため（さもなければこ
のタンパクは欠乏している）に，細胞内へ遺伝子を導入
することが可能である。遺伝子発現の抑制も，細胞表面
上での抗原発現の修飾およびそれによる免疫応答の修飾
に用いられ，それによって細胞は外来のものと認識され
ない。
本発明は，インビトロでの研究の技術およびマトリック
スも提供する。細胞培養の現在の方法は，細胞の構造お
よび機能の基本的見地に価値のある洞察を提供するが,3
次元で制御しうる系が欠けているので細胞の性質，伝
達，制御，および形態形成の研究は，困難である。付着
した細胞で覆われている人工マトリックスは，コラーゲ
ン，マトリゲルTm（MatrigelTm）のような基底膜複合
体，または他の物質のような細胞外マトリックスに埋め
込まれ得る。次いで，細胞型，増殖のための生化学的信
号，分化，移動，および細胞外マトリックス成分の多く
の組合せが,3次元系においてインビトロで試験され得
る。これらすべての要素を制御し，性質を観察すること
により，生体医学の科学分野は，天然の構造により似せ
た設定における細胞の作用への新しい洞察を得るであろ
う。
図面の簡単な説明 第１図は，キメラ器官（この図においては肝臓，膵臓，
または腸である）を生産するための本発明工程の模式図
である： （１）適当な実施細胞を採取し，分散させ，そして付着
および増殖が起こる細胞培養物中のポリマーマトリック
スにシードし，そして（２）肝を部分切除して移植片の
増殖を促進し，次いで血管新形成，細胞増殖，およびポ
リマーマトリックスの再吸収が起こる被移植動物にポリ
マー−細胞の足場を移植する。
第２図は，生物分解性の細胞マトリックスに用いられて
いるポリマーの化学構造であり：（ａ）ポリグラクチ
ン；（ｂ）ポリオルトエステル；および（ｃ）ポリアン
ヒドリドである。
第３図は，ポリマーマトリックスからの生物学的活性因
子のゆっくりとした放出を表わす図である。
第４図は，生物分解性ポリマー，細胞およびマトリック
スを用いたインビトロでの形態形成を研究するための技
術を示す図である。
第５図は，培養４日後のポリグラクチン910の繊維に付
着した肝細胞の写真（172倍）である。細胞はヘマトキ
シリンおよびエオシンで染色した。
第６図は，ポリマー繊維上で１ヶ月間培養した胆管上皮
細胞の写真である。
第７図は，成体ラット供与体由来の肝細胞の網への移植
片の写真（172倍）である。ポリマー−細胞移植片は，
殺す前に７日間適所に置かれた。肝細胞は健康で，いく
つかの有系分裂の形態が見られた。血管は全体的に存在
している。左側に，ポリマー領域の炎症性の浸潤が観察
される。細胞はヘマトキシリンおよびエオシンで染色し
た。
第８図は，ポリマー繊維に１週間付着した肝細胞の走査
電子顕微鏡写真（121倍）である。
第９図は，第８図のポリマー繊維上の肝細胞の高倍率の
拡大図（1600倍）である。
第10図は，網の中に移植した移植10日後の腸の細胞の顕
微鏡写真（10倍）である。この図は，血管が流れ込んで
いる網の中に6mmの嚢胞状の構造が形成されているのを
示している。ポリマー繊維は嚢胞の壁に見ることができ
る。
第11図は，第10図の嚢胞の横断面の写真（172倍）であ
り，腸の上皮細胞が並んだ管腔構造を示す。これらの細
胞は方向性を示す。この管腔は細胞の破片および粘液を
含有する。管腔の左側の白い卵形の領域は，ポリマー繊
維を示す。この領域は，炎症性浸潤および新生血管に囲
まれている。平滑筋の層が管腔の右側に見られ，この嚢
胞は小腸断片から生じ得ることを示唆している。ヘマト
キシリンおよびエオシンで染色した。
第12図は，グルコースに応答していくらかのインシュリ
ンの分泌を示す。ポリマー繊維に付着した培養４週間後
の膵臓小島の写真である。
第13図は，バイオマトリックス中のウシ大動脈内皮細胞
をシードしたポリマー繊維の写真である。細胞がポリマ
ーから分枝様の方向で，マトリックスに移動しているの
を見ることができる。
第14図は，ポリマー繊維に付着した培養１ヶ月後のウシ
大動脈内皮細胞の写真である。
第15図は，ポリマー繊維がマウス胎児の繊維芽細胞で覆
われていることを示す位相差顕微鏡写真である。この繊
維芽細胞がポリマー繊維から離れ，培養皿に直線的に流
れているのを見ることができる。
第16図は，マウス胎児の繊維芽細胞で覆われたポリマー
繊維の位相差顕微鏡写真である。これら胎児の繊維芽細
胞はポリマーから離れ，培地を通って組織培養プレート
の底に付着している。
第17図は，リン酸緩衝液に浸漬したポリアンヒトリド繊
維の走査型電子顕微鏡写真（472倍）である。この写真
は，ポリマー繊維を異なった緩衝液に浸漬することより
ポリマーの表面を改変することができ，それゆえ，細胞
の付着および文化に影響を及ぼすことができることを示
している。
第18図は,1％ゼラチンで覆われたポリマー繊維の走査型
電子顕微鏡写真（493倍）であり，ポリマー繊維は，細
胞の付着を増加させるために細胞接着剤で覆われ得るこ
とを示している。
第19図は，神経細胞の増殖に用いられる生物吸収性ポリ
マー繊維の斜視図である。
第20a図は，心筋細胞にシードし，心筋に移植するポリ
マー針状構造物の設計図である。
第20b図は，第20a図に示したようなポリマー針状構造物
の拡大図である。
第21a図は，ウシ毛細血管内皮細胞と培地との間に散在
する種々の厚さのコラーゲン（0,3.0mm,5.5mm,9.0mm,お
よび12.0mm）を含有するウェル（穴）の横断面図であ
る。
第21b図は，コラーゲンの厚さ（mm）に対して，第21a図
に示すウェル内で24時間後に残存している細胞数のグラ
フである。
第22図は，第21a図および第21b図に図示された，細胞の
生存能力および増殖における拡散距離の効果を示す写真
である：（ａ）24時間後の対照のウェルの細胞であり，
細胞数は24時間で倍になる；（ｂ）5.5mmの0.32％コラ
ーゲン上に重層した細胞であり，細胞の生存力は著しく
減少し，細胞数は最初にプレートした数よりもはるかに
少ないことを示している；および（ｃ）培地および細胞
の間に位置する12mmコラーゲン水和物に重層した細胞で
あり，それらの細胞は全て球状となり死んでいることを
示している。
発明の詳細な記述 本発明は，細胞の移入および移植のための一時的な足場
として生物吸収性の人工基質を用いた，機能的器官類似
物を提供するための方法である。本発明方法の成功は，
以下の原理の統合による： 1.生物における全ての構造物は，器官から器官および構
造物から構造物へと変化する機能的な組織の一定の再
生，再成形，および置き換えを受ける平衡の動的状態に
ある。
2.分離した構造細胞は，該細胞が置かれる環境および該
細胞が受ける変化の程度に依存して構造物を再生する傾
向にある。
3.組織は，約１〜3mm3より大きな体積では移植できな
い。なぜならば，新しい血管が形成されるまで栄養物は
拡散により供給され，この距離が脈管形成が起こるまで
拡散が起こり得る最大の距離であるからである。
4.細胞の形は細胞骨格成分により決定され，マトリック
スへの付着が細胞分裂および分化機能に重要な役割を果
す。もしも分離した細胞が，細胞付着のない浮遊物とし
て成熟した組織の中に置かれるならば，該細胞は本来の
組織化なしで始めるので，付着部位を見い出し，方向性
を持ち，そして機能するのが困難な時期を有し得る。こ
のことが，組織化し，増殖して，そして機能して生存し
うる移植細胞の総数を制限している。
後者の原理が，支持マトリックスの構造におけるキーポ
イントである。組織培養で構築され，その後成功裏に移
植される器官のためには，移植後に起こる血管の内部へ
の増殖に先立って細胞の増殖および分化が起こるよう
に，マトリックスは十分な表面積をもち，栄養物に接触
されなければならない。移植後，この構造物は，栄養物
および老廃物の拡散，および細胞増殖が起こる時の連続
的な血管の内部への増殖を考慮に入れなければならな
い。
失われた器官機能を置き換えるか，または補うためのこ
の方法は，薬理学的操作または，器官全体もしくは器官
の一部の移植のいずれかに多くの利点を有する。この領
域では長足の進歩がなされてきたが，これらの努力の結
果はしばしば不十分である。移植または薬理学的操作に
おける成功は，疾病の結果を緩和し得る。しかし，これ
は通常，治療を結果しないか，または非特異的な免疫抑
制の合併症ともとの疾病を交換することになる。
本発明方法の１つの利点は，該方法はパッセンジャー白
血球および抗原提示細胞の移植なしに，必要な生物学的
機能を有する実質細胞の選択的な移植のための手段を与
えるということである。その結果，薬剤を使用すること
なく組織の拒絶の危険が大幅に減少される（特に，もし
も同じかまたは類似のHLA組織型の細胞を培養できるな
らばである）。本発明は，器官の機能喪失を治療するそ
の他の手段以上に他の利点を有する。この利点は，培養
の間に新しい遺伝子を導入して欠乏したタンパク産物を
つくらせるように細胞を操作し得るか，または細胞表面
上の抗原発現を抑えるように細胞を修飾し得るので，同
じHLA組織型の細胞が利用できない場合に免疫抑制を必
要としないことによる。例えば，インシュリンの遺伝子
を患者自身の欠陥のある島細胞に挿入し得る。他の状態
は，第VIII因子欠損症,OTC欠損症，ならびに炭水化物お
よび脂質代謝障害を治癒させる遺伝子を挿入することに
より治癒され得る。これらの遺伝子の単離，クローニン
グおよび操作のための技術は，遺伝子工学の技術分野の
当業者に利用可能である。
移植のために被移植者自身の細胞を培養することの見込
みは，より根本的な利点を有する。つまり，器官提供者
の必要性をなくする。例えば，もし患者が虚血性の損傷
のために腸の90％を失うならば，残りの10％から細胞を
採取し，培養することができる。この細胞は培養で対数
的に増える。適当な細胞数に達するまで細胞を培養し，
細胞を適当なポリマーの足場で増殖させ，血管を形成
し，増殖および機能する新しい腸として患者にもどす。
肝機能の置き換えの場合には，培養における肝細胞増殖
に対する要求を全くすることなく，細胞−マトリックス
構造を構築することが可能であり得る。この仮説は，肝
臓の小片肝細胞を高効率で得ることができるという観察
に基づく。例えば,250gmのラットでの実験では，肝臓は
約12gmであることが知られている。この肝臓は,90％生
存率で2.5×108個の生存可能な肝細胞を生ずる。肝細胞
量の10％だけが細胞の機能に必要であるということも考
えられている。従って,250gmのラットには1.2gmの組織
が必要であり，約2.5×107個の細胞の移植片となる。こ
れは，インビボでの増殖がないと仮定してである。成体
と同様に子供への移植が理論的には可能である。８ヶ月
の子供は約250gmの重量の正常な肝臓を持っている。従
って，その子供は親から採取した生検材料から25gmの組
織を必要とする。成体の肝臓は約1500gmの重量があるの
で，生検材料はその肝臓の約1.5％だけであるかまたは
5.0×108個の細胞である。さらに，これは増殖がないと
仮定している。成体は，約2.5×109個の細胞を産生する
より大きな生検材料を必要とする。もしこれらの細胞が
高い効率で付着し，移植されるのであるならば，新しい
宿主内での増殖が起こる。その結果得られる肝細胞の量
は，要求される機能を置き換えるのに適当なものにな
る。
従来の技術とは大きく異なり，本発明方法は，インビト
ロにおける細胞の制御された成長および増殖のための一
時的な足場を使用し，次いで患者に機能細胞を移植す
る。その結果が，機能が置き換えられた器官と類似の３
次元構造で細胞の増殖を可能とするようにインビボで血
管形成されている器官である。最初の細胞培養の条件と
同じく，足場の設計および構築の両方が，細胞の生物学
的能力を獲得するように，そして胚および胎児の生命体
で起こる器官形成の個体発生をくり返すように細胞を刺
激するために使われる。ここで記述されるように，この
技術はキメラ新生形態形成と呼ばれる。
足場の設計および構築が主に重要である。マトリックス
は，細胞に対する栄養物および増殖因子の適切な拡散を
させるように，表面積を最大にするように形づくられる
べきである。密集して詰まった状態の細胞を通して適切
な拡散が起こり得る最大の距離は，生体内で起こるのと
類似の条件下では約100〜300ミクロンの範囲内のようで
ある。そこでは，栄養物および酸素は血管から周囲の組
織に拡散する。各細胞タイプおよびポリマー構造の実際
の距離は，インビトロおよびインビボで細胞の生存能力
および機能を測定して，経験的に決定されるべきであ
る。ウシ毛細血管内皮細胞とコラーゲンマトリックスと
の組み合わせについてのこの測定を，下記の実施例で詳
細に記述する。
最初に，細胞を組織培養の当業者に公知の技術を用いて
培養する。一度細胞が増殖し，マトリックスを被覆し始
めたならば，それらを付着，増殖および機能させるため
に患者の適当な部位に移植する。生物分解性ポリマーマ
トリックスの利点の１つは，脈管形成および他の生物活
性化合物がマトリックスに直接に取り込まれ得るので，
それらがインビボでマトリックスが分解するようにゆっ
くりと放出されることである。細胞−ポリマー構造物に
血管が形成され，構造物が分解すると，細胞はそれらの
固有の特性に従って分化する。例えば，通常，身体内で
管を形成する細胞は管に似た構造に自身を形づくり，神
経細胞は適当に構築されている通路に沿って伸びる。
好適な実施態様において，マトリックスはポリアンヒド
リド，ポリオルトエステルまたはポリグリコール酸のよ
うな生物吸収性または生物分解性合成ポリマーから成
り，その構造は第２図で示される。いくつかの実施態様
では，ポリマーへの細胞の付着は，基底膜成分，寒天，
アガロース，ゼラチン，アラビアゴム，コラーゲンI,I
I,III,IV,およびＶ型，フィブロネクチン，ラミニン，
グリコサミノグリカン，それらの混合物，および細胞培
養の技術分野の当業者に公知の他の物質のような化合物
でポリマーを被覆することにより促進される。インビト
ロでの研究のために，増殖中の細胞の最終的な性質に依
存して，ポリメタクリレートおよびシリコンポリマーを
含有する非生物分解性ポリマー物質を用いることができ
る。非分解性物質は，細胞間の反応（習性，伝達，制御
および形態形成）の理解のような，移植以外の目的ため
に細胞を培養で増殖させる場合に特に有用である。なぜ
ならば，好適なマトリックス構造は，通常拡散によって
のみ栄養物が供給されるよりも，固定された細胞密度を
より高くすることが可能であるからである。
本発明に用いられる全てのポリマーは，その後の細胞の
成長および増殖に適当な支持を与えるのに必要な，機械
的および生化学的なパラメーターと適合しなければなら
ない。ポリマーは，インストロンテスター（Instron te
ster）を用いた引張力，ゲル透過クロマトグラフィー
（GPC）によるポリマー分子量，示差走査型熱測定（DS
C）によるガラス遷移温度および赤外（IR）分光法によ
る結合構造のような機械的特性に関して；エイムス試験
およびインビトロでの催奇試験を包含する最初のスクリ
ーニングテストによる毒性，ならびに免疫原性，炎症，
放出および分解の研究についての動物での移植研究に関
して特徴づけることができる。
インビトロでの細胞付着および生存能力は，走査型電子
顕微鏡，組織学，および放射性同位元素を用いた定量評
価を用いて評価され得る。
ポリマーの足場の構造は，移植された実質成分に新しい
血管がかたくからみ合って細胞の成長，組織化，および
機能を支持するようになるまで，拡散によって細胞が養
分を与えられるのに十分な表面積をもつ必要がある。細
胞の単層にシードされたポリマーディスクおよび分枝状
繊維網状体の両方がこれらの要求を満す。
現時点では繊維状構造が好適である。この繊維は円形，
扇形，平板，星形であり得，単独または他の繊維とのか
らみ合わせであり得る。分枝状繊維の使用は同じ原理に
基づいており，その性質は容量の増加に比例して増加す
る表面積の問題を解決するために用いられている。全て
の多細胞生物は，このくり返される分枝構造を利用す
る。分枝系は，個々の器官の機能単位と同様に，器官間
の連絡網を示す。この構造物を細胞とともにシードおよ
び移植すると，各々が宿主の環境にさらされているばく
大な数の細胞の移植を可能にし，新しい血管形成が起こ
る間の栄養物および老廃物の自由な交換を与える。
本発明方法を第１図に図解する。要求される器官機能を
与えるために必要な細胞10の型は，提供者，被移植者，
または細胞培養系から得ている。例えば，肝臓，腸また
は膵臓細胞の懸濁液12を調製し，ポリマーマトリックス
14にシードする。細胞−ポリマーの足場16を至適条件下
で適当な時間培養する。次いで，この細胞−ポリマーの
足場16を移植する。失われた肝臓機能を与えるための器
官の例では，器官を新しい血管形成の源として作用する
肝門循環系に隣接する網の中に移植する。任意に部分的
な肝切除を行い，細胞の再生を刺激する。適切な血液供
給に加えて，肝門循環系からの“肝栄養”因子が肝臓の
再生を促進する。膵臓の血液から供給されるインシュリ
ンのような因子が，特異的に再生過程を促進するという
ことも考えられる。あるいは，栄養物，増殖因子，分化
または脱分化の誘導物質，分泌産物，免疫調節物質，炎
症の阻害物質，退化因子，リンパ管網状組織または神経
繊維の内部への増殖を促進または許容する生物学的活性
化合物，および薬剤を包含するこれらの因子は，第３図
で図説されているようにマトリックスの中に取り入れる
ことができるか，またはマトリックスと結合させて与え
ることができる。
第１図で示された分枝状繊維14は，直径30ミクロンおよ
び長さが1.0cmのとき，理論的には125,000,000個の細胞
を支持できる。肝臓器官が構築される例では，細胞集団
は肝細胞および胆管細胞を含むことができる。細胞は，
宿主，関係のある提供者または確立された細胞系から得
ることができる。胎児の細胞系は，該細胞が一般に他の
細胞系よりも丈夫であるので利用され得る。
１つかまたはそれ以上の細胞系の付着に対して単一のマ
トリックスを用いた方法の１つの変形では，各々の集団
について最初の細胞付着および増殖がマトリックス内で
別々に起こるように足場が構築される。あるいは，特異
的な位置で種々の型の細胞の付着を最適化するために，
単一の足場を異なる物質から形成し得る。付着は細胞型
とマトリックスの成分の両方の機能である。
ここでの好適実施態様は，宿主に移植される単一細胞−
マトリックス構造を利用することである。しかし,1つ以
上の細胞−マトリックス構造を使用するのが望ましい状
況があり得，機能する３次元器官構造を異なる細胞−マ
トリックス構造から形成するために，各々は付着した細
胞の増殖のための最適時間で移植される。いくつかの状
況では，生物分解性ポリマーマトリックス（周囲の間葉
細胞の修正を誘導してより未発達にさせる化合物または
“脱分化物質”を含む）のある部位に，最初に細胞をさ
らすことにより移植部位を調製することが望ましいこと
であり得る。その後，移植された細胞マトリックス構造
は，それがより成熟した細胞にかこまれているよりも胎
生の環境においてより正常に発生し得る。
上述の機能的な肝臓型の器官の設計，構築，および移植
に対する技術および材料を適用して，胆管上皮細胞をシ
ードした長くて固い繊維を肝細胞をシードした構造物に
挿入することを始めた。移植およびポリマーの分解後，
胆管細胞は所望の位置へ胆汁を放出するための適当な接
続を形成した。血管の供給，リンパ管網状体，および神
経細胞の内部への増殖を促進することができた。付着し
た肝細胞および胆管上皮細胞の両方をもつ組み合わせの
ポリマー−細胞の足場を，大腸間膜の後方に位置する後
方腹膜の中に移植することができた。胆管導管の伸長を
大腸間膜を通って空腸の辺縁の中にまで進めることがで
き，胆管ドレナージを空腸または上方の腸の中に入れる
ことができる。血管形成，細胞−細胞の再組織化，およ
びポリマーの再吸収が起こると，肝機能が置き換えら
れ，胆汁の流出が始まって腸の中に進んでいく。この位
置は，血管が供給されるので，いくつかの潜在的な利点
を有する。“肝栄養”因子が肛門循環系から生じて，再
生のために肝臓に供給されていることが知られている。
脈管形成は，これらの移植された肝細胞への流入物とし
ての肝栄養因子の源として知られている膵臓に直接に隣
接している門脈床から起こり得る。流出物は半奇系を通
り全身的な循環系に流れる腹膜後の副行血管を通り得
る。もしこれが起こると，末期段階の肝臓障害の患者の
胃腸の出血を導く合併症である肛門の高血圧の減少を許
容する移植肝臓細胞を介した門脈体静脈チャンネルにな
る。
元の肝臓は構造的に正常であり，胆汁を流出させること
ができる代謝的肝臓疾患の場合には，足場上の適当な肝
細胞を被移植者の肝臓の中に直接置くことが出来る。こ
の肝臓内移植は正常な宿主胆管系に関して起こる。その
後，元の肝臓は患者の細胞と患者の胆管樹の中に流れ込
んだ被移植者の細胞のキメラとなる。
この方法を成功させるために，インビボおよびインビト
ロの両方で移植細胞の機能を測定しなければならない。
インビボでの肝機能の研究は，被移植者の総胆管の中に
カニューレを置くことにより行われり得る。次いで，胆
汁の増加分が回収できる。胆汁色素は，非誘導体のテト
ラピロールを検索する高圧液体クロマトグラフィーによ
るか，またはβ−グルクロニダーゼでの処理を伴うかま
たは伴わないジアゾ化アゾジピロールエチルアンスラニ
レートとの反応によりアゾジピロールに変換し，その後
薄層クロマトグラフィーにより分析できる。２重結合お
よび単結合のビリルピンもまた，結合した胆汁色素のア
ルカリ性加メタノール分解後に薄層クロマトグラフィー
により測定できる。一般に，多数の機能する移植肝細胞
を移植すると，結合したビリルビンのレベルが増加す
る。単結合および２重結合したビリルビンを測定する同
じ方法が，これらのビリルビン結合物のレベルについて
培地をテストすることによりインビトロで実施し得る。
類似の器官の機能研究を，細胞培養中および移植後の両
方の細胞機能の拡張を測定するのに必要とされるよう
な，当業者に公知の技術を用いて行うことができる。
移植片を形成するための条件を最適化するために，一旦
インビトロおよびインビボでの機能を確かめて，構造物
の形態形成への研究を開始することができる。採取され
てきた胆管上皮細胞を，ポリマーの足場にシードするこ
とが出来る。次いで，この足場に，肝細胞を再びシード
することができる。第４図に略図で示した細胞−細胞の
相互作用は，光学顕微鏡，透過型顕微鏡および走査型電
子顕微鏡のための組織学的切片と同様に，時間差顕微ビ
デオ法によりインビトロでモニターすることができる。
タンパク分析を用いる研究と同様に，ポリマーの足場上
の細胞量を定量するために，標識されたグルコースを用
いた研究を行うことが出来る。次いで，細胞量について
のこれらの研究は，適当な細胞量がどれだけであるかを
決定するために，細胞機能の研究と関係づけることがで
きる。
以下の実施例は，細胞培養における生物侵食性の人工ポ
リマーへの細胞調製物の実際の付着，および動物へのこ
のポリマー−細胞の足場の移植を示す。細胞を採取する
標準的技術を用いて，単一の細胞ならびに胎児および成
体のラットおよびマウスの肝細胞，膵臓の島細胞，およ
び小腸のクラスターを，生物分解性のポリマーであるポ
リグラクチン910,ポリアンヒドリド，およびポリオルト
エステル上にシードしている。65匹の胎児および14匹の
成体の動物を供与体とした。115個のポリマーの足場を7
0匹の被移植動物に移植した:66個は肝細胞とともにシー
ド;23個は腸細胞およびクラスターとともにシードし；
そして,26個は膵臓の島調製物とともにシードした。細
胞は培養において生存能力を残存しており，胎児の腸お
よび肝細胞の場合には，ポリマー上にある間増殖してい
た。培養４日後に，細胞−ポリマーの足場を，宿主動物
内の網，肩申骨間の脂肪パッド，または腸間膜のいずれ
かに移植した。部分的肝切除と組み合わせた胎児の腸移
植の３つの場合では，網における移植が成功し，この場
合のうちの１つは目視できる6.0mmの嚢胞を形成してい
た。肝細胞移植の３つの場合（１つは成体の細胞を用
い,2つは胎児の細胞を用いて移植された）も，肝細胞の
生存性，分裂像，および細胞塊の血管形成を示す。
材料および方法 ポリマー類： ３種の吸収性合成ポリマーが，細胞の付着，増殖および
移植のためのマトリックスとして使用されるフィラメン
トおよびディスクを製造するのに用いられた（第２
図）。
1.ポリグラクチン。このポリマーは，吸収性を有する合
成縫合糸材料として開発され，グリコリドおよびラクチ
ドを90:10の割合で有するコポリマーである。これは,Vi
cryl編成吸収縫合糸として製造されている（Ethicon C
o.,Somerville,New Jersey）（Craig P.H.Williams J.
A.,Davis K.W.ら：ポリグラクチン910およびポリグリコ
ール酸吸収性合成縫合糸の生物学的比較，Surg.141;101
0（1975））。
2.ポリオルトエステル。使用された特殊なポリマーは,
3,9−ビス（エチリデン−2,4,8,10−テトラオキサスピ
ロ〔5,5〕ウンデカンと,trans−1,4−シクロヘキサンジ
メタノールと,1,6−ヘキサンジオールとの，モル比2:1:
1のコポリマーである（SRI,California）（Heller J.,P
enhale W.H.,Helwing R.F.ら：ポリアセタールおよびポ
リオルトエステルからのノルエチンドロンの放出AIChE
Symposium Series,206;77,pp.28−36（1981））。
3.ポリアンヒドリド。使用された特殊なポリマーは，ビ
ス（1,4−カルボキシフェノキシ）プロパンとセバシン
酸とのコポリアンヒドリドである。これは，生物適合性
であり，薬剤供給の応用に広く利用されている（Heller
J.,Penhale W.H.,Helwing R.F.ら：ポリアセタールお
よびポリオルトエステルからのノルエチンドロン（Nore
thidrone）の放出）。AIChE Symposium Series,206;77,
pp.28−36,1981;Leong K.W.,D′Amore P.Marletta M.
ら：薬剤キャリアマトリックスとしての生物腐食性ポリ
アンヒドリド,II.生物適合性および化学反応性。J.Biom
ed.Mat.Res.20:51,1986;Domb A.J.,Langer R.:ポリアン
ヒドリド I.高分子量ポリアンヒドリドの調製。J.Poly.
Sci.（印刷中）,Kopacek J.,Ulbrich K.:生物医学的ポ
リマーの生物分解。Prog.Poly.Sci.9:1（1983,および参
考文献中）。
ポリマーの構造： ポリグリコリドは，製造者により供給されたものを使用
した。ポリアンヒドリドおよびポリオルトエステルの小
さな薄いディスクまたはフィラメントは，次の方法のう
ちのひとつを使って製造した。
A.溶媒を用いたキャスティング：塩化メチレンを用いた
10％ポリマー溶液を，直径10mmのディスクの形状を有す
る枝分かれしたパターンのレリーフ構造物に流し，カバ
ープレスを用いて25℃で10分間保持した。溶媒を蒸発さ
せると，その表面に枝分かれしたパターンが彫り込まれ
た厚さ0.5mmのフィルムが得られた。
B.圧縮成形法：直径が10mm,厚みが0.5mmで，枝分かれし
たパターンのレリーフを有するディスク中に100mgのポ
リマーを入れて,30,000psiで圧縮した。
C.フィラメントの引き伸ばし：フィラメントは，溶融し
たポリマーから引き伸ばして製造された（直径30ミクロ
ン）。平らにした1cmの小さな房がこの実験で使用され
た。
D.ポリグラクチン910:グリコリドおよびラクチドが90:1
0の割合であるコポリマーでなり，共通の基部に収束し
ている多数の繊維は,Q−VicrylR縫合糸材料からポリマ
ーのよりあわせた端部をほぐすことにより，形成した。
これらの枝分かれした繊維の房は約1cmの高さであっ
た。それぞれの繊維は直径30ミクロンであった。
動物： すべての実験において，スプラーグ−ドーリーラットと
C57B1/6マウス（Charles River Labs,Wilmington,Massa
chusetts）の若い成体および胎児を，細胞提供体として
使用した。これらの動物は１匹ずつ個々に飼育し，飼料
および水が任意に摂取し得るようにし,12時間間隔で光
を与え，そして暗くした。ペンドバルビタール（Abbott
Labs,North Chicago,Illinois）を0.05mg/gの用量で動
物に腹腔（IP）内投与して麻酔をかけ，メトキシフルラ
ン（Pitman−Moore,Inc.,Washington Crossing,New Jer
sey）をコーン（cone）投与により補充した。胎児動物
は，妊娠13,17,20日目において，肝臓，膵臓および腸を
提供体として使用するために回収された。若い成体の動
物は，肝臓および膵臓の提供体として，そして細胞の足
場となるマトリックスの被移植体として使用した。
細胞の採取と細胞培養 肝臓： 麻酔を行った後，若い成体動物の腹部の毛をそって，ベ
タジンで処理し，無菌的に腹部を開いた。肝臓を分離
し,100Uのヘパリン（Elkins−Sinn.Inc.,Cherry Hill,N
ew Jersey）でヘパリン化し，門脈に,23ゲージのプラス
チックIVカニューレ（Critikon,Inc.,Tampa,Florida）
を挿入した。小さい大動脈は，横に切開し，肝臓を滅菌
生理食塩水２〜3ccで洗浄し，そのもとあった場所から
除去し，セルゲンの方法（Selgen,P.O:ラット肝細胞の
調製,III,組織分散における酵素要求性，Exp.Cell.Res.
82:391,1973）の修正法により,0.025％のコラーゲナー
ゼII型（BCA/Cappel Products,West Chester,Pennsylva
nia）酸化溶液を散布した滅菌シャーレに移した。20分
間潅流した後，細胞の分散と細胞培養のために肝臓を滅
菌フードに移した。
肝細胞の採取には２段階のコラゲナーゼ潅流法を利用し
た。インビボでの肝臓の潅流は，パルス的な潅流よりも
むしろ１分間あたり30〜40mm2の潅流液の連続的な潅流
により行われるべきである。最初に収穫した２〜３×10
6個の肝細胞のうち,10〜20％の細胞が生存していたの
が，連続的な流れを供給するぜん動性のポンプに切り換
えることにより４〜６×108個の細胞を収穫し,80〜90％
の生存率を示すようになった。種々の緩衝液についても
その効果を試験した。例えば,HEPES緩衝液は，潅流液の
酸性度を減少させるために使用された。
培養物中の肝細胞ポリマーの足場にカビ類または細菌類
が混入しないように，肝細胞の単離および潅流の両者に
おいて無菌操作を行った。抗生物質もまた，コラゲナー
ゼ潅流溶液に添加した。
胎児動物は，妊娠の適当な時期における妊娠動物からの
子宮の角状器官を分離し除去することにより得た。複数
の胎児がいる無傷の子宮を生理食塩水に入れ，これを解
剖顕微鏡のそなえつけられた無菌室に移した。個々の胎
児を切開し，肝臓，腸および膵臓を回収し，プールし
た。次に，器官を，細胞分離のために滅菌フードに移し
た。組織は細かく裁断し,0.025％のコラゲナーゼII型で
処理し，細胞懸濁液として分散させた。
膵臓： 麻酔をかけた後，若い成体動物の腹部の毛を剃り，ベタ
ジンで処理し，無菌的に腹部の中央を切開した。総胆管
を単離すると，膵臓があらわれた。Gotohらが述べた手
法を使用し,2.5ccの2.0％コラゲナーゼII型（BCA/Cappe
l Products,West Chester,Pennsylvania）を，総胆管中
に注射することにより，膵臓に注入した（Gotoh M.,Mak
i T.,Kiyozumi T.ら，マウス脾島分離の改良法，Trans.
40;4,pp.436−438,1985）。５分後に，膵島細胞を分離
するため，膵臓を滅菌フードへ移した。簡単に説明する
と，組織を25％フィコール溶液中に浸漬し，これが不連
続なフィコール密度勾配（23,21,11％）層の下になるよ
うにし,800×ｇで10分間遠心分離を行った。21〜11％の
界面に集まる小島を冷ハンク溶液で洗い,320×ｇで３回
遠心分離した。小島を10％の胎児ウシ血清が添加された
RPMI 1640（Gibco,Grand Island,New York）培地に再懸
濁させ，ポリマーの足場上にのせた。胎児動物は上述の
ように，供与体として回収した。
腸： 胎児動物の腸は，上述のように得た。
ポリマー−細胞の足場および移植： １×105〜１×106個/ccの懸濁液中の細胞をポリマーマ
トリックス上にプレートした。そしてそれを,10％の胎
児ウシ血清を添加したChee培地中に,10％CO2の雰囲気下
で３〜４日間保持した。移植直前の足場における細胞の
生存性を，トリパンブルー排除法により評価した。若い
成体スプラーグ−ドーリーラットを麻酔し，手術する場
所の毛を沿って，ベタジンで処理した。
ポリマー−細胞の足場を，次の３つの場所のうちの１つ
に移植した： １）肩申骨の脂肪部分； ２）網；および ３）腸間膜。
ほとんどの動物は，細胞増殖を刺激するため，部分的な
肝切除を行った。動物を3,7,または14日目に殺し，ヘマ
トキシリンとエオシンとで，組織学的に移植体を調べ
た。細胞のないポリマーをコントロールとして使用し
た。ポリマー−細胞の足場を，培養４日後および移植前
に組織学的に調べ，細胞の付着と生存性とを評価した。
細胞−マトリックス構造を調べるために，以下の方法を
また，使用した。
免疫螢光染色：細胞−ポリマーの足場を含む組織を，液
体イソペンタンに浸漬することにより凍結させ，冷凍庫
に−70℃で保存し，アルブミンでコーティングしたスラ
イド上に固定した。15〜30分間室温で解凍した後，スラ
イドをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄した。市
販のフルオレシン イソチオシアネート（FITC）でラベ
ルされた抗血清によりラベルされた適当なモノクローナ
ル抗体（例えば,HY抗原または肝細胞膜の他のマーカー
に対するモノクローナル抗体）を適当に希釈し，その数
滴を個々に，分離した水性生検区画に滴下した。そし
て，それらを30分間にわたり室温で湿室中にインキュベ
ートした。PBSで洗浄した後，それぞれの区画を，グリ
セラル−PBS混合液でカバーし，光源として落射照明と
高圧水銀ランプとを有する免疫螢光顕微鏡を使用して調
べた。
電子顕微鏡検査法：電子顕微鏡検査のための試料を，新
鮮な組織から得，そして２％グルタルアルデヒド中で固
定し，次に１％オスミウムテトロキサイド中で後固定
し，濃度を段階的に変化させたアルコール中で脱水し，
そしてエポン8:12中に包埋した。プラスチックに包埋さ
れた組織の１ミクロンの厚みの断片を，所望の領域から
調製する。選択した塊を，整え，超薄層断片を作成し，
そして酢酸ウラニルとクエン酸鉛とで染色し，そしてフ
ィリップス300X電子顕微鏡で検査する。
走査電子顕微鏡検査法（SEM）：肝細胞を分離し，適当
なポリマーに付着させた後，それらを適当な間隔で培養
する。培養後,2％グルタルアルデヒド−リン酸緩衝液の
50:50溶液中で１時間インキュベートして試料をSEMのた
めに調製し，その試料を次に，過剰のグルタルアルデヒ
ド溶液を取り除くために10分間にわたり,PBS中で４回洗
浄した。試料を，エタノール溶液を用い，その濃度を徐
々に高くしながら脱水した。次にエタノールを液体CO2
と交換する臨界点乾燥機中に，試料を置いた。温度を臨
界点にまで徐々に上昇し，脱水を確実にする。そして試
料を，金の薄膜で覆い，そして走査電子顕微鏡の高真空
下におく。
14体の成体と65体の胎児とを含む79体の動物を，細胞を
獲得するための供与体として用い,115個のポリマーの足
場を，移植のために調製した。これらの足場の60個に肝
細胞をシードし,23個に腸細胞とその塊を，そして26個
に膵島と細胞調製物とをシードした。移植は70匹の受容
体動物に行われた。58匹は，移植組織片の組織構造の検
査のために７日目に殺し,3匹は移植後３日目に，そして
９匹は14日目に調べられた。
培養３日から４日目におけるポリマーの足場での細胞生
存率は，使用したポリマー材料のタイプにより異なっ
た。第５図は,4日目培養したときの，ポリマーマトリッ
クス上の肝細胞を示す。第６図は,1ヶ月間培養したとき
のポリマー繊維上の胆汁管上皮細胞を示す。第８図およ
び第９図は,1週間培養したときのポリマー繊維に付着し
た肝細胞を示す。細胞の10％未満が，ポリアンヒドリド
ディスク上で生存した一方，ポリオルトエステルディス
クおよびフィラメント上で培養した細胞の80％が生き残
り，そしてポリグラクチン910上では90％を越える細胞
が生き残った。
培養３週間のポリグラクチン繊維上の肝細胞により，有
意な増殖の証拠が示された。それは，細胞集団中に点在
する断片的な繊維で１〜3mmの直径の小瘤の形成により
示される。
血管の内部成長が，すべてのタイプおよび構造のポリマ
ーにおいて，移植後３日目で確認された。移植された繊
維網状組織中で，新しい血管が，ポリマーフィラメント
の裂け目中に形成された。そのポリマーディスクは，ポ
リマー材料に隣接する毛細管の形成を示した。この血管
形成性の応答は，移植されたポリマーに対する炎症性の
（急性のおよび慢性の異物反応の両方を示す）浸潤を伴
った。炎症の強度は，試験されたポリマーのタイプによ
って異なった。宿主に対して外来物質がより広い表面領
域においてさらされるため，ポリオルトエステルまたは
ポリグラクチンの枝分かれした繊維をとり囲む炎症が，
ディスク形状よりも比例的に大きいようであったが，ポ
リアンヒドリドが，最も激しい急性および慢性の応答を
引き起こした。
３動物における肝細胞移植物の組織学的な検査により，
第７図に示されるように,7日目で肝細胞の成功裏の移植
の証拠が示された。健康に見える肝細胞の小さな集団
が，隣接する細胞膜および有系分裂の形態を示している
いくらかの領域の間で胆汁小管とともに観察された。そ
の細胞は，炎症反応に取り囲まれ，そして血管が，その
細胞集団中や周囲に存在した。ポリマー材料は，細胞に
ちょうど隣接するように観察された。
腸細胞および集団（クラスター）の成功裏の移植が,3動
物で観察された。組織学的な知見は，肝細胞の移植物に
類似していた。７日目の移植物の全体の調査で，長さ約
6.0mmの嚢胞の構造物が，その壁内で示されるポリマー
繊維とともに移植部位で見い出された（第10図）。第11
図で示されるように，電子顕微鏡での調査により内腔内
によく分化した腸上皮細胞（粘性のセルデブリスによっ
て腔をライニングしている）が見い出さた。ポリマー繊
維，血管，そして炎症細胞を含む嚢胞の１つの壁は，腸
上皮細胞に直接隣接する。他の壁は，筋肉のコーティン
グを含んでいた。これは，小さな細かくきざんだ胎児の
腸の切片を，最終的に発達した嚢胞の源として，そのポ
リマーが有することを示唆する。その嚢胞は，充分に分
化した腸上皮細胞および粘性の分泌をする細胞を示し
た。腸上皮細胞の他の集団は，活発な有糸分裂を示し
た。
移植に先立って，細胞をシードすることなしに移植した
対照のポリマーは，それらに対応するもの（柔組織の細
胞とともにシードされ培養物で保持されたもの）と同様
の血管由来のおよび炎症性の反応を誘導した。これによ
り，その細胞自身は，その炎症および観察される新しい
血管形成に主な役割を果たしていないことが示唆され
た。もし，適当であるならば，免疫抑制の薬剤を，注入
することまたはポリマー構造中に取り込ませることが可
能である。しかし，その移植物に対する制限された炎症
反応は，実際，成育を促進するのに好ましいかもしれな
い。これは，より正常な治癒応答を促進し，そして新し
い血管の“呼び出し”の役割を果たし得る。
供与体自身の細胞，または培養する前にリンパ細胞がと
り除かれた細胞を使うことが，腸細胞の培養および移植
に特に重要である。もし移植前にリンパ細胞が腸細胞か
らとり除かれなければ，そのことにより“移植片対宿
主”病が引き起こされる。本発明では，機能に必要とさ
れる細胞のみを，ポリマー上に載置し，これを患者に移
植するので，この可能性は減少する。
成功裏に連続して培養されその機能を保持する他のタイ
プの細胞には，膵臓細胞および大動脈細胞が包含され
る。第12図は，培養４週間のポリマー繊維に付着した膵
島の写真であり，グルコースに応答してインシュリンを
いくらか分泌するのが示されている。第13図は，バイオ
マトリックス中にウシ大動脈内皮細胞がシードされたポ
リマー繊維の写真である。その細胞が，小枝のような方
向性でマトリックスの中へポリマーを離れて移動するの
が見られる。第14図は，培養１ヶ月後のポリマー繊維に
付着したウシ大動脈の内皮細胞の写真である。これらの
細胞は，構造を再生するように見られる。上記細胞のそ
のようにしようとする能力は，それらが置かれた環境と
それらが受けた改変の程度に依存する。第６図に示すよ
うにインビトロで小管を形成する胆汁管細胞に加えて，
ポリマー繊維に結合した大動脈内皮細胞は，培養１ヶ月
後に分枝した小管構造を形成した。ポリマー繊維が再吸
収するとき，その細胞は，それらの方向性を維持した。
そのことは，それらが自身の幾何学的構造を保持するた
めそれら自身の新しいマトリックスを分泌することを示
す。
第15図は，マウス胎児の繊維芽細胞で覆われたポリマー
繊維を示す位相差顕微鏡写真である。繊維芽細胞は，培
養皿上で直線上となっているポリマー繊維をそれて流れ
出るように見られ得る。このことは，細胞−細胞間の方
向性の指示が，ポリマー繊維をはなれて移動するときに
維持されたことを示す。
第16図は，マウス胎児繊維芽細胞で覆われたポリマー繊
維の位相差顕微鏡写真である。これらの胎児繊維芽細胞
は，培地を通してポリマーをはなれて移動し，そして組
織培養プレートの底に結合していた。このことは，生き
ている組織の架橋が胎児繊維芽細胞によりポリマー繊維
と培養組織の底との間で作り出されたことを示し，その
ことは，それらの空間的な結びつきを示している。
これらの研究は，肝臓，腸，そして膵臓の細胞が細胞培
養においてポリマー上にうまく結合し，そして生存し得
ること，そして肝臓および腸の細胞が宿主動物中にうま
く移植されることを証明する。次の方法がポリマーへの
細胞結合の最適化を証明するために用いられ，これには
肝臓および膵臓がモデルシステムとして使用された。
非定量的な細胞の結合の研究が行なわれ，その方法にお
いては，結合の研究のためのモデル細胞としてN.I.H.3T
3細胞を用いた。試験されたポリマーには，ポリグラク
チン，ポリオルトエステルおよびポリアンヒドリドが含
まれていた。結合の研究は，膵島細胞について行なわれ
た。
ポリマーの調製 ポリグラクチン910,ポリオルトエステルおよびポリアン
ヒドリドの表面コンフォメーションを変化させる目的の
ため，これらのポリマーを数種類の異なる緩衝液で処理
した後，細胞付着に重要であると考えられる物質でおお
った。それぞれのポリマーはクエン酸緩衝液（pH4.
0），リン酸緩衝溶液（pH7.0），または炭酸緩衝液（pH
10.0）に浸漬することによりテストした。これらを37℃
で２日,5日または７日間インキュベートした。ポリマー
物質の表面特性は走査型電子顕微鏡（SEM）による500倍
および1700倍の拡大像によって特徴づけた。
被覆用材料は次のものを包含した:2％および５％の寒天
溶液;2％,6％および７％のアガロース溶液;1.5％および
11％のゼラチン；そして1.5％および11％のアラビアゴ
ム。被覆物は，適当重量の材料の脱イオン水溶液を調製
し,30分間オートクレーブすることにより調製した。溶
液は使用するまで40〜50℃の温水浴中で液体の状態に保
たれた。各ポリマーを適当な被覆物質に無菌的に浸漬し
た。ゼラチンは２％グルタルアルデヒド：リン酸緩衝液
（50:50）で１時間にわたり架橋させた。ゼラチンとア
ラビアゴムとを使用した複合被覆物質をテストした。コ
ラーゲンでおおわれたポリマーは，ポリマーをIV型コラ
ーゲンで被覆し，このポリマー−コラーゲン材料を一晩
凍結乾燥することにより調製された。コラーゲンでおお
われたサンプルの幾つかは，リン酸緩衝液に１時間浸漬
した。サンプルはすべてはSEMを用いて被覆の均一性を
調べた。サンプルはすべて無菌フード下で８〜12時間の
UV照射により殺菌を行なった。次に，細胞を加えて，細
胞付着の実験を行なった。
細胞付着の実験 細胞ポリマーのサンプルは，下記のサンプル調製手法を
使用し，位相差顕微鏡検査法とSEMとでテストした。サ
ンプルは２％グルタルアルデヒド：リン酸緩衝液（50:5
0）に１時間浸漬することによって固定化し，次にリン
酸緩衝液で20分間にわたりすすぎを３回行った。次に，
これらのサンプルを，次第に濃度を増加させたエタノー
ル（70％,80％,90％,95％）にそれぞれ20分にわたり浸
漬して，脱水させ，無水エタノールに一晩浸した後，液
体CO2を用いて臨界点乾燥法で乾燥し，金で被覆した。
膵島細胞の分離と精製 若い生成マウスに麻酔をかけ，腹部を正中線に沿って無
菌的に切開した。総胆管を分離し,30ゲージの針をこれ
に挿入した。2.5ccのIV型コラーゲナーゼを総胆管を通
して注入した。このとき十二指腸をクランプで締めてお
き，膵管中への逆流が起こるようにした。次に，膵臓を
取り出して,37℃にて45分間，コラーゲナーゼで消化し
た。次に膵臓を冷ハンク溶液で洗浄し，膵臓組織をナイ
ロンメッシュフィルターを通した。次に，不連続的なフ
ィコール勾配を用いて，膵島を分離し，これを冷ハンク
溶液で洗浄し，そして10％胎児ウシ血清を添加したRPMI
1640培地に再懸濁させた。膵島を適当なポリマーを含有
する24ウェルのプレートに載置し,37℃にて,10％CO2雰
囲気下でインキュベートした。
N.I.H.3T3細胞は細胞付着の他の実験のための細胞系列
として用いた。
第17図はリン酸緩衝液に浸漬したポリアンヒドリド繊維
の走査電子顕微鏡写真（472倍）である。この写真によ
り，ポリマー繊維を異なる緩衝液に浸漬するとポリマー
表面が変化し，従って，細胞の付着と分化とに影響をあ
たえることがわかる。
第18図は１％ゼラチンでおおわれたポリマー繊維の走査
電子顕微鏡写真（493倍）である。この写真により，ポ
リマー繊維が既知の細胞粘着剤で被覆されると細胞付着
を促進し得ることがわかる。
表Ｉは，培養５日後の3T3細胞のVicrylTMへの付着を示
す。ポリマーが11％ゼラチン，コラーゲン，およびコラ
ーゲン−リン酸緩衝液で被覆されたときに最大の付着が
認められた。表IIは,2日後と５日後の3T3細胞のポリオ
ルトエステルへの付着を示す。２日後に，架橋11％ゼラ
チン−11％ガムでコートされたポリマーへの最大の付着
が認められた。５日後に，架橋11％ゼラチンでコートさ
れたポリマーへの最大の付着が認められた。pHが細胞付
着に影響を与えるのがわかった。pH7のとき５日目に，
そして,pH10のとき２日目に最大の付着が起こった。表I
IIにより,3T3細胞のポリアンヒドリドへの付着を実証し
ている。最大の付着は，被覆されていないポリアンヒド
リドにおいて２日後に起こった。ポリマーが分解するた
め，その表に挙げられたリスト以外のポリマーについて
は研究しなかった。表IVは,2週間培養後の膵臓細胞（膵
島および繊維芽細胞）のVicrylTMへの付着を示してい
る。最大の付着は，架橋されたあるいは架橋されていな
い11％または1.5％のゼラチンおよびコラーゲンでおお
われているポリマーで起こった。ポリオルトエステルお
よびポリアンヒドリドへのこれらの細胞の付着は非常に
わずかしか観察されなかった。表Ｖは,2週間培養後，膵
島細胞の付着を示し，最大付着は，また，コラーゲンで
おおわれたポリマーにおいて起こることがわかる。
本発明方法は非常に多目的なものであり，かつインビボ
およびインビトロの両方において有用である。例えば，
マトリゲル（Matrigel）に包埋されたポリマー繊維上の
細胞は，インビトロにおいて三次元器官構造物をつくり
出すのに使用され得る。インビボにおける適用において
は，ポリマー構造物を細胞に適合するようにつくってお
くと，移植後に細胞の所望の機能と構造とが得られ，し
かも，細胞培養において細胞の増殖，分裂および機能が
早い時期に達成され得る。増殖および移植が成功裏に行
なわれるという指標は，移植物が，それにとって代わる
べきあるいはそれを補充すべきである器官と同等の機能
を示す場合をさしていう。例えば，腎臓は，効果的は透
析器官として，血流中に濃縮された低分子量物質を除去
する機能が働いている限り，レニンをつくる必要はな
い。機能する肝臓は，凝固因子のようなタンパクの生産
および胆汁の排出のみを必要とするであろう。この目的
のため，肝臓の移植片は小腸に隣接する網，脂質性高血
管性膜に移植され得る。機能する腸は，生命維持のた
め，充分な栄養物を吸収することができる。この栄養物
は通常の“食物”よりもむしろカロリー溶液状態で存在
し得る。
肝臓または膵臓に加えて，“分泌”器官が同様の方法を
適用して調製され得る。その方法においては，分泌細胞
を選択し；マトリックスを作成し；そのマトリックス上
で細胞を培養し；そして，細胞−マトリックス構造物
を，該細胞−マトリックス構造の血管形成を促進すべき
場所へ移植する。
第19図に示すように分泌器官以外の“器官”は本発明の
方法を使用して調製され得る。神経は，適当な神経細胞
54を含有する長い繊維52使用して神経構造物56を形成す
ることにより，調製され得る。この長繊維に沿って神経
細胞を増殖させた後，構造物56は，神経作用の必要であ
る適当な場所に移植される。
第20a図および20b図でに示すように，本発明は心筋疾患
の患者の治療に利用され得る。筋肉細胞をポリマーの針
状体に増殖させ（第20b図），次にこれを心臓の表面に
埋める（第20a図）。先に述べた原理によれば，損傷を
受けた心臓自身は新しい心臓には置き換えられないが，
新しく強い筋肉組織が傷ついた領域上に成長し、この成
長した組織が下部組織と同時に心臓脈を打ち，失った機
能の一部を回復し，部分的に傷跡組織を再形成する。
主に火傷患者の治療に用いられる人工皮膚をつくり出す
のに，種々の異なる方法が使用されている。これらのう
ちで，最も成功したのは，生物的に分解しうるコラーゲ
ンマトリックスを利用する方法である。この方法におい
ては，このコラーゲン上に上皮細胞をシードしておい
て，これを傷の部位に付着させ，そしてこれをシリコー
ンのような非分解性の物質で形成された水分不透過膜で
覆う。これらの方法は，より小さい面積およびより大き
い容積を有する他の器官（例えば，肝臓および膵臓）の
構築に有用であると述べられているが，実際に試みると
効果的ではない。移植に先立って，インビトロで細胞の
付着および分裂増殖を許容し得る高い表面面積構造物を
提供する必要があることについての認識がなかったから
である。成功させるためには，この構造物は，血管形成
されていないときに，十分な栄養物の拡散，廃物の排泄
および呼吸が可能であるように，設計されなければなら
ない。可能な限り小さい濃度勾配のもとで，細胞が多少
とも培地に出てこなければ，これは起こらない。細胞が
増殖するにつれて，細胞へのあるいは細胞からの栄養
物，廃物，ガスの伝達通路が制限されるようになり，培
地からもっとも遠い細胞が死んでいく。人工皮膚移植物
は，下部組織に速やかに載置されたため，細胞密度にお
ける有意の増加に先立ち，マトリックス中への毛細血管
の増殖が始まった。このことは，これまでは，考慮にい
れられていなかった。
キメラ性の新生形態形成と言う概念は，増殖中の細胞集
団の血管伸長が起こるまでに，細胞が拡散により栄養物
が付与され得る能力による。細胞がシードされたコラー
ゲンまたはゼラチンを使用し，細胞−マトリックス構造
物の固体移植物は，拡散の際にサイズの点で物理的に制
限されていると考えられる。いま，他の研究者により，
現在，細胞をシードした天然複合マトリックスを使用し
て，“器官に相当するもの”が調製されている。その一
つはコラーゲンゲルであり，これはＩ型コラーゲンの水
和溶液であるらしい。次の実験では，この水和コラーゲ
ンの細胞集団への栄養物の拡散能力についてテストす
る。
ウシ毛細血管の内皮細胞をゼラチンをコートした24穴ウ
ェル組織培養皿にプレートし，一晩をかけて細胞を付着
させた。最初の細胞数は,1×105であった。翌日，細胞
を，最終濃度が0.32％になるように異なる容量のＩ型コ
ラーゲンで覆った。コラーゲンの上に標準容量の培地を
加えたため，栄養物源から細胞までの距離が異なった。
この培地はウシ毛細血管内皮細胞の増殖に最適化された
ものであった。ダルベッコの最小基本培地,10％ウシ血
清および10μ/mlのレチナール由来の増殖因子を使用
した。第21a図に示されたように，細胞と培地との間に
挿入されたコラーゲンの厚さは0,3.0mm,5.5mm,9.0mm,お
よび12.0mmであった。24時間後に培地とコラーゲンとを
取り除き，細胞の数を数えた。
第21b図に示した実験結果は実質的に予想と一致した。
水和コラーゲンマトリックスの厚さが増大につれて，生
存細胞数が減少した。細胞付着後の最初の細胞数は89,5
80±3,719であった。コラーゲンマトリックスの挿入物
がなくて，培地に直接接する細胞は,24時間で２倍にな
り,163,233±8,582となった。培地と細胞との間のコラ
ーゲンゲルの厚さが3mmのとき，細胞の残存数は49,587
±3,708となった。この数は厚さが5.5mmのとき26,513±
3,015,9mmのとき4,593±899,そして12mmのとき5,390±4
88に減少した。9mmと12mmの場合には，すべての細胞は
円形となり生育できなかった。
第22図は，細胞増殖能と分裂における拡散距離の影響を
示す写真である：（ａ）コントロールウェルの24時間後
の細胞であり,24時間後には細胞数が２倍となってい
る；（ｂ）0.32％コラーゲンにより5.5mmの厚さで覆わ
れた細胞であり，生存細胞は著しく減少し，細胞の数が
最初にプレートされた細胞数よりはるかに少なくなって
いる；そして，（ｃ）培地と細胞との間に挿入された12
mmの厚みのコラーゲンで覆われた細胞であり，すべての
細胞が円形となって，死滅している。
これらのデータにより，移植を成功させるためには，拡
散距離が細胞の生存および増殖の臨界的要素であるとい
う考えが支持される。従って，コラーゲンゲルの均一に
シードされた細胞は生物学的に拡散距離という拘束によ
り制限される。1cm3を下まわる移植物を用いると，この
移植物の周辺から３〜5mmの深さまで細胞が生存し得る
と考えがちである。しかし，移植物の中央の細胞は栄養
物，拡散およびガス交換の制限のため，生存できない。
５〜10mmという，非常に薄い厚みで大きな平板ゲルを用
いれば，より大きい移植物とすることが可能であろうこ
とが想像される。しかし，この二次元的な溶液は移植に
おいて幾何的な制限を受ける。細胞密度を増大させるに
従って，拡散がより大きい制限を受け，従って，距離が
相応してより短くなるということは明白である。
本発明を特定の実施態様により説明したが，最大表面積
を有するマトリックス上で細胞を培養し，栄養物を含む
環境にさらすことによって，人工器官を構築する本発明
の方法および手段の改変および修飾は当業者に明白であ
る。これらの修飾および改変は，本発明に添付の請求の
範囲に包含される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ランジャー，ロバート エス. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02139 ソマービレ，グリーンビレ スト リート 46 (56)参考文献 特開 昭57−52460（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−28472（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501298（ＪＰ，Ａ) 特表 昭58−501817（ＪＰ，Ａ)

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】栄養溶液中での細胞増殖を制御するための
    人工マトリックスであって、 細胞懸濁液が付着する点を提供するような構造の生物適
    合性マトリックスを包含し、 ここで該マトリックスは、生物分解性の合成ポリマーで
    構成される繊維状構造物であり、栄養溶液中で細胞増殖
    を均一に支持するように構成され、栄養物を充分拡散さ
    せ、排出物を除去し、そして栄養溶液から全細胞へ充分
    なガス交換ができるのに充分な面積を有し、そのため、
    血管網組織が存在しない場合においても、充分な細胞増
    殖と分化とが起こり、３次元細胞−マトリックス構造物
    を形成し得る、マトリックス。
  2. 【請求項２】前記マトリックスが、ポリアンヒドリド、
    ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、お
    よびそれらのコポリマー、混合物あるいは組み合わせで
    なる群から選択される物質で構成される請求の範囲第１
    項に記載のマトリックス。
  3. 【請求項３】細胞付着を高める被覆層をさらに包含する
    請求の範囲第１項に記載のマトリックス。
  4. 【請求項４】前記第２の材料が、前記マトリックス表面
    への細胞の付着を高める物質の群から選択され、該物質
    の群が、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、
    基底膜材料、コラーゲン Ｉ、II、III、IVおよびＶ
    型、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカ
    ン、およびそれらの複合混合物でなる、請求の範囲第１
    項に記載のマトリックス。
  5. 【請求項５】前記マトリックスがディスク状であり、そ
    して細胞付着のための特定の凹凸のある、請求の範囲第
    １項に記載のマトリックス。
  6. 【請求項６】前記繊維状構造物が中空繊維を含む請求の
    範囲第１項に記載のマトリックス。
  7. 【請求項７】前記繊維状構造物が固体繊維を含む請求の
    範囲第１項に記載のマトリックス。
  8. 【請求項８】前記マトリックスが針状片として形成され
    ている請求の範囲第１項に記載のマトリックス。
  9. 【請求項９】栄養物、補因子、増殖因子、血管形成促進
    性化合物、免疫調節剤、炎症抑制剤、退行因子、分化お
    よび脱分化促進因子、リンパ管網状組織の内部成長を促
    進する生物学的活性分子、神経の成長を促進する因子、
    薬剤およびそれらの組合せでなる群から選択される化合
    物をさらに包含する請求の範囲第１項に記載のマトリッ
    クス。
  10. 【請求項１０】前記マトリックスが、異なる起源の細胞
    の付着のために別々の領域を有するように構成された請
    求の範囲第１項に記載のマトリックス。
  11. 【請求項１１】前記マトリックスが該マトリックス内で
    管状構造物の増殖を支持するように構成された請求の範
    囲第10項に記載のマトリックス。
  12. 【請求項１２】異なる細胞集団の付着と増殖とを最大に
    するように構成された分離した領域を有する請求の範囲
    第１項に記載のマトリックス。
  13. 【請求項１３】移植すべき細胞集団が供給されている、
    請求の範囲第１項に記載のマトリックス。
  14. 【請求項１４】細胞−マトリックス構造物が移植される
    べき位置において、まず宿主へ移植するのに使用するた
    めの、請求の範囲第１項に記載のマトリックス。
  15. 【請求項１５】前記細胞が、肝細胞、胆管細胞、上皮小
    体細胞、甲状腺細胞、副腎視床下部−脳下垂体系細胞、
    心筋細胞、腎臓上皮細胞、腎臓管状細胞、腎臓基底膜細
    胞、神経細胞、血管細胞、腸管細胞、骨および軟骨形成
    細胞、および、平滑筋および骨格筋細胞でなる群から選
    択される、請求の範囲第14項に記載のマトリックス。
  16. 【請求項１６】移植する細胞をインビトロでマトリック
    ス上で成長させるためのマトリックスであって、栄養環
    境中にある生物適合性で生物分解性である合成ポリマー
    マトリックス、および該マトリックスに付着した細胞を
    含有し、 ここで該マトリックスは、繊維状構造物であり、血管形
    成のない状態で該付着細胞の栄養分および排出物の自由
    な交換が行われるように構築されており、そのため十分
    な細胞の成長および分化が起こって３次元の細胞−マト
    リックス構造が形成され得る、マトリックス。
  17. 【請求項１７】前記マトリックスが、ポリアンヒドリ
    ド、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳
    酸、およびそれらのコポリマー、混合物あるいは組み合
    わせでなるポリマーの群から選択される物質で構成され
    る、請求の範囲第16項に記載のマトリックス。
  18. 【請求項１８】前記マトリックス表面への細胞付着を促
    進するための前記マトリックス材料上のコーティングを
    さらに含む、請求の範囲第16項に記載のマトリックスで
    あって、該コーティングが、基底構成物、寒天、アガロ
    ース、ゼラチン、アラビアゴム、基底膜材料、コラーゲ
    ンＩ、II、III、IVおよびＶ型、フィブロネクチン、ラ
    ミニン、グリコサミノグリカン、およびそれらの複合混
    合物でなる群から選択される、マトリックス。
  19. 【請求項１９】前記細胞が、肝細胞、胆管細胞、上皮小
    体細胞、甲状腺細胞、副腎視床下部−脳下垂体系細胞、
    心筋細胞、腎臓上皮細胞、腎臓管状細胞、腎臓基底膜細
    胞、神経細胞、血管細胞、腸管細胞、骨および軟骨形成
    細胞、ならびに、平滑筋および骨格筋細胞でなる群から
    選択される、請求の範囲第16項に記載のマトリックス。
  20. 【請求項２０】軟骨構造物を成長させるための請求の範
    囲第16項に記載のマトリックスであって、栄養環境中の
    生物適合性合成ポリマーマトリックス、および該マトリ
    ックスに付着した軟骨細胞を含有し、 ここで該マトリックスは、血管形成のない状態で該付着
    細胞の栄養分および排出物の自由な交換が行われるよう
    に構築されており、被験体の移植部位に縫合することに
    より該マトリックスを装着し得る、マトリックス。
  21. 【請求項２１】軟骨細胞に分化し得る細胞を含む、軟骨
    構造物を成長させるための請求の範囲第20項に記載のマ
    トリックス。
  22. 【請求項２２】骨、皮膚および神経前駆細胞でなる群か
    ら選択される細胞をさらに含む、請求の範囲第20項に記
    載のマトリックス。
  23. 【請求項２３】細胞が線維芽細胞である、請求の範囲第
    16項に記載のマトリックス。
  24. 【請求項２４】移植する細胞をインビトロでマトリック
    ス上で成長させるための方法であって、 該マトリックスに細胞を付着させる工程を包含し、 ここで該マトリックスは、栄養環境中にある生物適合性
    で生物分解性である合成ポリマーマトリックスを含有
    し、繊維状構造物であり、血管形成のない状態で該付着
    細胞の栄養分および排出物の自由な交換が行われるよう
    に構築されており、そのため十分な細胞の成長および分
    化が起こって３次元の細胞−マトリックス構造が形成さ
    れ得る、方法。
  25. 【請求項２５】前記マトリックスが、ポリアンヒドリ
    ド、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳
    酸、およびそれらのコポリマー、混合物あるいは組み合
    わせでなる群から選択される物質で構成される、請求の
    範囲第24項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記マトリックス表面への細胞付着を促
    進するための前記マトリックス材料上のコーティングを
    さらに含む、請求の範囲第24項に記載の方法であって、
    該コーティングが、基底構成物、寒天、アガロース、ゼ
    ラチン、アラビアゴム、基底膜材料、コラーゲンＩ、I
    I、III、IVおよびＶ型、フィブロネクチン、ラミニン、
    グリコサミノグリカン、およびそれらの複合混合物でな
    る群から選択される、方法。
  27. 【請求項２７】前記細胞が、肝細胞、胆管細胞、上皮小
    体細胞、甲状腺細胞、副腎視床下部−脳下垂体系細胞、
    心筋細胞、腎臓上皮細胞、腎臓管状細胞、腎臓基底膜細
    胞、神経細胞、血管細胞、腸管細胞、骨および軟骨形成
    細胞、ならびに、平滑筋および骨格筋細胞でなる群から
    選択される、請求の範囲第24項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】軟骨構造物を成長させるための請求の範
    囲第24項に記載の方法であって、 栄養環境中の生物適合性合成ポリマーマトリックス、お
    よび該マトリックスに付着した軟骨細胞を含有し、 ここで該マトリックスが、血管形成のない状態で該付着
    細胞の栄養分および排出物の自由な交換が行われるよう
    に構築されており、被験体の移植部位に縫合することに
    より該マトリックスを装着し得る、方法。
  29. 【請求項２９】軟骨細胞に分化し得る細胞を含む、軟骨
    構造物を成長させるための請求の範囲第28項に記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】骨、皮膚および神経前駆細胞でなる群か
    ら選択される細胞をさらに含む、請求の範囲第28項に記
    載の方法。
  31. 【請求項３１】細胞が線維芽細胞である、請求の範囲第
    24項に記載の方法。
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