JPH07103134B2 - リン酸エステル - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は新規なリン酸モノエステ
ルに関するものである。さらに詳しくは、アルカリ性ホ
スファターゼの作用により加水分解されてアゾ色素を放
出する新規なモノ−４−アリールアゾアリールリン酸エ
ステルに関するものである。

【従来の技術】人の体液中のアルカリ性ホスファターゼ
の活性を知ることは臨床検査上極めて重要である。すな
わち、一般にアルカリ性ホスファターゼの活性が高い時
は、肝臓、骨等の新陳代謝が不順な状態にあり、肝臓
病、くる病、骨肉腫、甲状腺異常などの症状が現われる
ことはよく知られている。従ってアルカリ性ホスファタ
ーゼの活性を測定するための種々の方法が考え出されて
いることは極めて当然なことである。日常の臨床検査に
おけるアルカリ性ホスファターゼ定量法としては操作が
簡単でしかも再現性の良いことが必要であるが、この目
的にはいわゆる比色法とケイ光法とがある。すなわち、
比色法とは、アルカリ性ホスファターゼの作用によって
加水分解されて色素あるいは色素の前駆体を放出する化
合物を酵素反応の基質として用い、酵素反応の結果放出
される色素を比色定量することにより、あるいは酵素反
応の結果放出される色素前駆体を、試薬を加えて化学反
応させて色素に変え、その色素を比色定量することによ
りアルカリ性ホスファターゼの活性度を知る方法であ
り、広く普及している比色計あるいは分光光度計を用い
て定量できるという利点がある。一方ケイ光法とは、ア
ルカリ性ホスファターゼの作用によって加水分解され
て、発ケイ光物質を放出する化合物を酵素反応の基質と
して用い、酵素反応の結果放出される発ケイ光物質のケ
イ光強度を測定することによりアルカリ性ホスファター
ゼの活性度を知る方法であり、比色法に比べて感度が高
いが微量の共存する発ケイ光物質による妨害を受けやす
いことおよびケイ光光度計があまり普及していないとい
う難点がある。本発明は比色法によるアルカリ性ホスフ
ァターゼの定量法において好適な基質となる新規化合物
モノ−４−アリールアゾアリールリン酸エステルに関す
るものである。従来、比色法によるアルカリ性ホスファ
ターゼの定量法として次の方法が用いられていた。 （１） ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを基質
として用い、アルカリ性ホスファターゼの作用による加
水分解の結果放出されるｐ−ニトロフェノールを比色定
量する方法であり、具体的方法についてはＯ．Ａ．Ｂｅ
ｓｓｅｙ，Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗｒｙ，およびＭ．Ｊ．Ｂｒｏ
ｃｋ著、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌 第１６４巻、３２１頁（１９
４６年発行）に記載されている。 （２） リン酸フェノールフタレインを基質として用
い、アルカリ性ホスファターゼの作用による加水分解の
結果放出されるフェノールフタレインを比色定量する方
法であり、具体的にはＡ．Ｌ．Ｂａｂｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．
Ｇｒｅｅｌｅｙ，Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｅｍａｎ，およびＧ．
Ｅ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ著、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ誌、第１２巻、４８２頁（１９６６年発行）に
記載されている。 （３） リン酸チモールフタレインを基質として用い、
アルカリ性ホスファターゼの作用による加水分解の結果
放出されるチモールフタレインを比色定量する方法であ
り、具体例はＣ．Ｍ．Ｃｏｌｅｍａｎｎ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、第１３巻、４０１頁（１
９６６年発行）に記載されている。 （４） チモールブルーモノホスフェイトを基質として
用い、アルカリ性ホスファターゼの作用による加水分解
の結果放出されるチモールブルーを比色定量する方法で
あり、具体例は特開昭５１−１３６６６２号に記載され
ている。 （５） フェニルリン酸を基質として用い、アルカリ性
ホスファターゼの作用による加水分解の結果放出される
フェノールを、赤血塩の存在下で４−アミノアンチピリ
ンと酸化縮合させ、生じた赤色キノンを比色定量する方
法で、具体例としては、Ｐ．Ｒ．Ｎ．Ｋｉｎｄ，および
Ｅ．Ｊ．Ｋｉｎｇ著、ＣｌｉｎｉｃａｌＰａｔｈｏｌｏ
ｇｙ誌、第７巻、３２２頁（１９５４年発行）；渡辺賢
誠ほか著、「臨床病理」誌、第１５巻、７０８頁（１９
６７年発行）中山年正ほか著「臨床病理」誌、第２３巻
（総会補冊）８５頁（１９７５年発行）に記載されてい
る。 以上に述べた従来法のうち（１）の方法はアルカリ性ホ
スファターゼの定量法として最も広く用いられている
が、比色波長が４１０ｎｍであるため血清中のビリルビ
ンやヘモグロビンなどの有色物による妨害を免れず、検
体盲検が必要となり、それだけ操作が繁雑になる欠点が
あった。従来法（２）〜（５）の方法においては、比色
波長がさらに長波領域にあるためこの欠点は一応克服さ
れている。しかしながら、フタレイン類のモノリン酸エ
ステルを基質とする（２）、（３）および（４）の方法
においては純度の高い基質を合成することが難しい。つ
まり、これらのモノリン酸エステルは対応するフタレイ
ンを分子中の１個の水酸基をオキシ塩化リンと反応させ
て得られるフタレインのモノホスホロジクロリデートを
加水分解して合成するが、フタレインに対するオキシ塩
化リンの量が多いとフタレイン分子中の２個の水酸基が
ホスホリル化されてしまい、またフタレインに対するオ
キシ塩化リンの量が少ないとオキシ塩化リン１分子に対
してフタレインが２分子あるいは３分子反応するので生
成物が２種あるいは３種も生成してしまう。いずれの場
合にもアルカリ性ホスファターゼの定量用基質として不
適当な化合物が副生する。したがって反応後の単離精製
が繁雑になり、純度の高い生成物を多く手に入れること
が困難であった。一方、従来法（５）の方法においては
フェノールを遊離させる酵素反応と発色反応との２段階
の反応過程を経ることが必要であるため操作もそれだけ
繁雑であった。このため以上のような欠点のないアルカ
リ性ホスファターゼ定量法の出現が望まれていた。

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的は測定の際の操作性に優れ、かつ血中の色素等の有
色物による妨害を受け難く、検出感度も優れ、しかも合
成および精製に難点がないアルカリ性ホスファターゼ定
量用基質として有用な新規化合物を提供することであ
る。

【課題を解決するための手段】上記の目的は、下記の一
般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される新規なモノ−４−
アリールアゾアリールリン酸エステルによって効果的に
達成され得ることを見出した。

【化２】 （式中、Ｍは水素原子、ナトリウム原子またはカリウム
原子であり、Ｒ^１とＲ^２の一方はメチルスルホニル基、
Ｒ^１とＲ^２の他方はニトロ基であり、Ｒ^３は塩素原子ま
たは水素原子、Ｒ^４は水素原子、ヒドロキシル基、メチ
ル基またはメチルカルボニルアミノ基であり、Ｒ^５は水
素原子または塩素原子であり、Ｒ^６はメチル基または３
−スルファモイルフェニル基である。）一般式（Ｉ）ま
たは（ＩＩ）で表わされる化合物はいずれもアルカリ性
ホスファターゼの作用によってアルカリ性ホスファター
ゼの活性に比例した速度で加水分解されて対応するアゾ
色素を放出するため、アルカリ性ホスファターゼの定量
用基質として用いることができる。特に一般式（Ｉ）に
おいてＲ^４及びＲ^５が水素原子である化合物は、原料入
手し易く、また、酵素反応の結果放出される色素の可視
吸収スペクトルの吸収極大波長が大きくしかも分子吸光
係数が大きいので好ましい。次に、上記一般式（Ｉ）ま
たは（ＩＩ）で表わされる化合物の具体例を示すが、本
発明の範囲はこれらの化合物のみに限定されるものでは
ない。

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】 まず、芳香族アミンＡ−ＮＨ_２（ＩＩＩ）とフェノール
誘導体Ｈ−Ｂ−ＯＨとを常法によりジアゾカップリング
させてアゾ色素（Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ−ＯＨ）（ＩＶ）を合
成する。なお、Ａに強い電子吸引性基であるメチルスル
ホニル基とニトロ基が存在するため、ジアゾ化によって
生じるジアゾニウム塩を合成するにあたってはいわゆる
ニトロシル硫酸法（たとえばＳ．Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒお
よびＷ．Ｋａｒｏ著〔Ｏｒｇａｎｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」第２
巻、２９５頁（１９７１年 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ発行）に具体例が記載されている。）を用いること
が好ましい。 次いでピリジンの存在下にアゾ色素（ＩＶ）を大過剰の
オキシ塩化リンと反応させてホスホロジクロリデート
（Ｖ）とした後、（Ｖ）を水と反応させてリン酸モノエ
ステル（Ｉ′）とする。 （ＩＶ）より（Ｖ）を得る反応においては、（ＩＶ）の
３倍モル以上、好ましくは３倍ないし１０倍モルのオキ
シ塩化リンをアセトン、トリメチルリン酸あるいはアセ
トンとトリメチルリン酸との混合溶媒にて２ないし５０
倍、好ましくは５〜１０倍に希釈した溶液に−１５℃な
いし１０℃、好ましくは−１０℃ないし０℃で、（Ｉ
Ｖ）をピリジン、ピリジンを含むアセトン、ピリジンを
含むトリメチルリン酸、あるいはピリジンを含むアセト
ンとトリメチルリン酸との混合溶媒に溶かした溶液を滴
下することにより、ほとんど副生成物が生じることなく
（ＩＶ）を（Ｖ）へ変換することができることを見出し
た。なお、ピリジンの代りに、トリエチルアミン等のピ
リジンより塩基性の強い３級アミンを（ＩＶ）の溶液に
加えてもさしつかえない。（Ｖ）の生成はシリカゲル薄
層クロマトグラフィーにおいて（ＩＶ）よりもＲｆ値の
小さいスポットが出現することによって確認できる。従
来たとえばｐ−ニトロフェニルホスホロジクロリデート
のごときアリールホスホロジクロリデートはオキシ塩化
リンとフェノールとを塩化カリウムなどの存在下に加熱
還流することにより合成されていた。その具体例は、た
とえば向山および橋本著、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔ
ｈｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｊａｐ
ａｎ誌、第４４巻、１９６頁（１９７１年発行）に記載
されている。しかしこのような激しい条件下では、上記
化合物（Ｖ）は効率よく生成しなかった。（Ｖ）を
（Ｉ′）ヘ変換する際には、（Ｖ）を単離せずに反応液
に水を加えればよい。ただし酸性条件下では（Ｉ′）が
分解することがあるから（Ｖ）と水との反応に際しては
発生する塩化水素を捕捉し得るピリジン等の三級アミン
を加えるか酢酸エチルなどの水に不溶な溶媒を共存させ
て水−油の２層系とすることによって好ましい結果が得
られることがある。こうして得た（Ｉ′）に濃い水酸化
ナトリウムあるいは水酸化カリウムの水溶液を加えて溶
解しｐＨを約１０に調節した後不溶部を濾去して得た溶
液をその約１０〜２０倍容のエタノール中に撹拌しつつ
滴下することによって（Ｉ）または（ＩＩ）の結晶を得
ることができる。 こうして得た化合物（Ｉ）または（ＩＩ）を少量の水に
溶かした後、エタノール中に注入して晶折することによ
り精製を行なうことができる。なお、この方法によって
得た結晶には、１分子あたり数分子の結晶水を含むこと
が多い。以上のようにして合成した上記一般式（Ｉ）ま
たは（ＩＩ）で表わされる本発明の化合物はアルカリ性
ホスファターゼ定量用基質として優れている。すなわち
上記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表わされる化合物
は、（１）アルカリ性ホスファターゼの作用によって、
アルカリ性ホスファターゼの活性度に比例した速度で加
水分解されてアゾフェノール色素を与え、（２）これら
の色素は、従来広く行なわれてきさｐ−ニトロフェニル
リン酸二ナトリウムを基質として用いる方法における呈
色色素であるｐ−ニトロフェノールよりも長波長側に可
視光吸収極大を有するので、それだけ血中色素等の有色
物質による妨害を受け難く、（３）かつこれらの色素は
水溶性であるため、酵素活性測定中に凝集や沈澱を起こ
すことがなく、したがってアルカリ性ホスファターゼ定
量用基質として使用した場合、定量試験条件設定の自由
度が高く、（４）しかも合成例に示す通り合成に難点が
なく、本明細書の冒頭に述べたとおりリン酸フタレイ
ン、リン酸チモールフタレイン、あるいはチモールブル
ーモノホスフェイトの合成においては化合物の単離精製
操作が繁雑であるのとは対照的に、通常の晶析によって
精製できる。本発明の化合物を用いてアルカリ性ホスフ
ァターゼを定量するには、Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ誌、第１６４巻、３２１頁、１９４６年
発行に記載されている。）におけるｐ−ニトロフェニル
リン酸二ナトリウムのかわりに本発明の化合物を用い、
Ｂｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法において酵素反応の結果生
じるｐ−ニトロフェノールの量を求めるかわりに本発明
の化合物から生じるアゾ色素Ａ−Ｎ＝Ｎ−Ｂ−ＯＨの量
を求めればよい。例えば、まず、一般式（Ｉ）または
（ＩＩ）にて示される化合物をｐＨ１０前後の緩衝液に
溶解し基質液を調製する。このとき、基質液に、酵素活
性化剤（例えば塩化マグネシウム）などを添加すると好
ましい。次に、この基質液に、被測定物であるアルカリ
性ホスファターゼを含有する液を添加し反応を行なわし
める。このとき、一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示され
る化合物は、基質液中に１〜２０ミリモル／リットルの
濃度で存在しているのが好ましい。また、一般式（Ｉ）
または（ＩＩ）で示される化合物は、アルカリ性ホスフ
ァターゼに対して、大過剰に、すなわちモル比では１０
倍以上存在していることが好ましい。上記反応は、１０
〜５０℃より好ましくは３０〜４０℃の温度にて、１０
〜６０分間の時間にて行なわれる。次に、必要に応じ
て、溶液のｐＨを塩基または酸を添加して上げたり、下
げたり、場合によっては、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミ
ド）、メチルセロソルプ等の有機溶剤を添加してこの反
応を停止させこのときの生成したアゾ色素の濃度を分光
光度計などによって濃度測定することによって、必要に
より、検量線からアルカリ性ホスファターゼを定量す
る。比色波長は当該色素の吸収極大波長付近に設定すれ
ばよいが、比色の際にシクロデキストリン類好ましくは
α−シクロデキストリンを添加することにより吸収極大
波長を長波長側へシフトさせることも可能である。この
とき、シクロデキストリン類の添加量は、比色液１ｍｌ
当り０．１ｍｇないし２０ｍｇ、好ましくは１ｍｇない
し１０ｍｇである。次に、本発明の一般式（Ｉ）または
（ＩＩ）で表わされる化合物のうち化合物３について合
成例を示す。化合物３以外のものについても前述の合成
法に基づき、また下記の記載に順じて容易に合成するこ
とができる。 合成例：化合物３の合成 オキシ塩化リン４ｍｌとアセトン２０ｍｌとを混合し−
８℃に冷却した。この溶液に、４−（２−メタンスルホ
ニル−４−ニトロフェニルアゾ）フェノール２ｇをアセ
トン２０ｍｌ、トリメチルリン酸１０ｍｌ、ピリジン８
ｍｌ、およびトリエチルアミン０．５ｍｌに溶かした溶
液を２５分間にわたって滴下した。この間、反応液の温
度が０℃を越えぬように外部から冷却した。さらに３０
分間０℃以下で撹拌を続けた後、３０ｍｌの水を滴下し
た。室温で１０分間撹拌した後、２００ｍｌの飽和食塩
水と氷との混合物中に注入し、生じた結晶を濾取した。
この結晶に１規定の水酸化ナトリウム水溶液２０ｍｌを
加えｐＨを約１０とした。不溶部を濾却した後、濾液を
エタノール１５０ｍｌ中に注入し、生じた結晶を濾取し
エタノールで洗浄し、減圧下に乾燥した。 収量２ｇ、λ_ｍａｘ ^{０．０２Ｎ−ＮａＯＨ} ３８２ｎｍ 次に、本発明の化合物を用いてアルカリ性フォスファタ
ーゼを定量する方法の具体例を示す。 参考例１． 基質液の調製：化合物３の結晶３５．０５ｍｇを１０ｍ
ｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０、０．５ｍｍｏｌｅ／リ
ットルの塩化マグネシウムを含む）に溶かした。 酵素液の調製：シグマケミカル社アルカリ性ホスファタ
ーゼＴｙｐｅ Ｉ約６ｍｇを２０ｍｌの蒸留水に溶かし
た液および、この液を２倍および４倍に希釈した液を３
種類調製した。 操作：基質液１ｍｌを試験管に入れ３７℃に３分間加温
した。酵素液０．１ｍｌを加え、３７℃で３０分間加温
し反応させた後０．０２規定の水酸化ナトリウム水溶液
１０ｍｌを加えて反応を停止した。酵素液のかわりに蒸
留水を用いる点を除いて全く同様に処理した盲検液を対
照として５２０ｎｍで吸光度（ΔＯＤ）を測定した。こ
のようにして、濃度の異なった３種類の酵素液について
各々測定を行なった。これらと同じ酵素液についてＢｅ
ｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法を適用した場合の４１０ｎｍに
おける盲検液を対照とした吸光度（ΔＯＤ）を測定し
た。 なおＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法の操作は上記化合物３
の結晶３５．０５ｍｇのかわりにｐ−ニトロフェニルリ
ン酸ナトリウム２０ｍｇを用いて４１０ｎｍで比色する
他は上記の操作と全く同様である。これら２つの方法に
よるΔＯＤの値の関係を図１に示した。この図１から次
のことが明らかとなった。 （１） 酵素濃度に比例して、すなわちＢｅｓｓｅｙ−
Ｌｏｗｒｙ法による値に比例してΔＯＤが変化するので
ΔＯＤの値から酵素の活性を求めることができる。 （２） 化合物３を基質とした場合のΔＯＤはＢｅｓｓ
ｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法のΔＯＤより大きな割合で変化して
いるので（直線の勾配が１以上）、化合物３を基質とし
た場合のほうがＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法より感度が
高い。 （３） 化合物３を基質とした場合には５２０ｎｍで比
色できるので、４１０ｎｍで比色するＢｅｓｓｅｙ−Ｌ
ｏｗｒｙ法より、血中の色素などの有色物質による妨害
を受け難い。 このように本発明の化合物は、アルカリ性ホスファター
ゼの定量用基質として好適な化合物であることがわか
る。 参考例２．参考例１の化合物３の結晶３５．０５ｍｇの
かわりに４８．１８ｍｇの化合物１２の結晶を用い、吸
光度の測定を５２０ｎｍではなく６４４ｎｍで行なう他
は参考例１と同様の操作を行なった。結果を図２に示し
た。この図２から次のことが明らかである。 （１）酵素濃度に比例して、すなわちＢｅｓｓｅｙ−Ｌ
ｏｗｒｙ法による値に比例してΔＯＤが変化するのでΔ
ＯＤの値から酵素の活性を求めることができる。 （２） 化合物１２を基質とした場合には、６４４ｎｍ
で比色できるので、４１０ｎｍで比色するＢｅｓｓｅｙ
−Ｌｏｗｒｙ法より血中の色素などの有色物質に妨害を
受け難い。 このように本発明の化合物は、アルカリ性ホスファター
ゼの定量用基質として好適な化合物であることがわか
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】化合物３を用いてアルカリ性ホスファターゼを
測定したときの結果を示すグラフである。

【図２】化合物１２を用いてアルカリ性ホスファターゼ
を測定したときの結果を示すグラフである。図１および
図２において、横軸はＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法を用
いた場合の吸光度（ΔＯＤ）であり縦軸は本発明の化合
物を基質として用いた場合の吸光度（ΔＯＤ）である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される
   リン酸エステル。 【化１】 （式中、Ｍは水素原子、ナトリウム原子またはカリウム
   原子であり、Ｒ^１とＲ^２の一方はメチルスルホニル基、
   Ｒ^１とＲ^２の他方はニトロ基であり、Ｒ^３は塩素原子ま
   たは水素原子、Ｒ^４は水素原子、ヒドロキシル基、メチ
   ル基またはメチルカルボニルアミノ基であり、Ｒ^５は水
   素原子または塩素原子であり、Ｒ^６はメチル基または３
   −スルファモイルフェニル基である。）